Chromatinstabilität und In-vitro-Kapazitationsparameter bei konservierten Eberspermien

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

__________________________________________________

Chromatinstabilität und

In-vitro-Kapazitationsparameter bei konservierten Eberspermien

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Gabriele Volker

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung:

Apl.-Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski

1. Gutachterin: Apl.-Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Erich Klug

Tag der mündlichen Prüfung: 26. Mai 2004

Die Arbeit wurde durch Mittel des Zentralverbandes der Deutschen Schweine- produktion e.V. (ZDS) und der Minitüb GmbH und Co. KG gefördert.

INHALTSVERZEICHNIS

Seite

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 9

1 EINLEITUNG 13

2 LITERATURÜBERSICHT 15

2.1 KAPAZITATION 15

2.2 AKROSOMREAKTION 19

2.3 SPERMIENCHROMATIN 21

2.3.1 Spermienchromatinstruktur 21

2.3.2 Spermienchromatinstruktur Assay (SCSA) 23

2.4 LAGERUNG VON EBERSPERMIEN 25

2.4.1 Einfluss der Lagertemperatur 27

2.4.2 Einfluss der Lagerdauer 28

2.5 FERTILITÄTSPROGNOSEN ANHAND SPERMATOLOGISCHER

UNTERSUCHUNGSTECHNIKEN 29

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN 34

3.1 VERSUCHSKONZEPTION 34

3.2 UNTERSUCHUNGEN DER SPERMIENCHROMATINSTABILITÄT 36

3.2.1 Ejakulatproben 36

3.2.2 Konventionelle spermatologische Untersuchungen 36 3.2.3 Modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatinstruktur-

Assay (mf-SCSA) 37

3.2.3.1 Vorbereitung der Spermaprobe 37 3.2.3.2 Dekondensation des Spermienchromatins und Säuredenaturierung 38

3.2.3.3 Färbung mit Akridinorange 39

3.2.3.4 Modifikation des Protokolls bei Raumtemperaturen über 25 °C 40 3.2.3.5 Computergestützte Auswertung digitalisierter fluoreszenzmikros-

kopischer Bilder 41

3.2.4 Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DICM) 43

3.3 FLOWZYTOMETRISCHEN BESTIMMUNG VON IN-VITRO-KAPAZITA-

TIONSPARAMETERN 45

3.3.1 Ejakulatproben 45

3.3.2 Verdünnung des Spermas für den Lagerungsversuch 46 3.3.3 Konventionelle spermatologische Untersuchungen 47 3.3.4 Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll^® 49

3.3.5 Beladen der Spermien mit Fluo-3-AM 49

3.3.6 Flowzytometrie 50

3.3.6.1 Messung der Membranintegrität durch Propidiumjodidfärbung 54 3.3.6.2 Messung des intrazellulären Calciuminfluxes 55 3.3.6.3 Messung der Auslösbarkeit der Akrosomreaktion durch Calcium-

ionophor A23187 58

3.4 STATISTISCHE AUSWERTUNG 62

3.5 CHROMATINSTABILITÄT IN EINER BESAMUNGSEBER-

POPULATION 63

3.5.1 Einfluss der äußeren Klimafaktoren auf die Chromatinstabilität (%)

und den Rotwert der chromatinstabilen Population im mf-SCSA 63 3.5.2 Vergleich der Rotwerte chromatinstabiler Spermien der Proben mit

denen des Standardejakulates 65

3.5.3 Vorkommen chromatininstabiler Spermien in einer Eberpopulation 66 3.5.4 Beziehungen von Chromatininstabilität und standardspermatolo-

gischen Parametern 68

3.5.5 Ergebnisse der Untersuchung von Spermienkopfform und Spermien-

kopfstruktur mittels Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie 70

3.6 ERGEBNISSE DER FLOWZYTOMETRISCHEN BESTIMMUNG VON

IN-VITRO-KAPAZITATIONSPARAMETERN 72

3.6.1 Ergebnisse der Beziehungen zwischen standardspermatologischen

und flowzytometrischen Parametern 72

3.6.1.1 Kinetik flowzytometrisch erfasster In-vitro-Kapazitationsparameter 72 3.6.1.2 Beziehungen zwischen standardspermatologischen Parametern und

In-vitro-Kapazitationsparametern 76

3.6.2 Ergebnisse des Lagerungsversuches 80

3.6.2.1 Einfluss unterschiedlicher Verdünner- und Lagerungstemperaturen auf standardspermatologische Parameter bei 24 h und 72 h gelagertem

Samen 80

3.6.2.2 Ergebnisse der Kontrollmessung 82

3.6.2.3 Einfluss unterschiedlicher Verdünner- und Lagerungstemperaturen auf die Plasmamembranintegrität nach Zugabe von Calciumionophor A23187 unter Kapazitationsbedingungen bei 24 h und 72 h gelagertem

Samen 84

3.6.2.4 Einfluss unterschiedlicher Verdünner- und Lagerungstemperaturen auf In-vitro-Kapazitationsparameter bei 24 h und 72 h gelagertem Samen 87

4 DISKUSSION 94

4.1 EINSETZBARKEIT DES MODIFIZIERTEN SPERMIENCHROMATIN- STRUKTUR-ASSAYS ALS IN-VITRO-DIAGNOSTIKUM ZUR BEUR-

TEILUNG VON EBERSPERMIEN 94

4.2 TEMPERATUR- UND LAGERGUNGSBEDINGTE BEEINFLUSSUNG DER IN-VITRO-KAPAZITATIONSPARAMETER VON GELAGERTEM

EBERSAMEN 99

4.3 SCHLUSSFOLGERUNG 106

5 ZUSAMMENFASSUNG 108

6 SUMMARY 110

7 LITERATURVERZEICHNIS 112

8 ANHANG 124

8.1 LABORBEDARF 124

8.2 MEDIKAMENTE UND REAGENZIEN 125

8.3 REZEPTE 126

8.4 DATENTABELLEN ZUR LAGERFÄHIGKEIT VON KONSERVIERTEN

EBERSPERMIEN 132

9 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 134

10 DANKSAGUNG 136

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abb. Abbildung

ad(d). adde (ergänze auf, füge hinzu) ai artificial insemination

ATP Adenosintriphosphat bidest. bidestillata

BHZP Bundeshybridzuchtprogramm

BSA Bovines Serum Albumin (Rinderserumalbumin) BTS Beltsville Thawing Solution

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius ca. circa

Ca²⁺ Calciumionen

[Ca²⁺]i intrazelluläre Calciumionenkonzentration

cAMP cyclic adenosine monophosphate (zyklisches Adenosin-Monophosphat) cGMP cyclic guanosine monophosphate (zyklisches Guanosin-Monophosphat) CO2 Kohlenstoffdioxid

COMP cells outside main population (Zellen außerhalb der Hauptpopulation) CTC Chlortetracyline

CV Variationskoeffizient Dia. Diagramm

Diss. Dissertation

dest. destillata (einfach destilliert) d.h. das heißt

DICM Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie d-DNA doublestranded DNA (doppelsträngige DNA) DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DTT 1,4 Dithiotreit

Ed(s). editor(s) (Herausgeber)

EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii (und andere)

excl. exclusive (ausschließlich) FITC Fluoreszenzisothiozyanat

FITC-PNA FITC-konjugiertes Peanut-Agglutinin FL-1 Grünfluoreszenz

FL-3 Rotfluoreszenz

Fluo-3-AM Fluo-3-Acetomethoxyester

FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht)

g Gramm / Gravitationsbeschleunigung (9,81m/sec²) ggf. gegebenenfalls

h hour (Stunde)

HBCD 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin

HBS Hepes buffered saline (hepesgepufferte Kochsalzlösung) Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethan

Inc. Incorporation (Vereinigung) Inzeit Inkubationszeit

Kap. Kapitel

KB künstliche Besamung kDa Kilodalton

kg Kilogramm

l Liter

LPC Lysophosphatidylcholin

M molar

MAS morphologisch abweichende Spermien Max. Maximalwert

mf-SCSA modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatinstruktur- Assay

mg Milligramm mmol Millimol

mOsmol/kg Milliosomol je Kilogramm min Minute

Min. Minimalwert Mio. Million ml Milliliter mM millimolar mod. modifiziert MOT Motilität MW Mittelwert

n Anzahl der Tiere / Ejakulate / Untersuchungen NaCl Natriumchlorid

NaOH Natronlauge

NAR normaler apikaler Rand nm Nanometer

Nr. Nummer

NRR Nonreturn-Rate o.g. oben genannt

p Wahrscheinlichkeitswert für die Nullhypothese

PBS phosphat buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PI Propidiumiodid

Pltr. Plasmatropfen PNA Peanut-Agglutinin

® eingetragenes Warenzeichen

R Spearman’scher Korrelationskoeffizient RP Pearson' scher Korrelationskoeffizient RNA Ribonucleic acid

s. siehe s.o. siehe oben

SAS^® Statistical Analysis System (Statistikprogramm) SCSA Spermienchromatinstruktur Assay

SD standard deviation (Standardabweichung) s-DNA singlestranded DNA (einzelsträngige DNA) SWM Sucrose(Saccharose)-Wash-Medium

Tab. Tabelle

Temp. Temperatur (°C)

u. und

µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer µM mikromolar

v. von

v.a. vor allem

Verd.temp. Verdünnertemperatur x (in Formel) multipliziert mit z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

/ (in Formel) dividiert durch

1 EINLEITUNG

In der heutigen Zeit müssen sämtliche Prozesse effektiv und kostengünstig sein.

