Aus der Arbeitsgruppe Biochemie und Tumorbiologie der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
der Medizinischen Hochschule Hannover
Die Rolle von
poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 in humanen TUR-Leukämiezellen nach Induktion von
oxidativem Stress
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Maike Tiemann aus Münster
Hannover 2008
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover
am 22.12.2008
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident:
Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit:
Prof. Dr. rer. nat. Ralf Hass
Referentin:
Prof. Dr. med. Eva Mischak-Weissinger
Korreferentin:
Prof. Dr. rer. nat. Theresia Kraft
Tag der mündlichen Prüfung:
22.12.2008
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Peter Hillemanns Prof. Dr. med. Anke Lesinski-Schiedat Prof. Dr. med. Robert Sümpelmann
I N H A L T S V E R Z E I C H N I S
1 EINLEITUNG... 5
1.1 Oxidativer Stress... 5
1.1.1 Entstehung von reaktiven Sauerstoffverbindungen ... 5
1.1.2 Auswirkungen des oxidativen Stresses auf die Zelle... 6
1.1.3 Abwehrmechanismen der Zelle gegen oxidativen Stress ... 7
1.1.4 Abbau oxidativ geschädigter Proteine durch das 20S-Proteasom ... 8
1.1.5 Andere Proteinabbauwege ... 11
1.1.6 PARP-Aktivität bei oxidativem Stress ... 13
1.1.7 Physiologische und pathophysiol. Beispiele für oxidativen Stress... 15
1.1.8 Anwendung oxidativ schädigender Substanzen in der Krebstherapie.... 16
1.2 Zytoskelett und Motorproteine... 18
1.2.1 Filamente des Zytoskeletts... 18
1.2.2 Interaktionen von Zytoskelett-Filamenten mit Motorproteinen ... 19
1.3 Membran und extrazelluläre Matrix... 21
1.3.1 Aufbau der Zellmembran... 21
1.3.2 Extrazelluläre Matrix und Matrixmetalloproteinasen... 22
1.4 TUR, TUR asPARP und TUR pTracer... 24
1.5 Ziele dieser Arbeit... 26
2 MATERIAL... 28
2.1 Chemikalien... 28
2.2 Puffer und Lösungen... 30
2.3 Antikörper... 32
2.4 Verbrauchsmaterialien... 33
2.5 Zellen...33
2.6 Geräte...34
2.6.1 Geräte für die Zellkultur...34
2.6.2 Geräte für die Proteinanalyse ...34
2.6.3 Geräte zur Dokumentation ...35
2.6.4 Geräte für die Massenspektrometrie ...35
3 METHODEN...36
3.1 Zellkultur...36
3.1.1 Kultivierung der Zelllinien...36
3.1.2 TPA - Test ...36
3.1.3 Bestimmung von Konzentration und Vitalität der Zellen ...36
3.1.4 Bestimmung der Zellzyklusphasen ...37
3.1.5 Stimulation der Zellen mit H2O2...37
3.1.6 PARP-1-Inhibition mit 3-ABA ...38
3.1.7 Zellgewinnung und Zelllyse für Proteinanalysen...38
3.1.8 Lipidextraktion ...39
3.2 Proteinbestimmung...40
3.3 Immunpräzipitation...41
3.3.1 Antikörperkopplung an Sepharose ...41
3.3.2 Präabsorption...41
3.3.3 Absorption...42
3.3.4 Ablösen der Sepharose und Vorbereitung zur 2D-Gelelektrophorese ....42
3.4 2D-Gelelektrophorese...43
3.4.1 Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung ...43
3.4.2 Zweite Dimension: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ....43
3.5 1D-Gelelektrophorese...44
3.6 Anfärbung von Gelen...45
3.6.1 Coomassie-Färbung...45
3.7 Massenspektrometrische Analyse... 46
3.8 Western Blot und Immunfärbung... 46
3.8.1 Western Blot ... 46
3.8.2 Immunfärbung und Filmentwicklung ... 47
3.8.3 Verarbeitung und Auswertung der Western Blot-Ergebnisse... 48
3.9 Dünnschichtchromatographische Auftrennung von Phospholipiden... 49
3.9.1 Dünnschichtchromatographie ... 49
3.9.2 Kupfersulfat-Färbung der Chromatographieplatte... 49
3.10 Dokumentation und Lagerung... 49
4 ERGEBNISSE... 50
4.1 Vitalitätsmessungen bei H2O2-Zeitkinetiken... 50
4.2 Zellzyklusphasen-Bestimmung bei H2O2-Zeitkinetiken... 54
4.3 Immunpräzipitation mit anti-PARP-1-Antikörpern... 57
4.3.1 IP mit einem anti-PARP-1-DBD-Antikörper ... 57
4.3.2 IP mit einem anti-PARP-1-Antikörper (full length) ... 61
4.4 Western Blots von Zytoskelettproteinen unter oxidativem Stress... 66
4.4.1 Myosin ... 66
4.4.2 Aktin ... 74
4.5 Western Blots von ROS-Abwehrproteinen unter oxidativem Stress... 81
4.5.1 Manganhaltige Superoxiddismutase (MnSOD)... 81
4.5.2 20S-Proteasom ... 86
4.5.3 Valosine containing protein (VCP)... 90
4.6 Western Blots von Matrixmetalloproteinasen unter oxidativem Stress.. 93
4.7 Dünnschichtchromatographische Auftrennung von Membranlipiden... 98
4.8 1D-Gelelektrophorese und ESI-Analyse von H2O2-Zeitkinetiken... 100
4.8.1 Western Blots von GAPDH unter oxidativem Stress ... 104
4.9 Proteinbestimmungen nach Biuret...108
5 DISKUSSION...112
5.1 Der Einfluss von PARP-1 auf Zellvitalität und Zellzyklus unter oxidativem Stress...112
5.2 ROS-Abwehrproteine unter oxidativem Stress in Abhängigkeit von PARP-1...115
5.3 Auswirkungen von ROS auf das Zytoskelett unter Beteiligung von PARP-1...118
5.4 ROS-induzierte Veränderungen im Aufbau der Zellmembran...123
5.5 Matrixmetalloproteinasen (MMP) bei ROS-Exposition...124
5.6 Weitere gefundene Proteinveränderungen unter oxidativem Stress...126
5.7 Schlussfolgerungen...128
6 ZUSAMMENFASSUNG...129
7 LITERATURVERZEICHNIS...131
8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...136
LEBENSLAUF...139
ERKLÄRUNG nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 PromO...141
DANKSAGUNG...142
1 Einleitung
1.1 Oxidativer Stress
1.1.1 Entstehung von reaktiven Sauerstoffverbindungen
Sauerstoff ist für die Zellen des menschlichen Körpers absolut essentiell. Insbesondere die Mitochondrien nutzen Sauerstoff für die oxidative Phosphorylierung im Rahmen der Atmungskette, bei der die aus Nährstoffen gewonnene Energie für den Körper in Form von ATP nutzbar gemacht wird. Neben dem Endprodukt Wasser entsteht in geringem Umfang auch das hochreaktive Superoxid-Anion ( O2-) durch Übertragung eines Elektrons auf molekularen Sauerstoff. Dieses kann durch Freisetzung von Eisen aus den Enzym-Komplexen der Atmungskette diese inaktivieren, wodurch noch mehr Radikalanionen gebildet werden. Die Superoxiddismutase (SOD) wandelt Superoxid- Anionen zu Wasserstoffperoxid (H2O2) um. Aus diesem kann, wenn es nicht enzymatisch beseitigt wird, in Gegenwart von Kupfer- oder Eisenionen das Hydroxylradikal ( OH-) entstehen. Diese drei sauerstoffhaltigen Moleküle bilden zusammen mit einigen anderen, wie Lipidperoxiden (ROOH), Peroxyl-Radikalen (ROO ) und Alkoxyl-Radikalen (RO ), die Gruppe der reaktiven Sauerstoff- verbindungen oder „reactive oxygen species“ (ROS) [16]. ROS entstehen auch in anderen Zellkompartimenten. Makrophagen und Leukozyten z. B. produzieren ROS als Bakterizide zur Infektabwehr. Durch einen NADPH-Oxidase-Komplex an der Phagosomenmembran wird in diesen Zellen die Herstellung von hochtoxischen Sauerstoffverbindungen, wie Superoxid, Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikalen, Hypochlorit (OCl-) und Stickstoffmonoxid (NO), katalysiert, die phagozytierte Erreger abtöten sollen. Dabei kommt es kurzfristig zu einem gesteigerten Sauerstoffverbrauch, der als „respiratory burst“ bezeichnet wird [22,20]. Insgesamt werden etwa 3–10 % des im Gewebe verbrauchten Sauerstoffs zu ROS umgewandelt [17].
1.1.2 Auswirkungen des oxidativen Stresses auf die Zelle
Reaktive Sauerstoffverbindungen können mit biologischen Makromolekülen, wie Nukleinsäuren, Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden, reagieren. Durch Oxidation verändern sie die Struktur dieser Moleküle und stören damit meist auch deren Funktion.
Das Ausmaß des entstehenden Schadens und das Überleben der Zelle hängen von Art, Konzentration und zellulärer Lokalisation der ROS sowie von den zur Verfügung stehenden Abwehrmechanismen der Zelle, vom Zelltyp und vom Differenzierungs- stadium ab [11,5].
Im Falle der Nukleinsäuren führt die Oxidation von Zuckern oder Basen zu DNA- Strangbrüchen, intra- und interchromosomalen crosslinks oder DNA-Protein-crosslinks.
