Wirkung von Neurotrophinen auf humane intestinale Mastzellen

Aus der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie Zentrum Innere Medizin

Direktor: Prof. Dr. med. M.P. Manns

Wirkung von Neurotrophinen auf humane intestinale Mastzellen

Dissertation

Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Jörn Hoppe Aus Hamburg

Hannover, 2005

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 20.09.2006

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. D. Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. med. S.C. Bischoff

Referent: Prof.`in Dr. med. Miriam Wittmann

Koreferent: Priv.-Doz. Dr. Heike Nave

Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2006

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Reinhold Ernst Schmidt Prof.`in Dr. Anke Schwarz Prof.`in Bettina Wedi

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 6

1.1 Mastzellen 6

1.1.1 Morphologie, Verteilung 6

1.1.2 Mastzellheterogenität 7

1.1.3 Entwicklung, Wachstum 8

1.1.4 Aktivierung, Mediatoren 9

1.2 Mastzellen und Nerven 12

1.3 Neurotrophine 14

1.3.1 Nerve Growth Factor (NGF) 15

1.3.2 Neurotrophin-3 (NT-3) 17

1.3.4 Neurotrophin-Rezeptoren 18

1.4 Fragestellung 21

2. Methoden 22

2.1 Materialien/Reagenzien 22

2.2 Isolation von Zellen aus der Darmschleimhaut 25

2.3 Mastzellanreicherung durch Magnetseparation 27

2.4 Zellzählung und Zelldifferenzierung 28

2.5 Zellkultur 28

2.6 Mediatormessungen 29

2.7 Immunzytochemie 30

2.8 RNA-Isolation und PCR 31

2.9 Westernblot 33

2.10 Statistik 34

3. Ergebnisse 35

3.1 Produktion von mRNA für Neurotrophin-Rezeptoren 35

3.2 Proteinnachweis für Trk-Rezeptoren 36

3.3 Effekte von Neurotrophinen auf das Überleben menschlicher Darmmastzellen 39

3.3.1 Kein Effekt von NGF 39

3.3.2 Effekte von Neurotrophin-3 (NT-3) 42

3.3.3 Keine Veränderung des Überlebens durch Neurotrophin-4 (NT-4) 44 3.4 Untersuchung der überlebensfördernden Effekte von NT-3 46 3.5 Regulation der Mediator-Freisetzung durch Neurotrophine 50

3.5.1 Einfluss von NGF 50

3.5.2 Auswirkungen von NT-3 53

3.6 Ausblick: Neurotrophin-Produktion durch Mastzellen 55

4. Diskussion 57

4.1 Humane intestinale Mastzellen 57

4.2 Neurotrophin-Rezeptoren 58

4.3 NGF und Mastzellen 60

4.4 Neurotrophin-3 und humane intestinale Mastzellen 61

5. Zusammenfassung 64

6. Referenzen 65

7. Lebenslauf 85

8. Erklärung 86

9. Danksagung 87

Abkürzungsverzeichnis ACC Acetylcystein

BDNF Brain-derived Neurotrophic Factor βFGF basic Fibroblast Growth Factor CNTF Ciliary Neurotrophic Factor

cDNA Komplementäre Desoxyribonukleinsäure DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzym-linked immunosorbent assay FACS Fluorescence-activated cell sorting Fc Konstante Region der Immunglobuline Fcε-R Immunglobulin E Rezeptor

FCS Fetal calf serum

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase HMC-1 Humane Mastzelllinie 1

IgE Immunglobulin E IgE-R Immunglobulin E Rezeptor IgG Immunglobulin G

IL Interleukin

IFN-γ Interferon-γ

LIF Leukaemia Inhibitory Factor LTC4 Leukotrien C4

MACS Magnetic beads-activated cell sorting mAk monoklonaler Antikörper

MC Mastzellen

MMC Mucosal mast cells

mRNA MessengerRibonukleinsäure

MW Mittelwert

NGF Nerve growth factor NPY Neuropeptid Y NT-3 Neurotrophin-3 NT-4 Neurotrophin-4

p Irrtumswahrscheinlichkeit pAk polyklonaler Antikörper PBS Phosphate-buffered saline

PBMC Peripheral blood mononuclear cells PCR Polymerasekettenreaktion

p75 low affinity NGF-receptor RIA Radioimmunoassay RNA Ribonukleinsäure RPMC Rat peritoneal mast cells

RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion SCF Stem cell factor (c-kit ligand)

SD Standardabweichung

SP Substanz P

TGFβ Transforming Growth Factor β TNF-α Tumornekrosefaktor-α

Trk-A Tyrosinkinase-A (high affinity NGF-receptor) Trk-B Tyrosinkinase-B

Trk-C Tyrosinkinase-C

1. Einleitung

1.1 Mastzellen

1.1.1 Morphologie, Verteilung

Als erstes wurde die Mastzelle 1877 von Paul Ehrlich beschrieben. Der Reichtum an prominenten, intrazytoplasmatischen Granula ließ ihn diesen Zelltyp als `gemästet`

beschreiben (1). Diese charakteristischen Granula verursachen nach der Färbung mit basischen Farbstoffen wie Toluidin oder Giemsa das Phänomen der Metachromasie, das heißt bei Betrachtung einen Wechsel der Farberscheinung (2, 3). Hier besteht eine morphologische Ähnlichkeit zu basophilen Granulozyten. Mastzellen besitzen jedoch einen rundlich-ovalen Zellkern, der im Gegensatz zum basophilen Granulozyten nicht segmentiert oder gelappt ist (4). Im Gewebe stellen sich Mastzellen mikroskopisch oval bis spindelig, oder dendritisch verzweigt, dar (2).

Reife Mastzellen sind gewebeständig. Unter physiologischen Bedingungen finden sich in der Blutzirkulation keine reifen Mastzellen (4). Aus Knochenmarkstammzellen entwickeln sich unter Einfluss von SCF CD34-positive Mastzellvorläuferzellen, die im peripheren Blut zirkulieren, bevor sie in ihr Zielorgan einwandern (5, 6). Diese Vorläuferzellen haben jedoch, durch das Fehlen von metachromatischen Granula und fehlende Expression des IgE- Rezeptors, noch nicht die Eigenschaften reifer Gewebemastzellen (7, 8). Die Ausreifung im Gewebe findet dann im organspezifischen Milieu und unter Einfluss von eosinophilen Granulozyten, Fibroblasten und Endothelzellen statt (2, 9).

Mastzellen lassen sich in vielen unterschiedlichen Organen, wie beispielsweise Uterus, Pankreas, Herz und Niere, aber auch im Hirn, nachweisen (2, 4, 10). In weitaus größerer Zahl finden sich Mastzellen aber an Orten, die Kontakt zur Außenwelt haben und damit eine Barrierefunktion erfüllen, wie die Haut, und die Schleimhäute des Atem- und Verdauungstraktes (2). Im menschlichen Darm hat die Lamina propria mucosae mit 2-3% die höchste Mastzelldichte, gefolgt von der Tela submukosa mit einer Mastzelldichte von 1%.

Nur noch vereinzelt finden sich Mastzellen in der Tunica muscularis und der Serosa (11, 12).

Überdurchschnittlich häufig sind Mastzellen in enger räumlicher Nähe zu Blutgefäßen, Epithelien und insbesondere Nerven lokalisiert (11, 13, 14).

Eine wichtige Rolle spielen Mastzellen außer bei der Typ I Allergie noch bei vielen anderen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. So wird eine Beteiligung bei

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der Abwehr von Bakterien und Parasiten, bei der Angiogenese, bei fibrotischen Prozessen, chronischer Entzündung und Tumorentwicklung beschrieben (2, 11, 12, 15, 16).

1.1.2 Mastzellheterogenität

Schon früh zeigte sich bei Mastzellen sehr heterogene Merkmalsausprägung hinsichtlich Morphologie, Biochemie und Funktion. Ausgehend von Nager-Mastzellen wurden zwei Subtypen klassifiziert. Zum einen den Bindegewebs-Typus (connective tissue mast cell, CTMC), der in der Haut und im Peritoneum zahlenmäßig überwiegt. Zum anderen den Schleimhaut-Typus (mucosal mast cell, MMC), der in der Mukosa von Darm und Lunge vorkommt (2, 17, 18). Die MMC ist mit 5-10 µm kleiner als die CTMC ( 10-20 µm), hat einen geringeren Histamingehalt, produzieren aber vermehrt Prostaglandin D2. MMC produzieren Leukotrien C4, CTMC dagegen nicht. Beide Typen lassen sich über den IgE-Rezeptor aktivieren, MMC lassen sich jedoch im Gegensatz zu CTMC nicht durch Substanzen wie Compound 48/80 oder Substanz P aktivieren, auch können MMC nicht wie CTMC durch Cromoglycinsäure inhibiert werden. Für MMC besteht zudem eine Abhängigkeit von T-Zell – Zytokinen (2, 19).

Diese Daten aus dem Nagermodell lassen sich nicht ohne Einschränkungen auf das humane System übertragen. Menschliche Mastzellen werden durch ihren Gehalt an Proteasen unterschieden (20, 21). Mastzellen, die nur die Protease Tryptase exprimieren, gehören zum MC_T-Subtyp, finden sich überwiegend in der Mukosa von Respirations- und Gastrointestinaltrakt (10, 20). Sie entsprechen am ehesten den MMC der Nager. Mastzellen, die sowohl Tryptase als auch Chymase exprimieren, werden unter dem Begriff MCTC

zusammengefasst, sind vorwiegend in den Tonsillen, in der Haut und der Tela submukosa des Verdauungstraktes lokalisiert (10, 20), und sind am ehesten dem CTMC der Nager vergleichbar. Ähnlich den MMC der Nager, sind menschliche Tryptase-positive Mastzellen bei Patienten mit insuffizienter T-Lymphozyten – Funktion nur in stark verminderter Zahl in der Schleimhaut des Gastrointestinaltraktes nachzuweisen, die Anzahl der MCTC veränderte sich nicht (22). Unterschiede gibt es weiterhin bei der Ultrastruktur der Mastzellgranula, wo ringartige Figuren, so genannte `Scroll-Formationen` den MCTC zugeschrieben werden (23, 24). Aus zu fast 100% MCTC bestehende Hautmastzellen reagieren auf Substanzen wie Compound 48/80, poly-L-Lysin, Morphin und Substanz P mit einer Mediatorfreisetzung, die aus über 90% MCT bestehenden Lungenmastzellen jedoch nicht (25). Die nur bedingt

sinnvolle Unterteilung humaner Mastzellen in MC_TC und MC_T zeigt sich in der Feststellung, dass Mastzellen aus Nasenschleimhaut und Darmmukosa, -submukosa, die eine Mischung beider Zellpopulationen darstellen, nicht durch die oben genannten Substanzen zu aktivieren sind (25). Bei einer Subtypen-spezifischen Reaktionsweise müsste ein Teil der Zellen aktivierbar sein. Des Weiteren wurden bei der Synthese von Lipidmediatoren wie Leukotrienen und Prostaglandin D2 nach Stimulation große Unterschiede zwischen Mastzellen aus Herz, Haut, Lunge und Darm beobachtet (26). Ein identischer Phänotyp zeigte sich wiederum bei der Untersuchung der Oberflächenproteine von Mastzellen aus unterschiedlichen Organen (27, 28). Die These, dass die Subtypenzugehörigkeit eher einem vom umgebenden Milieu abhängigen Funktionszustand entspricht und die bekannte Klassifikation das Ausmaß der Mastzellheterogenität nur unzureichend abbildet, wird unter anderem durch Studien gestützt, die einen Subtypenwechsel von Mausmastzellen in Abhängigkeit von Umweltbedingungen zeigen konnten (29-31).