Diese Forderung kann auch auf die Arbeit in den KB-Eberstationen übertragen werden. Fertile Eber müssen so früh wie möglich selektiert werden. Auch der Erfolg von Konservierungsverfahren muss mit sensitiven Methoden überprüft werden.

Allerdings sind standardspermatologische Parameter wie Motilität und morphologisch abweichende Spermien unzureichend für die Fertilitätsprognose. Daher ist der Einsatz von In-vitro-Fertilitätsdiagnostika gefordert, welche hohe Aussagen über die Fertilität treffen können und sich zudem noch in der Routinediagnostik als praktikabel erweisen.

Als ein solches In-vitro-Diagnostikum bietet sich der Einsatz des in diesem Institut modifizierten fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur-Assay (mf- SCSA) an. Chromatindefekte Spermien werden durch Säurebehandlung und Fluoreszenzfärbung mit Akridinorange sichtbar gemacht. Sie zeigen eine Rotfärbung.

Chromatinintakte Spermien sind grün gefärbt. Hintergrund dieser Untersuchung ist, dass chromatininstabile Spermien zwar prinzipiell eine Eizelle befruchten können, sie führen aber zu einer erhöhten frühembryonalen Mortalität.

Zum kostengünstigen Arbeiten einer KB-Station gehört auch, dass aus einem Ejakulat möglichst viele Besamungsportionen hergestellt werden können, ohne dass es zu Fertilitätseinbußen kommt. Dafür ist neben der Fertilitätsleistung der Eber auch die Lagerung der verdünnten Ejakulate von großer Bedeutung. Durch Lagerdauer und die Lagertemperatur treten Veränderungen an der Plasmamembran des Spermiums im Sinne einer Destabilisierung auf. Diese Destabilisierung ähnelt den Prozessen der Spermienkapazitation. Die Kapazitation der Spermien findet üblicherweise erst im weiblichen Genitale statt, um dort möglichst schnell mit der Eizelle interagieren zu können, denn durch Kapazitation und anschließender Akrosomreaktion reduziert sich die Lebensdauer der Spermien. Eine Folge der Plasmamembrandestabilisierung ist der Influx von Calciumionen in die Spermienzelle. Mit standardspermatologischen Verfahren kann die Destabilisierung

der Plasmamembran nicht erfasst werden. Mögliche Diagnostika zur Erfassung dieser lagerungs- und temperaturbedingten Veränderungen sind In-vitro- Kapazitationsparameter wie der intrazelluläre Calciumioneninflux und die Auslösbarkeit der Akrosomreaktion. Diese Parameter können nach Kapazitationsbehandlung flowzytometrisch erfasst werden.

Ziel war es, zunächst den mf-SCSA methodisch an hohe Umgebungstemperaturen anzupassen, um dann die Chromatinstabilität in einer Eberpopulation zu bestimmen und in Bezug zu standardspermatologischen Parametern zu setzen. Darüber hinaus sollten verarbeitungsbedingte Veränderungen der Plasmamembranstabilität unter Kapazitationsbedingungen flowzytometrisch dargestellt werden.

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 KAPAZITATION

Frisch ejakulierte Säugetierspermien sind noch nicht in der Lage, Eizellen zu befruchten. Sie müssen sich im weiblichen Genitale noch physiologischen Veränderungen unterziehen, durch welche sie die Befruchtungsfähigkeit erlangen.

Unabhängig voneinander wurden diese Ereignisse erstmals von CHANG (1951) und AUSTIN (1951) beschrieben und 1952 von AUSTIN als "Kapazitation" benannt. 1996 definierte HARRISON die Kapazitation als eine Serie positiv destabilisierender Ereignisse, die den Spermien erlaubt, die zona-induzierte Akrosomreaktion und hyperaktivierte Motilität innerhalb eines kleinen Zeitfenster durchzuführen, worauf dann der Zelltod folgt (s. Abbildung 1).

Zu den Vorgängen der Kapazitation in vivo gehören unter anderem das Entfernen der Dekapazitationsfaktoren aus dem Seminalplasma, Veränderung der Membraneigenschaften mit Erhöhung der Fluidität, Hyperaktivierung und Phosphorylierung von Proteinen. Diese Veränderungen finden bei der Sau fast ausschließlich im kaudalen Isthmus des Eileiters statt (YANAGIMACHI 1994;

TÖPFER-PETERSEN 1996).

Die Untersuchungen der klassischen Spermatologie finden immer an Ejakulaten statt, in denen die Spermien noch keinen Kontakt mit dem weiblichen Genitale hatten und dementsprechend noch keinem Kapazitationsprozess unterlaufen sind.

FLORMAN und BABCOCK (1991) stellten in ihren Versuchen fest, dass Säugetierspermien, welche unmittelbar im Anschluss an den Deckakt untersucht wurden, nicht in der Lage sind, in vitro eine Eizelle zu befruchten.

Möchte man die Aussagekraft der spermatologischen Untersuchung auf den Bereich der tatsächlichen Befruchtungsfähigkeit ausweiten, müssen die Spermien unter Kapazitationsbedingungen untersucht werden. Durch Inkubation in speziellen Medien kann man die Spermienkapazitation induzieren. Serumalbumin, Calciumionen und

Bicarbonat spielen in diesen Medien eine wichtige Rolle (VISCONTI und KOPF 1998).

HARRISON (1996) fand heraus, dass für das Erreichen von Kapazitationsbedingungen in vitro ein Bicarbonat/CO2-System erforderlich ist, welches eine spezielle Adenylatcyclase aktiviert. Das dadurch vermehrt gebildete cAMP aktiviert eine Kaskade von Proteinphosphorylierung, welche von der Aktivität der Proteinkinase A abhängig ist. Folge ist eine Auflockerung der Lipidstruktur der Plasmamembran (HARRISON und MILLER 2000; GADELLA und HARRISON 2000).

Der Ausstrom von Cholesterin auf die Plasmamembran führt ebenfalls zu einem Anstieg der Membranfluidität und daneben noch zu einer Modulation der intrazellulären Ionenkonzentration, z.B. einer Erhöhung der Calciumionenkonzentration (BALDI et al. 1991). Die physiologische Rolle der Calciumionen ist noch unklar. BREITBART und SPUNGIN (1997) vermuten in Ca²⁺

einen Botenstoff, was eine genaue Kontrolle des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels erfordern würde. Die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration wird vermutlich über die Plasmamembran (FLORMAN et. al. 1992; ARNOULT et al. 1996) und über die Membran der Mitochondrien (BREITBART et al. 1996) reguliert. Während der Kapazitation soll eine Ca²⁺-ATPase für die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration zuständig sein (FRASER und MC DERMOTT 1992; FRASER et al. 1995).

Der Calciumioneninflux in Spermien verläuft biphasisch. Zuerst findet ein schwächerer Calciumioneneinstrom statt, welcher dem weiteren Verlauf der Kapazitation dient, dann erfolgt ein stärkerer Influx, welcher zur Akrosomreaktion führt (FRASER et al. 1993). Die während der Kapazitation auftretende Hypermotilität der Spermienzellen ist calciumabhängig (FRASER 1982).

In ihren Übersichtsartikeln stellten BREITBART et al. (1997) und BREITBART und NOAR (1999) dar, dass während der Kapazitation die Konzentration an intrazellulärem Ca²⁺ und Bicarbonat ansteigt, was zu einer Aktivierung einer Adenylylcyclase führt, welche cyclisches AMP (cAMP) bildet. Auch durch die Bindung an die Zona Pellucida wird die Bildung von cAMP verstärkt. CAMP aktiviert die Proteinkinase A, welche diverse Proteine phosphoryliert. Proteinkinase A aktiviert außerdem einen spannungsabhängigen Calciumionenkanal in der äußeren

akrosomalen Membran, welcher zu einer Freisetzung von Calciumionen aus dem Inneren des Akrosoms in das Cytosol führt. Dieser Ioneneinstrom führt nur zu einer relativ geringen Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration. Dadurch wird die Phospholipase C aktiviert. Über die Reaktionsprodukte Diacylglycerol und Inositol-Triphosphat wird Proteinkinase C aktiviert, welche wiederum Calciumionenkanäle in der Plasmamembran öffnet. Inositol-Triphosphat aktiviert den Calciumionenkanal der äußeren akrosomalen Membran. Durch die Öffnung der Kanäle kommt es zu einem zweiten und höheren Calciumioneneinstrom. Diese Konzentrationserhöhung führt zur Membranfusion und damit zur Akrosomreaktion.

Um für die nachfolgende Akrosomreaktion an die Zona Pellucida binden zu können, müssen verschiedene Membranproteine bereitgestellt werden. So fand z.B.

SPUNGIN et al. (1995) heraus, dass ein 70 kDa großes Protein während der Kapazitation von der äußeren akrosomalen Membran auf die Plasmamembran transferiert wird. FLESCH et al. (1999) entdeckten, dass 3 Membranproteine durch die Kapazitation tyrosinphosphoryliert werden, was zu einer Erhöhung der Plasmamembranfluidität führt. Nach ROSATI et al. (2000) wird während der Kapazitation ein Glycoprotein im Äquatorialbereich zugänglich, welches ebenfalls für die Spermien-Eizell-Erkennung und die Spermien-Eizell-Bindung wichtig zu sein scheint.

