Direktor: Prof. Dr. med. M.P. Manns
Die Wirkung des IFN- γ auf Proliferation und
Fc γ -Rezeptor-Expression von humanen intestinalen Mastzellen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover vorgelegt von
Miriam Barkowsky
aus Höxter Hannover 2008
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Rektor: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Stephan Bischoff Referrent: Prof. Dr. med. Oliver Pabst
Korrefferent: Prof. Dr. med. Johannes Gessner Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2009
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Alexander Kapp
Prof. Dr. Burkhard Wippermann
Prof. Dr. Stefan Kubicka
1. EINLEITUNG 7
1.1. Die Mastzelle 7
1.1.1. Überblick 7
1.1.2. Entwicklung und Wachstum 8
1.1.3. Mastzellstimulation und Mastzellmediatoren 9
1.1.4. Physiologie und Pathophysiologie der Mastzellfunktionen 12
1.2. Interferon- γ 13
1.2.1. Die Gruppe der Interferone 13
1.2.2. Das Interferon-γ-Molekül 13
1.2.3. TH1 und TH2: ein Modell 14
1.2.4. Der Einfluss des Interferon-γ auf den Zellzyklus 15
1.3. FcγR: Immunglobulinrezeptoren für IgG 15
1.3.1. FcγRI 16
1.3.2. FcγRII 16
1.3.3. FcγRIII 18
1.4. Zielsetzung 21
2. MATERIALIEN UND METHODEN 23
2.1. Materialien 23
2.1.1. Substanzen zur Darmaufarbeitung 23
2.1.2. Magnetische Zellaufreinigung 23
2.1.3. PBMC-Isolation 23
2.1.4. Färbung und Zellzählung 24
2.1.5. Pufferrezepturen 24
2.1.6. Zellkultur 25
2.1.7. Zytokine 25
2.1.8. Proliferationsassay 25
2.1.9. Apoptoseassay 25
2.1.10. Antikörper und Tools 25
2.1.11. Releaseassays 26
2.1.12. RNA-Isolation 26
2.1.13. Reverse Transkription 27
2.1.14. Polymerase Chain Reaktion (PCR) 27
2.1.15. Geräte 27
2.2. Methoden 29
2.2.1. Ausgangsmaterial 29
2.2.2. Zellisolation 29
2.2.3. Aufreinigung von Mastzellen über Magnetseparation 31
2.2.4. Langzeitkultur 33
2.2.5. Coating mit IgG und IgG-Kreuzvernetzung 33
2.2.6. Zellzählung und Bestimmung der Kulturreinheit 33
2.2.7. Isolation von PBMCs aus humanem Vollblut 34
2.2.8. Proliferationsassay 34
2.2.9. Apoptose-Assay 34
2.2.10. mRNA-Isolierung 34
2.2.11. Reverse Transkription (RT) 35
2.2.12. Polymerase Chain Reaction (PCR) 35
2.2.13. Primersequenzen 35
2.2.14. Bedingungen der Amplifikationszyklen 36
2.2.15. Oberflächenexpression 36
2.2.16. IgG-Bindungsstudien 36
2.2.17. Histamin-RIA (Radioimmunoassay) 37
2.2.18. Leukotrien-EIA (Enzyme Immunoassay) 37
2.2.19. Statistische Tests 37
2.2.20. Orthographie 37
3. ERGEBNISSE 38
3.1. IFN-γ-Rezeptor-Expression in intestinalen Mastzellen 38 3.2. Der Effekt des IFN-γ auf das Wachstumsverhalten von intestinalen Mastzellen 38 3.3. Die Mastzelle nach IFN-γ-Kontakt: unverändertes Releaseverhalten der Zelle
nach FcεRI-Kreuzvernetzung 44
3.4. Regulation der Oberflächenexpression verschiedener Moleküle unter IFN-γ 46 3.5. FcγRezeptor-Expression auf humanen intestinalen Mastzellen und Auswirkungen
von IFN-γ-Kultur auf deren Genexpression 47
3.6. Bindung der IgG- Isotypen 49
3.7. IgG-Kreuzvernetzung induziert Mediatorrelease nach IFN-γ-Kultur 51
4.2. FcγRezeptor-Expression auf menschlichen kultivierten Darmmastzellen und das
IgG –Bindungsprofil 54
4.3. IgG-Kreuzvernetzung induziert Mediatorrelease 55
5. SCHLUSSFOLGERUNG 59
6. ZUSAMMENFASSUNG 61
7. REFERENZEN 63
8. DANKSAGUNG 74
9. LEBENSLAUF 76
10. ERKLÄRUNG NACH §2 ABS.2 NR. 5 UND 6 PROMOO 78
11. PUBLIKATIONSLISTE 79
Abkürzungsverzeichnis
ACC Acetylcystein
Ak Antikörper
APES 3-aminopropyltriethoxysilan
bp Basenpaare
CBMC Cord-blood derived mast cells (Nabelschnurblut- mastzellen)
CD Cluster of differentiation cDNA Komplementäre Desoxyri-
bonukleinsäure
d.h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure et al. et alter (und Mitarbeiter) EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzym-linked immunosor-
bent assay
FACS Fluorescence-activated cell sorting
Fc konstante Region der Im- munglobuline
(Fragment, cristaline) FcαR Immunglobulin A Rezeptor FcεR Immunglobulin E Rezeptor FcγR Immunglobulin G Rezeptor FCS Fetal calf serum
GDH Glyceraldehyd-3-
phosphatedehydrogenase GM-CSF Granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor HBMC Human bone-marrow deri-
ved mast cells (menschli- che Knochenmarksvorläu- fer Mastzellen)
HMC-1 Human mast cell line 1 IgA Immunglobulin A
IgE Immunglobulin E
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
IFN-γ Interferon-γ
ITAM immunoreceptor thyrosine- based activating motif ITIM immunoreceptor thyrosine-
based inhibitory motif LTC4 Leukotrien C4
MACS Magnetic beads-activated cell sorting
mAb monoclonal Antibody (monoklonaler Antikörper)
MC Mastzelle(n)
MCT Tryptase+/Chymase- Mastzellen
MCTC Tryptase+/Chymase+ Mastzellen
M-CSF Macrophage colony stimu- lating factor
MHC Major histocompatibility complex
MMC Mucosal mast cells
mRNA Messenger-
Ribonukleinsäure
mSCF membrane-bound stem cell factor
MW Mittelwert
NGF Nerve growth factor p Irrtumswahrscheinlichkeit pAk Polyklonaler Antikörper PBMC Peripheral blood mononu-
clear cells
PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerasekettenreaktion PMA Phorbol-12-myristat-
13-acetat
RIA Radioimmunoassay
RNA Ribonukleinsäure RT-PCR Reverse Transkiptase-
Polymerasekettenreaktion SCF Stem cell factor
(c-kit Ligand, Mastzell- wachstumsfaktor)
SD Standardabweichung
SEM Standard error of the mean,
(Standartfehler des Mittel- werts)
sSCF Soluble stem cell factor TGFβ Transforming growth
factor-β
TH T-Helfer Lymphozyten TNFα Tumor necrosis factor α TLR toll-like Rezeptor
VIP vasoaktives intestinales Polypeptid
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
1. Einleitung
1.1. Die Mastzelle
1.1.1. Überblick
In vielen peripheren Geweben, nicht aber in Lymphe und Blut trifft man auf diesen charak- teristischen Zelltyp: die Mastzelle. Ende des 19.Jahrhundert von Ehrlich zum ersten Mal als
”gemästete” Zelle unbekannter Funktion im Kaninchen-Mesenterium beschrieben, wurde Mastzellen später aufgrund ihres Aussehens eine Phagozytosefunktion zugeschrieben.(1,2) Auch in Geweben der Körper-Grenzflächen, d.h. in Schleimhäuten und dem Hautorgan siedeln sich Mastzellen charakteristischerweise an.(3,4) In Gewebeschnitten sind Mastzel- len vor allem um kleinere arterielle und venöse Gefäße und perineural, aber auch im ZNS nachzuweisen. Ihre an sauren Proteoglykanen reiche Granula lässt sich gut durch ba- sophile Farbstoffe anfärben. Diese zeigt dann die das lichtmikroskopische Bild der Mast- zellen prägende Metachromasie.(5)
Dieser aus hämatopoetischen CD34+ Vorläuferzellen entwickelte Zelltyp ist der myeloi- schen Reihe zuzuordnen. Die ungranulierten Mastzellvorläufer wandern aus dem Kno- chenmark über das Blut in die Gewebe ein, um schlussendlich hier ihre Effektorfunktion zu erlangen. Durch die Einwirkung von anderen dort ständigen Zelltypen, Zytokinen und ande- ren Bestandteilen der extrazellulären Matrix differenziert die Mastzelle aus.(6,7)
Dass Fibroblasten und/oder ihre Produkte hierbei eine zentrale Stellung haben müssen, wurde durch funktionelle Versuche von Levi-Schaffer et al. gezeigt. Ihnen gelang es als ersten, in einem Kokultur-Modell mit einer Fibroblastenlinie menschliche Mastzellen erfolg- reich in Kultur zu halten.(8) Später war es weitergehend möglich, in diesem Kokultur-Modell reife Mastzellen aus Vorläuferzellen zu gewinnen.(9-11)
Als Mastzellwachstumsfaktor wurde später der u.a. von Fibroblasten produzierte Stamm- zellfaktor (SCF) identifiziert.(12-15)
Aus diesem Reifungsprozess, auszumachen an zunehmender Granulierung, resultiert eine hochspezialisierte, gewebetypische Zelle.
In der Darmwand werden Mastzellen vor allem in der Lamina propria mucosae gefunden, in geringerem Maße in der Tela submucosa und in weiter abnehmendem Maße serosawärts.