Dies hat Störungen in den dynamischen Prozessen an der DNA, wie Replikation, Transkription und Reparaturmechanismen, zur Folge [5,13].
Innerhalb von Proteinen oder Peptiden kann die Oxidation von Aminosäuren in Struktur- und Funktionsstörungen des Proteins resultieren. Die Oxidation der Aminosäuren Histidin und Prolin führt z. B. zu einer Ringöffnung, so dass im Falle des Histidins der Proteinabbau durch Proteasen gehemmt wird bzw. im Falle des Prolins u. a. Störungen im Kollagenauf- und -abbau auftreten. Aus der Aminosäure Methionin entsteht durch Oxidation Met-Sulfoxid oder Met-Sulfon, aus Leucin Hydroxyleucin, und Tyrosin kann zu 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) metabolisiert werden [11,16].
Diese Veränderungen verursachen im Protein Fragmentationen, intra- oder inter- molekulares crosslinking sowie Änderungen der Tertiärstruktur und der Ladung.
Crosslinks können sowohl in Form von kovalenten Bindungen, z. B. Disulfidbrücken, als auch nichtkovalenten hydrophoben oder elektrostatischen Interaktionen vorkommen.
Sie führen zur Bildung von großen Aggregaten, die in der Zelle akkumulieren können.
Durch Auffaltung des Proteins treten hydrophobe Reste aus dem Inneren des Proteins nach außen und erhöhen so die Oberflächenhydrophobizität [11,10]. Werden im Zellkern beispielsweise Histonproteine oxidiert, so kommt es durch Strukturänderungen zu einer Dissoziation von entsprechenden DNA-Abschnitten. Die DNA ist dann zum einen vermehrt Schädigungen ausgesetzt, zum anderen kann auch die Transkription bestimmter Gene beeinflusst werden [5].
Ein Beispiel für oxidative Struktur- und Funktionsänderungen aus dem Bereich der Kohlenhydrate ist die Beeinträchtigung von Stabilität und Zelladhäsionsfähigkeit der extrazellulären Matrix bei Oxidation von Glykosaminoglykanen, wie Hyaluronsäure,
Chondroitinsulfat oder Keratansulfat [16,29]. Die Oxidation von Lipiden hat ebenfalls Strukturveränderungen zur Folge, wie die Einführung von Doppelbindungen oder die Spaltung von Kohlenstoffketten mit Umlagerung der Spaltprodukte zu atypischen Aggregaten. Dies greift u. a. in Aufbau und Funktion von Biomembranen, Rezeptoren und Transportproteinen ein [16]. Die Bildung von Lipid-, Kohlenhydrat- oder Nukleinsäure-Radikalen durch ROS kann auch sekundäre Proteinoxidationen und Akkumulation von Aggregaten in der Zelle verursachen [11].
Neben all diesen direkten Folgen des oxidativen Stresses beeinflussen ROS auch die Aktivität bestimmter Enzyme und greifen in spezifische Regulationsmechanismen ein.
So nimmt die Aktivität der Ca2+-ATPase der Plasmamembran bei oxidativem Stress ab, was in einer Störung der Ca2+-Homöostase resultiert. Dagegen nimmt die Aktivität von Elastasen im oxidierten Zustand zu, so dass Gewebe vermehrt abgebaut wird [16].
ROS werden darüber hinaus auch als mögliche second messenger in verschiedenen Signalkaskaden diskutiert [20]. Unter anderem bewirken sie die Freisetzung von Cytochrom c aus dem Intermembranraum des Mitochondriums und induzieren dadurch die Apoptose [15,18].
1.1.3 Abwehrmechanismen der Zelle gegen oxidativen Stress
Der Zelle stehen mehrere Wege zur Verfügung, um Schäden durch reaktive Sauerstoffverbindunden abzuwehren oder entstandene Schäden zu beseitigen. Zum einen gibt es eine Vielzahl zelleigener Antioxidantien, die ROS unschädlich machen, bevor Schaden entsteht. Zum anderen können oxidativ modifizierte Moleküle erkannt werden, um sie entweder zu reparieren oder abzubauen.
Bei den Antioxidantien werden nichtenzymatische und enzymatische unterschieden. Zu den nichtenzymatischen zählen α-Tocopherol (Vit. E), Ubichinon (Coenzym Q), β-Carotin (Pro-Vit. A), Ascorbat (Vit. C) und Glutathion. Sie reduzieren ROS und werden dabei selber oxidiert. Zum Teil sind hier noch weitere Coenzyme notwendig, um die Antioxidantien anschließend wieder zu regenerieren oder um Reaktionsprodukte ausscheidbar zu machen. Die Glutathion-Reduktase z. B. bringt oxidiertes Glutathion unter NADPH-Verbrauch zurück in seine reduzierte, antioxidativ wirksame Form [16,29].
Die Gruppe der enzymatischen Antioxidantien bilden Superoxiddismutasen (SOD), Katalasen und Peroxidasen. Die SOD wandelt 2 hochreaktive Superoxid-Anionen ( O2-)
zu einem Sauerstoff-Molekül und einem Peroxid-Dianion (O22-) um, welches mit 2 Wasserstoffionen zu H2O2 reagiert. Daraus entsteht mithilfe einer Peroxidase unter Oxidation eines Substrats Wasser. Als Alternative kann auch durch die Katalase aus 2 Wasserstoffperoxidmolekülen Wasser und Sauerstoff gebildet werden [16]. Die SOD kommt in Säugerzellen als kupfer- und zinkhaltige Cu,ZnSOD und als manganhaltige MnSOD vor. Die MnSOD ist überwiegend in der mitochondrialen Matrix, die Cu,ZnSOD überwiegend im Zytosol lokalisiert [17,18]. Eine Hochregulation der SOD wird bei vielen Krankheiten, die mit ROS in Verbindung gebracht werden, beobachtet.
Dazu zählen einige neurologische Erkrankungen, wie Mb. Parkinson, Mb. Alzheimer oder Amyotrophe Lateralsklerose, bestimmte anämische Störungen der roten Blutkörperchen sowie verschiedene maligne Neoplasien [17].
Ist es bereits zu Proteinschäden im Rahmen von oxidativem Stress gekommen, so können diese bis zu einem bestimmten Ausmaß von initial vorhandenen oder induzierbaren Reparaturproteinen rückgängig gemacht werden. Einige kovalente Modifikationen an der Primärstruktur von Proteinen können durch Enzyme, wie die Thioredox-Reduktase, die Disulfid-Isomerase oder die Methionin-Sulfoxid-Reduktase, behoben werden. Die Tertiärstruktur kann z. T. von Chaperonen durch erneute Faltung wieder hergestellt werden [11]. Chaperone sind Proteine, die zu den Hitzeschockproteinen (Hsp) gehören und mithilfe einiger Coenzyme die korrekte Faltung von neuen oder fehlgefalteten Proteinen unter ATP-Verbrauch katalysieren. Sie haben eine große Affinität zu hydrophoben Aminosäureresten, die bei abnorm gefalteten Proteinen an die Oberfläche treten. Indem Chaperone an diese hydrophoben Bereiche binden, verhindern sie die Bildung von großen Aggregaten aus fehlgefalteten Proteinen und schaffen gleichzeitig günstige Bedingungen für eine korrekte Faltung [22].
1.1.4 Abbau oxidativ geschädigter Proteine durch das 20S-Proteasom
Proteine, die so stark geschädigt sind, dass sie nicht repariert werden können, werden abgebaut, wie die gesteigerte Proteolyserate nach mildem oxidativen Stress zeigt [4].
Bei extremer oxidativer Schädigung nimmt die Proteolyse-Aktivität allerdings ab. Dies ist darauf zurückzuführen, dass gravierend veränderte Proteine in großen Aggregaten
einen bestimmten Grad an Schädigung, bei dem die Proteolyse maximal gesteigert ist.
Für Hämoglobin wurde z. B. eine maximale Abbaurate durch isolierte Erythrozyten- Proteasomen bei einer H2O2-Konzentration von 30 µM beobachtet [11].
Der Abbau von intrazellulären Proteinen findet hauptsächlich im Proteasom statt und ist komplex reguliert [7]. Proteasomen sind primär im Zytosol lokalisiert, kommen aber auch im Nukleus, in der Zellmembran sowie in Teilen des Zytoskeletts und des endoplasmatischen Retikulums vor. Einige α-Untereinheiten enthalten nukleäre Lokalisationssignale (NLS), was das Vorkommen von Proteasomen im Zellkern bestätigt [6].
Als Hauptformen des Proteasoms werden das ca. 700 kDa schwere 20S-Proteasom, das in Säugerzellen die vorherrschende Form darstellt [10], und das ca. 2000 kDa schwere 26S-Proteasom unterschieden. Das 20S-Proteasom, das auch die Grundstruktur des 26S- Proteasoms bildet, ist ein röhrenförmiger Proteinkomplex mit einer Länge von 17 nm und einem Durchmesser von ca. 12 nm. Er besteht aus insgesamt 4 Ringen, 2 äußeren α- und 2 inneren β-Ringen, die ihrerseits aus jeweils 7 Untereinheiten aufgebaut sind [6,11]. Die α-Ringe bilden Barrieren zwischen Zytoplasma und den proteolytisch aktiven Innenseiten der β-Ringe. Bestimmten β-Untereinheiten können verschiedene Peptidase-Aktivitäten zugeordnet werden. Die β1-Untereinheit schneidet chymotrypsin- ähnlich nach hydrophoben Aminosäuren, die β2-Untereinheit trypsinähnlich nach sauren Aminosäuren und die β5-Untereinheit caspaseähnlich nach basischen Aminosäuren. Daneben gibt es noch eine „branched chain aminoacid peptidase“
(BrAAP), die nach verzweigtkettigen Aminosäuren spaltet sowie eine „small neutral aminoacid peptidase“ (SNAAP), die nach kleinen neutralen Aminosäuren schneidet.