ASHWORTH et al. (1995) fanden heraus, dass sich im bicarbonat- und calciumhaltigen Tyrode-Medium das Bindungsverhalten von verschiedenen FITC- konjugierten Lectinen an Eberspermien ändert. Das Maximum der Reaktionen wird nach 3-stündiger Inkubation erreicht. Diese Änderungen finden nicht im bicarbonat- freien Medium statt. Ebenfalls konnten bei Inkubation mit dem Chelatbildner EGTA diese Veränderungen nicht festgestellt werden. Sie schlossen daraus, dass Bicarbonat einen Verlust an oberflächenbildenen Materialien verursacht. Die Unterschiede in der Lektinbindungsfähigkeit variieren von Lektinbindungsmustern, die nach Auslösung der Akrosomreaktion durch das Calciumionophor A23187 auftreten.

In mehreren Versuchen konnte die Vermutung aufgestellt werden, dass Inkubation in einem bicarbonathaltigen Medium zu vermehrten Sterben der Spermienzellen führt (HARRISON et al. 1993; HARRISON und MILLER 2000; GADELLA und HARRISON

2000). Mit ihren Untersuchungen haben GADELLA und HARRISON (2002) überprüft, ob der Bicarbonateffekt auf das "phospholipid scrambling" Teil einer apoptotischen Reaktion ist. Es wurden DNA und Mitochondrienmembran untersucht und es gab keinen Hinweis auf DNA-Fragmentierung und Mitochondrienmembrandepolarisierung während Inkubation mit Bicarbonat.

Durch Bicarbonat wird auch der Influx von Calciumionen in Eberspermien forciert.

Das stellten HARRISON et al. (1993) unter Verwendung des calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoffes Fluo-3-AM fest. Neben dem Calciumioneninflux wurde auch ein konstantes Ansteigen des Anteils plasmamembrandefekter Spermienzellen beobachtet. Daraus folgerten sie, dass der Calciumioneninflux auf eine Destabilisierung der Plasmamembran zurückzuführen ist (HARRISON 1996, s.

Abbildung 1).

Abbildung 1: Kapazitation als ein fortschreitender Destabilisierungsprozess der Plasmamembran (nach HARRISON 1996)

Nein Ja

Zonapenetration

Zeit

Destabilisierung

schnell de- stabilisierende

Spermien langsam de-

stabilisierende Spermien

HM und zona- induzierte AR

HM = Hypermotilität AR = Akrosomreaktion

2.2 AKROSOMREAKTION

In vivo muss das Spermium für die Fusion mit der Oozyte die Zona Pellucida penetrieren. Mit Hilfe von akrosomalen Enzymen wird die Zona Pellucida deshalb partiell hydrolysiert. Diese Enzyme werden nach Fusion der Spermienplasmamembran mit der darunter liegenden akrosomalen Membran und einhergehender Kanalbildung freigesetzt. Auslöser für diesen Prozess ist die Bindung an die Zona Pellucida (FAZELI et al. 1997). Die Membranfusion kann als Exozytose der Spermienakrosoms bezeichnet werden und entsteht durch einen massiven Influx von extrazellulären Calciumionen (FRASER et al. 1993). Von besonderer Bedeutung sind Hyaluronidase und Acrosin. Hyaluronidase unterstützt die Penetration der Cumuluszellschicht, deren Matrix aus Hyaluronsäure besteht (HARRISON 1983). Die Calciumaufnahme wird durch Anwesenheit von Bicarbonat im Inkubationsmedium erleichtert (HARRISON et al. 1993).

Als Marker für die Akrosomreaktion können verschiedene fluochrommarkierte Lektine verwendet werden. Lektine binden in spezifischer Weise an Carbohydrate. Das Lektin Peanut-Agglutinin (PNA) bindet bei Eberspermien spezifisch an die äußere akrosomale Membran (ASHWORTH et al. 1995; FLESCH et al. 1998). Peanut- Agglutinin erkennt endständige N-acetylgalactosereste oder N-acetyllactosereste (SERRANO und DIAZ-ESPARZA 2001). Man kann die Akrosomreaktion u.a. auch mit gelöster Zona Pellucida auslösen (SERRANO und DIAZ-ESPARZA 2001). Bei der Untersuchung von Schafbockspermien (WATSON et al. 1992) wurden elektronenmikroskopisch Unterschiede zwischen spontaner Akrosomreaktion und der durch das Ionophor A23187 induzierten festgestellt. Unter Einwirkung des Ionophors waren die gebildeten Vesikel größer, unregelmäßiger und von verschiedenartiger Größe.

Die Regulation von Calciumionen während der Akrosomreaktion erfolgt nach dem Übersichtsartikel von BREITBART et al. (1997) auf die Weise, dass durch die Proteinkinase A, aktiviert nach der Bindung an die Zona Pellucida und reguliert durch Adenylylcyclase, ein spannungsabhängiger Calciumionenkanal in der äußeren akrosomalen Membran aktiviert wird. Dieser setzt Calciumionen vom Inneren des Akrosoms in das Cytosol frei. Dieser relativ geringe Calciumioneninflux führt zur

der Proteinkinase C, welche wiederum spannungsabhängige Calciumionenkanäle in der Plasmamembran öffnet. Es kommt zu einem erneuten, größeren Calciumioneneinstrom.

SERRANO und DIAZ-ESPARZA (2001) sehen die Akrosomreaktion als schrittweisen Prozess:

1. Die Zona-Rezeptoren des Spermiums müssen mit dem Zona Pellucida Protein ZP3 interagieren (LEYTON u. SALING 1989).

2. Durch diese Interaktion wird es einer Tyrosinkinase ermöglicht, eine Transphosphorylierung durchzuführen

3. Es wird ein G-Protein mit einbezogen, welches die Konzentration der Second Messenger IP3 und Diacylglycerol (DG) erhöht. DG triggert die Phosphorilierungskaskade und erhöht intrazelluläres Calcium, aktiviert die cGMP-ase und cATP-ase, erhöht damit den Level von zyklischen Nukleotiden, und aktiviert cGMP- und cAMP-abhängige Proteinkinansen.

Durch Aktivierung der membranständigen Calciumkanäle kommt es zu einem Anstieg von intrazellulären Calciumionen. Außerdem steigt Stickstoffmonoxid (NO) intrazellulär an, was charakteristisch für die molekularen Reaktionen währen der AR ist.

2.3 SPERMIENCHROMATIN 2.3.1 Spermienchromatinstruktur

Die Struktur des Spermienchromatins ändert sich beim Durchlauf der Spermiogenese. Während der Entwicklung des Spermatozoon aus dem Spermatid wird das Chromatinvolumen durch Kondensation stark verringert (WARD und COFFEY 1991). In diesem Prozess werden auch Proteine ausgetauscht. Lysinreiche Histone, welche physiologisch in den somatischen Zellen vorkommen, werden durch Protamine ersetzt. Protamine sind reich an Thiol-Gruppen. Ferner sind sie hochbasisch und beinhalten in ihrem Aufbau einen hohen Gehalt an Arginin und Cystein. Durch Histone und Protamine wird die Tertiärstruktur der DNA, d. h. deren räumliche Struktur, festgelegt (KUMAROO et al. 1975). BALHORN et al. (1991) unterscheiden zwischen zwei Klassen von Protaminmolekülen: Protamin 1 und Protamin 2, welche in Säugetierspermien gefunden wurden. Spermien von z.B. Eber, Bulle, Schafbock und Ratte enthalten nur Protamin 1, wogegen beim Menschen auch Protamin 2 vorkommt, welches kein Cystein enthält (EVENSON et al. 2002) und entsprechend keine stabilisierenden Disulfidbrücken ausbilden kann. Der Austausch von Histonen gegen Protaminen soll nach Meinung von KOSOWER et al. (1992) die Bildung von abnormen Spermien forcieren.

Während der Endphase der Spermiogenese und des Transportes durch das Rete Testis und des Nebenhodens werden die Thiolgruppen des Cysteins der Protamine kontinuierlich oxidiert. Es entstehen inter- und intramolekulare Disulfidbrücken, welche dem Chromatin einen hohen Grad an Kompaktheit und Stabilität im ejakulierten Spermium vermitteln (BALHORN et al. 1991).

In Abbildung 2 ist dargestellt, wie sich die DNA-Anordnung zwischen somatischen Zellkern und Spermienzellkern unterscheidet. Nach dem Modell von BALHORN (1992) sind die Protamine der Länge nach an der Innenseite der kleinen Biegung des DNA-Stranges gebunden. Dieser Protamin-DNA-Komplex des einen Stranges passt genau in die große Biegung des Nachbarstranges, so dass von einer Seite-an-Seite- Anordnung gesprochen wird. Im Gegensatz zu den somatischen Zellen kann auf diese Weise keine Supercoiled-Struktur entstehen (WARD und COFFEY 1991).

WARD erweiterte 1993 o.g. Model: Die protamingebundene DNA ist in konzentrischen Kreisen angeordnet, von denen 72 Stück eine so genannte

"Doughnut-Domäne" bilden.

Abbildung 2: Unterschiede im Chromatinaufbau bei somatischen Zellen und Spermien (nach WARD 1993)

2.3.2 Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA)

Der Spermienchromatinstruktur-Assay dient zur Erfassung chromatindefekter Spermien und wurde 1980 von EVENSON et al. entwickelt. Maßstab hierfür ist die Chromatinstabilität, welche durch die Anfälligkeit der DNA gegenüber Denaturierung durch Säure ermittelt wird. Die der Säuredenaturierung unterzogene DNA wird mit dem metachromen Fluoreszenzfarbstoff Akridinorange (AO) angefärbt. Unter Anregung mit blauem Laserlicht (488 nm) fluoresziert AO grün, wenn es an doppelsträngige DNA als ein Monomer bindet, und rot, wenn es an einzelsträngige DNA als Aggregat bindet.