Irani et al. beschrieben 1986, dass menschliche Mastzellen durch ihren Gehalt an den neut- ralen Proteasen Tryptase und Chymase unterschieden werden können.(17) In der Mucosa von Lunge und Darm finden sich vor allem Mastzellen vom MCT-Typ (Tryptase+), in der intestinalen Submucosa und der Haut hingegen Mastzellen vom MCTC-Typ (Trypta- se++Chymase+).(18-20) Diese beiden Zellgruppen unterscheiden sich in ihrer Stimulierbar- keit, Granulaultrastruktur und in ihren Fixierungseigenschaften.(21,22)
Einleitung
8
Zur Untersuchung von humanen Mastzellen sind verschiedene in-vitro Systeme etabliert worden. Unterschiedliche Mastzelllinien konnten aus an Mastzell-Leukämie leidenden Pati- enten gewonnen werden. Diese Zelllinien haben den Nachteil, dass sie entweder langsam wachsen und sehr differenzierte Kulturbedingungen benötigen (LAD-Zellen) oder einen unreifen Phenotyp besitzen (HMC-1).(23,24)
Des weiteren können Mastzellen in-vitro aus CD34+ Vorläuferzellen entwickelt werden, welche aus Knochenmark, fetalem Lebergewebe, Nabelschnurblut oder (nur schwer) aus peripherem Blut isoliert wurden.(3,11,25)
Bereits ausdifferenzierte Mastzellen werden direkt aus den Geweben (Lunge, Darm, Peri- toneum) einzelner Spezies isoliert, wie es mit den humanen Darmschleimhaut-Mastzellen in dieser Arbeit geschehen ist.
Über das in-vivo Verhalten von Mastzellen sind weitergehende Erkenntnisse mit Hilfe von genetisch mutierten Mäusen gewonnen worden. Durch defekte SCF- (in Sl/Sld Mäusen) oder SCF-Rezeptor-Gene (in W/Wv Mäusen) besteht u.a. eine Mastzelldefizienz. In W/Wv Mäusen kann durch Transfer von Mastzellen aus Kontrolltieren der Mastzelldefekt spezi- fisch repariert werden. Phänotypische Unterschiede zwischen den Mastzell-defizienten und Mastzell-rekonstituierten Mäusen sind dann als Mastzell-bedingt zu interpretieren.(26,27)
1.1.2. Entwicklung und Wachstum
SCF ist für die Differenzierung und das Überleben humaner Mastzellen obligatorisch.
Vorraussetzung für eine Wirkung auf die Zelle ist eine Bindung dieses Zytokins an c-kit (CD117), den SCF-Rezeptor. SCF kommt sowohl als lösliches, als auch als membrange- bundenes Molekül vor und wird v.a. von Stromazellen wie Endothelzellen und Fibroblasten produziert.(12,28,29)
Im Rahmen ihrer Entwicklung sprechen viele Knochenmarksvorläuferzellen auf SCF an; mit Ausnahme der Mastzelle verlieren die Zellen von anderen hämatopoetischen Linien mit zunehmendem Reifungsgrad aber die Fähigkeit, c-kit zu exprimieren.(30)
Neben SCF ist das Zytokin IL-4 als Mastzellproliferation und –funktion beeinflussender Faktor zu nennen. Für CD34+- Mastzellvorläuferzellen wurde gezeigt, dass IL-4 während der Ausreifung c-kit herunterreguliert, und so die Anzahl der Mastzellen, die sich SCF- abhängig aus Vorläuferzellen entwickeln, vermindert.(31) Es konnte aber eine verstärkte FcεRI -Expression in Mastzellvorläufern durch IL-4 gezeigt werden.(32-34) Ausgereifte, SCF-kultivierte Darmmastzellen zeigen in Anwesenheit von IL-4 hingegen eine deutlich gesteigerte Proliferation sowie eine verstärkte Histamin- und Leukotrienfreisetzung nach FcεRI-Kreuzvernetzung.(35) Diese Befunde werden für andere ausgereifte Mastzellpopula- tionen bestätigt.(36,37)
Seit Anfang der 80er Jahre liegen für das Maus- und das Rattenmodell Erkenntnisse vor, die zeigen, dass IL-3 die Entwicklung von mukosalen Mastzellen aus Knochenmarkszellen und das Überleben von reifen Mastzellen in-vitro möglich macht.
Humane Mastzellpopulationen kann IL-3 alleine allerdings nicht am Leben erhalten. Einige Studien zeigen, dass IL-3 die Ausdifferenzierung von SCF-kultivierten Mastzell- Knochenmarksvorläufern fördert.(38,39) Diesen Ergebnissen wird allerdings in einer Studie von Sillaber und Sperr widersprochen.(40) Der Zusatz von IL-3 zu SCF -kultivierten reifen Darmmastzellen hat einen anti-apoptotischen Effekt. Weiterhin steigert IL-3, ähnlich wie IL- 4, die Freisetzung von Histamin und Sulfido-Leukotrienen (Ausnahme PGD2) nach IgE- abhängiger Stimulierung. IL-4 und IL-3 haben diesbezüglich additive Effekte.(41)
Eine Reihe weiterer Mastzellwachstumsfaktoren wie z.B. IL-6, IL-9, IL-10 und NGF wurde in verschieden in-vitro und in-vivo Systemen beschrieben. Daten für diese Faktoren sind für intestinale Mastzellen entweder nicht erhoben oder sie widersprechen in anderen Syste- men beschrieben Befunden.(42-46) So hatte NGF keinen Effekt auf das Wachstum von intestinalen Mastzellen (nicht veröffentlichte Ergebnisse).
In Mausmodel wurde GM-CSF, M-CSF und TGF-β als Inhibitoren der Differenzierung von Mastzellen identifiziert. TGF-β wurde auch im humanen System als Inhibitor des Mastzell- wachtums beschrieben.(47-52)
Sicherlich werden zukünftig noch andere wesentliche Faktoren bekannt werden, die die Mastzellentwicklung, ihre Effektorfunktion und Interaktion mit verschieden Zelltypen im Ge- webe regulieren. Darauf weisen auch Studien hin, die beschreiben, dass Fibroblasten einen bisher undefinierten Faktor produzieren, der antiapoptotische Wirkungen auf menschliche Darmmastzellen ausübt.(53)
1.1.3. Mastzellstimulation und Mastzellmediatoren
Welche Rolle spielen Mastzellen im immunologischen Gesamtzusammenhang? Indem sie nach entsprechender Stimulation Entzündungsmediatoren freisetzen fungieren Mastzellen, wie auch andere Entzündungszellen, als inflammatorische Effektorzellen. Diese Mediatoren finden sich entweder präformiert in Mastzellgranula gespeichert oder sie werden an Ort und Stelle de-novo synthetisiert (siehe Abb. 1.1). Präformiert liegen Substanzen wie Histamin, verschiedene Proteasen und Proteoglykane vor. Als Mastzell-spezifische Besonderheit nimmt man an, dass Zytokine wie z.B. TNF-α auf einen Reiz hin nicht ausschließlich neu- synthetisiert werden müssen; Mediatoren wie diese lägen zusätzlich in Granula gespeichert vor und können so auch unmittelbar freigesetzt werden.(54,55) Die Synthese von Arachi- donat-Derivaten wie Leukotrienen und Prostaglandinen erfolgt innerhalb weniger Minuten.