Mithilfe dieser Peptidasen baut das Proteasom Proteine zu Peptiden mit einer Größe von 3–25 Aminosäuren ab [6].
Dass auch oxidativ geschädigte Proteine proteasomal abgebaut werden, zeigen Versuche mit proliferierenden Zellen nach Stimulation mit H2O2. Nach mildem oxidativen Stress tritt eine Steigerung der Proteolyseaktivität auf, die durch Proteasom- Inhibitoren, wie Lactacystin oder NLVS, gehemmt werden kann [4,5,10]. Außerdem wurde in der humanen Leukämie-Zelllinie K562 eine zeitabhängige Steigerung der proteasomalen Aktivität nach Stimulation mit H2O2 gefunden, die nach 15 min ihr Maximum erreicht hatte und durch Lactacystin gehemmt werden konnte [4]. Von den beiden Haupttypen des Proteasoms, 20S und 26S, ist hauptsächlich das 20S-Proteasom für die Proteolyse oxidativ veränderter Proteine zuständig [11]. In K562-Zellen konnte
im Vergleich von oxidativ modifizierten und nativen Histonproteinen gezeigt werden, dass das 20S-Proteasom selektiv oxidativ veränderte Histone abbaut [4]. Passend zu dieser Aufgabe ist das 20S-Proteasom resistenter gegenüber oxidativer Schädigung durch H2O2 als das 26S-Proteasom [10].
Zu der Frage, wie das 20S-Proteasom oxidierte Proteine erkennt, bzw. wie der Abbau oxidativ geschädigter Proteine durch das 20S-Proteasom auf molekularer Ebene reguliert ist, gibt es verschiedene Beobachtungen. Zum einen bevorzugt das 20S- Proteasom hydrophobe aromatische und aliphatische Aminosäurereste. Während diese im unbeschädigten Protein durch die Tertiär- und Quatärstruktur nach innen gekehrt sind, treten sie durch Strukturänderungen im Rahmen der oxidativen Schädigung nach außen. So könnten diese hydrophoben Reste durch das 20S-Proteasom erkannt werden und ein Signal zum Abbau darstellen. Tatsächlich besteht eine Korrelation zwischen Oberflächenhydrophobizität und proteolytischem Abbau von Proteinen [11]. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass der Abbau von oxidiertem Calmodulin durch isolierte 20S-Proteasome von dem Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) abhängig ist [14].
Hsp90 kann an das 20S-Proteasom binden und wird in aufgereinigten 20S-Proteasom- Präparationen gefunden. Aus Erythrozyten isolierte 20S-Proteasome bauen in Ab- wesenheit von Hsp90 weder oxidiertes noch natives Calmodulin ab. Nach Zugabe von Hsp90 wird selektiv das oxidierte Calmodulin abgebaut. Außerdem kann die proteasomale Aktivität in der Zelle durch Hsp90-Inhibitoren reduziert werden [14].
Darüber hinaus wird das 20S-Proteasom durch die poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) dazu aktiviert, oxidativ geschädigte Proteine abzubauen. PARP wird, wie weiter unten beschrieben, durch DNA-Strangbrüche im Rahmen des oxidativen Stresses aktiviert. Unter Umsetzung von NAD+ bindet es polymere ADP-Ribosen u. a. an oxidativ geschädigte Histonproteine sowie an sich selbst. Auch das 20S-Proteasom wird nach Inkubation mit H2O2 durch PARP poly(ADP-ribosyl)iert, wie in Versuchen mit C14-markiertem NAD+ gezeigt werden konnte [4]. Weitere Hinweise für die essentielle Rolle von PARP beim proteasomalen Abbau oxidativ modifizierter Proteine ist zum einen die Tatsache, dass die Proteolyse von oxidierten Histonproteinen durch PARP- Inhibitoren gehemmt werden kann [4], zum anderen die Korrelation von proteasomaler Aktivität nach oxidativem Stress mit dem Expressionsniveau von PARP-Proteinen [5,24].
Neben dem Abbauweg oxidativ veränderter Proteine über das 20S-Proteasom wird auch eine Beteiligung des Immunoproteasoms am Abbau dieser Proteine diskutiert [10]. Ein
Immunoproteasom entsteht durch Austausch der β-Untereinheiten β1, β2 und β5 in die modifizierten Untereinheiten β1i, β2i und β5i nach Induktion durch verschiedene Zytokine, wie IFNγ, IFNβ und TNFα [6].
1.1.5 Andere Proteinabbauwege
Das 26S-Proteasom stellt neben dem 20S-Proteasom die zweite Proteasom-Hauptform dar. Es besitzt eine Grundstruktur, die dem 20S-Proteasom entspricht, und trägt zusätzlich an beiden Röhrenenden noch eine 19S-Regulatoreinheit (PA 700). Diese besteht aus zwei Subkomplexen mit insgesamt 17 Untereinheiten, darunter 6 AAA- ATPasen („ATPase associated with various cell activities“). Tatsächlich ist die Proteolyse im 26S-Proteasom, im Gegensatz zu der im 20S-Proteasom, ATP-abhängig [6, 10].
Ein weiterer Unterschied in der proteolytischen Aktivität der beiden Proteasom- Haupttypen 20S und 26S besteht darin, dass das 26S-Proteasom Proteine abbaut, die zuvor durch eine angehängte Poly-Ubiquitin-Kette markiert wurden. Ubiquitin ist ein 76 Aminosäuren großes ubiquitär vorkommendes Protein, das mithilfe der Enzyme E1 (Ubiquitin-aktivierendes Enzym), E2 (Ubiquitin-Carrier-Protein) und E3 (Ubiquitin- Protein-Ligase) kovalent an Substratproteine gebunden wird. Da es mehrere hundert verschiedene E3-Enzyme gibt, können je nach Bedarf und zellulären Bedingungen hochselektiv ganz bestimmte Proteine ubiquitiniert und somit zum Abbau markiert werden. Die Funktion der 19S-Regulatoreinheit des 26S-Proteasoms ist dabei die eines Türstehers. Mithilfe von Ubiquitin-bindenden Untereinheiten erkennt und bindet sie ubiquitinierte Proteine. Unter ATP-Verbrauch kann sie diese auffalten sowie den α-Ring des Proteasoms für das abzubauende Protein öffnen [6,7].
Das ubiquitinierte Substratprotein wird durch verschiedene Chaperone zum 26S- Proteasom geleitet. Eines davon ist das 97 kDa schwere „valosin containing protein“
(VCP oder p97). Es gehört zur Gruppe der AAA-ATPasen, ist hauptsächlich im Zytosol, aber auch im Nukleus lokalisiert und bindet an Polyubiquitin-Ketten. Es gibt Hinweise dafür, dass VCP das Substratprotein unter ATP-Spaltung aus dem es umgebenden Proteinkomplex herauslöst, um es für den Abbau im 26S-Proteasom vorzubereiten [27]. VCP spielt in Verbindung mit dem Ubiquitin-26S-Proteasom- System außerdem eine Rolle in verschiedenen Zellprozessen, wie Membranfusion, Zellzyklus-Regulation, Apoptose und zellulären Reaktionen auf Stress-Situationen.
Unter anderem wirkt VCP antiapoptotisch und proliferationsfördernd [28]. Dazu passend wird in vielen Tumorzellen eine gesteigerte VCP-Expression beobachtet [28].
Neben seiner primären Aufgabe, der Proteolyse, werden dem Proteasom, z. T. in Verbindung mit Ubiquitin, Beteiligungen an vielen verschiedenen Zellprozessen zugesprochen, darunter Zellzykluskontrolle und Zellteilung, Zellwachstum und Differenzierung, Transkriptions-regulation, Immun- und Entzündungsreaktionen, Signaltransduktion, Qualitätskontrolle und Beseitigung fehlgefalteter Proteine sowie Apoptose [6–8].
Beim Abbau oxidativ geschädigter Proteine spielt das Ubiquitin-26S-Proteasom-System allerdings keine große Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass zum einen Zellen mit gestörter Ubiquitinierungsaktivität (nach E1-Inaktivierung) trotzdem oxidierte Proteine mit unveränderter Aktivität abbauen, und zum anderen die Oxidation bestimmter Proteine, wie Ferritin oder Lysozym, deren Ubiquitinierungsrate nicht steigert.
Außerdem kann der Abbau oxidativ geschädigter Proteine durch Zugabe von ATP nicht verstärkt werden, sondern nimmt in Erythrozyten nach Zugabe von ATP sogar um 10–20 % ab [10,11]. Diese Beobachtungen sprechen gegen den Abbau oxidativ geschädigter Proteine durch das 26S-Proteasom.
Eine andere proteolytisch aktive Zellstruktur stellt das Lysosom dar. Dies ist ein membranumgebenes Zellorganell, in dem verschiedene hydrolytische Enzyme lokalisiert sind, die ihr pH-Optimum im sauren Milieu haben. Im Lysosom können sowohl phagozytierte, exogene Proteine und größere exogene Partikel als auch endogene Proteine und Zellorganellen abgebaut werden.