Die Auswertung erfolgt flowzytometrisch. Der Grad der DNA-Denaturierung wird quantitativ durch den per Computer errechneten Quotienten von roter Fluoreszenz / (rote und grüne) Fluoreszenz ermittelt und als alpha t (αt) bezeichnet (DARZYNKIEWICZ et al. 1975).

Als weitere Werte werden Mittelwert und Standardabweichung von αt erfasst. Der Mittelwert beschreibt die Verschiebungen und Trends von grün nach rot in der gesamten Zellpopulation. Die Standardabweichung beschreibt den Grad der Variation von αt von Zelle zu Zelle (EVENSON und JOST 2000). Um den relativen Anteil der Zellen mit denaturierter DNA zu erhalten, führten EVENSEN und JOST 1994 den Prozentsatz der Zellen außerhalb der Hauptpopulation (%COMPαt; cells outside the main population), gemessen bei 5000 Zellen pro Probe, als Auswertungskriterium ein. %COMPαt ist bezüglich der Voraussagbarkeit der Fertilität die wichtigste Variable.

Um die Erfassung von chromatinabnormen Spermien auch kleineren Laboren, die nicht die Möglichkeit der kostenintensiven flowzytometrischen Auswertung haben, zugänglich zu machen, wurde der SCSA weiter modifiziert, um die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop auswerten zu können. Bei dem von TEDAJA et al. (1984) entwickelten Akridinorange-Test werden Objektträgerausstriche der Proben angefertigt, die dann nach dem ursprünglichen SCSA-Prinzip behandelt werden. Die Auswertung erfolgt fluoreszenzmikroskopisch durch subjektive Erfassung von roten und grünen Zellen. Die Forscher untersuchten mit diesem Test nur humane Spermien. Vorteil der Nutzung des Fluoreszenzmikroskopes ist die gleichzeitige

Erfassung von morphologisch abweichenden Spermien. Beim Akridinorange-Test wird die effektive Spermienzahl ermittelt, welche das Produkt von Dichte und grünen Spermien darstellt. Bei der Untersuchung von Säugetierspermien mit dem Akridinorange-Test stellten KOSOWER et al. (1992) fest, dass die Art der Akridinorange-Fluoreszenz von dem Thiol-Disulfid-Status der Protamine abhängt. Sie setzten 1,4 Dithiotreit (DTT) in geringer Konzentration ein. DTT reduziert Disulfidbrücken und schützt freie SH-Gruppen gegenüber Oxidation. In dem Protokoll von ACEVEDO (2001a) wurde die DTT-Behandlung der AO-Färbung vorgeschoben, weil so der Zugang des Fluochroms zur DNA vereinfacht wird.

Die Problematik bei den Akridinorangefärbungen von Objektträgerausstrichen ist, dass die Ausstriche sehr schnell verblassen und damit die Einteilung der Spermien als chromatinintakt und chromatindefekt nicht immer eindeutig ist, insbesondere bei subjektiver Auswertung. Eine weitere Verbesserung des Protokolls von ACEVEDO (2001a) ist der in dieser Arbeit angewendete MF-SCSA von HELMS (unveröffentlicht). Hier wird DTT mit Dimethylsufoxid (DMSO) gemischt, um die Zellwände besser penetrieren zu können und um somit eine bessere Wirkung direkt am Spermienchromatin zu erzielen. Die Auswertung erfolgt computergestützt über eine Digitalkamera.

2.4 LAGERUNG VON EBERSPERMIEN

Die Reaktionen von Spermien auf einen Kältereiz finden hauptsächlich an der Plasmamembran statt. Diese durch Kälteeinwirkung entstandenen Plasmamembranschäden werden „Kälteschock” genannt. Die Sensibilität der Plasmamemban ist tierartspezifisch. Vor allem Eberspermien sind sehr empfindlich gegenüber Temperaturänderungen (WATSON 1981).

Beim molekularen Bau der Spermienmembran herrschen bezüglich der Fluidität und der Membrantransportmechanismen regionale Unterschiede (ROVAN 2001).

Temperatur, Fettsäurezusammensetzung und das Verhältnis zwischen Cholesterin und Phopholipiden beeinflussen die Membranfluidität (QUINN 1981). Bezüglich des Cholesterin-Phospholipid-Verhältnisses gibt es tierartliche Unterschiede. Nach TARDIF et al. (2003) weisen Eberspermien einen geringeren Cholesterolgehalt auf als andere Spezies. Bei einem geringeren Anteil an Cholesterin steigt die Membranfluidität und die Resistenz gegenüber Temperaturschwankungen sinkt.

ZENG und TERADA (2000) untersuchte vor dem Hintergrund, dass Cyclodextrin die Freisetzung von Cholesterol aus Maus- und Bullenspermien fördert (VISCONTI et al.

1999), die Veränderung der Kälteschockresistenz bei vorhergehender Behandlung der Spermien mit 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HBCD). Sie stellten fest, dass nach Beurteilung von intakten Akrosomen, Membranintegrität und Motilität HBCD eine protektive Wirkung auf Eberspermien hinsichtlich Kälteschocks hat.

Die Kälteschockempfindlichkeit scheint auch vom Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren in der Plasmamembran abhängig zu sein. WHITE machte 1993 die Unterteilung in Klassen mit hohem Gehalt an gesättigten Fettsäuren und denen mit niedrigerem Gehalt. Sensible Spermien haben ein höheres Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren (>2,5), wie z.B. Eber, Bulle, Schafbock.

Resistentere Spezies haben diesbezüglich ein geringeres Verhältnis (ca. 1); zu ihnen gehören z.B. Kaninchen, Hunde und Menschen. Bei einem höheren Anteil ungesättigter Fettsäuren steigt die Membranfluidität, wobei Resistenz und Vitalität der Spermien sinken (SCHILLING und VENGUST 1985). Von CIERESZKO et al.

(2000) wurden saisonale Veränderungen der Membranintegrität beschrieben, welche wahrscheinlich auf den Einfluss der Umgebungstemperaturen beruhen.

Durch den Kälteschock wird u. a. die selektive Permeabilität der Spermienmembranen für Calcium zerstört, was zu exzessiven intrazellulären Calciumionenkonzentrationen führt (WHITE 1993), einhergehend mit einem Motilitätsverlust und letztendlich Übergang zum Zelltod.

Als ein mögliches Kryoprotektiva wurde Seminalplasma untersucht. BERGER und CLEGG (1985) fanden heraus, dass Eberspermien, welche direkt aus dem Nebenhoden entnommen wurden, kälteschockresistenter waren als ejakulierte Spermien. Als Merkmal wurde die Freisetzung von Hyaluronidase untersucht, welche als Index für die Schädigung der akrosomalen Membran genommen wurde. Bei Vorinkubation der Nebenhodenspermien in Seminalplasma wurde sowohl bei vasektomierten als auch bei unbehandelten Ebern eine Erhöhung der Kälteschockresistenz festgestellt.

In ihrem Übersichtsartikel stellten BAILEY et al. (2000) fest, dass sich die Veränderungen am Spermium während der Kapazitation mit denen der Kryokonservierung ähneln.

Tabelle 1: Spermienveränderungen verbunden mit Kapazitation und Kryo- konservierung (BAILEY et al. 2000)

Kapazitation Kryokonservierung

CTC-Fluoreszenzmuster B CTC-Fluoreszenzmuster B Plasmamembranreorganisation und

Fluiditätserhöhung

Plasmamembranreorganisation und Destabilisierung

Erhöhter intrazellulärer Calciumgehalt Erhöhter intrazellulärer Calciumgehalt Entwicklung von reaktiven

Sauerstoffspezies (ROS)

Entwicklung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) cAMP-vermittelte Protein-

Tyrosinphoshorylierung

Auftreten von tyrosin-phosphorylierten Proteinen

Fähig, Oozyten in vitro zu befruchten Fähig, Oozyten in vitro zu befruchten

2.4.1 Einfluss der Temperatur

Die Temperatur der Besamungsportionen in der landwirtschaftlichen Praxis ist von großer Bedeutung. Besonders in Herbst- und Wintermonaten, wenn die nächtlichen Temperaturen sinken, können, trotz Versand in Isolierverpackung, auch die Besamungsportionen einen Wert unterhalb der kritischen Temperatur von 15 °C annehmen.

Bei der Kryokonservierung von Eberspermien wird in den gängigen Protokollen die Temperatur des verdünnten Ejakulates bis auf 5 °C abgesenkt, und dann folgt die Stickstoffbehandlung. Es konnte gezeigt werden, dass das Absinken von Motilität und des Anteils von normalen apikalen Rändern nicht Folge des Gefrierprozesses und des Auftauens ist, sondern schon bei unterschreiten der kritischen Temperatur von 15 °C auftritt. Die Membranzerstörung der Eberspermien während der Kryobehandlung kann die Fertilität reduzieren. Es ist daher nötig, den Inseminationszeitpunkt bei der Verwendung von tiefgefrorenem Sperma näher an dem Ovulationszeitpunkt auszurichten (4 bis 0 h vor Ovulation) als mit flüssigkonserviertem Sperma (12 bis 0 h vor Ovulation) (WABERSKI et al., 1994b).