1.1.3 Entwicklung, Wachstum

Die überragende Bedeutung für Entwicklung, Wachstum und Überleben von Mastzellen hat der Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF). Frühe Studien mit Mäusen, die Mutationen im W- oder SI-Genlokus aufwiesen, deckten neben vielen Defiziten auch das nahezu komplette Fehlen von Gewebemastzellen auf (32, 33). Später wurde gezeigt, dass der W-Lokus für die Rezeptortyrosinkinase c-kit und der SI-Lokus für den Stammzellfaktor (SCF oder c-kit-ligand) kodiert (34, 35). SCF wird membranständig von Fibroblasten, eosinophilen Granulozyten, Stroma- und Endothelzellen exprimiert, kommt aber auch in einer biologisch aktiven, löslichen Form vor (36, 37). Verschiedene Vorläuferzellen aus dem Knochenmark werden durch SCF zu Wachstum und Differenzierung angeregt, nur Mastzellen haben aber auch in ihrer reifen Form eine starke Expression des SCF-Rezeptors c-kit (38).

Vorläuferzellen aus fetaler Leber, peripherem Blut, Nabelschnurblut und Knochenmark entwickeln sich unter Einfluss von SCF zu Mastzellen (7, 39-41). Bei unreifen humanen Mastzellen der Linie HMC-1 wurde eine aktivierende Mutation des Gens für c-kit nachgewiesen, diese Zellen proliferieren daher ohne die Wirkung von Wachstumsfaktoren (42). Die essentielle Bedeutung von SCF zeigt sich auch darin, dass reife menschliche Mastzellen aus Lunge und Darm nur in Anwesenheit von SCF in Kultur zu halten sind (9, 43- 45). SCF wirkt in niedrigen Konzentrationen dem programmierten Zelltod entgegen und

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damit überlebensfördernd, in hohen Konzentrationen werden auch bei reifen Mastzellen noch proliferative Effekte bewirkt (43).

Weitere hauptsächlich für Nager beschriebene Wachstums- und Entwicklungsfaktoren sind IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 und Nervenwachstumsfaktor (NGF) (46-48), die im Wesentlichen aber nur bei gleichzeitiger Anwesenheit von SCF eine Wirkung erzielen. Bei menschlichen Mastzellen sind die Studienergebnisse in Abhängigkeit von der Mastzellherkunft und dem verwendeten Kultursystem sehr viel heterogener, einige Beobachtungen aus dem Nagermodell konnten nachvollzogen werden (49-53). Interessant ist hierbei zum Einen der Befund, das reife menschliche Mastzellen aus dem Darm im Gegensatz zu Mastzellen aus anderen menschlichen Geweben den Rezeptor für IL-3 exprimieren und verschiedene biologische Effekte, wie ein gesteigertes Überleben bei Zusatz von IL-3 zu SCF-kultivierten Mastzellen zu observieren ist (53). Noch deutlichere Unterschiede zeigt die Rolle von IL-4 für verschiedene Mastzellpopulationen. Für Vorläuferzellen aus fetaler Leber, Knochenmark, Nabelschnurblut und peripherem Blut wurde eine Hemmung der SCF- abhängigen Mastzellentwicklung unter Einfluss von IL-4 beschrieben, der IgE-Rezeptor sowie die Protease Chymase jedoch verstärkt exprimiert (54-56). Eine schwache wachstumsfördernde Wirkung wurde bei sich aus Nabeschnurblut differenzierenden Mastzellen nachgewiesen (49, 52). Im Zusammenspiel mit SCF ist IL-4 für reife humane Mastzellen aus Lunge und Darm hingegen ein äußerst starker Proliferationsfaktor (45, 51).

Inhibitorische Wirkungen auf Mastzellwachstum und –entwicklung sind im humanen System für Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Interferon- γ und Transforming Growth Factor (TGF)-β1 beschrieben worden (57-59).

1.1.4 Aktivierung, Mediatoren

Die klassische Stimulation von Mastzellen erfolgt über den IgE-Rezeptor (Fcε- Rezeptor I). Dieser ist in vivo immer mit IgE-Immuglobulinen beladen, die im Rahmen einer Aktivierung durch Allergene beziehungsweise polyvalente Antigene quervernetzt werden (2, 11, 60), woraufhin eine ganze Reihe von präformierten und neusynthetisierten Mediatoren freigesetzt wird (61). Weiterhin können Mastzellen über an Fcγ-Rezeptoren gebundene IgG- Immunglobuline antigenspezifisch aktiviert werden (62).

Auch Immunglobulin – unabhängige Aktivierungswege existieren. So stimuliert SCF Mastzellen zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren und verstärkt die IgE-abhängige

klassische Aktivierung (63-65). Vorwiegend im Maus- bzw. Rattenmodell gewonnene Daten zeigen eine Stimulierbarkeit durch basische Substanzen wie Compound 48/80 und Morphine, bestimmte Neuropeptide (NP-Y, VIP, Substanz P), Anaphylatoxin C5a, bakterielle Produkte wie FimH und Lipopolysaccharid, Dextrane, und verschiedene Zytokine und Chemokine wie beispielsweise IL-3, IL-5, MIP-1α und GM-CSF (2, 11, 60, 61, 66). Beispielhaft für die Mastzellheterogenität seien humane Hautmastzellen aufgeführt, deren Mediatorfreisetzung im Gegensatz zu humanen Lungen- und Darmmastzellen durch C5a, Substanz P und Compound 48/80 getriggert wird (20, 25, 61, 67). Einfluss auf die Mediatorfreisetzung nach IgE-Rezeptor – Quervernetzung hat außerdem die Anwesenheit von Zytokinen. So verstärkt IL-4 zusätzlich zu SCF die IgER-abhängige Ausschüttung von Histamin und Leukotrien C4 bei humanen intestinalen Mastzellen (51).

Inhibitorische Effekte auf Mediatorfreisetzung und Mastzellwachstum zeigten sich für reife menschliche Mastzellen bei Kultur mit TGF-β1 (59). Bekannte pharmakologische Inhibitoren von Mastzellen sind Mastzellstabilisatoren (z.B. Chromoglycinsäure) und Immunsuppressiva wie Cyclosporin A, FK506 und Glukokortikoide (68-70).

Zu den aus Granula freigesetzten präformierten Mediatoren gehören biogene Amine wie Histamin, Proteoglykane wie Heparin und Chondroitinsulfat, neutrale Proteasen wie Chymase, Tryptase und Carboxypeptidase, sowie Tumornekrosefaktor (TNF)-α (2, 11, 60).

Zu den nach Aktivierung neusynthetisierten und anschließend freigesetzten Mediatoren gehören sowohl Lipidmediatoren wie Leukotriene und Prostaglandin D2, als auch diverse Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren (2, 11, 71).

Daraus resultiert eine Vielzahl an biologischen Effekten. Histamin und die Lipidmediatoren vermitteln beispielsweise die typischen Symptome einer allergischen Sofortreaktion wie Rötung, Schwellung und Juckreiz. Allerdings haben sie auch vasodilatatorische Eigenschaften und regulieren im Darm neurophysiologische Prozesse wie Schleim- und Elektrolytsekretion, Muskelkontraktion und Peristaltik (2, 11, 72). Die Proteasen fördern unter anderem den Abbau von Neuropeptiden, Fibrinogen und Kininogen, spielen eine Rolle bei der Regulation von Fibroblasten und Endothelzellen, und fördern die Schleimsekretion(2, 11). Die Proteoglykane führen neben einer Antikoagulation zu einer Inhibition der Kallikrein- und Komplementaktivierung und binden bzw. stabilisieren Zytokine, Histamin und Proteasen. Die Lipidmediatoren modulieren neurophysiologische Abläufe, verursachen eine Vasodilatation, und sind Chemotaxine für Granulozyten und Lymphozyten (2, 11). Eine zentrale Rolle bei immunologischen Prozessen spiegelt sich in der Vielzahl von produzierten Zytokinen wider (2, 11, 72). Desweiteren gehören Mastzellen zu

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den Antigen-präsentierenden Zellen (73), sie fördern die Produktion von IgE durch B- Lymphozyten und sind sogar imstande, Bakterien zu phagozytieren (60, 72).

Zusammengefasst unterstreichen diese Daten die wichtige Rolle der Mastzelle bei immunologischen und nicht-immunologischen Gewebeprozessen.

Die nachstehende Tabelle gibt einen Überblick über die wichtigsten Mediatoren humaner Mastzellen.

Mediatoren menschlicher Mastzellen

Präformierte Mediatoren

Biogene Amine: Histamin

Proteoglykane: Heparin, Chondroitinsulfat

Neutrale Proteasen: Chymase, Tryptase, Carboxypeptidase Tabelle 1

Neusynthetisierte Mediatoren

Lipidmediatoren: Prostaglandin D2, Leukotriene (LTC4/D4/E4) Wachstumsfaktoren: β-FGF, VEGF, NGF

Chemokine: MIP-1α, MIP-1β, MCP-1

Zytokine: IL-1,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-13,IL-16,IL-18,IFN-γ,TNF-α,TGF-β1

1.2 Mastzellen und Nerven

Periphere Nervenzellen verzweigen sich in alle Organe des Körpers und zielen dort auf verschiedene Typen immunkompetenter Zellen. Funktionelle Auswirkungen solcher Co- Lokalisation wurde für Fibroblasten, dendritische Zellen, Epithel- und Endothelzellen, Stromazellen des Knochenmarks, Eosinophile, Basophile, Makrophagen, Lymphozyten und Mastzellen beobachtet (74).