Die lysosomale Proteolyse ist im Vergleich zur proteasomalen Proteolyse weniger spezifisch, da das Lysosom weder die unterschiedlichen Halbwertszeiten verschiedener endogener Proteine beachtet, noch auf wechselnde physiologische Rahmen- bedingungen, wie Nährstoffangebot, Hormonspiegel oder zellulären Stress, reagieren kann. Inhibition des Lysosoms hat einen gewissen Einfluss auf den Abbau langlebiger endogener Proteine, aber keinen auf den Abbau kurzlebiger [7]. Daher wird das Lysosom vor allem mit dem Abbau intrazellulärer Proteine mit langen Halbwertszeiten und dem ganzer Zellorganellen sowie extrazellulärer Proteine in Verbindung gebracht.
Für den spezifischeren Abbau von kurzlebigen und regulatorischen Proteinen sowie für den Proteinabbau als Anpassung auf wechselnde Bedingungen ist dagegen das Proteasom verantwortlich [7]. Bei der Reaktion auf oxidativen Stress und beim Abbau oxidativ geschädigter Proteine spielt das Lysosom keine besondere Rolle, wie Versuche
mit extrazellulärem, oxidativ geschädigtem Apolipoprotein B bekräftigen. Nach erfolgter Endozytose ins Lysosom wird dieses Protein nur in geringem Ausmaß abgebaut und akkumuliert vielmehr im Lysosom [11]. Darüber hinaus ist nach Endozytose die Halbwertszeit im Lysosom für oxidiertes Albumin länger als die für natives Albumin [11].
1.1.6 PARP-Aktivität bei oxidativem Stress
Eine unmittelbare Reaktion auf oxidative DNA-Schädigungen ist die Aktivierung der poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), die unter Verbrauch von NAD+ und Ab- spaltung von Nicotinamid verzweigte Ketten von bis zu 200 ADP-Ribosen an Akzeptorproteine kovalent bindet. Diese posttranslationale Modifikation kommt in fast allen kernhaltigen Zellen vor. Durch das angehängte, stark negative ADP-Ribose- Polymer verändern sich die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Akzeptorproteins. Dies beeinflusst z. B. die Interaktionsmöglichkeiten zwischen zwei Proteinen oder die Affinität von Kernproteinen zur ebenfalls negativ geladenen DNA.
Natürlicher Gegenspieler von PARP ist das Enzym poly(ADP-Ribose)-Glycohydrolase (PARG), das von ADP-Ribose-Polymeren terminale ADP-Ribose-Monomere abspaltet.
Damit diese in der Zelle keine weiteren Proteinschäden durch Ribosylierung verursachen, werden sie direkt nachfolgend von der ADP-Ribose-Pyrophosphatase in AMP und Ribose-5-Phosphat gespalten [1].
Die verschiedenen Mitglieder der PARP-Familie, von denen heute 18 bekannt sind, kommen in unterschiedlichen Zellkompartimenten vor [1,3]. Während über einige noch wenig bekannt ist, wurden andere mit verschiedensten Funktionen in vielen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht, wie z. B. PARP-1, -2 und -3 mit DNA-Reparatur, Genom-Stabilitätssicherung und Transkriptionsregulation, Tankyrase-1 und -2 mit Mitose und Modulation der Telomer-Länge sowie vault-PARP mit der Regulation von endosomalem Vesikeltransport [1–3]. Auch an der Regulation des proteasomalen Proteinabbaus [4,5] und an Apoptosevorgängen sind PARP-Proteine beteiligt [46]. Das am besten erforschte Mitglied der PARP-Familie ist PARP-1, ein überwiegend nukleäres Enzym, das aus 3 Domänen besteht, die sich noch in 6 Module (A–F) unterteilen lassen. N-terminal befindet sich die DNA-bindende Domäne (DBD) mit zwei Zinkfinger-Motiven und einem nukleären Lokalisationssignal (NLS), das PARP-1 als Kernprotein ausweist. Zusätzlich besitzt PARP-1 eine Automodifikations-Domäne
und eine C-terminal liegende katalytische Domäne, die NAD+ binden, ADP-Ribose übertragen und Kettenverzweigungen katalysieren kann [1].
Einzel- oder Doppelstrangbrüche in der DNA, z. B. durch ionisierende Strahlen, Alkylantien oder Oxidantien, steigern die Aktivität von PARP-1 in wenigen Minuten um das 100fache. Das bedeutendste Akzeptorprotein für die poly(ADP-Ribosyl)ierung ist dabei PARP-1 selber. Neben dieser Automodifikation, werden aber auch andere, meist mit dem Chromatin assoziierte Proteine, wie Histone, DNA-Ligasen, DNA- Polymerasen, DNA-Topoisomerasen sowie die Transkriptionsfaktoren p53 und NFκB, poly(ADP-ribosyl)iert. Durch die Änderung von Struktur und Ladung dieser Proteine ändert sich auch ihre Beziehung zur DNA, was wiederum Änderungen in der Chromatinstruktur zur Folge hat [1,2]. Dies könnte Reparaturproteinen, wie z. B.
„single strand break repair“ (SSBR)-Enzymen, den Zugang zur geschädigten DNA ermöglichen. Auch die Rekrutierung des Reparaturfaktors XRCC1 an der geschädigten DNA wird durch PARP-1-Aktivität begünstigt. Unabhängig von ganzen DNA- Strangbrüchen tritt PARP-1-Aktivität auch nach Schäden an einzelnen Basen im Rahmen des „base excision repair“ (BER)-Prozesses auf. Dabei gibt es direkte Interaktionen zwischen PARP-1 und der DNA-Ligase III [2].
Auch am Abbau oxidativ geschädigter Histone ist PARP-1 indirekt beteiligt. Bei PARP- Inhibition durch 3-ABA, 6(5H)Phenanthridinon oder 4-Amino-1,8-Naphthalimid ist der Abbau von oxidierten Histonen nach H2O2-Behandlung sowohl in vitro als auch in vivo deutlich gehemmt [4]. Durch poly(ADP-Ribosyl)ierung aktiviert PARP-1 das 20S-
Proteasom, das oxidativ geschädigte Proteine abbaut [4]. In Versuchen mit [14C]-markiertem NAD+ und H2O2 mit und ohne PARP-Inhibitoren konnte in der
anschließenden Untersuchung des 20S-Proteasoms gezeigt werden, dass dieses tatsächlich selbst Substrat für die poly(ADP-Ribosyl)ierung durch PARP ist [4].
Abgesehen von der Reaktion auf oxidative Schäden erfüllt PARP-1 in der Zelle noch weitere Aufgaben. So gibt es z. B. Hinweise darauf, dass Mitglieder der PARP-Familie eine wichtige Rolle in der Stabilitätssicherung des Genoms während der Mitose spielen [2]. Des Weiteren wurden Interaktionen von PARP-1 mit verschiedenen Transkriptions- faktoren, z. B. NFκB, beschrieben, so dass PARP-1 möglicherweise eine Rolle an der Transkriptionsregulation spielt [1,25].
Wie bedeutend die Rolle von PARP-1 in der Sicherung der Integrität des Genoms ist, zeigen Versuche an Mäusen mit PARP-1-Defekt. Diese sind sowohl auf zellulärer Ebene als auch auf der Ebene des gesamten Organismus hypersensitiv für ionisierende
Strahlung, Alkylantien und Oxidantien [2]. Außerdem sind die Rekrutierung des Faktors XRCC1 beim „single strand break repair“ und bestimmte Schritte beim „base excision repair“ in Zellen mit PARP-1-Defekt beeinträchtigt [2]. Doppel-Knockout- Mäuse, die weder PARP-1 noch PARP-2, das ebenfalls durch DNA-Strangbrüche aktiviert wird und mit Proteinen des SSBR und BER interagiert, exprimieren, sind nicht lebensfähig und sterben sehr früh in der Embryonalphase ab [1,2].
Neben all diesen zellerhaltenden Funktionen ist PARP-1 auch in Apoptosevorgänge involviert. So wurden in frühen Apoptosephasen massive Formationen von poly(ADP- Ribosen) beobachtet [1]. Außerdem induziert PARP-1 nach Einleitung der Apoptose die Translokation des proapoptotischen Proteins „apoptosis-inducing factor“ (AIF) aus dem Intermembranraum des Mitochondriums in den Zellkern, wo dieses an der Kon- densation des Chromatins und der Fragmentation der DNA beteiligt ist. Darüber hinaus kann eine Überaktivierung von PARP-1 auch zu nekrotischem Zelltod durch einen übermäßigen NAD+-Verbrauch führen [1]. Aufgrund dieser beiden Mechanismen sowie über die Aktivierung des proinflammatorischen Faktors NFκB wird PARP mit einigen entzündlichen Erkrankungen und mit zerebralen und myokardialen Ischämie- Reperfusions-Schäden in Verbindung gebracht [1,2]. PARP-1-Knockout-Mäuse sind tatsächlich weniger vulnerabel für ischämische Hirn- und Myokardinfarkte, septischen Schock und auch für induzierbaren Diabetes mellitus [1–3].
1.1.7 Physiologische und pathophysiologische Beispiele für oxidativen Stress
Da in der mitochondrialen Atmungskette kontinuierlich geringe Mengen ROS als Nebenprodukte entstehen, gehören oxidative Modifikationen von zellulären Strukturen zu den natürlichen Konsequenzen des aeroben Stoffwechsels [18,11]. Die Aufsummierung dieser im Laufe des Lebens entstehenden Schäden tragen zum Alterungsprozess von Zellen, Geweben und Organismen bei. Gleichzeitig nimmt die proteolytische Aktivität und damit die Regeneration von Schädigungen im Alter ab [9,14]. Alterserscheinungen, wie Katarakt oder altersabhängige Muskeldegeneration, sind mit ROS-Schäden assoziiert [17]. Außerdem gehört die Produktion von ROS durch Abwehrzellen zur normalen Entzündungsreaktion. In aktivierten Monozyten kann durch H2O2 u. a. die Produktion der Inflammationsfaktoren Cyclooxygenase 2, Prostaglandin E2 und Matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1) stimuliert werden [20].