In ihren Untersuchungen vermuteten MAXWELL und JOHNSON (1997b), dass der Hauptanteil der Membranveränderungen, welche in den Prozessen der Kryokonservierung und des Auftauens auftreten, in dem Stadium der Kühlung auf 5

°C auftreten und nicht Folge des Gefrierens und Auftauens sind. WATSON und GREEN (2000) konnten dagegen zeigen, dass der Anteil kapazitierter und akrosomreagierter Spermien bei Kühlung auf 4 °C nach Erwärmung auf 39 °C stärker ansteigt als bei Erwärmung auf nur 22 °C.

Die durch schnelles Kühlen hervorgerufene Zellzerstörung geht einher mit unwiederbringlichem Motilitätsverlust und Zerstörung von Membranen und Akrosom (PLUMMER und WATSON 1985).

WEBER (1989) zeigte, dass bei schrittweisem Abkühlen von verdünntem 35 °C warmen Samens in 10 °C-Schritten auf 5 °C signifikant mehr Spermien motil und mit normalem apikalen Rand vorlagen als bei direkter Kühlung auf diese Temperatur.

Wurden die Proben während des stufenweise erfolgten Kühlens länger auf der jeweiligen Temperaturstufe inkubiert (bis 24 h), so zeigten die Spermien noch

weniger Kühlsensibilität (bezogen auf % Motilität und % normaler apikaler Rand) als bei stufenweiser Abkühlung ohne verlängerte Haltezeiten. Die Inkubationszeit hat demnach mehr Einfluss auf die Kälteschockresistenz bei Kühlung auf 5 °C als die Inkubationstemperatur

In Versuchen von ZOU und YANG (2000) wurde frisch ejakulierter Ebersamen bei verschiedenen Lagertemperaturen (39, 20, 15 u. 4 °C) und einer Lagerdauer bis zu 48 h untersucht. Parameter waren Motilität, hypoosmotischer Schwelltest und akrosomaler Status. Zusammenfassend aus den Ergebnissen ist zu erkennen, dass eine Lagerung von 20 °C hinsichtlich der untersuchten Parameter besser ist als 15

°C, gefolgt von 4 °C und dann 39 °C.

2.4.2 Einfluss der Lagerdauer

In den angewendeten Verfahren zur Kryokonservierung von Eberspermien werden - vor Kühlung unter die kritische Temperatur von 15 °C - die Spermien bei einer darüber liegenden Temperatur für einige Stunden gelagert, da von verschiedenen Untersuchern festgestellt wurde, dass damit die Kälteresistenz der Zellen steigt.

TAMULI und WATSON (1994) untersuchten unverdünnten Samen bei Lagerung bei 20 °C bis zu 32 h vor und nach Kälteschock. Der Anteil plasmamembranintakter und akrosomintaker Spermien stieg bis zu einer Inkubationszeit von 16 h vor Kälteschock signifikant an. Plasmamembranintakte Spermien mit Akrosomdegeneration wurden prozentual nach 16 h Inkubation signifikant mehr, sowohl vor als auch nach Kälteschock.

MAXWELL und JOHNSON (1997a) untersuchten Motilität, Viabilität und Membranintegrität von Eberspermien während des Prozesses der Kryokonservierung. Bei einem Teil wurde während des Kühlprozesses die Temperatur des in BTS verdünnten Samens von 15 °C für 3,5 h gehalten, bevor zentrifugiert, mit Lactose-Egg-Yolk-Verdünner resuspendiert und auf 5 °C gekühlt wurde. Bei dem anderen Teil wurde ohne diese Haltezeit gearbeitet. Es wurde festgestellt, dass nach Durchführung der Haltezeit weniger Spermien beim Tiefgefrieren und Auftauen starben als ohne. Auch der Anteil der akrosomintakten Spermien war mit Haltezeit höher.

In einer Studie von WABERSKI et al. (1994a) wurde festgestellt, dass die Befruchtungskapazität (gemessen an Tag-2 bis Tag-4 Embryonen und Anzahl der akzessorischen Spermien) von verdünnten und bei 17 °C gelagerten Spermien besser ist, je näher die künstliche Besamung am Ovulationszeitpunkt (gemessen in 12 h-Intervallen) und je geringer die Lagerdauer (bis 48 h- / 87 h- / 118 h-Intervall) ist. So hat z.B. eine Lagerung von bis zu 87 h Stunden keinen Einfluss auf die Fruchtbarkeit bei Sauen, welche bis 12 h nach der Besamung ovuliert haben. Liegen dagegen 12-24 h zwischen Besamung und Ovulation, waren schon nach einer Lagerung über 48 h Einbußen in der Befruchtungsleistung zu erkennen.

2.5. FERTILITÄTSPROGNOSEN ANHAND SPERMATOLOGISCHER UNTER- SUCHUNGSTECHNIKEN

Hauptziel der spermatologischen Untersuchungen ist, Voraussagen über die Befruchtungsfähigkeit von Spermien treffen zu können. Die Befruchtungsfähigkeit kann nur in vivo ermittelt werden. In-vitro-Testverfahren können nicht mit Fertilität gleichgesetzt werden, da ihnen immer Teilvorgänge, welche nur in vivo ablaufen, fehlen (AMANN 1989). Die Problematik in der Erfassung der Fertilität ist ein hoher Zeit-, Kosten- und Organisationsaufwand.

In der Vergangenheit sind zahlreiche Tests entwickelt worden, die Spermien auf verschiedene Weise beurteilen. Zu den Parametern der klassischen Spermatologie gehören die Motilität und Morphologie. Die Intaktheit der Plasmamembran kann mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen untersucht werden. Der hypoosmotische Schwelltest und die Erfassung der regulativen Volumenverminderung gehören ebenfalls zu Messverfahren für die Membranintaktheit. Die klassische subjektive Motilitätsschätzung wurde durch die computergestützte Motilitätsanalyse ergänzt.

Hier werden auch weitere Kriterien, wie z.B. seitliche Kopfauslenkung und kurvolineare Geschwindigkeit, ermittelt. Es wurden auch Tests entwickelt, die die Reaktionen, die Spermien im weiblichen Genitale durchführen müssen, in vitro zu provozieren. Hierzu gehören u.a. Kapazitationsversuche, Auslösung der Akrosomreaktion und der zona-freie Hamster-Oozyten-Penetrationstest. In dieser

Übersicht soll im Wesentlichen auf die Methoden eingegangen werden, welche in dieser Arbeit angewendet wurden.

FALKENBERG et al. (1984) untersuchten mögliche Beziehungen von Spermaqualitätsparametern (Filtrationsvolumen, Spermakonzentration, Gesamtspermienzahl, Vorwärtsbeweglichkeit und Anteil morphologisch geschädigter Spermien) bei 18 Ebern mit Befruchtungsergebnissen aus durchschnittlich 29 Besamungen, dargestellt als Abferkelrate, gesamt und lebend geborene Ferkel pro Wurf. Es konnten fast keine statistisch abgesicherten Abhängigkeiten festgestellt werden. Bei der Bildung eines Indexwertes (=Gesamtspermienzahl pro Ejakulat x Vorwärtsbeweglichkeit (%) / Anteil morphologisch geschädigter Spermien) konnten dagegen mehrere signifikante Korrelationen gefunden werden.

Bei einem Eber mit physiologischem Spermiogramm aber totaler Infertilität stellte BANE (1961) bei 92-95% der Spermien elektronenmikroskopisch ein Auffliesen der akrosomalen Substanz fest. Ferner waren die Spermienköpfe im Allgemeinen kürzer als normal. Von HIRAI et al. (2001) wurden computergestützt Motilität und Kopfmorphologie von Spermien von 12 Pietraineber untersucht, welche den Mindestanforderungen für künstliche Besamung gerecht wurden. Maß für die Fertilität waren die Nonreturn-Rate (NRR) und die Wurfgröße, gemessen an durchschnittlich 553 Erstbesamungen. Die Eber wurden nach Berechnung der Leistungsmittelwerte in gleich große Gruppen mit über- und unterdurchschnittlicher Leistung eingeteilt. Eber mit höherer NRR hatten eine signifikant niedrigere Durchschnittsgeschwindigkeit bei den motilen Spermien als die der anderen Gruppe.

Ferner hatten diese Eber kleinere und kürzere Spermienköpfe. Bei der Wurfgröße unterschieden sich die beiden Gruppen nur hinsichtlich der Spermienkopflänge signifikant. Diese war bei den Ebern mit mehr als 10 Ferkeln pro Wurf länger.

Bei den Kapazitationsversuchen wurde in diversen Untersuchungen festgestellt, dass es schnell und langsam kapazitierende Spermien gibt. Welche dieser Gruppen letztendlich für die In-vitro-Befruchtung zuständig ist, ist unklar (HARRISON 1997).

HARKEMA et al. (1998) vermuten, dass die langsam kapazitierende Spermiensubpopulation für die Befruchtung in vivo zuständig ist.

TARDIF et al. (1999) untersuchten bei 9 Ebern Motilität, Vitalität (Eosin-Nigrosin- Färbung), akrosomaler Status (Chlortetracyclin-Färbung) und ATP-Gehalt vor und

nach thermalen Stress und mit optimaler und suboptimaler Besamungsdosis. Für die Fertilität wurde die Fertilitätsrate ermittelt, bestehend aus: (Anzahl der Feten/Anzahl der Corpora Lutea) x 100%. Besamt wurden 74 Sauen. Es konnten nur statistisch gesicherte Beziehungen zwischen der Motilität der Spermien in der suboptimalen Besamungsdosis vor dem thermalen Stress und der Fertilitätsrate ermittelt werden.