Mit einiger Latenz zum Erregungsreiz kommt es anschließend zur de novo Synthese von
Einleitung
10 Zytokinen und Chemokinen. (Abb. 1.1).(56-59)
Kreuzvernetzung der an FcεRI gebundenen antigen-spezifischen IgE-Moleküle über ein polyvalentes Antigen ist der am besten beschriebene und wahrscheinlich effektivste Me- chanismus zur Mastzellaktivierung.(60-63) Dieses ist der Kernmechanismus der von Coombs und Gell beschriebenen Typ I-Allergie, der allergischen Sofortreaktion.(64) Weite- re Mastzellagonisten sind SCF, die Anaphylatoxine C3a und C5a, Morphine, polybasische Moleküle wie Compound 48/80 und Neuropeptide (Substanz P, VIP, Somatostatin). Einige dieser Substanzen stimulieren aber nur bestimmte Mastzellsubtypen. So sind z.B. humane Lungen- oder Darmmastzellen durch C3a und C5a oder Compound 48/80 nicht zu erre- gen.(61,65,66) Neuere Studien zeigen, dass Mastzellen verschiedene Toll-like-Rezeptoren (TLR) und andere sogenannte ”Pattern-Recognition-Rezeptoren” exprimieren. Diese wer- den im funktionellen Zusammenhang mit der Aktivierung von Mastzellen durch verschiede- ne Bakterien oder bakterielle und virale Substanzen beschrieben (z.B. FimH, ein Protein der E. coli Typ I -Fimbrien, und Toll-like-Rezeptor-Agonisten wie LPS, CpGs oder dsRNA).(67-69)
Abb.1.1
Überblick: Mediatoren der Mastzelle
Sekretion Synthese/ Speicherung Produkt sofort
(Sekunden bis Minuten)
präformiert in Granula 1. Biogene Amine Histamin
präformiert in Granula 2. Proteoglycane Heparin
Chondroitinsulfat präformiert in Granula 3. Proteasen
Tryptase Chymase
Carboxypeptidase präformiert in Granula 4. Zytokine
TNF-α
de novo 5. Arachidonsäurederivate
Leukotriene (C4/D4/E4) Prostaglandin D2 PAF
verzögert (Stunden)
de novo nach Geninduktion
6. Zytokine TNF-α IL-1 IL-6 IL-8 IL-16 MIP-1α MIP-1β β-FGF
IL-3 IL-5 IL-13 IL-10 MCP-1
VEGF
Mastzellen setzen einige Substanzen sofort nach Stimulation frei, andere erst mit Latenz. Zu den sofort
freigesetzten gehören sowohl die aus Granula freigesetzten Mediatoren, wie auch de novo synthetisierten Moleküle. Verzögert sezernierte Substanzen sind die Folge stimulationsbedingter Geninduktion. (56-59)
Einleitung
12
1.1.4. Physiologie und Pathophysiologie der Mastzellfunktionen
Wie im vorrangegangenen Abschnitt bereits beschrieben, stehen Mastzellen als Effektor- zellen im Zentrum der von Coombs und Gell beschriebenen Typ I -Immunreaktion.(64) Die über IgE-abhängige Mechanismen freigesetzten Mastzellmediatoren erhöhen Durchblutung und Gefäßpermeabilität (durch Histamin) und wirken als Chemotaxine (z.B TNF-α, IL-5 und Arachidonsäurederivate). Die hierbei auftretenden Symptome Rötung, Schwellung, gestei- gerte Schleimsekretion, Niesen, Husten, Blutdruckabfall und Flüssigkeitsverlust sind mittel- bare Folgen der Freisetzung von Mastzellmediatoren. Diese erlebt der Betroffene als Rhini- tis, Urticaria, Asthma bronchiale bis hin zum anaphylaktischen Schock.(70-73)
Menschliche Mastzellen des Darms beteiligen sich auch durch diese Art von Reaktion maßgeblich an der Pathologie von Nahrungsmittelallergien. Die vermittelten Symptome sind hier Durchfälle, Erbrechen, Verdauungs- und Resorptionsstörungen aber auch Formen von extraintestinalen Manifestationen.(74,75)
Des weiteren werden Mastzellmediatoren für die Induktion der allergischen Spätreaktion sowie der Chronifizierung des allergischen Prozesses verantwortlich gemacht. Chronisch- allergische Entzündungen führen häufig zur Induktion von Fibrose und Angiogenese, Pro- zesse an denen Mastzellen wahrscheinlich über die Produktion von Fibroblasten- bzw. En- dothelwachstumsfaktoren wesentlich beteiligt sind.(76-79) Neben der Rolle als „Allergie- zelle“ wird der Mastzelle bei der Aufrechterhaltung anderer nicht primär allergischer chroni- fizierter Entzündungen Bedeutung beigemessen. Hierzu zählen die Rheumatoide Arthritis (RA), chronisch entzündliche Darmerkrankungen, das bullöse Pemphigoid und die En- cephalomyelitis dissiminata.(80-83)
Auch an der regulären Wundheilung und an Organfibrosen bei nicht allergischen Erkran- kungen (Leberfibrose, Lungenfibrosen, Sarkoidosen und Neurofibromatosen) scheinen Mastzellen beteiligt zu sein.(84-88)
In den letzten 10 Jahren machten viele Studien auf die Bedeutung von Mastzellen bei bak- teriellen, viralen und parasitären Infektionen aufmerksam (Die TLH-Rezeptoren/ Pattern- recognition-Rezeptoren wurden bereits im vorherigen Abschnitt erwähnt.).(89-92) Zwei wegweisende Arbeiten von 1996 beschreiben die bedeutende Rolle von Mastzellen in zwei unterschiedlichen in-vivo -Modellen akuter bakterieller Infektionen. In diesen Modellen sind von Mastzellen produzierte Entzündungsmediatoren wie TNF und Leukotriene essentiell für die Chemotaxis von Neutrophilen und folglich für die Kontrolle der Infektion.(93-95)
Die Mastzelle steht also am Anfang einer Immunantwort, da sie erstens in den meisten Geweben, vor allem an Körpergrenzflächen, dauerhaft anwesend ist und zweitens in der Lage ist, immunologische Botenstoffe nach Aktivierung vergleichsweise rasch freizusetzen.
Neben der Rolle als frühe unspezifische Entzündungszellen wird Mastzellen in einigen neueren Studien des weiteren eine wichtige Rolle bei der Initiierung der adaptiven Immun- antwort zugesprochen. Mastzellmediatoren, aber auch von Mastzellen exprimierte co-
stimulatorische Moleküle oder ihre Fähigkeit, unter bestimmten Bedingungen Antigene zu präsentieren könnten v.a. für die Induktion einer TH2-basierten spezifischen Immunantwort von Bedeutung sein.(96,97)
Die Mastzelle kann daher mit einem Wachposten verglichen werden, der multiple Möglich- keiten besitzt, Fremdes auszumachen um daraufhin differenzierte Abwehrmechanismen einzuleiten.
1.2. Interferon- γ
1.2.1. Die Gruppe der Interferone
Die Interferone werden zu einer Gruppe löslicher Proteine gerechnet, die als ”Zytokine”
bezeichnet werden. Zytokine sind, neben z. B. direktem Zell-Zell-Kontakt, ein weiterer Weg zur Kommunikation unter Immunzellen, mit dem Vorteil, dass hierdurch Kommunikation auch über gewisse Distanzen möglich ist. Sie werden aber auch von anderen, nicht im en- geren Sinne zum Immunsystem gehörigen Zellen sezerniert (z.B Fibroblasten). Es gibt un- gefähr 20 verschiedene Interferone. Interferon-γ (IFN-γ) stellt den einzigen Vertreter der Typ II-Interferone dar. Die anderen den Typ I-Interferonen zugeordnet werden. Des weiteren sind Interferon-artige Zytokine (IL-28A, IL-28B und IL-29) beschrieben worden.(98,99) Gemein haben alle Interferone, dass sie eingreifen (engl. ”interfere”), wenn intrazelluläre Pathogene ausgemacht wurden. Während über Typ I-Interferone versucht wird, so früh wie möglich die Zahl der infizierten/ veränderten Zellen klein zu halten, kann die Sekretion von Typ II-Interferon als Vermittlung zwischen unspezifischer und spezifischer Immunität und Langzeitkontrolle verstanden werden.(100) Interferon-α (sezerniert vor allem von hämato- poetischen Zellen) und Interferon-β (sezerniert v.a. von Fibroblasten, aber auch von Makrophagen), die hier als beispielhaft für Typ I-Interferone stehen sollen, synthetisiert die virusinfizierte Zelle, nachdem sie doppelsträngige RNA erkannt hat. Sie dienen sozusagen als Frühwarnsystem für die sie umgebenden Zellen. Als Folge werden zur Elimination des Virus verschiedene antivirale Prozesse initiiert.
Die Sekretion von IFN-γ erfolgt durch T-Lymphozyten und NK-Zellen. Neben direkten anti- viralen Effekten kommt es zu indirekt bakterizider Wirkung, der Stimulation von Antigenprä- sentation und Einflüssen auf Zellproliferation und –apoptose.(101)
1.2.2. Das Interferon-γ-Molekül
IFN-γ ist ein 143- Aminosäuren umfassendes, aus 6 α-Helices bestehender Homodimer. Es tritt mit zwei IFNγRα- (respektive RI-) Ketten seines Rezeptors (einen Klasse II-Zytokin-
Einleitung
14
Rezeptor) in Interaktion, nicht jedoch mit den zwei β- (RII-) Ketten, welche neben den α- Ketten der Signaltransduktion dienen. Über den Jak1/2-Stat1-Signalweg wird auf die Transkription der IFN-γ- abhängigen Gene, zum größten Teil Transkriptionsfaktoren, Ein- fluss genommen.(98,102)
1.2.3. TH1 und TH2: ein Modell
Laut einer Modellvorstellung, die Mosmann 1986 erstmals formulierte, wird IFN-γ als wichti- ges Zytokin einer speziellen Immunitätslage, der sogenannten TH1- Immunreaktion, gese- hen.(103) Zur Ausbildung einer TH1-Antwort kommt es, nachdem intrazelluläre Antigene (Viren, intrazellulären Bakterien, Tumorantigenen) einer naiven T-Zelle präsentiert wurden.
Dabei bildet sich eine antigenspezifische ”zelluläre/zellvermittelte Immunität” aus. Das TH1- Zytokinmilieu ist durch die Produktion von IFN-γ, IL-2 und TNF-α charakterisiert. Es folgt die Wandlung der ersten naiven T-Zellen (T0-Zellen) in TH1-Gedächnis- oder -Effektor-Zellen.
Zielzellen des hierbei sezernierten IFN-γ sind vor allem Makrophagen, die in der Folge ihre antimikrobielle Potenz verbessern, sowie ihre Fähigkeit zur Antigenpräsentation.(104) TH1- Zytokinmuster werden in chronischen Entzündungen (z.B M. Crohn), aber auch in speziel- len auf einzelne Organsysteme begrenzten Autoimmunkrankheiten (Multiple Sklerose, Dia- betes mellitus Typ I und Arthritis) gefunden.(105)
Defizienzen in diesem System führen zu erhöhten Anfälligkeiten des Betroffenen für myko- bakterielle Erkrankungen.(106)
Wird einer naiven T-Zelle wiederum ein extrazelluläres Antigen (v.a. Parasitenantigene) präsentiert, wandelt sie sich im Folgenden in eine TH2-polarisierte-Zelle, um daraufhin die TH2-typischen Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 zu synthetisieren und so B-Zellen, Mastzellen, basophile und eosinophile Granulozyten zu aktivieren. So kommt es zur Bildung antigen- spezifischer Antikörper.
Das TH2-System führt zur Ausbildung der sogenannten ”humoralen Immunität”. Atopische Diathesen werden als fehlgeleitete TH2-Immunreaktionen auf ungefährliche Antigene inter- pretiert. Diese Befunde werden fundiert durch die Tatsache, dass Personen mit bestimmten Genvariationen in verschiedenen HLA Klasse II-Allelen, oder Allelen der Genen von IgE, FcεRI, IL-4, IL-4-Rezeptor und wahrscheinlich auch IL-13 eine Prädiposition zu Asthma und Atopie aufweisen.(107-111)
Die Grenzen der TH1-/TH2-These werden zunehmend durchlässiger. In der Literatur wird sich immer seltener auf dieses vereinfachte Modell bezogen.
1.2.4. Der Einfluss des Interferon-γ auf den Zellzyklus
IFN-γ besitzt auf den Zellzyklus der myeloischen und lymphatischen Zellreihen gegensätzli- che Wirkungen: wo Kontakt mit diesem Zytokin in TH1-Lymphozyten wie oben beschrieben mitotische Wirkung hat, wird in Makrophagen Apoptose induziert.(112) Gleichzeitig wurde aber gezeigt, dass durch IFN-γ die Zelle vor vom Pathogen induzierter Apoptose geschützt wird.(113,114) Von anderer Seite wird eher der anti-proliferative Effekt betont. Balkwill et al.
