Tierärztliche Hochschule Hannover
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Janina Rau
Gehrden
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Harald Sieme
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken - Klinik für Pferde
Dr. Ir. Harriëtte Oldenhof
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken - Klinik für Pferde
1. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
2. Gutachterin: Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2016
Gefördert durch ein Stipendium der Joachim und Irene Hahn-Stiftung
Diese Dissertation ist ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin.
Für all meine Lieben
I
NHALTSVERZEICHNISAbkürzungen ...……….
1 Einleitung ……… 11
2 Literaturübersicht ……….. 13
2.1. Vorbereitung von Spermien auf die Fertilisation ………. 13
2.1.1. Fertilisationsassoziierte Reaktionen equiner Spermien ………... 14
2.1.1.1. Kapazitation ………... 14
2.1.1.2. Hyperaktivierung ………... 20
2.1.1.3. Akrosomreaktion ……….... 22
2.2. Kalzium-Ionophor A23187 ………..………... 23
2.3. Procain ………. 24
2.4. Vorbereitung von Oozyten auf die Fertilisation ………..…... 26
2.4.1. Oozytengewinnung ……… 27
2.4.2. Oozytenreifung ………. 28
2.5. Spermien-Zona pellucida Bindung ……….…. 30
2.6. Fertilisation ……….. 32
2.7. In-Vitro-Kultivierung frühembryonaler Stadien …...………... 35
3 Material und Methoden ………. 40
3.1. Experiment I: Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro ……….. 40
3.1.1. Chemikalien und Reagenzien ……….. 40
3.1.2. Samengewinnung und –aufbereitung ……….. 40
3.1.3. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch Inkubation in speziellen Medien ………... 41
3.1.4. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain …...………. 43
3.1.5. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes im Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien ……….………..……...… 44 3.1.6. Computerassistierte Spermienanalyse ………. 46 3.1.7. Durchflusszytometrische Analyse der Plasma- und Akrosommembran ….… 46 3.1.8. Durchflusszytometrische Analyse der Spermienkapazitation ………….…… 47 3.2. Experiment II:
Untersuchung der Bindungsfähigkeit equiner Spermien an die Zona pellucida in vitro
maturierter porziner Oozyten ….……….…… 48 3.2.1. Chemikalien und Reagenzien ……….. 48 3.2.2. Oozytengewinnung und –aufbereitung zur In-Vitro-Maturation …...………. 48 3.2.3. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten ……...………. 50 3.2.4. Heterologer Bindungsassay ………….……… 51 3.2.4.1. Aufbereitung in vitro maturierter porziner Oozyten für die Koinkubation mit equinen Spermien ………..………... 51 3.2.4.2. Aufbereitung equiner Spermien für die Koinkubation mit
in vitro maturierten porzinen Oozyten ………...……….…………...… 52 3.2.4.3. Koinkubation equiner Spermien mit in vitro maturierten
porzinen Oozyten …..………. 55 3.2.4.4. Bestimmung der Bindungsraten equiner Spermien an der Zona pellucida in vitro maturierter porziner Oozyten ………. 55 3.3. Statistische Auswertung ………... 58
4 Ergebnisse ………... 59 4.1. Experiment I:
Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro ………..…… 59 4.1.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Inkubation in modifizertem Whittens-Medium ……….... 59 4.1.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain …...………. 62
4.1.3. Einfluss der Reduktion des Kalzium-Ionophor A23187- oder Procaingehaltes im Medium mittels Zentrifugation auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien …..……….………... 64 4.2. Experiment II:
Heterologer Bindungsassay mit in vitro maturierten porzinen Oozyten
und equinen Spermien ………. 67 4.2.1. In-Vitro-Maturation porziner Oozyten ………...………... 67 4.2.2. Bestimmung einer geeigneten Konzentration equiner Spermien
für die Koinkubation mit porzinen Oozyten ……….. 68 4.2.3. Überprüfung der Inkubationsbedingungen für die equinen Spermien ……….. 71 4.2.4. Einfluss unterschiedlicher Spermienaufbereitungen auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien an in vitro maturierte porzine Oozyten
und auf die Oozytenmorphologie ………..………. 72
5 Diskussion …...……… 77 5.1. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien
durch Inkubation in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Medium ………. 77 5.1.1. Einfluss des Inkubationsmediums auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien ……….………. 78 5.1.2. Einfluss der Inkubationsbedingungen auf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien ………...………..…. 80 5.2. Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei präinkubierten equinen Spermien