Eine auffällige räumliche Nähe von Mastzellen und Nerven wurde schon vor mehr als einem Jahrhundert von Paul Ehrlich, dem Entdecker der Mastzelle, beschrieben und seither durch viele Arbeiten bestätigt (13, 75, 76). Dem Phänomen der Mastzell-Nerven-Assoziation nahmen sich einige morphologische Studien an und fanden Beweise für engsten Kontakt mit Nerven bis hin zur Innervation von Mastzellen in Haut, Lunge, Darm, synovialem und lymphatischem Gewebe (77-79). Weiterhin sind Mastzellen häufig in peripheren Nerven, in autonomen Ganglien und in verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems mit bevorzugter Lokalisation im Thalamus, zu finden (77, 80, 81). Im menschlichen Gastrointestinaltrakt waren, abhängig von der anatomischen Region , 47 – 77 % aller mukosalen Mastzellen in enger räumlicher Beziehung zu Nerven (höchste Inzidenz in der Appendix), auch Formationen mit direktem Kontakt der Zellmembranen wurden beobachtet (13). Eine klinische Bedeutung ergibt sich aus der Beobachtung, dass eine degenerative Transformation enterischer Nerven bei Erkrankungen wie Morbus Crohn, Colitis ulzerosa und Reizdarmsyndrom sowohl in entzündeten wie auch in nichtentzündeten Bereichen stattfindet (14, 82-84), und Mastzellen dort akkumulieren und aktiviert in enger räumlicher Nähe zu Nerven lokalisiert sind (13, 85, 86).

Im Gastrointestinaltrakt müssen alle physiologischen Prozesse, wie Transport des luminalen Inhalts, Absorption von Wasser, Ionen und Nährstoffen, Sekretion von Ionen und Wasser, Regulation der Blutversorgung, Abwehr von Pathogenen oder Induktion von Toleranz gegenüber nicht-pathogenen Antigenen, kontrolliert und aufeinander abgestimmt werden. Dazu besitzt der Darm geschätzte 10⁸ untereinander vernetzte Neuronen, die nach dem Gehirn größte Ansammlung von Nervenzellen des Körpers. Dieser Darmteil des Nervensystems kann viele Funktionen unabhängig von höheren Kontrollzentren wie dem zentralen Nervensystem ausführen, sogar ex vivo, wenn aus dem Körper isoliert. Dies führte zu dem Ausdruck `Enterisches Nervensystem` als drittem, unabhängigen Teil des Autonomen Nervensystems (87). Da dieses Netzwerk von Nervenzellen strukturell und funktionell höheren Integrationszentren wie im Gehirn oder Rückenmark ähnelt, wurde das enterische

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Nervensystem auch als `lokales Mini-Gehirn` oder `enterisches` beziehungsweise `zweites Gehirn` bezeichnet (88, 89).

Es gibt vielerlei Hinweise, dass sich Mastzellen und Nervenzellen gegenseitig beeinflussen. Eine wichtige Rolle hierbei spielen die Neurotrophine. So induzieren BDNF und CNTF beispielsweise eine Histaminausschüttung bei isolierten Rattenmastzellen aus dem Thalamus (90). LIF, bekannt als Faktor für die Differenzierung cholinerger Neurone und Promoter einer Produktion von SP, wird von Mastzellen der Ratte produziert (91, 92). Im nächsten Kapitel wird auf die Neurotrophine noch näher eingegangen. Neben den Neurotrophinen haben viele von Mastzellen produzierte Mediatoren wie Histamin, Leukotriene, Prostaglandine, Zytokine (wie ßFGF, PDGF, TGF-ß, IL-1, IL-5 und IL-9) und die Proteasen Chymase/Tryptase, ebenfalls neurotrophe, neuromodulatorische oder Transmitter - degradierende Eigenschaften (11, 93-96).

Für die Neuropeptide NPY, SP, Somatostatin, VIP und Neurotensin zeigte sich eine ausgeprägte degranulierende und histaminliberierende Wirkung auf peritoneale Rattenmastzellen (97, 98). Auch humane Mastzellen aus der Haut reagierten auf Stimulation mit SP, VIP, Somatostatin und PACAP mit einer Histaminausschüttung (99, 100). Ein weiterer Hinweis für eine heterogene Regulation von Mastzellen wird durch die Beobachtung gestützt, dass humane mukosale Mastzellen aus Lunge und Darm überhaupt nicht, und intestinale mukosale Rattenmastzellen von den oben genannten Neuropeptiden nur auf SP, reagierten (98, 99). Eine Arbeit zeigte interessanterweise eine Histaminfreisetzung durch SP nur bei intestinalen Gewebsproben von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, und nicht bei der gesunden Kontrollgruppe (101).

Der Einfluss des autonomen Nervensystems auf Mastzellen konnte in vielen Studien untermauert werden. Die Mehrheit der Arbeiten zeigt einen stimulierenden Effekt von Acetylcholin auf die Histaminausschüttung und Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (102- 104). Durch Stimulation parasympathischer Nerven konnte die Degranulation von Mastzellen induziert werden (105, 106).

In Versuchen mit Katecholaminen wie Adrenalin und Noradrenalin, sowie Adrenorezeptoragonisten, konnten in der überwiegenden Mehrheit inhibierende Wirkungen auf eine Mastzellaktivierung demonstriert werden (107-109).

Bekanntermaßen führt die Interaktion von intestinalen Mastzellen, intrinsischen Nerven und Epithelzellen zu einer Regulation der intestinalen Ionensekretion, eine Aktivierung von Mastzellen durch bakterielle Antigene, Nervenstimulation oder IgE- Rezeptor-Quervernetzung äußerte sich letztendlich in einer erhöhten mukosalen Sekretion von

Ionen (110-113). Eine Kontrolle der intestinalen Nerven-Mastzell-Achse durch höhere Zentren des Nervensystems konnte bei Ratten gezeigt werden. Akuter oder chronischer Stress führte, ebenso wie die intrazerebrale Injektion von Corticotropin-Releasing-Factor (CRF), zu einer erhöhten intestinalen Permeabilität, Schleim- und Flüssigkeitssekretion (114-116).

Einen Einfluss des zentralen Nervensystems impliziert auch die Feststellung, dass sich eine Degranulation von peripheren Mastzellen nach Pavlow klassisch konditionieren lässt (117).

Bei Hunden zeigte sich, dass hypothalamische Mastzellen nach Antigenkontakt die hypothalamisch-hypophysär-adrenale Achse aktivieren können, eine erhöhte Kortisolsekretion war die Folge (118).

Insgesamt zeigen diese Daten eine wichtige Rolle der Mastzell-Nerven-Interaktion bei vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, insbesondere im Gastrointestinaltrakt.

1.3 Neurotrophine

Die Neurotrophine sind eine Familie von strukturell und funktionell verwandten Polypeptiden mit bis zu 50 % homologen Aminosäuresequenzen. Während der Entwicklung und im entwickelten Nervensystem induzieren Neurotrophine Proliferation, Differenzierung und Überleben von Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems (119, 120).

In jüngerer Zeit gibt es eine zunehmende Evidenz für verschiedenste biologische Effekte von Neurotrophinen auf Zellen des Immunsystems, mit einer Beteiligung bei autoimmunen, neurodegenerativen und allergischen Erkrankungen, sowie bei einem breitem Spektrum von Entzündungsreaktionen mit so unterschiedlichen Prozessen wie beispielsweise Wundheilung, Psoriasis, Asthma und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (121-125).

Eine protektive Rolle zweier Neurotrophine, NGF und NT-3, zeigte sich bei der experimentell-induzierten Entzündung des Darms von Ratten (125).

Außer von neuronalem Gewebe werden Neurotrophine in unterschiedlichsten Organen und Geweben von verschiedenen Zelltypen produziert. Dazu gehören Fibroblasten, Myelomonozyten, Lymphozyten, Keratinozyten (121, 126-128) und Mastzellen (129).

Der bekannteste und am besten untersuchte Vertreter der Neurotrophine im engeren Sinne ist der Nerve Growth Factor (NGF), dessen Name in den 1950er Jahren eingeführt wurde, um einen Effekt auf sich entwickelnde Neuronen des sensiblen und sympathischen Nervensystems zu beschreiben (130). Weitere Vertreter dieser Gruppe sind der Brain-derived

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Neurotropic Factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4 (NT-4), sowie die neueren und weniger gut definierten Neurotrophine 5 bis 7 (131).

Im Folgenden werden die in dieser Arbeit intensiver untersuchten Neurotrophine NGF und NT-3 gesondert dargestellt.

1.3.1 Nerve Growth Factor (NGF)

Die weitaus meisten Studien über Einflüsse von Neurotrophinen gibt es zu NGF.

Abgesehen von seiner wachstumsfördernden Eigenschaft auf Nervenzellen hat NGF vielgestaltige Effekte auf nicht-neurales Gewebe.

So besteht ein anti-apoptotischer Effekt von NGF für neutrophile Granulozyten (132), eosinophile Granulozyten (133) und B-Zellen (134). NGF scheint selektiv die IgG4-Synthese von menschlichen B-Lymphozyten zu stimulieren (135), weiterhin wird Wachstum und Differenzierung der B-Zellen gefördert (136). Es besteht ein Priming-Effekt für eine nachfolgende Freisetzung inflammatorischer Mediatoren bei reifen menschlichen Basophilen (137), positive Auswirkungen auf die Wundheilung wurden festgestellt (122). In Synergie mit GM-CSF und IL-5 ist NGF ein Kolonie-stimulierender Faktor für humane Eosinophile und Basophile (138, 139). Gut beschrieben ist auch ein lang anhaltender hyperalgetischer Effekt des Nervenwachstumsfaktors, beispielsweise nach Injektion in Nagetiere (140-142). Sowohl bei Tieren (143) als auch bei Menschen (144) wurden nach verschiedenen Formen von Stress erhöhte Blutspiegel des Neurotrophins gemessen. Auch bei Patienten mit multiplen allergischen Erkrankungen und Asthma finden sich erhöhte Spiegel von zirkulierendem NGF (124).