(Versuche an myeloischen Blasten) und Lundblad et al. (Versuche an Gliomzellinie) er- klärten dieses schon früh durch einen Arrest des Zellzyklus am Übergang von G1 in die Synthesephase.(115,116)
Die Wirkung des IFN-γ auf die Mastzelle vor dem Hintergrund des bereits Bekannten sollte in dieser Arbeit interessieren. Dabei wurde nicht nur der Einfluss auf das Zellüberleben un- tersucht, da sich dieses Zytokin als wichtiger Einflussfaktor mehrerer funktioneller Proteine der Mastzelloberfläche bewies. Hiervon wurde FcγRI, ein IgG-Rezeptor, näher untersucht.
(siehe Fragestellung)
1.3. Fc γ R: Immunglobulinrezeptoren für IgG
Die Interaktion des IgG-Fc-Fragments mit der Zellmembran erfolgt über drei Arten von Fcγ- Rezeptoren: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16).(117-120) Heute weiß man, dass über eine FcγRezeptor-Kreuzvernetzung Einfluss auf den Aktivierungsgrad der Zelle genommen werden kann.(121) Dieses ergänzt die frühere Ansicht, der IgG-Besatz und die Kreuzvernetzung dieser Rezeptoren diene lediglich der Erkennung von zu phagozytieren- den Antigen-Antikörper-Komplexen und einer erleichterten Phagozytose von opsonisierten Strukturen, sowie der Vermittlung von Komplementwirkungen. Grundlegend bestimmt wird dieses durch die Wahrscheinlichkeit, mit der eine Rezeptor-Liganden-Interaktion eintritt, beschrieben in der Bindungskonstante. FcγRI ist unter den Rezeptoren für IgG der einzige hochaffine Rezeptor (Bindungskonstante 108-109M-1), charakterisiert durch die Fähigkeit, die IgG-Moleküle in nicht-komplexierter Form zu binden.(122) Eine mögliche Kreuzvernet- zung über ein multivalentes Antigen findet ggf. nachträglich statt.(120) Ganz anders stellen sich die Verhältnisse bei FcγRII und FcγRIII, den niedrigaffinen Rezeptoren ihrer Gruppe, dar (Bindungskonstanten 2x106M-1 bzw. 5x105M-1).(120,123,
124) Die
Möglichkeit einer dauerhaften Bindung an diese Rezeptoren besteht v.a. für präformierte Antigen-Antikörper- Komplexe.(120) Damit besitzen sie einen Sonderstatus unter den Immunglobulinrezepto- ren. Da am Aufbau der in Frage kommenden Antigen-Antikörper-Komplexe Immunglobuline unterschiedlichster Subtypenbeteiligt
sein können, und die einzelnen Rezeptoren Präfe- renzen in der Bindung der IgG-Isotypen aufweisen, finden auch weitergehende Interaktio- nen der Immunglobulinrezeptoren untereinander statt.(125,126) Dieses setzt aber nichtEinleitung
16
unbedingt die Aktivierung durch den selben Immunkomplex voraus. Für eine Interaktion reicht die gleichzeitige Aktivierung, die Kostimulation, zweier Immunglobulinrezeptoren aus.
1.3.1. FcγRI
FcγRI findet sich auf humanen Monozyten, dentritischen Zellen und ist in eosinophilen und neutrophilen Granulozyten durch IFN-γ induzierbar.(127) Murine Mastzellen exprimieren diesen Rezeptor nicht. Für das FcγRI -Protein codieren 3 Gene (A, B und C) und es finden sich 6 Transkripte (a1, a2, b1, b2, b3 und c).(119,128,129) Am Aufbau (siehe auch Abbil- dung 1.2) des 72kDa großen FcγRI sind eine transmembranöse α-Kette mit zwei bzw. drei extrazellulären Ig-artig gefalteten Domänen und ein γ-Ketten-Homodimer beteiligt. Letzteres trägt zwei ITAM-Sequenzen (immunoreceptor thyrosine-based activating motif), welche die Verbindung zwischen Rezeptor und intrazellulärer Signaltransduktion darstellen. Als bevor- zugte Isotypen werden IgG1 und IgG3 an FcγRI gebunden, weniger dagegen IgG4 oder IgG2.(130) Suboptimale FcεRI- und FcγRI- Errungungen können sich potenzieren und so zu einem Release führen, da ihre intrazytoplasmatischen Signalkaskaden zusammenlau- fen.(130,138) Auf den Einfluss des IFN- γ auf diesen Rezeptor und die Expression in Mast- zellen wird in der Fragestellung und Diskussion näher eingegangen.(130)
1.3.2. FcγRII
Im menschlichen Genom sind neben dem Gen für FcγRIIb (mit den Splicingvarianten b1 und b2), dass auch in anderen Arten weit verbreitet ist, als Besonderheit Gene für FcγRIIa (Transkripte a1 und das lösliche Protein a2) und FcγRIIc (Transkript c) nachgewiesen.(119) FcγRIIa bindet v.a. IgG1, aber auch IgG3. Die geringste Affinität besteht für IgG4. FcγRIIb – Besatz erfolgt am ehesten durch IgG1 und IgG3, auch durch IgG4, am wenigsten IgG2.(130) FcγRIIc ist dahingehend noch nicht weiter charakterisiert. Die FcγRII- Rezeptoren bestehen nur aus einer α-Kette. Ihr intrazellulärer Anteil schließt die ITAM- (FcγRIIa und FcγRIIc) und ITIM-Sequenzen (FcγRIIb) ein, über welche direkt intrazytoplas- matische Signalkaskaden angestoßen werden.(120) Die ITIM-Sequenz (immunoreceptor thyrosine-based inhibitory motif) des FcγRIIb nimmt in dieser Gruppe in Punkto Struktur und Funktion eine Sonderstellung ein. Durch diese funktionelle Substruktur vermindert die gleichzeitige Aktivierung des FcγRIIb die Auswirkungen der Aggregation ITAM-tragender Rezeptoren auf die Zelle.(119,120,133-136)
Für menschliche Mastzellen, die aus CD34+-Vorläufern generiert wurden und für basophile und neutrophile Granulozyten, wie auch für Makrophagen ist beschrieben, dass FcγRIIb funktionell ist, d.h. ist in der Lage, die Auswirkungen der Stimulation aktivierender Rezepto-
ren zu reduzieren.(137-139)
Es wurde sogar gezeigt, dass FcεRI selbst zur Auslöschung der eigenen Signale beiträgt, indem er FcγRIIb–Signaling bahnt (mit murinem FcγRIIb transfizierte RBL-2H3- Zellen).(140) In der FcεR-vermittelten Typ-I Allergie können über IgG-Moleküle die Auswir- kungen von Fcε–vermittelter Mastzellstimulation moduliert werden. Neben der direkten Konkurrenz des IgG mit IgE um das Antigen, besitzt der IgG-Rezeptor FcγRIIb anti- allergische Potenz. Dieser mindert nach Koaggregation mit dem IgE-Rezeptoren die Folgen des Fcε-Signaling.(141) In-vitro konnte durch ein synthetisches Fusionsprotein und ein An- tikörperkonstrukt genau dieser Mechanismus imitiert werden, der als Vision zukünftiger medikamentöser/ gentherapeutischer Allergietherapien gesehen wird. Aber nicht nur Inter- aktionen mit ITAM-tragenden Rezeptoren sind bekannt.(125,141)
FcγRIIb-Aggregation vermindert z.B auch die c-kit-vermittelte Proliferation in murinen aus Knochenmark gewonnenen Mastzellen.(142) Über FcγRIIb auf B-Zellen wird die B-Zell Ak- tivierung, Proliferation und Immunglobulinsynthese gehemmt.(143) So hat FcγRIIb also einen zweiseitigen suppressiv- immunregulatorischen Effekt: Sowohl die Immunisierung gegen ein Antigen wird beeinflusst, als auch die Sofortreaktion nach erneutem Antigen- kontakt. Darüber hinaus wird durch Eingriff ins T-Zell-Signaling auch die T-Zell-Aktivierung abgeschwächt.(144)
Als Folge des Fehlens des entsprechenden Gens und darauf folgender verminderter Re- zeptorexpression findet man wie zu erwarten überschießende Immunreaktionen, deren krankhafte Folgen im Mausmodel in Tabelle 1.3 zusammengetragen sind.
FcγRIIa ist der auf menschlichen Zellen am weitesten verbreitetste Fcγ-Rezeptor (beschrie- ben auf Neutrophilen, Monozyten, Thrombozyten und dendritischen Zellen).(130,138) Die Moleküle besitzen als einzige Fc-Rezeptoren die Tendenz zu dimerisieren.(145) Durch FcγRIIa wird die Phagozytose von Antigenen vermittelt. Dies führt zur Beseitigung von möglicherweise schädlichen Immunkomplexen und zur erleichterten Antigenaufnahme durch APCs.(146-148) Besondere Bedeutung erlangt FcγRIIa in γ-Ketten-defizienten Indivi- duen, bei denen als Folge (abgesehen von FcγRIIc) alle ITAM-tragenden Fcγ-Rezeptoren außer FcγRIIa fehlen.
