Immunpräzipitation

3.3.1 Antikörperkopplung an Sepharose

Es wurden Immunpräzipitationen mit folgenden Antikörpern durchgeführt:

• Der polyklonale anti-PARP-1-Antikörper (full length) von Axxora wurde in einer Endverdünnung von 1:250 verwendet.

• Der monoklonale anti-PARP-1-DBD-Antikörper von Axxora wurde ebenfalls in einer Endverdünnung von 1:250 eingesetzt.

• Der polyklonale anti-Myosin IIa-(non muscle)-Antikörper von Sigma-Aldrich wurde in einer Endverdünnung von 1:750 verwendet.

Zunächst wurde der jeweilige Antikörper an Protein-A-Sepharose gekoppelt. Dazu musste die Protein-A-Sepharose zuerst in ausreichend PBS 30 min lang bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler quellen und anschließend 5 mal mit 1 ml PBS gewaschen und bei 13200 rpm 20 s lang zentrifugiert werden. Nachdem die gequollene Sepharose mit demselben Volumen PBS aufgefüllt wurde, musste der jeweilige Antikörper 60 min lang bei 4 °C im Überkopfschüttler an die Sepharose gekoppelt werden. Bei dem polyklonalen anti-PARP-1-Antikörper und dem monoklonalen anti-PARP-1-DBD-Antikörper wurden 40 µl Antikörper/ml verwendet.

Der anti-Myosin IIa-(non muscle)-Antikörper wurde in einem Verhältnis von 13 µl Antikörper/ml verwendet. Anschließend wurde 2 mal mit 1 ml PBS gewaschen

und 20 s lang bei 13200 rpm zentrifugiert.

3.3.2 Präabsorption

Um zu vermeiden, dass die Zellproteine unspezifisch an die Sepharose der gekoppelten Antikörper-Sepharose-Beads binden, wurden die Proben zunächst mit 100 µl Sepharose-Suspension/ml Probe 30 min lang bei 4 °C im Überkopfschüttler inkubiert und anschließend 2 min lang bei 4000 rpm zentrifugiert. Die Sedimente wurden als

„Kontrolle nach Präabsorption“ bei der 2D-Gelelektrophorese weiter untersucht.

3.3.3 Absorption

Als nächstes wurden die Proben mit 100 µl gekoppelter Antikörper-Sepharose-Beads/ml Probe 2 h lang bei 4 °C im Überkopfschüttler inkubiert und dann für 2 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Die Beads wurden 3 mal mit 1 ml RIPA-Puffer und 3 mal mit 1 ml 1 % NP-40 gewaschen und nach jedem Waschvorgang für 2 min bei 4000 rpm zentrifugiert.

3.3.4 Ablösen der Sepharose und Vorbereitung zur 2D-Gelelektrophorese

Die Beads wurden erst mit 50 µl Beads-Sample-Puffer und anschließend mit 20 µl Reswelling Puffer jeweils 20 min lang bei 50 °C im Thermomixer inkubiert. Nachdem die Probe für 20 s bei 13200 rpm zentrifugiert und der Überstand abgenommen worden war, wurden die Beads erneut mit beiden Puffern inkubiert, zentrifugiert und die

Überstände von erster und zweiter Inkubation vereinigt, so dass nun für die 2D-Elektrophorese 140 µl Probe zur Verfügung standen.

3.4 2D-Gelelektrophorese

3.4.1 Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung

Um die Zellproteine zunächst nach ihrem isoelektrischen Punkt aufzutrennen, wurde das Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System von Amersham Biosciences verwendet.

Die dazu verwendeten IPG-Streifen mit einem immobilen nichtlinearen pH-Gradienten (Immobiline DryStrip gels, 18 cm, pH 3–10 von Amersham Biosciences) waren zuvor für 10–20 h in Reswelling-Lsg. rehydriert worden. Die Probe wurde mittels „cup loading“ am positiven Pol aufgetragen und der gesamte Streifen sowie die Probentasche mit Cover Oil überschichtet. Es wurde das Programm 2 Cup manifold (Temperatur 20 °C, maximale Stromstärke 50 µA) gewählt, das aus 4 Schritten besteht:

Schritt 1 150 V, 3 h Schritt 2 300 V, 6 h Schritt 3 1000 V, 6 h Schritt 4 8000 V, 6 h

Nach der Entnahme der IPG-Streifen aus dem Gerät wurden sie entweder direkt für die SDS-Gelelektrophorese verwendet oder zur Aufbewahrung bei -80 °C eingefroren.