Daher kommen oxidative Zellschäden auch bei entzündlichen und allergischen Erkrankungen, wie Arthritis, Sepsis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen oder Asthma vor [20,16]. Bei Ischämie-Reperfusions-Schäden, die z. B. bei Myokard- oder Hirninfarkten, bei Schockzuständen, Operationen an inneren Organen oder Organtransplantationen auftreten, entsteht ein Großteil des Schadens während der Reperfusion des zuvor ischämischen Gewebes. Dabei werden neben Entzündungs- mediatoren auch ROS freigesetzt, die zum Gewebeschaden erheblich beitragen [9,15].
Auch physikalische und chemische Noxen, wie UV- oder Röntgenstrahlung, Ethanol und viele Medikamente, induzieren die Produktion von ROS und schädigen u. a.
dadurch Zellen und Gewebe [16].
Darüber hinaus spielen ROS auch eine Rolle bei der Entstehung von Atherosklerose,
verschiedenen Karzinomen [20], einigen neurologischen Erkrankungen, wie Mb. Parkinson oder Mb. Alzheimer [9,17], sowie bei Zellschädigung durch
Hyperglykämie [30].
1.1.8 Anwendung oxidativ schädigender Substanzen in der Krebstherapie
Oxidativer Stress wird in der Chemotherapie vieler maligner Neoplasien zur Schädigung der Tumorzellen eingesetzt. Doxorubicin (Adriamycin), Daunorubicin, Epirubicin und andere Anthrazykline reichern sich im Zellkern an und wirken überwiegend über die Freisetzung von freien Sauerstoffradikalen, die in der Tumorzelle DNA, Histone und anderer Strukturen oxidativ schädigen und DNA-Protein-Crosslinks bzw. Protein-Protein-Crosslinks erzeugen. ROS werden in der Tumorzelle durch Verstoffwechselung des Zytostatikums oder durch Redox-Reaktionen gebildet [4,13,47]. Werden die autonom proliferierenden, humanen Leukämiezelllinien U937 und TUR mit Adriamycin inkubiert, so wird, ähnlich wie bei der Inkubation dieser Zellen mit H2O2, eine Aktivitätssteigerung des Proteasoms beobachtet, wobei das Maximum nach 15 min erreicht wird [13]. Diese Aktivitätssteigerung des Proteasoms ist durch den PARP-Inhibitor 3-ABA um etwa 50 % hemmbar, was anzeigt, dass auch bei der zellulären Reaktion auf oxidativen Stress durch Adriamycin PARP den proteasomalen Proteinabbau aktiviert [13]. In Co-Immunopräzipitationen von Adriamycin- behandelten U937-Zellen mit einem anti-PARP-Antikörper können,
Untereinheiten nachgewiesen werden, was auf eine Assoziation von PARP mit dem 20S-Proteasom nach oxidativem Stress schließen lässt. Sowohl PARP-Inhibitoren als auch Proteasom-Inhibitoren machen die Zellen empfindlicher für Adriamycin und senken die Adriamycin-Dosis, die notwendig ist, um eine letale Wirkung zu erzielen [13]. All diese Beobachtungen gelten nicht für nichtproliferierende, differenzierte U937-Zellen, was darauf hinweist, dass der Abbau oxidativ modifizierter Proteine über das von PARP aktivierte Proteasom einen Mechanismus darstellt, der hauptsächlich in proliferierenden, wenig differenzierten Zellen aktiv ist [5,13]. Tumorzellen, die häufig erhöhte PARP- und Proteasom-Aktivitäten zeigen [4], können resistent gegen Medikamente wie Adriamycin sein oder im weiteren Verlauf nach erfolgter Chemotherapie Rezidive entwickeln. Im direkten Vergleich der Zellreihe U937 mit der Zellreihe TUR, die eine höhere PARP- und Proteasom-Aktivität aufweist [18], zeigt sich, dass bei TUR-Zellen für eine letale Wirkung eine höhere Adriamycin-Dosis nötig ist. TUR-Zellen sind also dank ihrer gesteigerten Aktivität von PARP und ihrer erhöhten proteasomalen Aktivität gegen dieses Chemotherapeutikum resistenter als U937-Zellen. Beim Vergleich der Malignitätsgrade beider Zelllinen in vivo wird in der Tat bei den TUR-Zellen ein deutlich aggressiveres Tumorwachstum in immun- defizienten SCID-Mäusen gefunden als bei den U937-Zellen [13,18].
1.2 Zytoskelett und Motorproteine
1.2.1 Filamente des Zytoskeletts
Das Zytoskelett ist ein Netzwerk aus Proteinfilamenten, das das Zytosol von eukaryotischen Zellen durchzieht. Es gibt der Zelle ihre Form, Stabilität und räumliche Struktur. Die drei Hauptarten der Filamente sind Aktinfilamente, Mikrotubuli und Intermediärfilamente. Sie unterscheiden sich in Aufbau und Funktion.
Aktinfilamente (auch Mikrofilamente genannt) sind Polymere des Proteins Aktin, die sich zu doppelsträngigen helikalen Filamenten zusammenlagern. Die Aktinmonomere (G-Aktin) binden dabei in Kopf-zu-End-Formation aneinander, so dass das polymere Aktinfilament (F-Aktin) eine Polarität mit einem Plus- und einem Minus-Ende aufweist.
Unter ATP-Verbrauch werden am Plus-Ende des Filaments Aktinmonomere angehäuft, während am Minus-Ende Aktinmonomere abgebaut werden. Diese ständige Dynamik macht es möglich, auf wechselnde Rahmenbedingungen und Anforderungen flexibel und schnell zu reagieren [22]. Beim Menschen gibt es 6 Aktin-Isoformen. Davon kommen 3 α-Aktin-Isoformen in Muskelzellen vor, eine β-Aktin-Isoform in nicht- muskulären Zellen sowie 2 γ-Aktin-Isoformen in nichtmuskulären Zellen und in glatter Muskulatur [31]. Aktinfilamente bilden verformbare Netze, die überall in der Zelle verteilt sind, wobei die größte Dichte im Zellcortex unterhalb der Zellmembran zu
finden ist. Durch eine Vielzahl von Hilfsproteinen, wie Fimbrin, Filamin oder α-Actinin, sind sie miteinander quervernetzt, wodurch die Festigkeit dieses Netzwerkes
deutlich erhöht wird. Die Art der Quervernetzung entscheidet dabei über die Eigenschaften des Aktin-Netzwerkes. Während eine Vernetzung durch Fimbrin- Proteine zur Ausbildung von dichten, parallelen Bündeln führt, welche in Filopodien enthalten sind, formen sich bei Quervernetzung durch α-Actinin lose gebündelte Stressfasern, die mit Myosin-Motorproteinen interagieren können. Mit einem Durchmesser von 5–9 nm stellen Aktinfilamente die feinsten Filamente des Zytoskeletts dar. Sie legen die Form der Zelle fest, ermöglichen Zellwanderung und bilden Mikrovilli und andere Zellfortsätze. In sogenannten Fokalkontakten (oder Adhäsions- plaques) sind Aktinfilamente an der extrazellulären Matrix verankert. Dies erhöht die Stabilität des Gewebes und gibt den Aktinfilamenten die Möglichkeit, Zug auf umliegende Strukturen auszuüben [22].
Microtubuli sind aus Tubulin aufgebaut, welches lange, starre Hohlzylinder mit einem Durchmesser von 25 nm bildet. Mit einem Ende sind die Mikrotubuli einer Zelle am Centrosom befestigt. Mit dem anderen Ende ziehen sie von dort aus sternförmig in die Zellperipherie. Dieses periphere Ende unterliegt einem ständigen, dynamischen Wechsel zwischen An- und Abbau von Tubulinmonomeren. Mikrotubuli sind verantwortlich für intrazellulären Vesikeltransport, für die Ausbildung von beweglichen Zilien und Flagellen an der Zelloberfläche sowie für die Trennung der Chromatiden durch die Mitosespindel während der Zellteilung [22].
Intermediärfilamente sind aus spezifischen Proteinen aufgebaut und bilden seilartige Fasern mit einem Durchmesser von 10 nm. Sie verleihen der Zelle mechanische Festigkeit und nehmen Zugkräfte auf. Anders als Aktin und Tubulin, die stark konserviert sind, kommen Intermediärfilamente in großer Vielfalt vor und zeigen eine relativ ausgeprägte Gewebespezifität [22].
1.2.2 Interaktionen von Zytoskelett-Filamenten mit Motorproteinen
Motorproteine können sich mit ihrer Kopfdomäne entlang der Filamente des Zytoskeletts bewegen. Durch einen Zyklus aus Bindung an die Filamente, Konformationsänderung, ATP-Hydrolyse, Lösung von den Filamenten, Rückstellung der Konformation und erneuter Bindung an die Filamente gleitet das Motorprotein Schritt für Schritt am Zytoskelett-Filament entlang. Je nach Funktion des einzelnen Motorproteins werden mit den unterschiedlichen Schwanzdomänen z. B. membran- umhüllte Organellen entlang der Filamente durch die Zelle transportiert oder Filamente gegeneinander bewegt. Durch gegeneinander gleitende Filamente entstehen sowohl Muskelkontraktionen und Zilien- oder Flagellenbewegungen als auch Zellkontraktionen und das Zusammenziehen des kontraktilen Rings am Ende der Mitose. Die Motorproteine der Aktinfilamente gehören zur Familie der Myosine, die der Mikrotubuli zur Familie der Dyneine oder Kinesine [22]. Auf die beiden Letztgenannten wird hier nicht weiter eingegangen.