Das Gen für FcγRIIc wird für ein Hybridgen aus den Genen für FcγRIIa und IIb gehal- ten.(149) FcγRIIc wurde im Menschen auf natürlichen Killer Zellen und myelomonozytären Zellen wie Makrophagen und Monozyten beschrieben, wobei die Immunglobulinbindung- seigenschaften eher dem FcγRIIb ähneln, er sich aber den Signalwegen des FcγRIIa be- dient.(150,151)
Einleitung
18
1.3.3. Fc
γRIII
Der Aufbau des FcγRIII (CD 16) (im Menschen exprimiert als Produkte des FcγRIIIA- und FcγRIIIB-Gens), ähnelt dem des FcγRI. Die IgG-bindende α-Kette wird auch hier durch ein ITAM-tragendes γ-Homodimer ergänzt (wie auch bei FcεRI und FcγRI).(152) Immunkom- plexe unter Beteiligung von IgG1 und IgG3, weniger IgG4 und IgG2 werden bevorzugt ge- bunden.(130) Außerdem kann über FcγRIII die Phagozytose partikulärer Strukturen und deren anschließende Degradation vermittelt werden.(153) Keine Möglichkeit zu eigener Signalweiterleitung besitzt FcγRIIIb. Diesem Rezeptor fehlt der zytoplasmatische Anteil, der den Signalweg einleitet.(154) FcγRIII wird als bedeutendster Rezeptor bei der Vermittlung von Autoimmunität gesehen. Die Folgen des Fehlens des FcγRIII-Rezeptors im Mausmodel zeigt Tabelle 1.3.
Schematische Darstellung des Aufbaus des FcεRI, FcγRI, FcγRII a und c, des FcγRIIb und des FcγRIII. FcεRI, FcγRI, FcγRII a und c, sowie FcγRIII initiiren die folgende Signalkas- kade über aktivierende ITA(M)- Motive, der einkettige FcγRIIb im Gegensatz dazu über ein inhibitorisches ITI(M)-Motiv . Des weiteren unterscheiden sich die Rezeptoren in der An- zahl der Ig-artigen extrazellulä- ren Domänen. FcεRI trägt als einziger die β-Kette.
Abb. 1.2 Schematische Darstellung des Aufbaus von FcεRI, FcγRI, FcγRII a und c, FcγRIIb und des FcγRIII (119,130)
Name Cluster of diffe- rentiation
Größe, Substruktur Signal- trans-duktion
Liganden$ Affinität zum Liganden
Expression Regulierbarkeit über Cytokine
Folge des Knock-outs im Mausmodel
FcγRI CD64 72 kDa
α-Kette, γ-Ketten Homodimer
ITAM 1.IgG1= IgG3
2.IgG4 3.IgG2
108-109M-1* MC, Mono, DZ, durch IFNγ indu- zierbar auf Eo,&N
IFN↑(in MC) FcγRI-/ -:
Überentfindlichkeitsreaktionen↓, Zytokinfreisetzung↓,
Phagozytose↓, Antigenpräsentation↓, AK-abh-Zytotox. ↓, Phagozytose↓, Bakterien-Clearance↓, Arthritis↓,
FcγRIIa CD32 40 kDa
α-Kette ITAM 1.IgG1
2.IgG2#= IgG3 3.IgG4
2 x106M-1§ hu:
MC, Eo, B(?), M, N, LZ, P,DZ
In Eo:
IFN↑, GM-CSF↑
FcγRIIb CD32 40 kDa
α-Kette ITIM 1.IgG1= IgG3
2.IgG4 3.IgG2
2 x106M-1§ MC, Eo,B(?),M, N im Monozyten: IL4↑, IFN↓
in B-Zellen:
IL4↓
FcγRIIc CD32 40 kDa
α-Kette ITAM 2 x106M-1§ hu
NK, M, mu BMMC
FcγRII-/ -:
AK-Bildung↑,-syst.&lok.Anaphylaxie↓, Arthus-Reaktion↑, anti-Basalmembran Glomerulonephritis↑, Induzierbarkeit von Goodpasture-Syndrom und Arthritis↑
Bakterien-Clearance↑,
FcγRIII CD16 50-80kDa
α-Kette, γ-Ketten Homodimer
ITAM 1.IgG1= IgG3
2.IgG4 3.IgG2
5 x105M-1§ MC+, Eo, M, N,B roMC: IL4↑ FcγRIII-/- ähnelt FcyR-/-: Arthus-Reaktion↓, Vasculitis↓,
haemolyt.Anämie↓, Thrombopenie↓
$Ordnung nach abnehmender Affinität,* hochaffin, § niedrigaffin,# IgG2-Bindung trifft nur auf einzelne Allotypen zu,° nicht regelmäßig MC= Mastzelle, M= Monozyt, Eo= Eosinophiler Granulozyt, N=
Neutrophiler Granulozyt, DZ= Dendritische Zelle, LZ= Langerhans Zelle, P= Blutplättchen(Thrombozyt),T= T-Zelle, NK= Natürliche Killerzelle hu= nur in menschlichen Zellen, ro = im Mausmodel, ↑=
Hochregulation, ↓= Herunterregulation,+ im Menschen nur minimal induzierbar, im Mausmodel beim Serosa-Typ (SCF-Kultur), nicht beim Mucosa-Typ (IL3-Kultur)
20
Abb. 1.3.
Kurzcharakteristik der Fc
γRezeptoren (119,130,155-157)
1.4. Zielsetzung
Als Zielsetzung dieser Arbeit sollte die Wirkung von IFN-γ auf humane intestinale Mastzel- len untersucht werden.
Hierbei wurden zwei Aspekte genauer untersucht.
Zum einen interessierte, inwiefern IFN-γ das Wachstumsverhaltens von intestinalen Mast- zellen beeinflusst.
Zum anderen sollte der Effekt des IFN-γ auf die Expression und Funktion von Fcγ- Rezeptoren in humanen intestinalen Mastzellen studiert werden.
Im murinen Model war bereits beschrieben worden, dass Mastzellen FcγR exprimieren.
(117,121)
Im murinen knock-out Modell konnten bereits in-vivo Rückschlüsse auf FcγR-Funktion ge- zogen werden (siehe Abb.1.2).(130-132,155-157)
Im humanen System sind FcγRezeptoren bisher fast ausschließlich in solchen Mastzellen studiert worden, die in-vitro aus Vorläuferzellen generiert wurden.(118,119,129,158) Aus peripherem Blut entwickelte Mastzellen exprimieren FcγRI und FcγRII.(118,119,129,158) Es wurde gezeigt, dass IFN-γ die Expression des FcγRI deutlich heraufregu- liert.(129,158,159) Die Aktivierung dieser Zellen durch FcγRI-Kreuzvernetzung, die zur Ausschüttung von Entzündungsmediatoren und Zytokinen führte, war nach Vorkultur der Zellen mit IFN-γ möglich.(129,158,159)
Aus peripherem Blut (z.B. Nabelschnurblut) oder dem Knochenmark gewonnene Mastzell- vorläuferzellen werden in 6-10 -wöchiger Kultur zur Ausreifung gebracht und entsprechen funktionell nicht immer den primär aus Gewebe isolierten Zellen, da, wie in der Einleitung beschrieben, ein gewebespezifisches Umfeld die Ausdifferenzierung bestimmt. Z.B. unter- scheiden sich diese Zellen von den Gewebsmastzellen in ihrer Reaktion auf verschiedene Wachstumsfaktoren, wie z.B. IL-3 und IL-4.(31-41)
Dieses gab Anlass dazu, intestinale Mastzellen zu studieren, welche zum Zeitpunkt der Gewinnung schon ausgereift waren.
Neben der oben beschrieben zentralen Funktion des IFN-γ, Mastzellen für IgG-abhängige Stimuli zu sensibilisieren, konnte im murinen und humanen System gezeigt werden, dass IFN-γ die Entwicklung von Mastzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen inhibiert. Die- ses wurde sowohl auf pro-apoptotische, als auch auf anti-proliferative Mechanismen zu- rückgeführt. (31,162) Ein anti-prolifertiver Effekt vermittelt durch IFN-γ wurde auch für peri- toneale Mausmastzellen beschrieben. (160)
Einleitung
22
Der Effekt von IFN-γ auf das Wachstumsverhalten von primär aus Gewebe isolierten hu- mane Mastzellen war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt.
Durch diese Vorbefunde leiteten sich folgende Fragen ab:
