4 ERGEBNISSE
4.4 Western Blots von Zytoskelettproteinen unter oxidativem Stress
4.4.1 Myosin
Nachdem Immunpräzipitationen gezeigt haben, dass nichtmuskuläres Myosin IIa Typ 9 in unbehandelten TUR-Zellen ein möglicher Interaktionspartner von PARP-1 ist und dass diese mögliche Interaktion nach Inkubation mit H2O2 nicht mehr nachzuweisen ist, wurde die Reaktion dieses Proteins auf oxidativen Stress im Western Blot untersucht.
Dazu wurden Zellextrakte aus H2O2-Zeitkinetiken mit Inkubationszeiten zwischen 10 und 120 min und ein Antikörper gegen nichtmuskuläres Myosin IIa verwendet. Um festzustellen, ob die Reaktion von Myosin auf oxidativen Stress durch PARP-1 beeinflusst wird, wurden die Effekte in TUR-Zellen mit denen in TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen verglichen (Abb. 8). Als Ladungskontrollen wurden geeignete Banden aus Coomassie-gefärbten eindimensionalen Elektrophoresegelen der jeweils selben Kinetik gewählt. Mit der ImageJ-Software wurden die Intensitäten von Bande und Kontrollbande gemessen und zueinander ins Verhältnis gesetzt (Tab. 9 a–c). Dieses Verhältnis wurde graphisch in einem Balkendiagramm dargestellt (Abb. 8).
Es zeigt sich, dass die in der unbehandelten Kontrolle bei 200 kDa sichtbare Myosin-Bande in allen drei Zelllinien bereits nach 10 min vollständig verschwunden ist (Abb. 8). Gleichzeitig verstärkt sich eine schon in der Kontrolle sichtbare Bande im Bereich von 350 oder mehr kDa und nimmt dann im Verlauf bis 60 min kontinuierlich ab. Möglicherweise handelt es sich hierbei um eine modifizierte oder mit anderen Proteinen assoziierte Form des Myosins, die unter oxidativem Stress entsteht. Im Bereich zwischen 50 und 75 kDa wird eine sehr breite Bande sichtbar, die kontinuierlich zunimmt und Abbau-Produkte des Myosins enthalten könnte. Zu vorbeschriebenen Veränderungen des Myosins unter oxidativem Stress zählt die Phosphorylierung der leichten Myosin-Ketten durch die MLCK und die darauf folgende Bildung von Filamenten [41,42], die Dissoziation des Myosins vom Zytoskelett einerseits [41] sowie andererseits die Translokation der schweren Myosin-Ketten vom Zytosol zum Zytoskelett [43].
Unterschiede zwischen den drei untersuchten Zelllinien in Bezug auf die Reaktion des Motorproteins Myosin IIa auf oxidativen Stress waren in diesem Versuchsaufbau nicht
auszumachen. Die hier gefundenen Effekte von H2O2 auf Myosin scheinen somit unabhängig vom Expressionslevel von PARP-1 zu sein.
Abb. 8: Links: Myosin IIa (non muscle, 200 kDa) im Western Blot von TUR-, TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen in H2O2-Zeitkinetiken mit Inkubationszeiten von 10–120 min mit Kontrollbanden aus Coomassie-gefärbten Gelen der jeweiligen Kinetiken. Rechts: Graphische Darstellung der Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden. Werte aus Tab. 9 a–c.
Ko. 10 30 45 60 90 120
Tab. 9 a–c: Bandenintensitäten der Myosin-Western Blots von H2O2-Kinetiken 10–120 min von TUR- (a), TUR asPARP- (b) und TUR pTracer-Zellen (c) und der zugehörigen Kontrollbanden als Differenz zur jeweiligen Hintergrundsintensität; gemessen in Graustufenwerten von 0–255 (0 = schwarz, 255 = weiß);
Verhältnis der Intensitäten von Bande und Kontrollbande (siehe Abb. 8).
Die hier vorgestellten Myosin-Western Blots von TUR-, TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen unter H2O2-Expositionen zwischen 10–120 min wurden insgesamt 3 mal reproduziert und sind hier exemplarisch einmal dargestellt.
a) TUR H2O2-Kinetik 10–120 min, Western Blot Myosin
H2O2
b) TUR asPARP H2O2-Kinetik 10–120 min, Western Blot Myosin
H2O2
c) TUR pTracer H2O2-Kinetik 10–120 min, Western Blot Myosin
H2O2
Um den Zeitpunkt, an dem das Myosin unter oxidativem Stress verschwindet, näher einzugrenzen, wurden H2O2-Zeitkinetiken von TUR-Zellen mit Inkubationszeiten zwischen 2 und 10 min sowie zwischen 2 und 120 min untersucht. Die Intensitätsverhältnissse von Banden und Kontrollbanden aus Coomassie-Gelen wurden als Balkendiagramm graphisch dargestellt (Abb. 9 und Tab. 10 a–b). Es zeigt sich, dass bereits nach der kurzen Zeit von 2 min keine Myosin-Bande mehr bei 200 kDa im Western Blot zu sehen ist. Noch kürzere Inkubationszeiten waren aufgrund des Versuchsaufbaus nicht möglich.