Die Myosine bilden beim Menschen eine Proteinfamilie mit etwa 40 ein- oder zweiköpfigen Mitgliedern, die sich meist vom Minus- zum Plus-Ende des Aktinfilaments bewegen. Sie kommen in unterschiedlichen Zellen vor und erfüllen vielfältige Funktionen. Das bekannteste Mitglied dieser Familie ist das zweiköpfige Myosin II. Es besteht aus zwei gestreckten schweren Ketten, deren Schwanzdomänen
eine α-helikale Doppelwendel bilden und deren Kopfdomänen jeweils zwei leichte Ketten tragen. Die Schwanzdomänen mehrerer hundert Myosinmoleküle lagern sich zu bipolaren Myosinfilamenten zusammen. In Muskelzellen bilden regelmäßig an- geordnete Myosin- und Aktinfilamente Myofibrillen, die die kontraktilen Elemente der Muskelfasern darstellen [22].
Auch in nichtmuskulären Zellen kommt Myosin II (non-muscle Myosin IIa und IIb) vor. Es liegt in diesen Zellen in zwei unterschiedlichen Konformationen vor. Im gestreckten Zustand, der gewissermaßen die aktive Form darstellt, können Myosinmoleküle bipolare Filamente bilden. Im gebogenen, inaktiven Zustand gehen Schwanz- und Kopfdomäne wahrscheinlich Wechelwirkungen miteinander ein.
Reguliert wird dieser Konformationszustand der Myosinmoleküle durch die calciumabhängige „myosin light chain kinase“ (MLCK). Dieses Enzym phosphoryliert eine der beiden leichten Ketten, was die gestreckte Form des Myosinmoleküls begünstigt. Eine erhöhte MLCK-Aktivität wird u. a. bei der Umstrukturierung von Aktinfilamenten und Myosin II zu kontraktilen Stressfasern sowie bei der Bildung des kontraktilen Rings am Ende der Zellteilung beobachtet [22].
1.3 Membran und extrazelluläre Matrix
1.3.1 Aufbau der Zellmembran
Zellmembranen bestehen aus einer Doppelschicht von amphiphilen Lipidmolekülen, deren hydrophobe Enden zum Inneren der Doppelschicht ausgerichtet sind, während die hydrophilen Enden in Richtung des Extrazellularraums und in Richtung des Zellinneren weisen. Unter den Lipidmolekülen der Zellmembran gibt es neben den Neutrallipiden Phospholipide, die den überwiegenden Teil ausmachen, Glykolipide und Cholesterin sowie auch komplexe Strukturen, wie Ceramide und Lecithine. Phospholipide bestehen aus einer polaren Phosphatgruppe, das über Glycerin an zwei unpolare
Fettsäureschwänze gebunden ist. Diese Fettsäureschwänze bestehen aus 14–24 Kohlenstoffatomen und können Doppelbindungen enthalten, die einen Knick in
der Alkylkette verursachen und so die Fluidität der Membran vergrößern. Zu den Hauptphospholipiden zählen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphati- dylserin und Sphingomyelin. Daneben gibt es z. B. noch die selteneren Inositol- phospholipide. Die Lipiddoppelschicht ist fluide, d. h. einzelne Lipidproteine können innerhalb der Schicht diffundieren. Zudem steht die Zellmembran in ständigem Austausch mit den intrazellulären Membranen von Zellorganellen. Etwa 50 % der Zellmembran wird durch Membranproteine gebildet. Diese können als Transmembran- proteine mit hydrophoben und hydrophilen Anteilen so in die Membran eingebettet sein, dass sie diese ein- oder mehrfach durchmessen und auf beiden Membranseiten mit anderen Proteinen interagieren können. Andere Membranproteine sind nur in einer der beiden Schichten der Lipiddoppelschicht verankert. Membranproteine haben ganz unterschiedliche Funktionen, z. B. als Rezeptoren, Enzyme, Transportproteine, Ionen- kanäle, Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Adhäsionsproteine. Darüber hinaus ist eine eukaryotische Zelle von einer Schicht aus Oligosacchariden, die kovalent an Membranproteine und -lipide gebunden sind, sowie aus integralen Proteoglykanen und Polysaccharidketten umgeben, die die Zelle vor mechanischen und chemischen Schäden schützt und Zell-Zell-Interaktionen beeinflusst [22].
Bestandteile der Zellmembran sind, ebenso wie die oben beschriebenen Strukturen, durch ROS-induzierte Schäden gefährdet. Geschädigte Proteine werden z. T. durch gleichzeitig entstehende Lipid-Radikale fraktioniert. Für zytosolische Proteasen sind nur die hydrophilen Domänen der Membranproteine erreichbar, die ins Zytosol ragen.
Hinweise für die Existenz von integralen Membranproteasen wurden ebenfalls gefunden [11].
1.3.2 Extrazelluläre Matrix und Matrixmetalloproteinasen
Zellen sind im Gewebeverband in eine hochkomplexe extrazelluläre Matrix eingebettet, die aus verschiedenen Proteinfasern, wie Kollagen, Laminin, Fibronectin, Elastin, Entactin, Vitronectin, Gelatin und Fibrillin, in einem hydratisierten Gel aus Glykosaminoglykanen besteht. Unter den Proteinfasern gibt es zum einen Elastinfasern, welche quervernetzte Strukturen bilden, die sich ausdehnen und wieder zusammenziehen können, zum anderen Kollagenfasern (Typ I, II, III und XI), die den Extrazellularraum in Form seilartiger Fibrillen durchziehen und ihm Stabilität geben.
Kollagen Typ IV und Laminin sind am Aufbau der Basalmembran beteiligt, welche die Epithelien von darunterliegenden Gewebeschichten trennt. Aufgabe der extrazellulären Matrix ist es u. a., Zell-Zell-Verbindungen im Gewebe zu ermöglichen sowie Zellform und -polarität zu bestimmen. Die Organisation der Faserproteine hat zudem einen Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts der angrenzenden Zellen und somit auch auf deren Ausbreitung. Außerdem binden Bestandteile der extrazellulären Matrix an Zelloberflächenrezeptoren und greifen in Signalübertragungswege ein [22,19].
Matrixmetalloproteinasen (MMP) bilden eine Gruppe von zink- oder calcium- abhängigen, extrazellulär aktiven Peptidasen, die nahezu alle Bestandteile der extrazellulären Matrix spalten können. Auch zahlreiche zellmembrangebundene und lösliche extrazelluläre Proteine, wie die Gerinnungsfaktoren Fibrinogen und Plasminogen oder bestimmte Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren, können von MMPs abgebaut werden. Im Menschen sind 23 verschiedene MMPs bekannt, die sich in den Strukturdomänen gleichen, aber in ihrer Substratspezifität variieren. Die meisten MMPs lassen sich in die drei Hauptgruppen der Kollagenasen, Gelatinasen und Stromalysine einteilen. Daneben gibt es noch die kleineren Gruppen der Membrantyp- MMPs, Matrilysine, Elastasen und sonstigen MMPs [19]. Matrixmetalloproteinasen werden u. a. von Zellen der monozytären Entwicklungslinie als inaktive Proenzyme sezerniert. Durch verschiedene Enzyme oder Substanzen, u. a. auch durch ROS, werden diese unter Abspaltung der Prodomäne extrazellulär aktiviert. Manche MMPs werden auf diese Weise durch andere MMPs aktiviert, wie z. B. MMP-1 durch MMP-7 [19,21].
Monozyten nach H2O2-Stimulation beobachtet, die von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB abhängig zu sein scheint [20].
MMPs spielen eine große Rolle bei unterschiedlichen Prozessen des Um- und Abbaus von Gewebe, z. B. bei der embryonalen Entwicklung, dem Knochenwachstum, der Angiogenese, dem Menstruationszyklus, der Rückbildung des postpartalen Uterus, der Wundheilung oder dem Umbau von geschädigten Gewebeverbänden. Auch bei krankhaften Prozessen, die mit Gewebeumbau verbunden sind, wie Entzündungen, Zirrhosen, Fibrosen, Sklerosen, Tumorwachstum oder Metastasierung spielen MMPs eine Rolle. Bei Immun- und Entzündungsreaktionen ermöglichen sie Entzündungszellen die Migration durch das Gewebe, aktivieren oder inaktivieren Zytokine durch Spaltung und wirken an der Antigenpräsentation an der Zelloberfläche von Ag-präsentierenden Zellen mit [19]. Im physiologischen Zustand stehen die MMPs in einem Gleichgewicht zu den „tissue inhibitors of matrixmetalloproteinases“ (TIMPs). Eine Störung dieses Gleichgewichts kann z. B. im Falle von Tumorzellen zu invasivem Wachstum und Metastasierung führen, da die MMPs es dem Tumor ermöglichen, Gewebe zu infiltrieren, Organgrenzen zu überschreiten, Basal-membranen zu durchbrechen, Zugang zu Lymph- und Blutgefäßen zu erlangen und dem Immunsystem zu entgehen.