1. Wird durch IFN-γ das Wachstumsverhalten von intestinalen Mastzellen beeinflusst?
2. Verändert IFN-γ die funktionelle Antwort dieser Mastzellen nach IgER- Kreuzvernet- zung?
3. Werden FcγR auf humanen intestinalen Mastzellen exprimiert?
4. Welchen Einfluss haben IFN-γ und andere Zytokine auf die Expression von FcγR?
5. Können intestinale Mastzellen durch IgG- Kreuzvernetzung aktiviert werden?
2. Materialien und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Substanzen zur Darmaufarbeitung
ACC Sigma Chemie GmbH, München
EDTA Merck, Darmstadt
NaCl Merck, Darmstadt
KCl Merck, Darmstadt
CaCl Merck, Darmstadt
MgCl Merck, Darmstadt
Na2HPO4 Merck, Darmstadt
Natriumazid Merck, Darmstadt
D-Glucose Sigma Chemie GmbH, München
Penicillin/Streptomycin Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland Amphotericin Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland
Gentamycin Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland
Metronidazol Fresenius, Bad Homburg
BSA Boeringer, Mannheim
HEPES Sigma Chemie GmbH, München
Gelatine Sigma Chemie GmbH, München
Pronase Boeringer, Mannheim
Chymopapain Sigma Chemie GmbH, München
Collagenase D Boeringer, Mannheim
Medium RPMI 1640 + GlutaMAX® und 25mM HEPES
Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland Fetales Kälberserum (FCS) Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland
2.1.2. Magnetische Zellaufreinigung
MACS®-System Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach
100µm Nybold -Filter Swiss Silk Bolting Cloth Manufacturing Co.Ltd, Zürich, Schweiz
250µm Nybold -Filter Swiss Silk Bolting Cloth Manufacturing Co.Ltd, Zürich, Schweiz
2.1.3. PBMC-Isolation
Ficoll-Paque Amersham Biosciences, Uppsala, SE
Materialien und Methoden
24
2.1.4. Färbung und Zellzählung
Trypanblau Sigma Chemie GMBH, München
Diffquick Rapid Differential Hematology Staining
DADE Behring, Newark, USA May-Grünwalds Eosin-Methylenblau-Lösung Merck, Darmstadt
Giemsa Sigma-Aldrich Chemie, RdH Seelze, Taufkir-
chen
Neubauer- Zählkammer Assistent Glaswarenfabrik Karl Hecht KG, Sondheim
Fuchs-Rosenthal-Zählkammer Assistent Glaswarenfabrik Karl Hecht KG, Sondheim
2.1.5. Pufferrezepturen
ACC-Lösung (0,1%) 0,5g ACC in 500ml Tyrode+EDTA
Aufbewahrungspuffer 0,236M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,72mM Na2HPO4, 11,1mM Glucose,
0,4mM EDTA, 5mM Hepes, 0,5mg/ml Ampicillin, 0,2mg/ml Gentamycin, 0,2mg/ml Metronidazol
Collagenase-Lösung 1,5mg/ml Collagenase D in TGMD
FACS-Puffer 0,1%BSA, 0,1% Natriumazid,
250µg/ml Kaninchen IgG in PBS
Blocking-Puffer FACS-Puffer, 250µg/ml IgG Ziege, 250µg/ml IgG Schwein
Gelatine-Lösung 2% Gelatinepulver in H20
HA-Puffer 1mg/ml BSA in Hepes-Puffer
HA+EDTA-Puffer 2mM EDTA in 1000ml HA
HACM-Puffer 1mM CaCl2 und 1mM MgCl2
HEPES-Puffer 20mM Hepes, 0,125M NaCl, 0,5mM D-
Glucose und 5mM KCl
PBS-Puffer (20x) 180g/l NaCl, 5,34g/l KH2PO4, 22,86g/l Na2HPO4, pH 6,4-6,6
PBS-Puffer (1x) 1:20-Verdünnung aus PBS-Puffer (20x)
PCH-Lösung 3mg/ml Pronase, 0,75mg/ml Chymopapain in
Tyrode+EDTA-Puffer
TGMD-Puffer 1,23mM MgCl2, 15µg/ml DNAse, 1mg/ml
Gelatine (2%Lösung in Tyrode-Puffer)
Tyrode-Puffer 137mM NaCl, 2,7mM KCl, 0,36mM
Na2HPO4, 5,55mM D-Glucose
Tyrode+2mM-EDTA-Puffer 2mM EDTA in Tyrode
TAE-Puffer 40mM Tris, 1mM EDTA, 0,057% Eisessig 5x DNA Gelladepuffer 30% Glycerol, 20mM EDTA, 0,05% Brom-
phenolblau, 0,05% Xylencanol
Ansatz aller Lösungen in sterilem pyrogenfreiem Wasser (Ampuwa, Fresenius, Bad Hom- burg), Sterilfiltration, Lagerung bei 4°C.
2.1.6. Zellkultur
Kultur-Komplettmedium RPMI 1640 + GlutaMAX® und 25mM HEPES + 10% FCS+ Penicillin/Streptomycin
(100U/ml bzw. 100µg/ml)+ Amphotericin (0,5mg/ml)+ Gentamycin (0,2mg/ml) Zellkulturplatten Nuncleon Surface Nunc, Roskilde, Dänemark
Zellkulturflaschen Nuncleon Surface Nunc, Roskilde, Dänemark
2.1.7. Zytokine
SCF Anagen, Thousand Oaks, Californien
IL-4 Dr.Frank Kalthoff, Novatis, Wien, Österreich
IFN-γ Imukin, Boeringer Ingelheim Pharma GmbH
& Co., Ingelheim am Rhein
2.1.8. Proliferationsassay
Szintillationsflüssigkeit Ultima Gold™ XR, Packard BioSciences, Meridien, Conneticut, USA
Szintillationsröhrchen Greiner, Frickenhausen
2.1.9. Apoptoseassay
Apo ONE ™ Homogenous Caspase 3/7- Assay
Promega, Madison, Wisconsin, USA
2.1.10. Antikörper und Tools
Maus αCD117 (Clone YB5.B8) Pharmingen, Hamburg
Ziege αMaus IgG-Mikrobeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach
huIgG Plasma Calbiochem, Merck Biosciences, Bad Soden
Maus αhuIgG Pharmingen, Hamburg
Maus IgG1 Clone 15H6 SouthernBiotech, Birmingham, Alabama,USA
Materialien und Methoden
26
humanes IgG1 Myeloma Calbiochem, Merck Biosciences, Bad Soden αhuCD 16 PE Becton Dickinson, San Jose, Californien,
USA
αhuCD 32 PE Caltag Laboratories, Hamburg
αhuCD 64 PE Caltag Laboratories, Hamburg
αhuCD 89, unmarkiert Caltag Laboratories, Hamburg αhu HLA-DR, unmarkiert DAKO A/S, Glostrup, Dänemark
γ1 Maus IgG1 PE Becton Dickinson, San Jose, Californien, USA
Ziege αMaus IgG1 FITC Southern Biotech, Birmingham, Alabama, USA
hu IgG1 Calbiochem, Merck Biosciences, Bad Soden
hu IgG2 Calbiochem, Merck Biosciences, Bad Soden
hu IgG3 Calbiochem, Merck Biosciences, Bad Soden
hu IgG4 Calbiochem, Merck Biosciences, Bad Soden
Maus αhu IgG1 Pharmingen, Hamburg
Maus αhu IgG2 Pharmingen, Hamburg
Maus αhu IgG3 Pharmingen, Hamburg
Maus αhu IgG4 Pharmingen, Hamburg
Ziege α Maus IgG1 FITC Southern Biotech, Birmingham, Alabama, USA
Chrom Pure Goat IgG, whole molecule Jackson Immunoresearch Laboratories, Soham, GB
Chrom Pure Swine IgG, whole molecule Jackson Immunoresearch Laboratories, Soham, GB
22E7 (αIgE-Rezeptor α-chain) Dr.Chizzonite, Hoffmann-La Roche, Nuteley, NY, USA
2.1.11. Releaseassays
Histamin-RIA-KIT Immunotech, Marseille
Leukotrien-EIA-KIT Assay Designs, Inc., Ann Arbor, USA
2.1.12. RNA-Isolation
RNeasy™Mini-Kit Firma Qiagen, Hilden
2.1.13. Reverse Transkription
RQ1 Rnase-free DNAse Promega, Madison, Wisconsin, USA
EDTA Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Reverse Transkriptase SuperSkript III Invitrogen, NV Leek, Niederlande Nukleotide 2,5mM dNTP-Mix Invitrogen, NV Leek, Niederlande Poly-AAA-Primer pd(T)12_18 5`-
PO4,Na+Salt
Pharmacia Biotech, Amersham Biosciences, Freiburg
0,1M DTT Invitrogen, NV Leek, Niederlande
5x First-strand-Buffer Invitrogen, NV Leek, Niederlande
2.1.14. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Nukleotide 2,5mM dNTP-Mix Invitrogen, NV Leek, Niederlande
50mM MgCl2 Invitrogen, NV Leek, Niederlande
Sense-Primer MWG Biotech AG, Ebersberg
Antisense-Primer MWG Biotech AG, Ebersberg
DNA-Polymerase Platinum® Taq DNA- Polymerase
Invitrogen, NV Leek, Niederlande 10x Rxn PCR-Buffer Invitrogen, NV Leek, Niederlande
Agarose Pulver Invitrogen, NV Leek, Niederlande
Ethidiumbromid-Lsg. Invitrogen, NV Leek, Niederlande
2.1.15. Geräte
Kulturschrank Heraeus Instruments, Hanau
Zentrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld
Tischtentrifuge Eppendorf Centrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg Zentrifuge zur Ultrazentrifugation Sigma
2K15
Sigma Laborzentrifugen, Osterode am Harz Durchflußcytometer FACSCalibur, Beckton Dickinson, San Jose,
CA, USA
Thermocycler DNA Engine PTC-100 MJ Research Inc., Reno, Nevada, USA
Materialien und Methoden
28
Cytocentrifuge Cytospin 3 Shandon, Life Sciences Internat.,GB
Wasserbad SW-20C Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach
Elektrophorese-Kammer Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg
2.2. Methoden
2.2.1. Ausgangsmaterial
Zur Gewinnung der humanen intestinalen Mastzellen dienten chirurgische Darmresektate (größtenteils Tumorresektate) aus sämtlichen Darmabschnitten.
Hierbei wurde möglichst kurz nach Resektatentnahme und nach sparsamer Reinigung von restlichem Darminhalt unter fließendem Wasser ein ca. 9-36cm2 großer, transmuraler Anteil aus einem gesunden Resektatabschnitt abgetrennt. Fettbürzel wurden entfernt und das Resektat in Puffer gespült, u.a. um das Gewebe von Blutbestandteilen zu reinigen. Das Resektat wurde über Nacht bei 4°C in Aufbewahrungspuffer gelagert.
2.2.2. Zellisolation
Die Zellisolation fand am darauffolgenden Tag statt. Die Mucosa wurde mit Schere und Pinzette von der Tunica muscularis abpräpariert, um anschließend in 50 ml 0,1 %er ACC Lösung (Angaben für <10g Mucosa) ein bis zwei Mal für 10 Min. bei 37°C im Wasserbad gespült zu werden. Die Schleimhaut sollte so von sämtlichem Mukus befreit werden. Zur Ablösung des Darmepithels schloss sich dann eine 20 min. Wasserbadinkubation in 40 ml Tyrode(1x)+ 7mM EDTA an. Darauf folgte die Zerteilung des Gewebezellverbands mit einer Schere in 20 ml PCH-Lösung. Die dabei entstandenen Mucosa-Stückchen (Größe ca.1x1mm) boten eine idealere Andauungsoberfläche für die darauffolgenden enzymati- schen Verdauungsschritte durch verschieden Proteasen. Nach Filtration der PCH/Gewebe- Suspension durch einen Filter (Porengröße: 250µm) wurden die Gewebestücke in 30 ml PCH-Lösung für 30 Min. im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Nach erneuter Filtration wurde das Filtrat verworfen. Das auf dem Filter verbleibende Gewebe wurde einer 30 min. Was- serbadinkubation in 25ml Collagenase-Lösung unterzogen, die Suspension wurde an- schließend filtriert und das Filtrat aufgefangen. Der letzte Inkubationsschritt wurde einmal wiederholt. Die beiden nun vorliegenden Filtrate wurden vereinigt und in 40ml Medium zur Feinfiltration (Porengröße des Filters: 100µm) aufgenommen. Als Filtrationsprodukt resul- tierte eine gemischte Zellsuspension.
