4 ERGEBNISSE
4.4 Western Blots von Zytoskelettproteinen unter oxidativem Stress
4.4.2 Aktin
Das mit Myosin interagierende Zytoskelettprotein Aktin wurde ebenfalls im Western Blot hinsichtlich seiner Reaktion auf oxidativen Stress in TUR-, TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen untersucht. Dazu wurde ein Antikörper verwendet, der sich gegen die 45 kDa schwere, nichtmuskuläre β-Aktin-Isoform richtet. Als Ladungskontrollen dienten Banden aus Coommassie-Gelen der jeweils selben Kinetik. Die Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden wurden graphisch in Balkendiagrammen dargestellt (Tab. 12 a–c und Abb. 11).
Abb. 11: Links: β-Aktin (45 kDa) im Western Blot von TUR-, TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen in H2O2-Zeitkinetiken mit Inkubationszeiten von 10–120 min mit Kontrollbanden aus Coomassie-gefärbten Gelen der jeweiligen Kinetiken. Rechts: Graphische Darstellung der Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden. Werte aus Tab. 12 a–c.
Ko. 10 30 45 60 90 120
Intensität [rel. Einheit] TUR
0,501
Intensität [rel. Einheit] TUR asPARP 02
Intensität [rel. Einheit] TUR pTracer 05
Ähnlich wie beim Myosin ist auch die Aktin-Bande, die in der Kontrolle deutlich zu sehen ist, bei den drei Zelllinien TUR, TUR asPARP und TUR pTracer nach 10 min verschwunden oder allenfalls noch sehr schwach zu sehen (Abb. 11). Im Wesentlichen verhielten sich die drei untersuchten Zellreihen auch hier nicht unterschiedlich.
Tab. 12 a–c: Bandenintensitäten der Aktin-Western Blots von H2O2-Kinetiken 10–120 min von TUR- (a), TUR asPARP- (b) und TUR pTracer-Zellen (c) und der zugehörigen Kontrollbanden als Differenz zur jeweiligen Hintergrundsintensität; gemessen in Graustufenwerten von 0–255 (0 = schwarz, 255 = weiß);
Verhältnis der Intensitäten von Bande und Kontrollbande (siehe Abb. 11).
a) TUR H2O2-Kinetik 10–120 min, Western Blot Aktin
H2O2
b) TUR asPARP H2O2-Kinetik 10–120 min, Western Blot Aktin
H2O2
c) TUR pTracer H2O2-Kinetik 10–120 min, Western Blot Aktin
H2O2
Um den Zeitpunkt der H2O2-Inkubation, ab welchem Aktin im Western Blot nicht mehr nachweisbar ist, genauer zu ermitteln, wurden Zeitkinetiken mit Inkubationszeiten von 2–10 min und 2–120 min untersucht (Abb. 12 und Tab. 13 a–b). Dabei wird deutlich, dass Aktin, anders als Myosin, welches schon nach 2 min verschwunden ist, im Bereich zwischen 2 und 10 min kontinuierlich an Menge abnimmt und erst nach 30 min völlig verschwunden ist. Der Zeitpunkt, ab dem Aktin bei oxidativem Stress nicht mehr im Western Blot nachweisbar ist, scheint demnach zwischen 10 und 30 min zu liegen.
Abb. 12: β-Aktin (45 kDa) im Western Blot von H2O2-Zeitkinetiken von TUR-Zellen mit Kontrollbanden aus Coomassie-gefärbten Gelen der jeweiligen Kinetiken; graphische Darstellung der Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden. 1 – Inkubationszeiten von 2–10 min; 2 – Inkubationszeiten von 2–120 min. Werte aus Tab. 13 a–b.
TUR
Tab. 13 a–b: Bandenintensitäten der Aktin-Western Blots von H2O2-Kinetiken 2–10 min (a) und 2–120 min (b) von TUR-Zellen und der zugehörigen Kontrollbanden als Differenz zur jeweiligen Hintergrundsintensität; gemessen in Graustufenwerten von 0–255 (0 = schwarz, 255 = weiß); Verhältnis der Intensitäten von Bande und Kontrollbande (siehe Abb. 12).
Ob für dieses Verschwinden im Western Blot Abbau oder aber Modifikationen am Aktinprotein ursächlich sind, kann mit diesem Verfahren nicht ermittelt werden. Da Aktin für Form und Stabilität der Zelle essentiell ist, erscheint es sehr unwahrscheinlich, dass es nach 30 min Inkubation mit H2O2 zu einem vollständigen Abbau dieses Zytoskelettproteins kommt. Vorbeschriebene Umstrukturierungen des Aktins unter oxidativem Stress sind u. a. die Polymerisation von Aktin-Monomeren [44,45], die Dissoziation vom Zytoskelett [41] sowie die Umlagerung von Aktin-Stressfasern zu kurzen Fasern und parakristallinen Strukturen [41,45].