Wie schon angesprochen, wird NGF von vielen dem Immunsystem zugehörigen Zellen synthetisiert. Dazu gehören Keratinozyten (145), eosinophile Granulozyten (146), T- Lymphozyten (besonders Th2-polarisierte) (147), B-Lymphozyten (134), Makrophagen, Langerhans Zellen (148), Fibroblasten (149) und Ratten-Mastzellen (129).

Hinweise, dass humane Mastzellen Nervenwachstumsfaktor produzieren gibt es hauptsächlich durch Studien mit der humanen Mastzelllinie HMC-1 (150). Kulturüberstände dieser Zellen stimulierten das Wachstum kultivierter sensorischer Ganglien, dieser Effekt konnte durch anti-NGF-Antikörper geblockt werden (151). Weiterhin zeigten HMC-1 Zellen eine mRNA Expression für NGF, BDNF und NT-3, aus Nabelschnurblut kultivierte Mastzellen exprimierten mRNA für NGF und BDNF (151, 152). Letztendlich wurden auch

Hinweise gefunden, dass humane Mastzellen aus Nabelschnurblut IgE-Rezeptor vermittelt NGF freisetzen (153).

Bei der Betrachtung der Effekte von NGF auf Mastzellen muss differenziert werden zwischen Daten aus Tiermodellen und Daten, die aus Experimenten mit menschlichen Mastzellen gewonnen wurden. Wegen der schon beschriebenen Heterogenität von Mastzellen sind auch Unterschiede in der Herkunft (Lunge, Darm, Haut, Nabelschnurblut, Zelllinie) von großer Bedeutung.

Am Beginn stand die Beobachtung, dass nach subkutaner Injektion von NGF in neonatale Ratten eine Mastzellhyperplasie und –hypertrophie stattfand (154). Mastzellzahlen konnten stark vermindert werden bei Ratten, die neutralisierende Antikörper gegen NGF erhielten (155). Später konnte gezeigt werden, dass NGF bei murinen Knochenmarkzellen in vitro eine Entwicklung zu Mastzellen induzieren vermochte (47). Wie schon bei Nervenzellen, zeigt sich ein positiver Einfluss von NGF auf das Überleben auch bei murinen Mastzellen, wahrscheinlich sekundär vermittelt über eine erhöhte Zytokinproduktion der Zellen (156). Als weiterer Hinweis für eine anti-apoptotische Wirkung führte NGF zu einer erhöhten Expression von bcl-2 bei peritonealen Mastzellen der Ratte (RPMC), nicht jedoch von anderen Genen der bcl-Familie (157). Bei dem Vergleich von NGF mit dem essentiellen Mastzell-Wachstumsfaktor SCF verringerten beide die Fragmentierung von DNA sowie den Verlust von Mikrovilli als Zeichen einer Hemmung der Apoptose, jedoch zeigte sich bei NGF im Gegensatz zu SCF kein proliferativer Effekt (158).

Während Studien mit murinen Mastzellen auf NGF als einen wichtigen Faktor für die Differenzierung und das Überleben hindeuten, gibt es nur wenige Daten zu menschlichen Mastzellen. In letzter Zeit wurde für Mastzellen aus Nabelschnurblut zum Einen nach Kultur mit NGF zusätzlich zu SCF eine erhöhte Expression Mastzell-typischer Marker wie Tryptase, c-Kit und FcεRIα beschrieben (50). Zum Anderen wurden Hinweise auf eine anti- apoptotische Wirkung nach Kultur mit NGF und SCF erhöhte Mastzellzahlen beobachtet, ohne dass Veränderungen im Zellzyklus von der G0/G1 Phase zu den S/G2+M Phasen unter NGF zu finden waren (159).

Funktionelle Veränderungen von Mastzellen durch NGF zeigten sich in verschiedenen Untersuchungen. So führte die Injektion von NGF in Rattenpfoten zu einer lokalen Degranulation von Mastzellen (160). Weiterhin kam es unter Stimulation mit NGF in vitro im Beisein von Lysophosphatidylserin zu einer Histaminfreisetzung aus peritonealen Mastzellen der Ratte (161, 162), auch wurden unter diesen Bedingungen die IL-6 Produktion gesteigert und die TNFα Sekretion über einen Prostanoid-abhängigen Weg inhibiert (163). NGF war

Einleitung

fähig, bei RPMC Cyclooxygenase-2 zu induzieren (164), die Expression von mRNA für IL-3, IL-4, IL-10, TNF-α und GM-CSF hochzuregulieren (157), und als Chemoattraktans zu wirken (165).

Humane Mastzellen plazentaren Ursprungs scheinen Histamin nach Stimulation durch NGF unter ähnlichen Bedingungen wie für RPMC beschrieben (162), auszuschütten (90).

Direkte klinische Relevanz könnte aus der Beobachtung erwachsen, dass NGF und sein Rezeptor Trk A bei Patienten mit Colitis ulzerosa und Morbus Crohn in entzündeten Darmabschnitten sowohl in neuronalen als auch in nicht-neuronalen Zellen (hier besonders Mastzellen) stark vermehrt exprimiert werden (166).

1.3.2 Neurotrophin-3 (NT-3)

Weitaus weniger Untersuchungen, verglichen mit NGF, gibt es zu den Effekten von Neurotrophin-3 (NT-3), das erst fast 40 Jahre nach NGF entdeckt wurde (167). Es gibt vielfältige Wirkungen von NT-3 besonders auf periphere und zentrale neuronale Zellen, aber auch auf nicht-neuronale Gewebe (168, 169). Im Mausmodell bewirkt das Fehlen von NT-3 schwere sensible und sympathische neuronale Defizite (170).

NT-3 ist bisher das einzige Neurotrophin, bei dem ein Einfluss auf die Entwicklung des enterischen Nervensystems festgestellt werden konnte. NT-3 zeigte sich als notwendig für Differenzierung, Überleben und physiologische Funktion von enterischen Neuronen und Glia, und damit für eine regelrechte Funktion der Peristaltik (171). Interessant ist die Beobachtung, dass NT-3 (und die von ihm regulierten Kalzium-aktivierten Kaliumkanäle vom Typ IK 1) vermindert nachzuweisen sind bei Zellen des Plexus myentericus in menschlichem Dickdarm von Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (172). In einer neueren klinischen Phase II-Studie zeigte sich unter subkutaner Gabe von NT-3 eine signifikante Verbesserung von Stuhlfrequenz, Kolontransit und subjektiver Symptomatik bei Patienten mit chronischer funktioneller Verstopfung (173).

Die Effekte von NT-3 auf nicht-neuronale Zellen sind vielgestaltig. Bei Melanozyten kommt es zu einer Hemmung der Apoptose (174), NT-3 scheint eine Rolle bei der normalen Kardiogenese zu spielen (175), ist aber auch verstärkt exprimiert bei Pankreaskarzinomen (176). Makrophagen produzieren vermehrt NO unter dem Einfluss von NT-3 (177). Eine chemotaktische Wirkung von NT-3 ist sowohl für Makrophagen (178) als auch für Schwann- Zellen beschrieben (179). Neben den anderen Neurotrophinen ist NT-3 ein wichtiger Faktor

für das Überleben und die Aktivierung von eosinophilen Granulozyten bei Patienten mit allergischem Asthma bronchiale (180).

NT-3 wird, außer von neuronalen Zellen, auch von T-Lymphozyten (181), Makrophagen (177) und eosinophilen Granulozyten (182) produziert.

Die Effekte von NT-3 auf Mastzellen sind weitgehend unbekannt. Eine Untersuchung zeigte eine erhöhte Zahl von Mastzellen in der Haut neonataler, NT-3-überexprimierender Mäuse. Eine Stimulation dieser Mastzellen mit NT-3 führte in einer Organkultur der Haut zu einer lichtmikroskopisch beobachtbaren Degranulation, die jedoch bei isolierten Mastzellen in vitro nicht reproduzierbar war (183).

1.3.4 Neurotrophin-Rezeptoren

Neurotrophine können zwei verschiedene Klassen von Rezeptoren aktivieren, die Tropomyosin-related kinase (Trk) – Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen und den p75- Rezeptor, ein Mitglied der Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor-Familie (184, 185). Trk- Rezeptoren werden von Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems exprimiert, aber auch von immunkompetenten Zellen wie Monozyten, B- und T-Lymphozyten (184).

Am längsten bekannt ist der Tyrosinkinase-Rezeptor Trk A, ein 140 kDa Molekül (p140), mit seinem primären Liganden NGF (186-188). Allerdings kann Trk A auch mit geringerer Affinität das dem NGF strukturverwandte Neurotrophin-3, sowie Neurotrophin-4, binden (189). Der primäre Ligand für Trk B (66% Übereinstimmung mit Trk A in der Aminosäuresequenz) ist BDNF, NT-3 und NT-4 können diesen Rezeptor jedoch ebenso aktivieren. Trk C (68% Übereinstimmung mit Trk A in der Aminosäuresequenz) bindet nur NT-3 (190, 191). Der p75-Rezeptor, in einer veralteten Bezeichnung auch low affinity nerve growth factor receptor LNGFR, bindet alle Neurotrophine (192, 193).

Eine Übersicht über die Rezeptoren und ihre Bindungspartner gibt Tabelle 1.

Einleitung

Um festzustellen, ob die biologischen Effekte von Neurotrophinen auf Mastzellen spezifisch und Rezeptor-vermittelt sind, haben verschiedene Arbeitsgruppen die Expression von Neurotrophin-Rezeptoren bei Mastzellen untersucht. Zuerst konnte auf RPMC Trk A, nicht jedoch p75, mittels Durchflusszytometrie mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Diese Erkenntnis wurde gestützt durch erfolgreiche Inhibition der Phosphorylierung von Trk A und der NGF-induzierten anti-Apoptose bei denselben Zellen unter Verwendung der Tyrosinkinase-Inhibitoren Herbimycin A und K-252a (158). Latent gegensätzlich zu der fehlenden Detektion von p75 bei Ratten ist die Beobachtung, dass der p75-Rezeptor eine Rolle bei der kombinierten IL-3-/NGF-induzierten Mastzelldifferenzierung in normalen Mäusen zu spielen scheint, da in p75-defizienten mi/mi Mäusen NGF als funktionell inaktiv beschrieben wurde (194).