Diese wurde anschließend nochmals abzentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in Mastzell-Komplettmedium aufgenommen. Es fand sich in der Differentialzählung eine Zell- population mit einem Mastzellanteil von durchschnittlich 24± 2% (Mittelwert± SD). Die iso- lierten Zellen wurden anschließend über Nacht ohne Zusatz von Zytokinen kultiviert (4x106 Zellen/ml; 37,7°C; 5,0% CO2).
Materialien und Methoden
30
Abb 2.1
Aufarbeitung einer Darmmucosa
A B
über- nacht
100µm-Filter 250µm-Filter 250µm-Filter 250µm-Filter 250µm-Filter
präp. Isolierung der Mucosa Spühlen in ACC
Tyrode (1x)+
7mM EDTA
Zerteilung der Mucosa in PCH
Inkubation in PCH
1. Collagenase- dauung
2. Collagenase- dauung Filtrat
verwerfen
Filtrat auffangen
Filtrat auffangen
Filtrate vereini- gen
Aufnahme in KM, Kultur
10 min
20 min
30 min
30 min
30 min
Die Schritte der Aufarbeitung einer Darmmucosa (A).Vom chirurgischen Darmresektat zur gemischten Zellsuspension mit einem durchschnittlichen Mastzellanteil von 24± 2% (Mittelwert± SD), (B, Färbung:
May-Grünwald/Giemsa), roter Kreis: Mastzelle nach Isolation Filtrat
verwerfen
2.2.3. Aufreinigung von Mastzellen über Magnetseparation
Die aus der Zellisolation hervorgegangene Zellsuspension wurde mit dem Ziel der Mast- zellanreicherung mittels magnetischer Zellseparation (MACS®-System) über Positivselekti- on weiter aufgereinigt. Die Reaktion des Erstantikörpers Maus αCD 117
(Konzentration 5 ng/ml, alle Angaben für 1x108 Gesamtzellen) fand in 250µl HA+EDTA- Puffer für
15 Min. bei 4°C statt, worauf sich ein Waschschritt in 50ml HA+EDTA-Puffer anschloss.
Nach Abzentrifugation und Aufnahme in 200µl HA+EDTA folgte eine 10 min. Inkubation mit 50µl des an magnetische Beats gekoppeltem Ziege αMaus IgG (unter den gleichen Bedin- gungen wie bei Erstantikörper). Durch Bindung an den Erstantikörper wurden so CD 117+
(c-kit+)-Zellen, d.h. ausschließlich Mastzellen, markiert. Zur Vorbereitung der Selektion und um ein Verstopfen der MACS®-Säule zu verhindern wurde die Zellsuspension nach dem Waschen in 50 ml HA+EDTA über einen ultrafeinen Filter (30µm Porengröße) gegeben, das Filtrat herunterzentrifugiert und in 15ml HA+EDTA-Puffer aufgenommen. Hiermit wurde die MACS®-Säule, die in einen starken Magneten eingespannt worden war, beschickt. Die Negativfraktion (d.h. die Suspension der nicht markierten Zellen) konnte unterhalb der Säule aufgefangen und verworfen werden. Die Positivfraktion wurde nach Herauslösen der Säule aus dem Magneten mit HA+EDTA eluiert. Diese Positivfraktion konnte anschließend abzentrifugiert und zur Bestimmung der Zellzahl und Reinheit (Methoden siehe unten) in Komplettmedium aufgenommen werden.
Zeigte sich an Tag 1 nach Isolation, dass sich die hier beschriebene Aufreinigung nicht an- bot (zu geringe Zellzahl oder zu hoher Anteil toter Zellen), wurden die Zellen unter Zusatz der Zytokine (Konzentrationen s.u.) mit einer Dichte von 2x106Zellen/ml in 6 -well Platten in Kultur gebracht.
Materialien und Methoden
32
Abb 2.2
Aufreinigung der Zellsuspension über das MACS
®(Magnetic Cell Separation)- Verfahren
A B
30µm-Filter
Maus αhu CD117
Waschen in HA+EDTA
Ziege αMaus IgG
Waschen in HA+EDTA
Aufnahme in HA+EDTA
Beschicken der MACS-Säule Filtrat
verwerfen
Eluieren der Positivfraktion mit HA+EDTA
Zentrifugation, Aufnahme in
KM
15 min
10 min 250µl
HA+EDTA/
< 1x 108 Zellen
Zusatz der Zy- tokine
Schematische Darstellung der Aufreinigungsprozedur (A). Lichtmikroskopische, May-Grünwald/Giemsa- gefärbte Darstellung einer aufgereinigten Zellkultur (B). Nach MACS® fanden sich durchschnittlich 60± 25% Mastzellen (Mittelwert± SD)
2.2.4. Langzeitkultur
Zur weiteren Aufreinigung wurden die gewonnen Zellen direkt nach der Zellisolation oder nach dem sich anschließenden MACS® bis zum Erreichen der gewünschten Reinheit kulti- viert und daraufhin für die weiterführenden Versuche verwendet. Die Kultur (37°C; 5,0%
CO2) der Mastzellen fand in Komplettmedium in 6-well-Platten (1-2x105 Zellen/ml) unter Zusatz von SCF (50 ng/ml) statt. Wöchentlich wurde die Hälfte des Mediums ausgetauscht und die Zytokine erneut hinzugefügt. Mit dem MACS® -Verfahren aufgereinigte Zellen hat- ten nach 2-3 Wochen Kultur eine Reinheit von 97-100%. In einigen Versuchen wurden Mastzellen verwand, welche direkt nach Isolation ohne MACS®-Aufreinigung in Kultur ge- bracht worden waren (50ng/ml SCF; 2 x106 Zellen/ml). Diese Zellen hatten nach 4-5 Wo- chen ein Reinheit von 70-98%. Nur Mastzellkulturen die eine Reinheit von mehr als 95%
aufwiesen, flossen in die weiterführenden Untersuchungen ein.
Nach der Vorkultur wurden adhaerente Mastzellen mit einem Zellschaber vom Boden ge- löst, mit einer Pipette resuspendiert, geerntet, abzentrifugiert und das Pellet in das ge- wünschte Volumen Kulturmedium zur Weiterkultur aufgenommen. Während der Versuche erfolgte die Zellkultur in 96-well Platten (4x104 Mastzellen /200µl) unter Zugabe verschie- dener Konzentration von SCF, IL-4 und IFN-γ (genaue Bedingungen s. Ergebnisteil).
2.2.5. Coating mit IgG und IgG-Kreuzvernetzung
Die Vorkultur fand wie unter 2.2.4 beschrieben statt. Zu Beginn des Versuchsprotokolls wurden die Zellen für 24 Stunden auf zwei Kulturbedingungen (SCF oder SCF+IFN-γ) auf- geteilt. Für die sich daran anschließende 24-stündige Inkubation wurden die Zellen mit 1µg/ml Plasma IgG (Ausnahme: Kontrollbedingungen) versetzt. Dieses enthielt die IgG- Isotypen in plasmatypischem Verhältnis.
Hierbei wurden die Zellen in 200µl des in der vorherigen Inkubation verwandten Mediums belassen. Um mögliche präformierte Antikörperaggregate nicht mit einzusetzen, wurden sämtliche Antikörperlösungen vorher bei 20000g für 40 min zentrifugiert. Die Mastzellen wurden anschließend geerntet und ein Mal in PBS gewaschen. Aus einem Teil der Mast- zellen wurde ein Zelllysat in Aqua dest. zur Bestimmung des Gesamthistamingehalts an- gefertigt. Die restlichen Zellen wurden in HACM aufgenommen (200µl/ Bedingung) und anschließend einem αhuIgG (Maus IgG1; 1µg/ml) oder der entsprechenden Isotypkontrol- len (mIgG; 1µg/ml) ausgesetzt. Der Waschschritt in PBS wurde vorgeschaltet, um die Bil- dung von Immunkomplexen zu verhindern, die mit niedrigaffinen FcγRezeptoren hätten interagieren können. Als Positivkontrolle wurden Mastzellen mit dem IgERI kreuzvernet- zenden Antikörper 22E7 (100 ng/ml) inkubiert. Nach 60 min wurde die Reaktion gestoppt und die Zellen in ein Eiswasserbad überführt. Die Überstände wurden abzentrifugiert und bei –80°C gelagert.
Das Kulturmedium, in welchem die erste Inkubation durchgeführt wurde, war mit fetalem Kälberserum versetzt. Darum mußte eine relevante Histaminfreisetzung und Degranulation der Zellen durch Immunkomplexe unter Beteiligung von Serumbestandteilen ausgeschlos- sen werden. Diese hätte unter Umständen eine erfolgreiche gewollte nachfolgende Degra- nulation abgeschwächt. Histaminmessungen des Kulturmediums zeigten keine relevante vorzeitige Degranulation (Daten nicht gezeigt). Aus dem gleichen Grund wurde für den letzten Inkubationsschritt, d.h. während der Kreuzvernetzung, auch proteinfreies HACM gewählt.
2.2.6. Zellzählung und Bestimmung der Kulturreinheit
Durch eine Trypanblau–Färbung (Zellsuspension/Färbelsg.: 1:1) konnte der Anteil an le- benden (ungefärbt) und toten (Blaufärbung) Zellen bestimmt werden. Ein Zählquadrat ent- sprach im Fall der Neubauer-Kammer (2x4 Zählquadrate) einem Suspensionsvolumen von
Materialien und Methoden
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0,05µl und im Fall der Fuchs-Rosenthal-Kammer (2x 16 Zählquadrate) einem Suspensi- onsvolumen von 0,1µl. Es wurden mindestens 100 lebende Zellen bestimmt.