Außerdem sind MMPs an der Aktivierung bzw. Deaktivierung von Wachstumsfaktoren, Zelladhäsionsmolekülen, Apoptosefaktoren, Angiogenesefaktoren etc. im Rahmen der Tumorentwicklung beteiligt. In vielen Tumoren wird daher eine erhöhte Expression von MMPs gefunden [21].
1.4 TUR, TUR asPARP und TUR pTracer
In dieser Arbeit werden Versuche zur Auswirkung von oxidativem Stress auf drei verschiedene Zelllinien durchgeführt, TUR, TUR asPARP und TUR pTracer. Bei der TUR-Zelllinie (ATCC CRL 2367) handelt es sich um eine Subklon der humanen, myelomonozytären Leukämiezelllinie U937 (ATCC CRL 1593.2) [64]. In U937-Zellen kann durch verschiedene Substanzen wie Phorbolestern, Vitamin D3, γ-Interferon oder Tumornekrosefaktoren (TNF) ein Proliferationsarrest und die Differenzierung entlang der monozytären Linie induziert werden [64]. Einer dieser Differenzierungsfaktoren ist 12-O-Tetradekanoylphorbol-13-Acetat (TPA). Die TUR-Zelllinie stellt einen TPA- resistenten Subklon der U937-Zelllinie dar, der 1992 von R. Hass und M. Hirano generiert wurde. TUR-Zellen zeigen monozytäre Eigenschaften, differenzieren sich nach Induktion durch den Phorbolester TPA jedoch nicht entlang des monozytären Differenzierungswegs, sondern fahren mit Proliferation fort [64]. Beim Vergleich der Malignitätsgrade beider Zelllinen in vivo zeigte sich, dass durch TUR-Zellen ein deutlich aggressiveres Tumorwachstum in immundefizienten SCID-Mäusen ausgelöst wird als durch U937-Zellen [13,18]. Gegenüber dem durch oxidativen Stress wirkenden Chemotherapeutikum Adriamycin sind TUR-Zellen unempfindlicher als U937-Zellen [13].
Ein weiterer Unterschied zwischen beiden Zelllinien stellt das Expressionslevel von PARP-1 dar. TUR-Zellen zeigen eine konsekutiv erhöhte PARP-1-Expression verglichen mit U937-Zellen [18]. Wird die PARP-Aktivität in den TUR-Zellen pharmakologisch mit 3-ABA gehemmt, so lässt sich erneut durch TPA eine Differenzierung der Zellen auslösen [25]. Dies zeigt, dass die erhöhte PARP-1-Aktivität in den TUR-Zellen zur TPA-Resistenz dieser Zellen führt. Es stellte sich die Frage, ob die erhöhte PARP-1-Expression außerdem einen Überlebensvorteil unter oxidativem Stress darstellt. Dazu konnte von Ciftci et al. 2001 [13] gezeigt werden, dass sowohl PARP-Inhibitoren als auch Proteasom-Inhibitoren U937- und TUR- Zellen empfindlicher für Adriamycin machen. Die Aktivität des 20S-Proteasoms, das oxidativ geschädigte Proteine abbaut, steigt unter oxidativem Stress in TUR-Zellen stärker an als in proliferierenden U937-Zellen [13]. Diese Aktivitätssteigerung des 20S-Proteasoms ist PARP-1-abhängig und wird durch PARP-1-Inhibition gehemmt. Bei Co- Immunopräzipitationen von Adriamycin- behandelten U937-Zellen mit einem anti-
Assoziation von PARP mit dem 20S-Proteasom nach oxidativem Stress schließen lässt.
Die erhöhte Adriamycin-Toleranz der TUR-Zellen beruht somit auf der höheren PARP- 1-Expression und der daraus folgenden höheren 20S-Proteasom-Aktivität in diesen Zellen [13].
In der vorliegenden Arbeit werden die Auswirkungen von oxidativem Stress durch H2O2 auf TUR-Zellen untersucht. Verglichen werden die TUR-Zellen mit TUR asPARP-Zellen. Diese zeichnen sich, wie in Harnacke et al. 2005 beschrieben, durch eine heruntergeregelte PARP-1-Expression aus, da sie ein 650 Basenpaar langes Fragment des PARP-1-Gens in antisense-Orientierung enthalten, das ihnen mithilfe des pTracer-CMV2-Vektors über Elektroporation stabil transfiziert wurde. Im Western Blot konnte die Herunterregulation von PARP-1 in den TUR asPARP-Zellen belegt werden [25]. Auch die 20S-Proteasom-Aktivität ist in den TUR asPARP-Zellen niedriger als in den TUR-Zellen [25]. TUR pTracer-Zellen sind Kontrollzellen, die den „leeren“
pTracer-CMV2-Vektor enthalten [25]. TUR-, TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen standen in der Arbeitsgruppe von Prof. Hass zur Verfügung. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass in den TUR asPARP-Zellen, ähnlich wie in den ursprünglichen U937-Zellen, durch den Differenzierungsfaktor TPA ein Proliferationsarrest und die Differenzierung entlang des monozytären Pfads induziert werden kann [25].
1.5 Ziele dieser Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Prozesse zu untersuchen, die in der Zelle unter oxidativem Stress stattfinden. Besonderes Interesse gilt dabei Veränderungen an Bestandteilen des Zytoskeletts und der Zellmembran unmittelbar nach Stimulation mit H2O2. Darüber hinaus werden Funktionen und Interaktionspartner des durch oxidativen Stress aktivierten Kernproteins PARP-1 untersucht. Betrachtet wird dazu die humane myelomonozytäre Leukämie-Zelllinie TUR, die aggressiv wachsende Tumoren in SCID-Mäusen entwickelt. TUR-Zellen zeigen eine gesteigerte Aktivität von PARP-1 und vom 20S-Proteasom, wodurch sie resistenter gegenüber dem durch oxidativen Stress wirkenden Zytostatikum Adriamycin werden [18]. Effekte in TUR-Zellen nach oxidativem Stress werden verglichen mit Effekten in TUR-Zellen, denen ein Fragment des PARP-1-Gens in antisense-Richtung transfiziert wurde und die dadurch eine verminderte PARP-1-Expression zeigen (TUR asPARP-Zellen) [25]. Die Empfindlich- keit beider Zelllinien gegenüber H2O2 wird durch Vitalitätsmessungen und Zellzyklus- analysen direkt miteinander verglichen.
Mithilfe von Immunpräzipitationen mit einem anti-PARP-1-Antikörper werden mögliche Interaktionspartner von PARP-1 in TUR-Zellen vor und nach Inkubation mit H2O2 gesucht. Im Western Blot werden die Reaktionen bestimmter Proteine auf H2O2 in beiden Zelllinien miteinander verglichen, darunter unter anderem das 20S-Proteasom, das als Interaktionspartner von PARP-1 am Abbau oxidativ veränderter Proteine beteiligt ist [4,5], die MnSOD sowie die Matrixmetalloproteinasen MMP-1 und MMP-7.
Effekte von H2O2-induziertem Stress auf die Elemente des Zytoskeletts, Aktin und Myosin, in Abhängigkeit von Konzentration und Expositionsdauer werden ebenfalls in Immunoblots untersucht. Darüber hinaus wird versucht, Auswirkungen von H2O2 auf Membranlipide dünnschichtchromatographisch aufzudecken.
Aus der Zytostatikagruppe der Anthrazykline wirken insbesondere Doxorubicin (Adriamycin) und Daunorubicin sowie Bleomycin über die Freisetzung von ROS im Zellkern der Tumorzelle und dadurch bedingte DNA-Konformationsänderungen [47].
Diese Zytostatika werden in der Behandlung vieler Krebserkrankungen, wie Hodgkin- und Nonhodgkin-Lymphomen, akuten Leukämien, Mamma-, Ovar- und Schilddrüsen- karzinomen, eingesetzt [32]. Resistenzen gegenüber diesen Zytostatika sowie
dar [13]. Abwehrmechanismen der Zelle gegen ROS-vermittelte Toxizität zu untersuchen, kann dazu beitragen, die Mechanismen dieser Resistenzentwicklung besser zu verstehen und effektivere Therapeutika zu entwickeln.