Die Suche nach Neurotrophin-Rezeptoren bei menschlichen Mastzellen wurde fast ausschließlich mit Zellen der humanen Mastzelllinie – 1 (HMC-1) durchgeführt. So konnte die Expression von Trk A auf mRNA-, Protein- und funktionellem Level mittels PCR, Western Blot, Durchflusszytometrie und Immunoblot zum Nachweis der Phosphorylierung gezeigt werden (151). Tam et al wiesen Trk A sowie Trk B und Trk C bei HMC-1 Zellen nach. Der Nachweis von Trk A, B und C bei Mastzellen aus menschlichem Lungengewebe

Rezeptor Primärer Ligand Weitere Liganden

Trk A NGF

Trk B

Trk C

p 75

BDNF

NT-3

Alle Neurotrophine

-

NT-3, NT-4 NT-3, NT-4 Tabelle 1

wurde nur auf mRNA-Ebene geführt, Mastzellen aus menschlichem Nabelschnurblut exprimierten mRNA für Trk A und C (152).

Der p75-Rezeptor konnte in keiner der Arbeiten nachgewiesen werden (151, 152). In jüngster Zeit wurde in einer einzelnen Arbeit die Expression von Trk C auf Mastzellen aus der Haut neonataler Mäuse beschrieben, hierbei fanden sich NT-3-vermittelt erhöhte Mastzellzahlen, eine Rolle von NT-3 und seinem Rezeptor Trk C in der Ausdifferenzierung unreifer Mastzellen wurde vermutet (183).

Einleitung 1.4 Fragestellung

Das Wissen über die Wirkung von Neurotrophinen auf Wachstum, Überleben und biologische Funktion von Mastzellen ist gering. Genauere Untersuchungen existieren nur für den Nervenwachstumsfaktor (NGF). Zudem wurden die meisten Daten tierexperimentell oder in Studien mit menschlichen leukämischen Mastzellen (HMC-1 – Zelllinie), beziehungsweise mit aus Vorläuferzellen in vitro generierten Mastzellen, gewonnen. Gleiches gilt für die Expression von Rezeptoren für Neurotrophine.

Zu den Effekten von Neurotrophinen und der Expression ihrer Rezeptoren auf direkt aus dem menschlichen Darm isolierte und damit in vivo ausgereifte Mastzellen gibt es keine Publikationen.

Aufgrund der schon in der Einleitung beschriebenen Heterogenität von Mastzellen stellt sich die Frage, ob sich die Erkenntnisse anderer Studien bezüglich der Effekte von NGF und der Expression seines Rezeptors Trk A auch auf die Population humaner intestinaler Mastzellen übertragen lässt. Weiterhin war von Interesse, ob Mastzellen der Regulation durch andere Neurotrophine wie Neurotrophin-3 (NT-3), NT-4 oder BDNF unterliegen.

2. Methoden

2.1 Materialien/Reagenzien

Enzyme / Substanzen / Materialien für die Zellaufarbeitung: DNAse I (Boehringer, Mannheim); Pronase, Collagenase D (Roche Molecular Products, Basel, Schweiz);

Chymopapain (Sigma Chemical Co., St.Louis, USA); Bovines Serumalbumin (BSA, Fraktion IV, fettsäurefrei, Boehringer, Mannheim); Gelatine, Hepes (getestet für Zellkultur, Sigma Chemie GmbH, München); Acetylcystein (ACC, Sigma Chemie GmbH, München); 30µm, 100µm und 250µm Nybold-Filter (Swiss Silk Bolting Cloth Manufacturing Co. Ltd., Zürich, Schweiz); MACS^®-System und MACS^® LS-Säulen (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach).

Puffer und Lösungen: Tyrode-Puffer (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 0,36mM Na2HPO4, 5,55mM D-Glukose); Hepes-Puffer (20mM Hepes, 125mM NaCl, 0,5mM D-Glukose, 15mM KCl); TE-Puffer (Tyrode-Puffer mit 2mM EDTA); Aufbewahrungspuffer (118mM NaCl, 5,55mM D-Glukose, 2,7mM KCl, 0,36mM Na2HPO4, 0,2mM EDTA, 20mM Hepes, + Ampicillin 0,5mg/ml, Gentamycin 0,2mg/ml, Metronidazol 0,2mg/ml); TGMD-Puffer (Tyrode-Puffer mit 1,23mM MgCl2, 15µg/ml DNAse, 1mg/ml Gelatine); PCH-Lösung (Tyrode-Puffer + EDTA mit 3mg/ml Pronase und 0,75mg/ml Chymopapain); Co-Lösung (TGMD-Puffer mit 1,5mg/ml Collagenase D); ACC-Lösung (TE-Puffer mit 1mg/ml Acetylcystein(ACC)); HA+EDTA-Puffer (Hepes-Puffer mit 1mg/ml BSA und 2mM EDTA);

HACM-Puffer (HA-Puffer mit 1mM CaCl₂ und 1mM MgCl₂); PBS 10x (Gibco Life Technologies, Paisely, Schottland, UK); Homogenisierungs-Puffer (100mM Tris/HCl, 2%

bovines Serum Albumin, 1M NaCl, 4mM EDTA, 2% Triton X-100, 5µg/ml Aprotinin); PBS- Tween (PBS + 0,25% (v/v) Tween); Assay-Puffer (PBS 0,05 mol/L, pH 7,4, mit 10 mg/ml Gelatine); Lade-Puffer (30% Glycerol, 20mM EDTA, Bromphenolblau 0,05%, Xylencyanol 0,05%); Extraktions-Puffer (25mM Tris-HCl, 0,5mM EDTA, 0,05% Triton X-100, 10mM β- Mercaptoethanol, 1µg/ml Bupeptin, 1µg/ml Aprotinin; für den Gebrauch: 0,5ml 100mM PMSF in 100% Ethanol + 100ml Extraktions-Puffer); Probenpuffer für Westernblot (45,45mg/ml Tris, 0,3% SDS, pH 8,8 + 0,2mg/ml Glycerin, 2% SDS, 0,2M DTT und 0,5mg Bromphenolblau); SDS-Page-Puffer 10x (151,4 g Tris, 720g Glycin, 50g SDS, pH 8,8);

Sammelgel-Puffer 4x (18,18g Tris, 12ml 10% SDS, pH 8,8); Trenngel-Puffer 4x (18,18g Tris, 4ml 10% SDS, pH 8,8); Westernblot-Puffer (14,5g Glycin, 29,0g Tris, 1,85g SDS, 1000ml Methanol, pH 8,3). Sämtliche Puffer und Lösungen wurden mit sterilem,

Methoden

pyrogenfreien Wasser (Ampuwa, Fresenius, Bad Homburg) angesetzt, soweit nicht anders angegeben auf pH 7,4 eingestellt, sterilfiltriert, und bei 4°C aufbewahrt.

Substanzen für die Zellkultur: RPMI 1640 mit Hepes, Glutamax und Phenolrot;

hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum FCS (beides Gibco Life Technologies, Paisely, Schottland, UK); Metronidazol (Fresenius, Bad Homburg); Penicillin/Streptomycin, Amphotericin B für Zellkultur (Gibco Life Technologies, Paisely, Schottland, UK); 6-, 12-, 24-, 48-, und 96-well Kulturplatten (NUNC, Wiesbaden).

Zusammensetzung des Kulturmediums: RPMI 1640 mit Hepes, Glutamax und Phenolrot, 10% (v/v) FCS, 0,2mg/ml Gentamycin, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 0,5mg/ml Amphotericin B.

Antikörper: anti-SCF-Rezeptor c-kit (anti-CD 117 YB5.B8, Pharmingen, Hamburg); anti- IgE-Rezeptor α-chain (mAk 29C6 und mAk 22E7, beide Dr. Chizzonite, Hoffmann-La Roche, Nutely, NJ, USA); anti-sLT mAb (Dr. K. Brune, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen); Ziege-anti-Maus-IgG für MACS^®- System (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach); Esel anti-Ziege-IgG, Peroxidase-gekoppelt (Santa Cruz, Heidelberg); Esel anti-Kaninchen-IgG, Peroxidase-gekoppelt (Amersham, Freiburg); IgG1-Isotypkontrolle (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA); anti-Ki- 67 (mAk MIB-1, Dianova, Hamburg); anti-Trk A ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-Trk B (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA); anti-Trk C (neutralisierender Ak, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Zytokine: Rekombinantes humanes SCF (Tebu GmbH, Frankfurt am Main); rekombinantes humanes IL-4 (Dr. Frank Kalthoff, Novartis, Wien); rekombinantes humanes β-NGF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA); rekombinantes humanes NT-3; humanes NT-4 (beide Tebu GmbH, Frankfurt am Main bzw. PeproTech Inc., Princeton, NJ, USA).

Färbe-Lösungen: Trypan-Blau (Sigma Chemie GmbH, München); Giemsa-Lösung; May- Grünwald-Lösung; Mayer`s Hämalaun (Merck, Darmstadt); Diff-Quick^® (Dade Behring, Düdingen).

Immunzytochemie: Aminoethyl-Carbazol-Substrat-Kit (AEC, Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA); 3,3`-Diaminobenzidine-tetrahydrochloride-substrate-Kit (DAB,

Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA); Target Unmasking Fluid (TUF, Kreatech Diagnostics, Amsterdam, Holland); 3-aminopropyltriethoxysilan (APES); Tween; Mayer`s Hämalaun; Kaiser`s Glycerol Gelantine (alles Merck, Darmstadt); In Situ Cell Death Detection Kit (TUNEL-Assay, Roche Diagnostics, Mannheim).

Mediatormessungen: Histamin-RIA (Coulter-Immunotech, Hamburg); BDNF-ELISA (Chemicon, Temecula, CA, USA); LTC4 Tritium Tracer ((14,15,19,20-³H)LTC4(spezifische Aktivität 168,4 Ci/mmol) und (14,15-³H)LTC4(spezifische Aktivität 39,3 Ci/mmol), NEN Research Products, Boston, MA, USA); LTC4-Standard (Amersham Corp., Arlington, IL, USA).

RNA-Isolation und PCR: RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden); RNAse-freie DNAse (Promega, Madison, WI, USA); First Strand Puffer (Gibco Life Technologies, Paisely, Schottland, UK); Superscript™ Reverse Transkriptase (Life Technologies, Eggstein); Oligo dT Primer (Pharmacia, Uppsala, Schweden); 2,5 U Taq DNA Polymerase (Life Technologies, Eggstein); dNTP (Invitrogen, ); MgCl₂; PCR-Puffer (beide Gibco Life Technologies); TAE-Puffer; Agarose; Ethidiumbromid; Primer (synthetisiert bei Life Technologies).