Die vorgestellten Aktin-Western Blots von TUR-Zellen unter H2O2-Expositionen von 10–120 min, 2–10 min und 2–120 min, sowie von TUR asPARP- und TUR pTracer-Zellen unter H2O2-Expositionen zwischen 10–120 min wurden jeweils zweimal reproduziert und sind hier exemplarisch einmal dargestellt.
a) TUR H2O2-Kinetik 2–10 min, Western Blot Aktin
Die Reaktion des Aktins auf oxidativen Stress wurde außerdem bezüglich ihrer Abhängigkeit von der H2O2-Konzentration untersucht. Dazu wurden TUR-Zellen mit aufsteigenden H2O2-Konzentrationen von 0,01–1000 mol/l (Bild 1 der Abb. 13), 100–
1000 µmol/l (Bild 3 der Abb. 13) sowie 50–300 µmol/l (Bild 2 der Abb. 13) inkubiert und anschließenden im Western Blot analysiert. Die Intensitätsverhältnissse von Banden und Kontrollbanden aus Coomassie-Gelen wurden als Balkendiagramm graphisch dargestellt (Tab. 14 a–c und Abb. 13).
In Bild 1 wird deutlich, dass die Aktin-Bande bis zu einer Konzentration von 10 µmol/l konstant bleibt, sich aber bei 100 µmol/l deutlich weniger intensiv darstellt. Anders als beim Myosin verschwindet die Bande allerdings nicht vollständig. Auch in Bild 3 verschwindet die Aktinbande bis 1000 µmol/l nicht, wird aber schwächer. Bild 2 zeigt einen Intensitätssprung zwischen 100 und 150 µmol/l.
Ebenso wie beim Myosin, wurde auch für Aktin eine Konzentrationsreihe von 100–1000 µmol/l nach Vorinkubation mit 3-ABA erstellt (Bild 3 der Abb. 13).
Hier ist die kontinuierliche Abnahme der Bandenintensität, die in den nicht vorinkubierten Zellen zu beobachten war, nicht erkennbar. Die Intensität bleibt bis 1000 µmol/l unverändert stark. Dies könnte darauf hinweisen, dass die Veränderungen bzw.
der Abbau des Aktins unter oxidativem Stress davon abhängt, ob die PARP-1-Funktion erhalten ist. Diese Annahme wird allerdings, wie oben beschrieben, in den Zeitkinetiken mit TUR asPARP-Zellen nicht bestätigt.
Die Ergebnisse der vorangegangenen Proteinbestimmungen zur Sicherstellung einer jeweils gleichen Bahnenbeladung bei den Kinetiken und Konzentrationsreihen können den Tab. 26 und Tab. 28–Tab. 34 im Kapitel 4.9 entnommen werden.
Abb. 13: β-Aktin (45 kDa) im Western Blot von H2O2-Konzentrationsreihen von TUR-Zellen mit Kontrollbanden aus Coomassie-gefärbten Gelen der jeweiligen Konzentrationsreihen; graphische Darstellung der Intensitätsverhältnisse von Banden und Kontrollbanden.
1 – 0,01–1000 mol/l; 2 – 50–300 mol/l; 3 – 100 –1000 mol/l +/- 3-ABA. Werte aus Tab. 14 a–c.
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit] H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200 H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit] H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit] H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [µmol/l]
Intensität [rel. Einheit]
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100
H2O2-Konzentration [ mol/l]
100 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200 Ko.
250 300 H2O2-Konzentration [ mol/l]
50 100 150 200 H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 Ko.
100 1000 H2O2-Konzentration [ mol/l]
0,01 0,1 1 10 Coomassie
Tab. 14 a–c: Bandenintensitäten der Aktin-Western Blots von H2O2-Konzentrationsreihen 0,01–1000 M (a), 50–300 M (b) und 100–1000 M +/- 3-ABA (c) von TUR-Zellen und der zugehörigen Kontrollbanden als Differenz zur jeweiligen Hintergrundsintensität; gemessen in Graustufenwerten von 0–255 (0 = schwarz, 255 = weiß); Verhältnis der Intensitäten von Bande und Kontrollbande (siehe Abb.
13).
a) TUR H2O2-Konzentrationsreihe 0,01–1000 M, Western Blot Aktin
H2O2
b) TUR H2O2-Konzentrationsreihe 50–300 M, Western Blot Aktin
H2O2
c) TUR H2O2-Konzentrationsreihe 100–1000 M +/- ABA, Western Blot Aktin
H2O2