Ebenfalls einen Bezug zur Fertilitätsrate hatte das CTC-Muster für die Akrosomreaktion bei der suboptimalen Besamungsdosis. Die Untersucher messen diesem Ergebnis allerdings nicht viel Wert bei, da die Variation zwischen den Ejakulaten äußerst gering war.

Zur Erfassung von Kapazitation und Akrosomreaktion verwendeten JIMÉNEZ et al.

(2002) 3 verschiedene FITC-konjugierte Lektine. Sie untersuchten flowzytometrisch damit 58 Eber mit physiologischen Werten für Motilität, Viabilität und morphologisch abnormale Spermen, von denen aber 19 als subfertil beurteilt wurden. Die Bindung von Triticum vulgaris agglutinin war sowohl bei frischen, als auch kapazitierten und auch bei akrosomreagierten Spermien der subfertilen Gruppe signifikant niedriger als in der fertilen. Unterschiede im Vergleich beider Gruppen gab es auch bei der Bindung von Ulex europaceus agglutinin, welche aber nur bei kapazitieren Spermien von subfertilen Ebern eine signifikant höheren Fluoreszenzintensität zeigte als bei fertilen. Bei der Verwendung von Concanavalia ensiformis agglutinin unterschieden sich die Werte für kapazitierte und akrosomreagierte Spermien der beiden Gruppen signifikant – die der subfertilen Probanden waren geringer.

HERRERA et al. (2002) fanden heraus, dass es signifikante Unterschiede in der Auslösung der Akrosomreaktion durch Progesteron zwischen fertilen und subfertilen Ebern gibt. Der Prozentsatz der auf diese Weise akrosomreagierten Spermien war bei den subfertilen Ebern niedriger als bei den fertilen. Untersucht wurden 73 normosperme Probanden. Bei der Erfassung der spontanen Akrosomreaktion waren die Unterschiede zwischen den Leistungsgruppen statistisch nicht absicherbar, ebenfalls nicht die Vorwärtsbeweglichkeit und die Vitalität. Die Auslösung der Akrosomreaktion mit dem Calciumionophor A23187 wurde von JANUSKAUSKAS et al. (2000) bei kryokonservierten Bullenspermien untersucht. Die Fertilität wurde über die 56-Tage Nonreturn-Rate ermittelt. Hier konnte nur eine signifikante Korrelation der verbleibenden äquatorialen Fluoreszenz (FITC-PNA), festgestellt per

Fluoreszenzmikroskopie, mit der Fertilität festgestellt werden. Bei der flowzytometrischen Untersuchung gab es keine signifikanten Ergebnisse.

Nach den Untersuchungen von BAILEY (1994) korrelieren In-vivo-Fertilitätsraten von kryokonservierten Bullensperma mit der Fähigkeit der Spermien, moderate intrazelluläre Calciumgehalte aufrecht zu erhalten.

Mit der Beurteilung des Spermienchromatins konnten Beziehungen mit der Befruchtungsfähigkeit hergestellt werden. Die meisten Untersuchungen liegen über Menschen und Bullen vor. Aus seinen Versuchen zogen EVENSON et al. (1980) Rückschlüsse, dass die DNA von Spermien unfruchtbarer Männer empfindlicher auf hitzebedingte Denaturation reagieren als die von fertilen Männern. TEDAJA et al.

(1984) untersuchten DNA von Männern nach Säuredenaturierung mit anschließender Akridinorange-Färbung. Fertile Männer zeigten einen höheren Prozentsatz grün fluoreszierender Spermien als infertile.

IBRAHIM und PEDERSEN (1988) stellten fest, dass humane Spermien trotz hohem Anteil roter Fluoreszenz im Akridinorange-Test zona-freie Hamster-Oozyten penetrieren können. Sie konnten keine signifikante Korrelation zwischen Motilität und roter Fluoreszenz feststellen, wohl aber zwischen roter Fluoreszenz und abnormer Morphologie. Ohne statistische Absicherung bemerkten sie, dass einige Männer aus dieser Gruppe kinderlos geblieben sind, weil ihre Frauen wiederholt Fehlgeburten erlitten haben. Eine ähnliche Entdeckung machten CARREL et al. (2003). Sie untersuchten den Grad der DNA-Fragmentierung mittels TUNEL-Assay. Hierbei stellten sie fest, dass der Prozentsatz an DNA-Fragmentation bei Paaren mit wiederholten Fehlgeburten signifikant (p<0,001) höher ist als in der Kontrollgruppe.

Auch morphologisch fielen diese Ejakulate durch einen hohen Anteil am Kopf verjüngter Spermien auf.

BOCHENEK et al. (2001) fanden bei der Untersuchung von 8 Bullen à 3 Ejakulaten unter Nutzung der Nonreturn-Rate als Fertilitätsindikator signifikante Korrelationen mit den Ergebnissen des SCSA, u.a. COMP- t, SD, % Rot (= % chromatininstabile Spermien) , MeanRot, heraus. Aus ihren Forschungen zogen DOBRINSKI et al.

(1994) die Schlussfolgerung, dass in Samen von fertilen Bullen nur geringe Prozentsätze an abnormal kondensierter DNA auftreten. Ferner vermuten sie, dass

diese Erscheinung auf eine Störung der Spermiogenese im Nebenhoden zurückzuführen ist.

Untersuchungen über Eberfertilität und Spermienchromatin liegen leider nicht in dem Umfang wie beim Menschen und Bullen vor. In einer Studie von EVENSON et al.

(1994) konnten je 3 Eber mit sehr geringer und mit sehr hoher Fertilitätsleistung über den SCSA eingeordnet werden. DIDION et al. (1999) stellten bei Ebern eine signifikante Korrelation ihrer SCSA-Werte mit der Wurfgröße fest und vermuteten, dass es einen Zusammenhang mit frühembryonalen Fruchttod gibt.

3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN

3.1 VERSUCHSKONZEPTION

Die Arbeit gliedert sich in zwei Teile (s. Abbildung 3). Im ersten Teil der Arbeit wurde die Chromatinstabilität von Eberspermien mit dem in diesem Institut modifizierten fluoreszenzmikroskopischen Spermienchromatinstruktur-Assay (mf-SCSA) bestimmt.

Ziel war es, zunächst den mf-SCSA methodisch an hohe Umgebungstemperaturen anzupassen, um dann die Chromatinstabilität in einer Eberpopulation zu bestimmen und in Bezug zu standardspermatologischen Parametern zu setzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden mit dem Flowzytometer In-vitro- Kapazitationsparameter bei konservierten Eberspermien bestimmt. Als In-vitro- Kapazitationsparameter wurden die Erhöhung des intrazellulären Calciumioneninfluxes und die Auslösbarkeit der Akrosomreaktion mit Calciumionophor A23187 während der Kapazitationsinkubation gewählt. Diese wurden in zwei unterschiedlichen Versuchsabschnitten bestimmt. Zum einen wurden die In-vitro-Kapazitationsparameter an stationsüblich behandelten Ejakulaten erfasst und mit standardspermatologischen Parametern verglichen. Zum anderen wurden die In-vitro-Kapazitationsparameter unterschiedlich lang gelagerter Eberspermien bestimmt, welche während Verdünnung und Lagerung verschiedenen Temperaturen ausgesetzt wurden. Dieser letzte Versuchsabschnitt sollte mögliche verarbeitungsbedingte Membrandestabilisierungen aufzeigen. Er wird der Übersicht halber im Folgenden „Lagerungsversuch” genannt.

Abbildung 3: Übersicht der Versuche 1.Teil:

Bestimmung der Chromatin- stabilität (n=134 Eber)

Methodik mf-SCSA bei hohen Umgebungstempera-

turen

Bezug zur Motilität

2. Teil:

Messung von In-vitro- Kapazitationsparametern

Bezug zu Motiliät und Morphologie

Selektion von 16 Ebern mit erhöhtem Anteil (%) chromatininstabiler

Spermien

Bezug zu Motilität und Morphologie

Differenz-Interferenz- Konstrast-Mikroskopie chromatinstabiler und -instabiler Spermien

Verdünnung und Lagerung unter Standardbedingungen

nach 24 h Lagerung (n=18 Eber einer Besamungsstation) kinetische Messung über

4 Zeitpunkte

Messung nach 3 und 120 Minuten Inkubation

verschiedene Verdünner- und Lagertemperaturen nach 24 h

und 72 h Lagerung (n=5 institutseigene Eber) (=Lagerungsversuch) kinetische Messung über

4 Zeitpunkte

Vergleich der verschiedenen Verdünner-, Lagertem- peraturen und Lagerdauern

hinsichtlich der In-vitro- Kapaziationsparameter

3.2 UNTERSUCHUNGEN DER SPERMIENCHROMATINSTABILITÄT

Der Laborbedarf ist, sofern nicht im Text näher beschrieben, im Anhang aufgeführt.

Verwendete Chemikalien und Reagenzien und aus ihnen herzustellende Rezepte sind ebenfalls im Anhang aufgelistet

3.2.1. Ejakulatproben

Für die Ermittlung der Stabilität des Spermienchromatins wurde in BTS (JOHNSON et al. 1988) verdünnter Samen von Ebern des Bundeshybridzuchtprogramms einer Besamungsstation verwendet. Es wurden 134 Eber untersucht. Die Tiere befanden sich während der Versuchsdurchführung von Juli 2002 bis Juni 2003 in regelmäßigem Besamungseinsatz, d.h. es erfolgte ca. zweimal pro Woche eine Ejakulatgewinnung. Der Probenversand erfolgte übernacht per Expressdienst. Die verdünnten Ejakulate wurden für den SCSA-Versuch in 11,5 ml-Röhrchen (Fa.