Westernblot: PBS-Puffer (Gibco Life Technologies, Paisely, Schottland, UK) + Tween ();

Chemiluminescence Reagent (NEN Life Science); Complete™ Mini, „Protease inhibitor cocktail tablets“ (Roche Diagnostics, Mannheim); BioRad-Lösung (BioRad Protein Assay, BioRad Laboratories, München); BioRad high-range marker (BioRad Laboratories, München); Nitrozellulosemembran (Immobilon-P Transfermembran, Millipore, Bedford, MA, USA); Magermilchpulver (Merck, Darmstadt).

Methoden

2.2 Isolation von Zellen aus der Darmschleimhaut

Ausgangsmaterial für die Isolation humaner intestinaler Mastzellen waren chirurgische Darmresektate (195). Direkt nach der Entnahme eines Darmresektates (Tumorresektat) wurde ein ca. 20-50 cm² großes Gewebsstück herausgeschnitten. Hierbei wurde darauf geachtet, Gewebe nur aus dem gesunden Teil, mit intakter Schleimhaut, zu entnehmen. Das Gewebsstück wurde sofort in 4°C kalten TEA-Puffer gelegt, im Labor nochmals mit frischem TEA-Puffer gewaschen, und anschließend bis zur Weiterverarbeitung am nächsten Tag bei 4°C im Kühlschrank gelagert.

Die Weiterverarbeitung des Gewebes wurde unter einer Sterilbank (LaminAir HB 2472, Heraeus Instruments, Hannover) wie folgt durchgeführt:

1.) Mukosa und Submukosa wurden möglichst zügig mit einer chirurgischen Schere von der Muskularis abpräpariert.

2.) Zur Schleimlösung/-entfernung wurde das Gewebe 1-2 x 10 min lang in 50 ml ACC- Lösung, zur Epithelzellentfernung anschließend 20 min in TE-Puffer mit 5mM EDTA in einem Wasserschüttelbad (Julabo SW-20C, Julabo Labortechnik, Seelbach) bei 37°C inkubiert.

3.) Das Gewebe wurde in einer Petrischale unter Zugabe von 20 ml Enzymlösung (Pronase/Chymopapain, PCh-Lösung) mit einer Schere ca.15 min zerkleinert, bis eine Suspension von gleichmäßig kleinen (ca.1 x 1 mm) Gewebestückchen entstand. Die Suspension wurde durch einen groben 250 µm Nybold-Filter, unter Nachspülen mit TE-Puffer, filtriert. Das Filtrat wurde verworfen.

4.) Das auf dem Filter verbliebene Gewebe wurde in 30 ml PCh-Lösung aufgenommen und für 30 min bei 37°C im Wasserbad geschüttelt. Es folgte eine erneute Filtration durch einen 250 µm Nybold-Filter unter Nachspülen mit TGMD-Puffer, das Filtrat wurde wiederum verworfen.

5.) Nachfolgend wurde das Gewebe für 30 min in 25 ml Co-Lösung bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Das nach Spülen mit 75 ml TGMD-Puffer gewonnene Filtrat (Einzelzellsuspension) wurde bei 1200 rpm 10 min abzentrifugiert (CS-6R Centrifuge, Beckmann-Coulter) und in Medium resuspendiert. Dieser Schritt wurde mit dem restlichen Gewebe wiederholt.

6.) Beide Filtrate wurden vereinigt und unter Spülen mit 50 ml Medium durch einen feinen 100 µm Nybold-Filter gegeben. Die Zellen wurden nun nochmals

abzentrifugiert (1200rpm, 10 min), resuspendiert, in 10 ml Kulturmedium aufgenommen, unter dem Mikroskop (Olympus CK2, Olympus Optical, Tokyo, Japan) bei 20-facher Vergrößerung gezählt (Trypan-Blau) und differenziert (Zytospin, Diff-Quick^®;Mikroskop: Ortholux 2, Leitz, Wetzlar).

7.) Die Gesamtzellzahl betrug 17 ± 8 x 10⁶ pro Gramm Gewebe, die Mastzellreinheit betrug 3 ± 2 %. Die Zellen wurden über Nacht bei einer Zelldichte von 2,5-5 x 10⁶ pro ml in Kulturmedium ohne weitere Zytokinzusätze kultiviert (Brutschrank, Heraeus Instruments, Hannover).

Methoden

2.3 Mastzellanreicherung durch Magnetseparation

Nach Übernachtkultur erfolgte die magnetische Mastzellanreicherung mit Hilfe des MACS^®- Systems (196, 197):

1.) Die Zellen wurden vorsichtig, unter Zuhilfenahme eines Zellschabers, aus der Kulturflasche entnommen und 10 min bei 1200 rpm abzentrifugiert. Nachfolgend wurden die Zellen resuspendiert, in 250µL HA+EDTA-Puffer pro 1 x 10⁸ Zellen aufgenommen, und für 15 min bei 4°C unter leichtem Schütteln mit dem Primärantikörper (YB5.B8, Maus IgG1 gegen c-kit, 5 ng/ml) inkubiert.

2.) Nun wurden die Zellen in 10 ml HA+EDTA-Puffer gewaschen, erneut zentrifugiert (1200 rpm, 10 min bei 4°C), und in 200µL HA+EDTA-Puffer pro 1 x 10⁸ Zellen aufgenommen. Anschließend folgte für 10 min unter leichtem Schütteln bei 4°C die Inkubation mit dem Sekundärantikörper, einem mit magnetischen Beads gekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (50µL Ak-Lösung pro 200µL Zelllösung).

3.) Es folgte eine Aufnahme in 50 ml HA+EDTA-Puffer und ein Filtrationsschritt über einen 30µm Nybold-Filter, um später die MACS^®-Säule verstopfende ausgefallene DNA und tote Zellen weitgehend zu entfernen. Das Filtrat wurde zentrifugiert (1200 rpm, 10 min bei 4°C).

4.) Das Zellpellet wurde resuspendiert und in 5-10 ml HA+EDTA-Puffer aufgenommen.

Die MACS^®-Säule wurde im Magnetfeld plaziert und mit 5 ml HA+EDTA-Puffer vorgespült. Die Zellsuspension wurde in kleinen Mengen über die Säule gegeben, es wurde zwischendurch mit Puffer gespült, abschließend wurde nochmals mit ca. 5 ml HA+EDTA-Puffer nachgespült. Das Eluat (die MACS^®-minus.Fraktion) wurde verworfen.

5.) Die MACS^®-Säule wurde aus dem Magnetfeld genommen, und es wurde unter Stempeldruck (mitgelieferter MACS^®-Stempel) mit 12 ml HA+EDTA-Puffer gespült.

Man erhielt die MACS^®-plus-Fraktion mit den angereicherten Mastzellen.

6.) Die MACS^®-plus-Fraktion wurde abzentrifugiert (1200 rpm, 10 min bei 20°C), die Zellen wurden in Kulturmedium aufgenommen, gezählt (Trypan-Blau), differenziert (Zytospin, Diff-Quick^®), und unter den weiter unten beschriebenen Bedingungen kultiviert. Intestinale Mastzellen konnten mit diesem Verfahren auf 60 ± 35%

angereichert werden (51).

2.4 Zellzählung und Zelldifferenzierung

Zellzahlen wurden zu verschiedenen Zeiten während der Zellisolation und Aufreinigung bestimmt (siehe oben), sowie vor und nach jedem Kulturversuch. Hierfür wurden 20µL der Zellsuspension mit 20µL Trypan Blau (Verhältnis 1:1) gemischt, und in einer Neubauer- Zählkammer (Assistent, Deutschland) unter dem Mikroskop gezählt. Trypan Blau färbt tote Zellen blau an, wohingegen lebende Zellen nicht angefärbt werden. Es wurden immer mindestens 100 lebende Zellen gezählt. Da ein Zählquadrat unserer Neubauer-Zählkammer 0,1µL entsprach, konnte entsprechend dem Volumen und der Verdünnung die Zellzahl errechnet werden.

Die Zelldifferenzierung erfolgte über die Anfertigung von Zytospins. Hierfür wurde eine Zytozentrifuge (Shandon, Pittsburg, PA, USA) verwendet. 50 – 100 µL Zellsuspension wurden 3 min bei 500 Umdrehungen/min zentrifugiert. Anschließend wurden die Zytospins entweder mit Diff-Quick^®, oder in Einzelfällen zur besseren Differenzierung und für Fotoaufnahmen nach Pappenheim (May-Grünwald/Giemsa) gefärbt. Mindestens 30 Mastzellen (beziehungsweise je nach Mastzellkonzentration 200 Gesamtzellen) wurden gezählt, wobei die Mastzellen durch ihr charakteristisches Aussehen (metachromatische Granula) leicht von anderen Zellarten zu differenzieren waren.

2.5 Zellkultur

Für die Kultur der humanen intestinalen Mastzellen wurde RPMI 1640 (mit Hepes, Glutamax, Phenolrot, 10% FCS und Antibiotika) verwendet. Dem Kulturmedium wurde regelhaft SCF (50ng/ml, sofern nicht anders bezeichnet) zugesetzt, für bestimmte Kulturbedingungen auch IL-4 (2ng/ml). Die Zugabe der Neurotrophine (NGF, NT-3, NT-4) bei den Kulturversuchen geschah in folgenden Konzentrationen: NGF (50ng/ml), NT-3 (50ng/ml) und NT-4 (50ng/ml).

Es wurde in einem Zellkulturschrank bei 37°C, 5% CO2 und maximaler Luftfeuchtigkeit kultiviert. Es wurden 6-well (5 ml), 12-well (2 ml), 24-well (1 ml), 48-well (500µL), und 96- well (200µL) Kulturplatten verwendet. Gereinigte Mastzellen (nach MACS^®) wurden mit einer Zelldichte von 0,1 – 0,4 x 10⁶ Zellen/ml kultiviert. Das Mastzellwachstum wurde nicht wesentlich durch unterschiedliche Zelldichten oder Kulturplatten beeinflusst. Das Kulturmedium wurde alle 7 Tage gewechselt, in dem vorsichtig die Hälfte des Volumens abpipettiert, und diese Menge dann mit frischem Medium ersetzt wurde. Auch die Zytokine wurden wöchentlich erneut zugefügt. Die Blockierung von Trk-C geschah mit einem Ziege-

Methoden

anti-human-TrkC-Ak mit der Fähigkeit zur Neutralisierung der Rezeptor-Ligand Interaktion.