Zur Zelldifferenzierung wurden Cytospins in einer Cytozentrifuge (500RPM/ 3min) angefer- tigt. Es wurden hierfür 80µl Zellsuspension mit einer optimalen Zelldichte von 1-2 x105 Zel- len/ml eingesetzt. Anschließend wurde der Cytospin nach Pappenheim (May- Grünwald/Giemsa) gefärbt. Je nach zu erwartender Mastzelldichte wurden 500-1000 Ge- samtzellen unter dem Mikroskop nach Zelltyp differenziert. So ergab sich der prozentuale Mastzellanteil.
2.2.7. Isolation von PBMCs aus humanem Vollblut
Frisch entnommenes venöses Vollblut wurde mit 0,01 mM/ml EDTA antikoaguliert. Das gesamte Volumen wurde 3:4 mit PBS verdünnt. In einem 12ml-Röhrchen wurden anschlie- ßend 5ml Ficoll mit 5ml der Zellsupension überschichtet und für 40 min bei 300g zentrifu- giert. Der Zellring (bestehend aus Monozyten, Lymphozyten und Basophilen Granulozyten) zwischen den zwei Hauptphasen der Schichtung wurde mit einer Pipette möglichst selektiv abgezogen und in 15ml PBS für den folgenden Zentrifugationswaschschritt (300g, 10min) überführt. Das entstehende Pellet wurde in 2 ml Komplettmedium bzw. in PBS aufgenom- men. Es schlossen sich der Zähl- und Differenzierungsschritt an. Nach Verdünnung auf die gewünschte Zelldichte wurden die Zellen in RLT-Puffer aufgenommen.
2.2.8. Proliferationsassay
Aussage über das Maß der Zellproliferation konnte über den Einbau von H3-markiertem Thymidin in die sich reduplizierende DNA erlangt werden. Hierfür wurden 1x 10-6 Ci H3- Thymidin-Lösung zu 200µl Zellsuspension jeder Bedingung und zu den Leerwerten (200µl Medium ohne Zellen) gegeben. Nach 12 stünd. Inkubation wurde 3x in PBSs gewaschen, nach Abzentrifugation das Pellet in 400µl H2O lysiert und in die mit 4ml Szintillationsflüssig- keit gefüllten Szintillationsröhrchen überführt. Im β-Counter wurden anschließend die CPM (Counts Per Minute) gemessen.
2.2.9. Apoptose-Assay
Unter zu Hilfenahme des Caspase-3/-7-Substrates (Z-DEVD-Rhodamine110) des oben aufgeführten Assays konnte photometrisch die Aktivität der Caspase-Kaskade ermittelt werden. Hierfür wurde das Substrat 1:100 mit Apo-ONE™Homogenious Caspase-3/-7- Buffer verdünnt und anschließend in gleichem Volumen zur Zellsuspension gegeben und 2h inkubiert. Die OD wurde bei 485nm bestimmt. Je höher die OD, umso mehr fluoreszie- rendes Substrat war entstanden und umso aktiver waren obengenannte Enzyme.
2.2.10. mRNA-Isolierung
Die mRNA konnte aus Lysaten (Lyse durch 350µl RLT+0,001%β-Mercaptoethanol-Puffer) der zum Pellet zentrifugierten Zellen jeder Bedingung isoliert werden. Hierfür stand das RNeasy™Mini-Kit (Firma Qiagen, Hilden) zu Verfügung.
Das RLT-Lysat wurde zur Verbesserung der Bindungseigenschaften der Säule 1:2 mit 70%
Ethanol verdünnt und dann auf eine Säule überführt. Letztere hielt durch ihre Silika-Gel- Membran die (Gesamt-)RNA zurück. Es schlossen sich 3 Zentrifugations-Waschschritte mit Puffern an (1x 700µl RW1-Puffer, 2x 500µl RPE-Puffer), bevor die RNA mit 45µl RNAse freiem Wasser über Zentrifugation eluiert werden konnte.
2.2.11. Reverse Transkription (RT)
Die eingesetzte Menge RNA lag bei ca.1µg Gesamt-RNA in 19µl Eluat der obengenannten Säule. Der RT ist eine DNAse-Digestion durch RNAse-freie DNAse (1U/µl) für 15 min bei 37°C vorgeschaltet. Zur RNA-Denaturierung (10 min, 70°C) wurden 6,25x10-3M EDTA zu- gesetzt. Die RNA, 1x10-10M Nukeotid-Mischung (dNTP-Mix), als Poly-AAA-Primer, Oligo- dT, 5x10-5M DTT und First-strand-Puffer wurden mit der Reversen Transkriptase (2U/µl) bei 49°C für 60 min zur Reaktion gebracht.
2.2.12. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Pro Bedingung wurden 2,5x 10-3M Nukleotid-Mischung, 2,5x10-2M Magnesiumdichlorid, 5x 10-3M Sense-Primer, 5x 10-3M Antisense-Primer, 2,4µl 10x PCR-Buffer mit 1,5µl RT- Produkt zur Amplifikation durch die Polymerase (0,01U/µl) angesetzt. Im Thermocycler wurden Dauer und Temperatur der Denaturierungs- Annealing- und Synthesephase und der Endverlängerung (s.u.) der zu amplifizierenden DNA angepasst.
Die entstandenen Fragmente wurden in einem 0,005%Ethidiumbromid-1%Agarose-Gel elektrophorestisch aufgetrennt und durch Fluoreszenzlicht sichtbar gemacht.
2.2.13. Primersequenzen
Gen Primer Sequenz
GDH Sense-Primer 5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GC-3'
Antisense-Primer 5`-GAG GCA GGG ATG ATG TTC TG-3`
IFN-γRI Sense-Primer 5`-CCA TCT CGG CAT ACA GCA AA-3`
Antisense-Primer 5`-CTC AGT GCC TAC ACC AAC TA-3`
FcγRI Sense-Primer 5`-CTT CTA CAT GGG CAG CAA GA-3`
Antisense-Primer 5`-GTT CTC TGG GTG ACA ATA CG-3`
FcγRIIa Sense-Primer 5`-CAG CAT GGG CAG CTC TTC-3`
Antisense-Primer 5`-CAC ATG GCA TAA CGT TAC-3`
FcγRIIb1/2 Sense-Primer 5`-ATT GTT GCT GCT GTA GTG GCC-3`
Antisense-Primer 5`-GAA ACC TTC TCT TTT GGA ACT-3`
FcγRIIc Sense-Primer 5`-TCT AGA TGA CCA CAT GGC ATA ACG-3`
Antisense-Primer 5`-CCT GGA CGT CAA ATG ATT GCC ATC-3`
FcγRIII Sense-Primer 5`-CTT CTG GGA TAA GTG GAC TC –3
Antisense-Primer 5`-CTT CAT GGT TAG TGG TTC GTC-3
Materialien und Methoden
36
2.2.14. Bedingungen der Amplifikationszyklen
Zu Abb. 3.1Gen Temperatur/Zeit
Anzahl der Zyklen Denaturierungsphase Annealingphase Synthesephase Endverlängerung
GDH 94°C/ 30s 54°C/ 45 s 72°C/ 120s 72°C/ 120s 28
IFNγRI 94°C/ 30s 54°C/ 45 s 72°C/ 120s 72°C/ 120s 28
Zu Abb. 3.10 Donor 1
Gen Temperatur/Zeit
Anzahl der Zyklen Denaturierungsphase Annealingphase Synthesephase Endverlängerung
GDH 94°C/ 30s 54°C/ 45 s 72°C/ 120s 72°C/ 120s 36
FcγRI 94°C/ 60s 56°C/ 80s 72°C/ 70s 72°C/ 420s 39
FcγRIIa 94°C/ 60s 58°C/ 80s 72°C/ 70s 72°C/ 420s 39
FcγRIIb 94°C/ 60s 58°C/ 80s 72°C/ 70s 72°C/ 420s 37
FcγRIIc 94°C/ 60s 58°C/ 80s 72°C/ 70s 72°C/ 420s 39
FcγRIII 94°C/ 60s 58°C/ 80s 72°C/ 70s 72°C/ 420s 35
Zu Abb. 3.10 Donor 2
Gen Temperatur/Zeit
Anzahl der Zyklen Denaturierungsphase Annealingphase Synthesephase Endverlängerung
GDH 94°C/ 30s 54°C/ 45 s 72°C/ 120s 72°C/ 120s 38
FcγRIIb 94°C/ 30s 58°C/ 45 s 72°C/ 120s 72°C/ 120s 37
2.2.15. Oberflächenexpression
Hierzu wurden SCF bzw. SCF+IL-4 vorkultivierte Zellpopulationen zusätzlich 72h ± IFN-γ kultiviert. Pro Bedingung wurden 5x 104 Zellen mit einer Mindestreinheit von 97% einge- setzt. Die Zellen wurden für 30 Min in 100µl FACS-Puffer bei 4°C mit den Primärantikörpern und, wenn notwendig, in einem zweiten Schritt mit den Sekundärantikörpern inkubiert. Die Analyse erfolgte mit PE-makierten Ak gegen huCD16, huCD32, huCD64 (jeweils 8µg/ml) oder einem entsprechendem PE-markierter IgG1-Kontroll-AK (8µg/ml). Zur Detektion von FcαR, FcεR und HLA-DR (jeweils 20µg/ml) wurden nicht-makierte Ak oder ein entspre- chender Isotyp-Kontoll-AK eingesetzt. Die Detektion erfolgte durch einen zweiten Antikör- per (FITC-markierter αIgG1-Antikörper).
Die Messung wurde mit einem FACSCalibur (Becton Dickinson) durchgeführt.
2.2.16. IgG-Bindungsstudien
Unter den gleichen Bedingungen wie in 2.2.15 beschrieben, wurde die Erstinkubation mit humanem IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 (jeweils 500µg/ml) vorgenommen. In einer zweiten identischen Inkubation wurde dann nach dem ersten Waschschritt mit αIgG1 FITC, αIgG2 FITC, αIgG3 FITC, αIgG4 FITC und einem Maus IgG1 FITC- Kontrollantikörper markiert.