Sarstedt, Nümbrecht) geliefert. Bei Ankunft im institusteigenen Labor wurde die Temperatur des Samens gemessen. Samen unter 15 °C Temperatur wurde für die Versuche nicht verwendet.

3.2.2 Konventionelle spermatologische Untersuchungen

Zur subjektiven Motilitätsschätzung wurden 1 ml Aliquots in einem Reagenzglas 5 Minuten in einem 38 °C warmen Wasserbad inkubiert und in einem Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (38 °C) (Fa. Zeiss, Jena) bei 160-facher Vergrößerung untersucht. Es wurde der Prozentsatz motiler Spermien ermittelt.

Zur Untersuchung morphologisch abweichender Spermien wurde ein 750 µl Aliquot der Probe in ein mit 300 µl Formolcitrat (s. Anhang) gefülltes 1,5 ml-Eppendorf- Reaktionsgefäß (Fa. Greiner, Frickenhausen) pipettiert und vermischt. Untersucht wurden je Probe 100 Spermien bei 1000-facher Vergrößerung und Ölimmersion unter dem Phasenkontrastmikroskop nach dem Schema von KRAUSE (1965).

3.2.3 Modifizierter fluoreszenzmikroskopischer Spermienchromatinstruktur- Assay (mf-SCSA)

Chromatininstabile Spermien sind gegenüber Säuredenaturierung der DNA anfällig.

Bindet der metachrome Fluoreszenzfarbstoff Akridinorange an denaturierte, einzelsträngige DNA, fluoresziert er rot. Bei Bindung an chromatinstabile DNA, welche durch Säureeinwirkung nicht denaturiert wurde, wird grünes Licht emittiert.

Das Chromatin-Screening wurde in der Zeit von Juni bis September 2002 durchgeführt. Es wurden verdünnte Ejakulate von 134 Stationsebern (BHZP) untersucht.

Pro Versuchstag wurden 15 dieser Ejakulate und ein Standard, welcher aus Aliquoten eines schockgefrorenen und im Stickstoff gelagerten verdünnten Ejakulat eines hauseigenen Ebers bestand, gefärbt und am Folgetag computergestützt ausgewertet.

3.2.3.1 Vorbereitung der Spermaprobe

Der Versand der verdünnten Ejakulate erfolgte per Übernachttransport in 11,5 ml Röhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) in einer Styroporkiste.

Je 2 ml einer Probe und 2 ml Natriumzitrat-Puffer (s. Anhang) wurden in einem Zentrifugenröhrchen (konisch geformt, Fa. Sarstedt, Nümbrecht) suspendiert und für 10 min bei 2100 x g und 20 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf 0,5 ml mit einer Wasserstrahlpumpe abpipettiert, 2 ml Natriumzitrat-Puffer zugegeben und das Spermienpellet resuspendiert. Es wurde erneut mit o.g. Werten zentrifugiert. Danach wurde der Überstand bis auf 100 µl abgesaugt und das Pellet darin resuspendiert.

Zum Anfertigen der Ausstriche wurden Superfrost Plus (Fa. Roth, Karlsruhe) Objektträger mit einem säurefesten Stift mit Proben-Nummer und Datum beschriftet.

Es wurde ein kleiner Tropfen der zentrifugierten Probe auf den Objektträger getropft und ausgestrichen. Der Ausstrich wurde bei Zimmertemperatur für ca. 10 Minuten luftgetrocknet.

3.2.3.2 Dekondensation des Spermienchromatins und Säuredenaturierung

Die folgenden Arbeitsschritte erfolgten wegen der Toxizität der Reagenzien unter einem Abzug. Zusätzlich wurden Atemschutzmasken und Einmalhandschuhe verwendet. Um die lichtempfindlichen Lösungen und Ausstriche vor direktem Tageslicht zu schützen, wurden die Raumfenster verdunkelt.

a) Dekondensation

Pro Ausstrich wurden 2 ml Natriumzitratpuffer 2,9 % (s. Anhang) benötigt. Zu dem in einem Becherglas abgefüllten benötigten Puffervolumen wurden 10 mmol 1,4- Dithiothreit (DTT, Fa. Roth, Karlsruhe) je Liter gegeben. Als nächstes wurde DMSO (Fa. Roth, Karlsruhe) mit Aqua bidest. im Verhältnis von 1,5 mmol zu 2,75 mmol in einem separaten Reagenzglas gesättigt. Nach Ablauf der exothermen Reaktion und deutlichem Abkühlen des Reagenzglases wurde dessen Inhalt in das Becherglas zur DTT-Lösung gegeben und kurz geschwenkt.

Die Lagerung der Objektträger erfolgte waagerecht auf einem Reagenzglasständer unter dem Abzug. Die Bearbeitung der Ausstriche wurde von der Dekondensation bis zum Abschluss der Färbung mit einem Zeitversatz von 15 Sekunden vorgenommen.

Jeder Ausstrich wurde vorsichtig und gleichmäßig mit 2 ml der hergestellten Dekondensationslösung überschichtet. Die Einwirkzeit betrug 30 Minuten.

Kurz vor Ablauf der Zeit wurde eine Spritzflasche mit Natriumzitratpuffer 2,9 %, eine Küvette (Färbeküvetten nach Hellendahl, Fa. Roth, Karlsruhe) mit demselben Inhalt und ein Giftstoffbehälter zum Auffangen der Spülflüssigkeit bereitgestellt. Die überschichteten Objektträger wurden der Reihe nach über dem Behälter abgegossen, mit der Spritzflasche mit sanften Druck von oben nach unten nachgespült und für zehn Minuten in die puffergefüllte Küvette gestellt. Danach wurden die Objektträger herausgenommen, auf der Rückseite mit Zellstoff abgetrocknet und nahezu senkrecht auf eine saugfähige Unterlage gestellt, wo sie unter dem Abzug bei Zimmertemperatur für ca. 10 Minuten trockneten.

b) Säuredenaturierung

Die getrockneten Ausstriche wurden anschließend für 100 Minuten in einer Küvette mit Carnoy’s Solution (pH-Wert 2, s. Anhang) überführt. Die Küvette wurde mit Aluminiumpapier ummantelt, um zusätzlich direkte Lichteinwirkung zu vermeiden.

Ca. 15 Minuten vor Ablauf der Denaturierungszeit sind eine Küvette für die Färbelösung und eine Küvette für die Spülflüssigkeit zum Abkühlen in einen Gefrierschrank gelegt worden. Nach Ablauf der Denaturierungszeit wurden die Ausstriche entnommen, auf der Rückseite abgetrocknet, nahezu vertikal aufgestellt und unter dem Abzug unter Lichtausschluss bei Raumtemperatur luftgetrocknet.

3.2.3.3 Färbung mit Akridinorange

Für die Färbelösung (Rezepte s. Anhang) wurden 40 ml Zitronensäurelösung (aus 5

°C Kühlschrank), 2,5 ml Di-Natriumhydrogenphosphat-Lösung (aus 5 °C Kühlschrank) und 10 ml Akridinorange-Stammlösung (aus 5 °C Kühlschrank, dunkel gelagert) in die vorgekühlte, mit Aluminiumpapier ummantelte Küvette gegeben und gemischt. Die Objektträger wurden dann für 20 Minuten in die Färbeküvette gesetzt, welche während dieser Zeit im 5 °C Kühlschrank gelagert wurde.

Nach Ablauf der Zeit wurden die Objektträger wieder entnommen, auf der Rückseite abgetrocknet und für 10 Minuten (Lagerung im 5 °C Kühlschrank) in eine mit 5 °C kaltem Natriumzitratpuffer 2,9 % gefüllte, vorgekühlte und aluminiumpapierummantelte Küvette gestellt. Anschließend wurden die Ausstriche entnommen, erneut auf der Rückseite mit Zellstoff abgewischt und auf einer saugfähigen Unterlage für ca. 20 Minuten bei nahezu vertikaler Aufstellung im Dunkeln luftgetrocknet. Die Lagerung der getrockneten Ausstriche erfolgte im Kühlschrank bei ca. 5 °C und unter Lichtausschluss.

3.2.3.4 Modifikation des Protokolls bei Raumtemperaturen über 25 °C

Bei erhöhten Raumtemperaturen im Sommer zeigten die Ausstriche in der Auswertung nicht die gewünschte Rot-Grün-Färbung, sondern wiesen einen deutlichen Rotstich in der üblicherweise grünen, chromatinintakten Population auf.

Eine computergestützte Auswertung war auf diese Weise nicht korrekt möglich.

Daher wurden folgende zusätzliche Maßnahmen eingeleitet:

Sämtliche Lösungen, welche gemäß Protokoll nicht 5 °C Kühlschranktemperatur hatten, wurden im Kühlschrank auf 20 °C runtergekühlt und in 20 °C warmen Wasserbädern gelagert. Gleiches galt für lösungsgefüllte Küvetten. Die Temperatur wurde permanent im jeweiligen Wasserbad gemessen, und bei Erreichen von 22 °C wurde das Wasserbad gegen ein 20 °C warmes getauscht.