Hierbei ist beschrieben, dass 1-3µg/ml des Antikörpers 50% der Bindung von rekombinantem NT-3 (5ng/ml) an rekobinantes Trk-C in einem funktionellen ELISA blockieren (Herstellerangaben). Für die Blockierungsversuche wurde der anti.TrkC-Antikörper in unterschiedlichen Konzentrationen (30µg/ml, 3µg/ml, 0,3µg/ml) zugesetzt und alle 3-4 Tage erneuert. Die Dauer der Kulturversuche an sich betrug 14 Tage. Für diese Kulturversuche wurden, soweit nicht anders angegeben, aufgereinigte humane intestinale Mastzellen eingesetzt (nach MACS^®), die vor Beginn der Kulturversuche bereits 7-10 Tage in Kulturmedium mit SCF (50ng/ml) vorkultiviert wurden. Durch diese Maßnahme lag die Mastzellreinheit bei Versuchsbeginn bei 93±3% (43).

2.6 Mediatormessungen

Histamin-RIA: Die Freisetzung von Histamin aus humanen intestinalen Mastzellen wurde, wie auch die Freisetzung von Leukotrien C4 und BDNF, in vitro untersucht. Die Mastzellen wurden nach Kultur gezählt, abzentrifugiert und in HACM-Puffer aufgenommen (Zelldichte 1-10 x 10⁴ MC/ml, 400-1000µL pro Bedingung). Die Proben wurden mit 10 min Vorlaufzeit für 30 min mit dem mAk 29C6 oder ohne (Kontrolle) in einem Wasserschüttelbad bei 37°C inkubiert. Durch die Zugabe von mAk 29C6 wurde die IgE-abhängige Histaminfreisetzung aus Mastzellen untersucht. 29C6 richtet sich gegen ein nicht-IgE-bindendes Epitop der hoch- affinen α-Kette des IgE-Rezeptors. Eine maximale Aktivierung wurde durch Zugabe von 100ng/ml Antikörper erreicht (63, 198). Die Stimulation wurde durch Inkubation der Proben in Eiswasser gestoppt. Die Proben wurden abzentrifugiert (200 g, 10 min), Überstände wurden abgenommen, aliquotiert und bei -80°C bis zur Messung eingefroren (63). Die Zellen wurden zur RNA-Gewinnung weiterverarbeitet. Vor der Stimulation wurde von jeder Kulturbedingung zur Bestimmung des in den Zellen gespeicherten Histamins ein Zelllysat hergestellt. Hierfür wurden die Zellen in eine hypotone (< 150 mosmol) Lösung transferiert, gevortext und bei -80°C eingefroren. Vor der eigentlichen Messung wurde diese Proben 5 min lang im Ultraschallbad aufgetaut, die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert (400 g, 10 min) und der Überstand zur Messung verwendet (56, 196, 197). Histamin wurde mit einem Histamin- Radioimmunoassay (RIA) gemessen (137), die Durchführung der Messung richtete sich nach den Herstellerangaben. Standardbedingungen wurden im Triplikat, Proben im Duplikat gemessen. Die Nachweisgrenze für Histamin lag bei 1 pg/ml.

Leukotrien C₄-RIA: Die Proben wurden, wie unter Histamin-RIA beschrieben, gewonnen und behandelt. Das Testprinzip war ein Flüssig-Phase-Radioimmunoassay (137). 100µL Überstand oder Standard LTC4-Verdünnungen (400-3,125 pg/ml) wurden mit 100µL LTC4

Tritium Tracer (0,38 pmol/ml), 100µL anti- sLT-mAk-Lösung (0,005 mg/ml Gesamtprotein) und 100µL Ha-Puffer gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Hierbei konkurrierte das in der Probe vorhandene Leukotrien mit dem radioaktiv markierten Leukotrien um die Antikörper-Bindungsstellen. Anschließend wurde 250µL Aktivkohle-Suspension (Assay- Puffer + 800 mg/ml Aktivkohle, 160 mg/ml Dextran T70, 1 mg/ml Natriumazid) für 15 min zugesetzt, um ungebundenes Leukotrien zu absorbieren. Die Proben wurden zentrifugiert (2500 rpm, 15 min, 4°C), und 450µL des Überstands in Szintillationsröhrchen transferiert.

Die Menge Antikörper-gebundenen LTC₄ wurde im β-Counter quantifiziert, sie war invers proportional zu der Leukotrien-Konzentration in der Probe. Der verwendete Antikörper hatte die gleiche Sensitivität für LTC₄, LTD₄ undLTE₄ und zeigte keine Kreuzreaktivität mit LTB₄ und seinen Metaboliten, mit PGD₂, E₂, F_2A oder Thromboxan B₂ . Die gleiche Affinität des Ak für alle sLT`s ist vorteilhaft zu sehen, da bei mononukleären Zellen unter Inkubationsbedingungen immer in geringer Menge LTC₄ in LTD₄/E₄ umgewandelt wird . Standardbedingungen wurden im Triplikat, Proben im Duplikat gemessen. Die Nachweisgrenze für Leukotrien C₄ lag bei 3 pg/ml.

2.7 Immunzytochemie

Mastzellen wurden geerntet und mittels einer Zytozentrifuge (Shandon, Pittsburg, PA, USA) bei 500 Umdrehungen/min für 3 min auf mit 3-Aminopropyltriethoxysilan (APES) Objektträger aufgebracht und anschließend über Nacht bei 37°C getrocknet. Pro Zytospin wurden 10-20 x 10³ Mastzellen eingesetzt. Für den Nachweis von Ki-67 wurden die Zytospins 10 min in Aceton fixiert. Für den Nachweis von DNA-Strangbrüchen (TUNEL- Assay) wurden die Zytospins in 4%igem Paraformaldehyd bei pH 7,2 fixiert und in einer aufsteigenden Alkoholreihe (30, 40, 50, 70, 90 und 100% Ethanol für jeweils 5 min) entwässert. Anschließend wurden die Zytospins unter dem Abzug getrocknet, in Alufolie gewickelt und bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C gelagert.

Ki-67 Nachweis: Ki-67 ist ein Proliferations-assoziiertes, im Zellkern liegendes Antigen. Es wird in allen Phasen des Zellzyklus (G₁, S, G₂, M) positiv und hat dann eine Halbwertszeit von 20 Stunden (199). Anti-Ki-67 wurde 1:1 laut Herstellerangaben verdünnt, Kontrollen wurden durch Inkubation mit unspezifischem Immunglobulin des gleichen Subtyps

Methoden

durchgeführt. Die Zytospins wurden zunächst einer Mikrowellen-Vorbehandlung in Target Unmasking Fluid (TUF) unterzogen (500 W bis zum Siedepunkt, dann 150 W für 10 min).

Anschließend wurden die Zytospins 10 min in 3%igem Wasserstoffperoxid (mit 97%

Methanol) inkubiert. Nachfolgend wurde mit PBS-Puffer gespült und 30 min mit Blockierungsreagenz (AEC-Kit) behandelt. Es wurde gespült und über Nacht bei 4°C mit anti-Ki67 inkubiert. Die Bindung des Primärantikörpers wurde mit Hilfe eines Aminoethyl Carbazole Substrate Kits (AEC-Kit, Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA) nach Instruktionen des Herstellers sichtbar gemacht. Abschließend erfolgte eine Gegenfärbung mit Mayer`s Hämalaun für 10 sec und eine Eindeckelung mit Kaiser`s Glycerol Gelatine (196, 197).

TUNEL-Assay: Um Apoptose zu detektieren, wurde eine enzymatische in situ-Markierung von Apoptose-induzierten DNA-Strangbrüchen durchgeführt (200). Hierfür wurde die TUNEL-(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT); TdT-mediated dUTP nick end labeling) technik im Rahmen eines kommerziellen In Situ Cell Death Detection Kits (Roche Diagnostics, Mannheim) benutzt. Die Zytospins wurden 10 min mit 3%igem Wasserstoffperoxid (in 97% Methanol) vorbehandelt, mit PBS-Puffer gespült und mit dem TUNEL-Reaktionsgemisch über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Spins mit Converter-POD (TUNEL-Kit) für 30 min bei 37°C behandelt, und die Färbung mit AEC lichtmikroskopisch sichtbar gemacht. Es folgte eine Gegenfärbung mit Hämalaun (15 sec) und die Eindeckelung mit Glyceringelatine.

2.8 RNA-Isolation und PCR

Mastzellen wurden nach Kultur (Mastzell-Reinheit ≥ 98 %) und Stimulationsexperiment in Lyse-Puffer aufgenommen und bei -80°C eingefroren. Aus diesen Zellen wurde die Gesamt- RNA mit Hilfe des Rneasy Mini Kits gewonnen. Ungefähr 3 µg Gesamt-RNA konnte pro 10⁶ Zellen isoliert werden (196). Genomische DNA wurde mit RNAse-freier DNAse (1 U/ µL) 15 min bei 37°C verdaut. Nach Zugabe von 25 mM EDTA wurde die RNA bei 70°C für 10 min denaturiert. Anschließend wurde die RNA (etwa 200ng Gesamt-RNA) im Rahmen einer Reversen Transkription in cDNA umgeschrieben. Um die Synthese von cDNA (60 min bei 37°C) zu ermöglichen, wurden Superscript™ Reverse Transkriptase (200 U) und 20 pmol oligo dT primer zugegeben. Für die PCR-Reaktion wurde 1/20 des gewonnenen cDNA- Volumens eingesetzt. Die PCR wurde in einem 50µL-Ansatz mit 2,5 U Taq DNA Polymerase und je 10 pmol der Primer durchgeführt. In diesem Reaktionsgemisch wurde die cDNA 35

Zyklen lang (60 sec bei 94°C, 80 sec bei 60°C und 70 sec bei 72°C) mit einem Pelthier Thermal Cycler (PTC-200, MJ Research, Watertown, MA, USA) amplifiziert. Auf den letzten Zyklus folgte eine Elongation für 7 min bei 72°C. Ein 1%iges Agarose-Gel mit 500 ng/ml Ethidiumbromid wurde gegossen (Gelelektrophorese-Kammer, Serva Electrophoresis, Heidelberg). 10 µL des PCR-Produktes wurde mit 5 µL Ladepuffer versetzt, für 60 min im Agarose-Gel elektrisch aufgetrennt, unter UV-Licht visualisiert und abschließend fotografiert.