3.4.2 Zweite Dimension: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

In der zweiten Dimension wurden die Proteine nach Größe, Form und Ladung aufgetrennt. Hierzu wurde die Peqlab Maxi 20 x 20 cm Apparatur mit 1 mm Spacer und Elektrophorese-Puffer verwendet. Das Trenngel, das je nach Größe der zu trennenden Proteine 7,5–15 % Acrylamid enthielt, musste ca. 30 min lang mit 70 % Isopropanol überschichtet polymerisieren. Nachdem das Isopropanol mit A. bidest abgespült worden war, wurden die IPG-Streifen, die zuvor für jeweils 15 min in Äquilibrierungs-Puffer I und II auf dem Rollschüttler inkubiert worden waren, an den oberen Gelrand angelegt und mit 0,5 % Agarose überschichtet.

In den ersten 30 min der Elektrophorese wurde eine Spannung von 100 V angelegt und anschließend eine Spannung von 200 V, bis die Frontlinie den unteren Gelrand erreicht hatte. Danach wurden die Gele angefärbt.

3.5 1D-Gelelektrophorese

Bei der 1D-Gelelekrophorese wurden die Zellproteine der unbehandelten und behandelten Zellen in einer Dimension nach Größe, Ladung und Gewicht aufgetrennt.

Als erstes musste die Proteinkonzentration im Überstand bestimmt werden, um zu gewährleisten, dass die nebeneinander auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragenen Proben jeweils dieselbe Menge Protein enthielten.

Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gele wurden in den Größen 5,5 cm x 8,5 cm, 10 cm x 20 cm und 20 cm x 20 cm mit Spacern von 1 mm bzw. 1,5 mm Dicke verwendet. Dazu wurden Apparaturen von Peqlab und BioRad benutzt. Nachdem das Trenngel mit einer Acrylamid-Konzentration von 5–15 % (je nach Größe der untersuchten Proteine) 30 min lang mit 70 % Isopropanol überschichtet polymerisiert war, wurde das Isopropanol wieder gründlich mit A. bidest abgespült und ein Sammelgel auf das Trenngel gegossen, wobei mithilfe eines Kamms Taschen für die Proben freigehalten wurden. Nachdem das Sammelgel nach ca. 30 min polymerisiert war, wurde die Apparatur mit Elektrophorese-Puffer befüllt. Bevor die Proben, die alle dieselbe Menge Protein und 5x Loading-Puffer im Verhältnis 1:5 enthielten, dann in die dafür vorgesehenen Geltaschen einpipettiert wurden, mussten sie zuvor 5 min lang bei 95 °C im Thermomixer denaturiert und danach kurz abzentrifugiert werden. Die 5,5 cm x 8,5 cm großen Gele und die 10 cm x 20 cm großen Gele wurden mit 30 µg Protein befüllt, die 20 cm x 20 cm großen Gele mit 60 µg Protein. Als Molekulargewichts-Standard wurden 7,5 µl des BioRad All Blue Markers mitlaufen gelassen. Für den Elektrophorese-Lauf wurde bei den 5,5 cm x 8,5 cm großen und den 10 cm x 20 cm großen Gelen im Sammelgel eine Spannung von 50 V und im Trenngel eine Spannung von 90 V angelegt, bei den 20 cm x 20 cm großen Gelen im Sammelgel eine Spannung von 100 V und im Trenngel eine Spannung von 200 V. Die Elektrophorese wurde beendet, sobald die Frontlinie den unteren Gelrand erreicht hatte.

Die Gele wurden anschließend entweder mit Coomassie gefärbt und ggf. Banden für die massenspektrometrische Analyse herausgeschnitten, oder es wurde ein Western Blot