Alle Arbeiten unter dem Abzug, in denen sich die Objektträger nicht in einer Küvette befanden (Dekondensation und Trocknung), wurden in einer großen, oben offenen Styroporkiste durchgeführt (s. Abbildung 4). Mittig wurde 1 Reagenzglasständer platziert, auf dem sich ein Thermometer zur laufenden Temperaturkontrolle befand.

Rechts und links daneben wurden Reagenzglasständer aufgestellt, die zur Lagerung der Objektträger dienten. An den Längsenden der Styroporkiste befanden sich zwei eisgekühlte Akkus. Über die Akkus wurden rechts und links Styroporplatten gedeckt.

Die Temperatur im Bereich der Objektträger wurde zwischen 20 – 22 °C gehalten, ggf. wurden die Kühlakkus ausgewechselt.

Abbildung 4: Aufbau der als Klimabox genutzten Styroporkiste

Styroporkiste Reagenzglasständer mit

Objektträgern

Kühlakku Kühlakku

Reagenzglasständer mit Thermometer

seitliche Begrenzung der Kühlakku-Abdeckung

3.2.3.5 Computergestützte Auswertung digitalisierter fluoreszenzmikros- kopischer Bilder

Die Auswertung erfolgte in einem abgedunkelten Raum mittels Fluoreszenzmikroskop (Fa. Zeiss, Jena) unter Verwendung eines blauen Lasers bei 490 nm, einem 20er Phasen-Objektiv, Phase 2 und entsprechender 200-facher Vergrößerung. Die Lichtemission fand im Bereich der Wellenlängen 530 nm (grün = doppelsträngige DNA, chromatinstabil) und 640 nm (rot = einzelsträngige DNA, chromatininstabil) statt. Die mikroskopischen Bilder wurden mit einer aufgesetzten Digitalkamera abfotografiert. Es wurden pro Ausstrich mindestens 500 Zellen ausgewertet, wozu je nach Ausstrichdichte 7 bis 10 Fotos gemacht werden mussten.

Diese Fotos wurden direkt in einen Computer eingespeist. Als Software wurde das Bildbearbeitungsprogramm analySIS^® 3.0 (Soft Imaging System GmbH, Münster) verwendet, welches nach Vorabdefinition die Einteilungen der Spermien in rote bzw.

grüne Zellen vornahm, die Zellzahlen ermittelte und Farbwerte errechnete.

Die Software musste für die Auswertung der gefärbten Eberspermienausstriche wie folgt eingestellt werden:

Die Kalibrierung der Digitalkamera erfolgte auf das 20er Objektiv des Fluoreszenzmikroskops. Unter den Bildqualitätsparametern wurde für die Digitalkamera eine Lichtempfindlichkeit von ISO 200 eingestellt und die Belichtungszeit von 40 ms gewählt. Die Aufnahmen wurden mit der höchsten Auflösung (2776 x 2074 Pixel) gemacht. Im manuellen Weißabgleich, welcher zur Korrektur von Farbstichen im Echtfarbbild dient, betrugen die Korrekturfaktoren 0,9 für rot und grün und 1,54 für blau.

Als nächstes wurde ein Klassifikationsschema definiert. Da in der Untersuchung rote von grünen Zellen unterschieden werden sollten, erfolgte die Einrichtung von 2 Klassen. „Klasse 1” waren chromatininstabile Spermien, die der Farbe Rot, „Klasse 2” waren chromatinstabile Spermien, welche der Farbe Grün zugeordnet wurden.

Bei der Definition der Detektion wurde festgelegt, welche Partikel ausgewertet werden sollen. Durch Einstellung der Detektion auf ein Minimum von 700 Pixeln

wurde ausgeschlossen, dass Partikel, welche kleiner als Eberspermien sind, als Spermien gewertet wurden. Die Art des digitalen Overlays wurde festgelegt, damit die erfassten Spermien je nach Klassenzugehörigkeit als entsprechend gefärbte Partikel dargestellt wurden. Damit bot sich die Möglichkeit, die korrekte Erfassung der Zellen in die entsprechenden Klassen zu überprüfen.

Als letztes mussten Farbschwellwerte gesetzt werden. Dazu wurde durch mindestens eine rote und eine grüne Zelle im digitalisierten Bild ein horizontales oder polygonales Intensitätsprofil gelegt. Im Overlay konnten dann für die roten Zellen die Grenzwerte für die Rot- und Grünanteile abgelesen werden; entsprechend auch für die grünen Zellen. Die auf diese Weise ermittelten Werte wurden unter der Funktion

„Farbschwellwerte setzen“ im RGB-Feld eingegeben und als Farbschwellwertdatei abgespeichert. Mit dieser Farbschwellwertdatei musste ein Ausstrich komplett ausgewertet werden. Nach Möglichkeit sollten pro Färbetag alle Ausstriche mit der gleichen Farbschwellwertdatei bearbeitet werden. Nach kurzem Durchmustern einiger Ausstriche wurde die für den Färbetag am besten geeignete Farbschwellwertdatei aus den bereits genutzten und gespeicherten Dateien ausgewählt und bei Bedarf geringgradig modifiziert.

Nach Festlegung der o.g. Kriterien für die richtige Zuordnung der Spermien in die ensprechenden Klassen wurde das zuerst fotografierte Bild markiert und die Detektion als automatische Stapelverarbeitung aufgerufen. Der Computer wertete so nacheinander alle Bilder eines Ausstrichs aus. Die Ausgabe der Klassenmessergebnisse erfolgte in Tabellenform und konnte direkt in das Tabellenkalkulationsprogramm Microsoft Excel^® eingefügt werden. Es wurden Zahl und prozentualer Anteil roter und grüner Spermien angegeben, sowie die Werte

„Mittelrot“, „Mittelgrün“, „Mittelintensität“, „Mittelsättigung“ der jeweiligen Klasse.

„Mittel” heißt, dass immer der jeweilige Mittelwert der Rot- bzw. Grünwerte aller im Ausstrich untersuchten Spermien wiedergegeben wurde. Rot- bzw. Grünwerte setzen sich aus den Einzelwerten der Mischung der drei Farben Rot, Grün und Blau zusammen, welche Werte von 0 bis 255 annehmen können. Zur Beurteilung der Stabilität des Spermienchromatins wird in dieser Arbeit auch der „Rotwert" der chromatinstabilen (grünen) Population" angewendet. Dieser Wert ergibt sich aus dem Produkt von „Mittelrot" und „Mittelsättigung" dividiert durch „Mittelintensität". Durch

Anwendung dieser Formel wird die Vergleichbarkeit der Ausstriche erhöht. Die Farbeigenschaft eines Farbstoffes wird definiert durch den Farbton und die Farbsättigung. Die Sättigung bestimmt den Weißanteil der Farbe. Die Intensität ist die Helligkeit bzw. Leuchtstärke einer Farbe. Sie wird im Wesentlichen von der Leuchtkraft der Lichtquelle und der Belichtung beeinflusst. Durch Anwendung der o.g. Formel können die Farbwerte von Spermienpopulationen unterschiedlicher Ausstriche, welche unterschiedlich belichtet wurden, besser verglichen werden.

3.2.4 Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DICM) chromatinstabiler und chromatininstabiler Spermien

Mit Hilfe der Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie können Oberflächen- strukturen der Spermien dargestellt werden. Die Auswertung erfolgte im Hellfeld unter dem Fluoreszenzmikroskop. Zuerst wurde ein einzelnes Spermium im Fluoreszenzlicht aufgesucht und als „rot" (=chromatininstabil) oder „grün"

(=chromatinstabil) klassifiziert und dann im Hellfeld mittels DICM auf Kopfform- und Strukturanomalien untersucht.

In diesem Versuchsabschnitt wurden bei Ausstrichen von SCSA-auffälligen Ejakulaten ( 5 % chromatininstabile (rote) Spermien) die Form und die Oberflächenstruktur der Spermienköpfe im Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskop untersucht, unterteilt nach im fluoreszenzmikroskopischen Bild rot und grün gefärbten Spermien. Dafür wurden die Ausstriche bei 1000-facher Vergrößerung (100 er Objektiv) unter Zuhilfenahme eines speziellen Immersionsöls (Immersol^® 518N, Fa. Zeiss, Jena) im Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des Differenz- Interferenz-Kontrast-Filters und der dazugehörigen Phasenkontrastkondensorphase angeschaut. Das Fluoreszenzlicht war dabei aus- und das Hellfeld eingeschaltet. Die Bilder wurden mit der Digitalkamera abfotografiert und mit der analySIS^® 3.0 Software bei 1560-facher Vergrößerung über den Computermonitor subjektiv ausgewertet.

Die Einteilung der Kriterien für die Beurteilung der Spermienköpfe erfolgte nach SAACKE (1990). Formabweichungen von „normal“ (n) waren „pyriform/birnenförmig“,

„tapered/verjüngt“, „short/kurz, „micro/Zwergkopf“, „giant/Riesenkopf“,

„asymetrical/asymmetrisch“ und „flat/abgeflacht“ (s. Abbildung 5).

Kriterien für die Bestimmung der Struktur der Spermienköpfe waren das Vorhandensein von „Diademen“ und „Kratern“ („cratered“) wobei bei „Kratern“

zwischen einfachen und mehrfachen Auftreten pro Spermium unterschieden wurde.

Die Zuordnung erfolgte subjektiv am Computermonitor.

Normal Pyriform Tapered Short Micro Giant

Asymetrical Flat Diadem Cratered

Abbildung 5: Schematische Darstellung zur Beurteilung von Spermienköpfen in der Differenz-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (nach SAACKE 1990)