Primer-Liste

GAPDH Sense: 5`- ACCACAGTCCATGCCATCAC –3`

(452 bp) Antisense: 5`- TCCACCACCCTGGTTGCTGTA –3`

Trk-A Sense: 5`- GGCTCCTCGGGACTGCGATG –3`

(273 bp) Antisense: 5`- CAGGAGAGAGACTCCAGAGCG –3`

Trk-B Sense: 5`- AGCAACCTGCAGCACATCAA –3`

(289 bp) Antisense: 5`- CTTCCTCCACAGTGAGGTTA –3`

Trk-C Sense: 5`- GTGTCTGCAGCAAGACTGAG –3`

(316 bp) Antisense: 5`- GTGGTGAGCCGGTTACTTGA –3`

p 75 Sense: 5`- TGAGTGCTGCAAAGCCTGCAA –3`

(229 bp) Antisense: 5`- TCTCATCCTGGTAGTAGCCGT –3`

NGF Sense: 5`- CCAAGTCCACTGGACTAAAC –3`

(493 bp) Antisense: 5`- CCAGTGCTTTGAGTCAATGC –3`

BDNF Sense: 5`- GGTGATGCTCAGTAGTCAAG –3`

(290 bp) Antisense: 5`- CCATGGGATTGCACTTGGTC –3`

NT-3 Sense: 5`- CAGAACATCACGGCGGAAAC –3`

(349 bp) Antisense: 5`- CACACAGGACGTGTCTATCC –3`

NT-4 Sense: 5`- GACCTCAAGTCATGGACCTG –3`

(274 bp) Antisense: 5`- GAGCACCTGGAGACAGAAAG –3`

Methoden 2.9 Westernblot

Zelllysate: Um Proteine von humanen intestinalen Mastzellen darstellen zu können, wurden Zelllysate hergestellt. 3-5 x 10⁵ Mastzellen wurden pro Bedingung eingesetzt. Es wurden nur hochreine Mastzellkulturen verwendet (Reinheit 98-100%). Weiterhin wurden HMC-1 Zellen benutzt (Kulturbedingungen s.oben), und es wurden Lysate von normalem humanem Darmgewebe hergestellt. Mastzellen wurden geerntet und anschließend abzentrifugiert (2500 rpm, 5 min, Raumtemperatur). Darmgewebe wurde zuvor mit einem Dispergierstab (Ultra Turrax T8, IKA Labortechnik, Staufen) homogenisiert. Die Überstände wurden abgenommen und verworfen. Es wurde mit PBS-Puffer (1 ml) gewaschen und erneut zentrifugiert, der Überstand wurde wiederum verworfen. Um die Zellen zu lysieren, wurde das Pellet in 60 – 100 µL Extraktions-Puffer mit Proteaseinhibitoren (5 mM PBSC) resuspendiert. Die Suspension wurde abzentrifugiert (14000 rpm, 5 min, 4°C), um die Proteine von Zelltrümmern zu befreien. Die entstandenen Überstände wurden aliquottiert und bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C eingefroren.

Proteinkonzentrationsbestimmung: Um sicherzugehen, dass in den Proben genug Protein vorhanden war (quantitative Vergleiche zwischen einzelnen Proben wurden nicht angestellt), wurde die Proteinmenge bestimmt. Hierfür wurde die Biuret-Methode verwendet. Um Vergleichskonzentrationen zu erhalten, wurden Lösungen mit BSA (0,1 – 12 µg) angesetzt, hieraus wurde die Eichkurve ermittelt. Proteine aus den Zelllysaten wurden als 1-2 µL Probe in Wasser und BioRad-Lösung (BioRad Protein Assay) gegeben. Die Proben wurden im Photometer bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. Anhand der Eichkurve wurden die Proteinkonzentrationen der Proben errechnet.

Westernblot: Pro Probe wurde 10 –25 µg Protein (aus dem Zelllysat) eingesetzt. Das Protein wurde 1:1 mit einem Probenpuffer (45,45 mg/ml Tris, 0,3% SDS, pH 8,8 + 0,2 mg/ml Glycerin, 2% SDS, 0,2 M DTT) versetzt. Das Protein wurde für 5 min bei 95°C denaturiert.

Die Proben wurden anschließend, ebenso wie ein BioRad High Range Marker zur späteren Proteingrößenbestimmung, in einem 4%igen SDS-Acrylamid-Sammelgel (0,75 ml SGP, 0,45 ml 30%iges Acrylamid, 1,8 ml Ampuwa; versetzt mit 1 µL/ml TEMED und 10 µL/ml 10%

Ammoniumperoxidsulfat (beide Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)) aufgetragen. Die elektrische Auftrennung erfolgte für 2-2,5 Stunden bei 120 Volt in einem 12 %igen SDS- Acrylamid-Trenngel (2,5 ml TGP, 4 ml 30%iges Acrylamid, 3,4 ml Ampuwa; versetzt mit 1

µL/ml TEMED und 10 µL/ml 10%iges Ammoniumperoxidsulfat). Die im SDS-Acrylamid- Trenngel enthaltenen Proteine wurden anschließend auf eine Membran transferiert (geblottet).

Das Trenngel wurde auf eine Nitrozellulosemembran (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA, USA) gelegt. Auf das Gel und unter die Membran wurde 3-fach Filterpapier gelegt. In dieser Anordnung wurde das `Sandwich` dann in eine Westernblot-Kammer (Mini Blot Kammer, BioRad Laboratories, München) mit Westernblot-Puffer transferiert. Es wurde über Nacht bei 4°C und 20 Volt geblottet. Am nächsten Tag wurde für 1 Stunde mit 5%igem Magermilchpulver (in PBS/Tween) geblockt. Nachfolgend wurden zwei Waschschritte (je 10 min, in PBS/Tween) durchgeführt. Dann wurde die Membran mit dem Primärantikörper (anti- TrkA, anti-TrkB, anti-TrkC) für 2 Stunden inkubiert. Nach erneuten 2 Waschschritten folgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper (für TrkA: Esel anti-Kaninchen IgG, Peroxidase- gekoppelt; für TrkB und TrkC: Esel anti-Ziege IgG, Peroxidase-gekoppelt) für 1 Stunde. Um unspezifische Bindungen zu reduzieren, wurde 3-mal für je 15 min mit PBS/Tween gewaschen. Durch die Peroxidase-Koppelung der Antikörper konnten die Proteine auf der Membran nach 1 min Inkubation mit Chemiluminescence Reagent auf einem hochempfindlichen Röntgenfilm (Hyperfilm TM, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK; Belichtungszeit 1-2 min) dargestellt werden.

2.10 Statistik

Die Daten sind, soweit nicht anders bezeichnet, als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Bei ordinal skalierten Daten wurde der Median verwendet. Gepaarte, nicht parametrische Daten wurden mit dem Wilcoxon-Test auf signifikante Differenzen geprüft. Ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner als 5% (p < 0,05) wurde ein Ergebnis als signifikant bezeichnet .

Ergebnisse 3. Ergebnisse

3.1 Produktion von mRNA für Neurotrophin-Rezeptoren

Untersucht wurde zunächst die Expression der Neurotrophin-Rezeptoren Trk A, Trk B, Trk C und p 75 auf Transkriptionsebene mittels RT-PCR. Abbildung 1 zeigt die Detektion von mRNA für Trk A, Trk B und Trk C, nicht jedoch für p 75, bei humanen intestinalen Mastzellen (MC). Die verwendeten Mastzell-Kulturen hatten nach 14 Tagen Kultur mit SCF (25 ng/ml) eine Reinheit von 98 ± 2 % (Differenzierung nach May-Grünwald/Giemsa- Färbung). Auch bei unreifen menschlichen Mastzellen der Linie HMC-1 ließ sich mRNA für die Trk-Rezeptoren, nicht jedoch für p 75, nachweisen. Der Nachweis von Glyceraldehyd-3- phosphat-dehydrogenase (GDH) diente als Kontrolle für die Integrität der cDNA. Um eine Kontamination (und damit eine Amplifikation) mit genomischer DNA auszuschließen, wurden Proben mit aufgetragen, bei deren Aufarbeitung keine reverse Transkription durchgeführt wurde (Negativkontrolle). Als Positivkontrolle dienten Lysate von Mukosa/Muskularis menschlichen Dickdarms (Colon), die eine Vielzahl von neuronalen und immunologischen Zellen beheimatet, die Neurotrophin-Rezeptoren exprimieren (120, 184).

Dargestellt ist ein repräsentatives von drei unabhängigen Experimenten. Nach IgE-Rezeptor – Quervernetzung durch 90 min Inkubation mit mAk 29C6 zeigte sich bei den Mastzellproben keine erhöhte oder erniedrigte Expression für Trk-Rezeptoren (Daten nicht gezeigt), obwohl die Aussagekraft der eher qualitativen als quantitativen Eigenschaften der durchgeführten RT- PCR hier sicherlich eingeschränkt ist.

Abbildung 1: mRNA-Expression für Neurotrophin-Rezeptoren

Abb. 1: mRNA – Nachweis für Trk – Rezeptoren auf humanen intestinalen Mastzellen; die Gesamt – RNA von Proben aus menschlichem Colon, von HMC – 1 – Zellen, und von 14 Tage mit SCF (25 ng/ml) kultivierten Mastzellen wurde aufgereinigt und die Expression von mRNA für Trk – Rezeptoren bzw. p 75 mittels RT – PCR (35 Zyklen) dargestellt.

3.2 Proteinnachweis für Trk-Rezeptoren

Um herauszufinden, ob sich die Darstellbarkeit der Trk-Rezeptoren auf mRNA-Ebene auch für das tatsächliche Rezeptorprotein nachvollziehen lässt, wurde eine Westernblotanalyse mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Aufgrund des fehlenden Nachweises von mRNA für den Rezeptor p 75 und des gescheiterten Nachweises von p 75 auch anderer Gruppen (151, 152) wurde dieser im Folgenden nicht weiter untersucht. Als

Trk A

Trk B

Trk C

Negatiivkontrolle

GDH

p75

Colon HMC-1 MC

Marker

Trk A

Trk B

Trk C

Negatiivkontrolle

GDH

p75

Colon HMC-1 MC

Marker