2 Material
2.1 Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien wurden in der Qualitätsstufe pro analysis von folgenden Firmen bezogen:
3-Aminobenzamid (3-ABA) Biomol, Hamburg, Deutschland Acrylamid (Rotiphorese Gel 40 (37, 5:1)) Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Agarose (low melting point) Sigma-Aldrich, München, Deutschland All blue Precision Plus Protein Standard BioRad Laboratories, München, Deutschland Ammoniumpersulfat (APS) Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland BCA Protein Assay Kit, Lsg. A + B Pierce Biotechnology, Rockford, USA Bromphenolblau Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland BSA Proteinstandard Sigma-Aldrich, München, Deutschland CHAPS Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Chloroform Sigma-Aldrich, München, Deutschland Dry Strip Cover Fluid Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Dithiothreitol (DTT) Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland ECL Western Lightening-Reagenzien Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA EDTA-Na2 Sigma-Aldrich, München, Deutschland EGTA Sigma-Aldrich, München, Deutschland Essigsäure J.T. Baker, Phillipsburg, USA Ethanol J.T. Baker, Phillipsburg, USA Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom, Berlin, Deutschland Formaldehyd ICN Biomedicals, Eschwege, Deutschland L-Glutamin PAA Laboratories, Engelsbach, Deutschland Glutardialdehyd Merck, Darmstadt, Deutschland Glycerin Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland β-Glycerolphosphat Sigma-Aldrich, München, Deutschland Glycin Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Harnstoff Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Isopropanol J.T. Baker, Phillipsburg, USA Kupfersulfat-Pentahydrat Merck, Darmstadt, Deutschland Leupeptin Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, München, Deutschland Methanol J.T. Baker, Phillipsburg, USA Natriumacetat Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Natriumazid Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland Natriumchlorid J.T. Baker, Phillipsburg, USA Natriumfluorid Sigma-Aldrich, München, Deutschland Natriummetavanadat Sigma-Aldrich, München, Deutschland Natriumpyrophosphat Sigma-Aldrich, München, Deutschland Natriumthiosulfat Merck, Darmstadt, Deutschland NP-40 Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Deutschland PBS Tablets Sigma-Aldrich, München, Deutschland Penicillin PAA Laboratories, Engelsbach, Deutschland Pharmalyte pH 3–10 Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich, München, Deutschland Phosphorsäure (Rotipuran ≥ 85%) Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Roti-Blue Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland RPMI 1640 Medium Biochrom, Berlin, Deutschland
Sepharose Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK
Silbernitrat Merck, Darmstadt, Deutschland Sodiumdodecylsulfat (SDS) Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland Stickstoff (flüssig) Linde AG, Höllriegelskreuth, Deutschland Streptomycin PAA Laboratories, Engelsbach, Deutschland Tetramethylethylendiamid (TEMED) Sigma-Aldrich, München, Deutschland 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) Sigma-Aldrich, München, Deutschland Tris-Base Calbiochem, Darmstadt, Deutschland Tris-HCl Sigma-Aldrich, München, Deutschland Triton x 100 Calbiochem, Darmstadt, Deutschland Tween-20 Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Wasserstoffperoxid Merck, Darmstadt, Deutschland
2.2 Puffer und Lösungen
Puffer/Lösungen Zusammensetzung
Äquilibrierungs-Puffer 1 6 M Harnstoff 2 % SDS
50 mM Tris-HCl pH 8,8 30 % Glycerin
1 % DTT ad A. bidest Äquilibrierungs-Puffer 2 6 M Harnstoff
2 % SDS
50 mM Tris-HCl pH 8,8 30 % Glycerin
2,5 % IAA ad A. bidest
Beads-Sample-Puffer 10 M Harnstoff
2 % NP-40
5 % Pharmalyte pH 3–10 5 % β-Mercaptoethanol ad A. bidest
Blocking-Puffer PBS
0,05 % Tween-20 5 % FCS
Coomassie-Färbelösung 20 % Methanol
20 % Roti-Blue ad A. bidest
Elektrophorese-Puffer 25 mM Tris 192 mM Glycin
0,1 % SDS ad A. bidest
Entwicklungs-Lsg. (Silberfärbung) 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat 0,02 % Formaldehyd
ad A. bidest
Fixierung-Lsg. 40 % Ethanol
10 % Eisessig ad A. bidest
Lagerungsreagenz 8,7 % Glycerol
0,02 % Natriumazid ad A. bidest
Loading-Puffer, 5x Stammlösung, pH 6,8
2,5 M Tris 40 % Glycerin
2,5 % SDS 25 mM DTT Bromphenolblau ad A. bidest
Lyse-Puffer pH 7,5 20 mM Tris 150 mM NaCl
1 mM EDTA 1 mM EGTA
2,5 mM Na-Pyrophosphat 1 mM β-Glycerolphosphat 1 mM Na-Metavanadat
1 µg/ml Leupeptin 1 % Triton x 100
0,5 % NP-40 1 mM PMSF (frisch dazu)
Reswelling-Lsg. 8 M Harnstoff
1 % CHAPS
0,5 % (v/v) Pharmalyte pH 3–10 0,002 % Bromphenolblau 0,4 % DTT (frisch dazu) ad A .bidest
RIPA-Puffer 10 mM NaF
0,5 % NP-40 0,05 % SDS 5 % Glycerin 1 mM PMSF
ad Lyse-Puffer pH 7,5
Sammelgel 125 mM Tris pH 6,8
0,076 % APS 0,1 % SDS 0,26 % TEMED 4 % Acrylamid ad A. bidest
Sensitivierungs-Lsg. (Silberfärbung) 95 % Ethanol 0,125 % (w/v) Glutardialdehyd
0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat 6,8 % (w/v) Natriumacetat
ad A. bidest
Silberfärbe-Lsg. 0,25 % (w/v) Silbernitrat
0,02 % Formaldehyd ad A. bidest
Stopp-Lsg. (Silberfärbung) 1,46 % EDTA-Na2 x 2 H2O ad A. bidest
Stripping-Puffer 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8
2 % SDS 100 mM DTT
Tank-Blot-Puffer 39 mM Glycin
48 mM Tris 1,2 mM SDS 20 % Methanol ad A. bidest
Trenngel 375 mM Tris-Base pH 8,8 0,05 % APS
0,1 % SDS 0,5 % TEMED
5-15 % Acrylamid je nach Größe der zu trennenden Proteine ad A. bidest
2.3 Antikörper
anti-PARP-1 (full length), pab Axxora Deutschland, Grünberg, Deutschland anti-PARP-1 DBD, mab Axxora Deutschland, Grünberg, Deutschland anti-Myosin IIa non muscle, pab Sigma-Aldrich, München, Deutschland anti-β-actin Clone AC-15, mab Sigma-Aldrich, München, Deutschland anti-MnSOD, pab Upstate, Lake Placid, USA anti-20S-Proteasom α/β-subunits, pab Biotrend Chemikalien, Köln, Deutschland anti-MMP-1 hinge region, pab Biomol, Plymouth, USA anti-MMP-7, pab Biomol, Plymouth, USA anti-VCP-97 (p97 ATPase), mab Progen Biotechnik, Heidelberg, Deutschland anti-GAPDH (6C5), mab Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA
ECL-Antikörper, Horseradish peroxidase-linked
- anti-mouse IgG Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK - anti-rabbit IgG Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK
2.4 Verbrauchsmaterialien
Kulturflaschen Nunc, Wiesbaden, Deutschland CyStain DNA 2step kit Partec, Münster, Deutschland Immobiline DryStrip gels Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK
(18 cm, pH 3–10)
Hybond-C Extra (Nitrocellulose) Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Whatman Blotting Paper BioRad Laboratories, München, Deutschland Tank Blot transfer units und Zubehör Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK ECL Hyperfilm RPM 3103 K Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Probengefäße für Massenspektrometrie Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Tissue Culture Plate 96-Well Sarstedt, Nümbrecht, USA HPTLC Fertigplatten RP-18F Merck, Darmstadt, Deutschland
(Silika-Gel, 10 x 10 cm)
Kanülen, Einmalspritzen, Skalpelle B.Braun Melsungen, Melsungen, Deutschland
Gelgießapparaturen, Elektrophoresekammern, Glasplatten, Spacer, Kämme:
für 5,5 x 8,5 cm große Gele BioRad Laboratories, München, Deutschland für 10 x 20 cm große Gele PeqLab Biotechnology, Erlangen, Deutschland für 20 x 20 cm große Gele PeqLab Biotechnology, Erlangen, Deutschland
2.5 Zellen
Es wurde mit den Zelllinien TUR, TUR antisense-PARP (asPARP) und TUR pTracer gearbeitet. Diese Zelllinien standen im Labor der Arbeitsgruppe von Prof. Hass zur Verfügung. Bei den TUR-Zellen (ATCC-Nr. CRL-2367) handelt es sich um einen Subklon der humanen myelomonozytären Leukämie-Zelllinie U937, der gegen den Differen-zierungsfaktor 12-O-Tetradekanoylphorbol-13-Acetat (TPA) resistent ist und eine erhöhte Expression von PARP-1 zeigt [13,18].
TUR asPARP-Zellen enthalten ein 650 Basenpaar langes Fragment des PARP-1-Gens in antisense-Orientierung, das ihnen mithilfe des pTracer-CMV2-Vektors über Elektroporation stabil transfiziert wurde. TUR pTracer-Zellen sind Kontrollzellen, die den „leeren“ pTracer-CMV2-Vektor enthalten [25].
2.6 Geräte
2.6.1 Geräte für die Zellkultur
Brutschrank (CO2-Inkubator) Sanyo-Biomedical, Bad Nenndorf, Deutschland Sicherheitswerkbank Heraeus, Hanau, Deutschland IX 50 Mikroskop Olympus, Hamburg, Deutschland Vi-Cell 1.01 mit Software Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland MiniSpin Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland Thermozentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland
FACS Flow Cytometry System Dako, Hamburg, Deutschland (Durchflusszytometer)
FloMax analysis software für FACS Partec, Münster, Deutschland MultiCycle cell cycle software für FACS Phoenix Flow Systems, San Diego, USA
2.6.2 Geräte für die Proteinanalyse
Multiscan EX Labsystems Thermo Electron Corporation, Neuss, Deutschland (Photometer)
Ascent Software for Multiscan Thermo Electron Corporation, Neuss, Deutschland (Vers. 2.6)
IPGphor Gerät Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Electrophoresis Power Supply 301 Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK Leuchtfeld-Kasten Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland RM5 Rotator (Rollschüttler) GFL Labortechnik, Burgwedel, Deutschland
Schüttelwasserbad 1083 GFL Labortechnik, Burgwedel, Deutschland Duomax 1030 (Schwenkgerät) Heidolph, Kelheim, Deutschland
Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg, Deutschland Überkopfschüttler Labinco, Breda, Niederlande Vortex MS1 IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland Wärmeschrank Memmert, Schwabach, Deutschland XP505 Filmentwicklungsgerät 3M, Neuss, Deutschland