Tab. 10 a–b: Bandenintensitäten der Myosin-Western Blots von H2O2-Kinetiken 2–10 min (a) und 2–120 min (b) von TUR-Zellen und der zugehörigen Kontrollbanden als Differenz zur jeweiligen Hintergrundsintensität; gemessen in Graustufenwerten von 0–255 (0 = schwarz, 255 = weiß); Verhältnis der Intensitäten von Bande und Kontrollbande (siehe Abb. 9).
a) TUR H2O2-Kinetik 2–10 min, Western Blot Myosin
b) TUR H2O2-Kinetik 2–120 min, Western Blot Myosin
H2O2
Abb. 9: Myosin IIa (non muscle, 200 kDa) im Western Blot von H2O2-Zeitkinetiken von TUR-Zellen mit Kontrollbanden aus Coomassie-gefärbten Gelen der jeweiligen Kinetiken; graphische Darstellung der Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden. 1 – Inkubationszeiten von 2–10 min; 2 – Inkubationszeiten von 2–120 min. Werte aus Tab. 10 a–b.
Ko. 10
Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der Reaktion des Myosins auf oxidativen Stress von der H2O2-Konzentration untersucht. Dazu wurden TUR-Zellen mit H2O2 -Konzentra-tionen von 0,01-1000 mol/l inkubiert und die Zellextrakte in Western Blots mit dem Anti-Myosin IIa non muscle - Antikörper analysiert (Abb. 10, Bild 1). Es wurde eine Inkubationszeit von 2 min gewählt, da die Veränderung im Bandenmuster des Myosins, wie oben gezeigt, bereits nach dieser Zeit eindeutig zu sehen ist. Als Ladungskontrollen wurden Banden aus Coommassie-gefärbten Gelen der jeweils selben Konzentrationsreihe verwendet. Die Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden wurden graphisch in Balkendiagrammen dargestellt (Tab. 11 a–c und Abb. 9).
In Bild 1 der Abb. 10 zeigt sich im Bereich bis 100 µmol/l eine unverändert starke Myosin-Bande von 200 kDa. Bei 1000 µmol/l jedoch, der Konzentration, die für alle zeitabhängigen Versuche verwendet wurde, ist kein Myosin mehr erkennbar. Die H2O2 -Konzentration, ab der sich das Myosin verändert, scheint demnach zwischen 100 und 1000 µmol/l zu liegen. Um diesen Bereich näher zu umreißen, wurden Konzentrationsreihen von 100–1000 µmol/l (Bild 3 der Abb. 10) bzw. 50–300 µmol/l (Bild 2 der Abb. 10) durchgeführt. Wie in Bild 3 im linken Bildteil zu sehen, erscheint die Myosin-Bande außer in der unbehandelten Kontrolle ausschließlich in der Probe mit 100 µmol/l H2O2. Schon bei 200 µmol/l verschwindet diese Bande. Auch Bild 2 weist darauf hin, dass der Konzentrationsbereich, ab welchem das Myosin sich verändert, etwas über 100 µmol/l liegt. Hier verschwindet die Bande bereits bei 150 µmol/l H2O2. Versuche, den Bereich noch weiter einzugrenzen, waren unter dem verwendeten Versuchsaufbau nicht möglich.
Außerdem wurde eine Konzentrationsreihe von 100–1000 µmol/l H2O2 mit TUR-Zellen durchgeführt, die zuvor mit dem PARP-1-Inhibitor 3-Aminobenzamid (3-ABA) vorinkubiert worden waren. So sollte im nachfolgenden Western Blot (Bild 3 der Abb.
10) ermittelt werden, ob die Reaktion des Myosins auf oxidativen Stress von PARP-1 abhängig ist oder beeinflusst wird. Im Bandenmuster des Myosins im Western Blot sind keine wesentlichen Unterschiede zwischen TUR-Zellen mit ungehemmter und solchen mit gehemmter PARP-1-Funktion zu sehen.
Die Ergebnisse der vorangegangenen Proteinbestimmungen zur Sicherstellung einer jeweils gleichen Bahnenbeladung bei den Kinetiken und Konzentrationsreihen können den Tab. 26 und Tab. 28–Tab. 34 im Kapitel 4.9 entnommen werden.
Abb. 10: Myosin IIa (non muscle, 200 kDa) im Western Blot von H2O2-Konzentrationsreihen von TUR-Zellen mit Kontrollbanden aus Coomassie-gefärbten Gelen der jeweiligen Konzentrationsreihen;
graphische Darstellung der Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden.
1 – 0,01–1000 mol/l; 2 – 50–300 mol/l; 3 – 100–1000 mol/l +/- 3-ABA. Werte aus Tab. 11 a–c.
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit] H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit] H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 Ko.
100 1000 H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200 Ko.
250 300 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit] TUR
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100
Tab. 11 a–c: Bandenintensitäten der Myosin-Western Blots von H2O2-Konzentrationsreihen 0,01–1000 M (a), 50–300 M (b) und 100–1000 M +/- 3-ABA (c) von TUR-Zellen und der zugehörigen Kontrollbanden als Differenz zur jeweiligen Hintergrundsintensität; gemessen in Graustufenwerten von 0–255 (0 = schwarz, 255 = weiß); Verhältnis der Intensitäten von Bande und Kontrollbande
(siehe Abb. 10).
a) TUR H2O2-Konzentrationsreihe 0,01–1000 M, Western Blot Myosin
H2O2
b) TUR H2O2-Konzentrationsreihe 50–300 M, Western Blot Myosin
H2O2
c) TUR H2O2-Konzentrationsreihe 100–1000 M +/- 3-ABA, Western Blot Myosin
H2O2