durch Zusatz von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain ………...… 81 5.2.1. Einfluss von Kalzium-Ionophor A23187 auf fertilisationsassoziierte
Reaktionen bei equinen Spermien ……….…………..… 82 5.2.2. Einfluss von Procainauf fertilisationsassoziierte Reaktionen
bei equinen Spermien ………...……….…. 83 5.2.3. Induktion der Hyperaktivierung bei equinen Spermien ……… 84 5.3. Heterologer Bindungsversuch mit in vitro maturierten porzinen Oozyten
und equinen Spermien ……… 85
5.3.1. Einfluss des Inkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium-Ionophor
A23187 oder Procain auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien …………...…… 86
5.3.2. Einfluss der Inkubation in Magermilchverdünner auf die Bindungsfähigkeit equiner Spermien ………..… 87
5.3.3. Einfluss des Spermieninkubationsmediums und des Zusatzes von Kalzium- Ionophor A23187 oder Procain auf die Oozytenmorphologie ……….…... 89
5.4. Schlussfolgerungen zur Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an porzine Oozyten ….……..………… 91
5.5. In-Vitro-Fertilisation equiner Oozyten ……….……...……. 93
6 Zusammenfassung ……….. 95
7 Summary ………. 98
8 Abbildungsverzeichnis ………. 100
9 Tabellenverzeichnis ……….. 102
10 Literaturverzeichnis ……….. 103
A
BKÜRZUNGENALH Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung
BCECF-AM Bis-Carboxyethyl-Carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester BSA Bovines Serumalbumin
BWW Biggers-Whitten-Whittingham Medium CaIP Kalzium-Ionophor A23187
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat CASA Computer assistierte Spermienanalyse CO2 Kohlendioxyd
DAPI Diamidin-Phenylindol
DiSC3 3,3'-Dipropylthiadicarbocyanin Iodid DMEM F-12 Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
eCG Equines Choriongonadotropin EGF Epidermal Growth Factor FCS Fetales Kälberserum
FF Follikelflüssigkeit
FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor
FITC-PNA Fluorescein Isothiocyanat konjugiertes Peanut Agglutinin FSH Follikel stimulierendes Hormon
GH Growth Hormon
GnRH Gonadotropin Releasing Hormon hCG Humanes Choriongonadotropin HCO3- Bikarbonat
HEPES Hydroxyethyl-Piperazinyl-Ethansulfonsäure
HSM Humanes Spermienmedium
ICSI Intrazytoplasmatische Spermieninjektion
IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1 IVM In-Vitro-Maturation
IVF In-Vitro-Fertilisation
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
LH Luteinisierendes Hormon
LIN Linearität
mM Millimolar
µM Mikromolar
MOT Gesamtmotilität
MW Modifiziertes Whittens-Medium NBCS Neugeborenen-Kälberserum
NK Nichtkapazitations-Medium
nz Nicht zentrifugiert
OPU Ovum Pick Up
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PI Propidium-Iodid
PMS Progressiv motile Spermien PTP Protein-Tyrosin-Phosphorylierung PVA Polyvinylalkohol
PVI Perivitelline Injektion
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese SOFM Synthetic Oviduct Fluid Medium
sp TALP Spermien-Tyrode's Albumin Laktat Pyruvat STR Geradlinigkeit
(TC)M 199 (Tissue Culture) Medium 199
z Zentrifugiert
ZP Zona pellucida
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1 E
INLEITUNGDie In-Vitro-Fertilisation (IVF) findet im Bereich der assistierten Reproduktion beim Pferd derzeit wissenschaftlich starke Beachtung. Die Erfolgsraten dieses Verfahrens sind allerdings noch überaus gering, wohingegen IVF bei anderen Nutztieren (v.a. Rind) schon routinemäßig angewendet wird. Seit 1992 (PALMER et al. 1991; BÈZARD 1992) konnte mittels IVF (ausgenommen ICSI) kein lebendes Fohlen hervorgebracht werden.
Die Herausforderung der IVF besteht darin, Bedingungen im Labor zu schaffen, die sowohl die weiblichen als auch die männlichen Gameten auf die Fertilisation vorbereiten. Das wesentliche Vorgehen der IVF umfasst die Gewinnung intakter Oozyten und deren In-Vitro- Maturation sowie die Spermiengewinnung und das Auslösen der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen - Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion. Außerdem müssen geeignete Inkubationsbedingungen in vitro geschaffen werden, welche die Gametenreifung, die Fertilisation und die Kultivierung frühembryonaler Stadien ermöglichen.
Der Fertilisationserfolg der bisher zur Verfügung stehenden Protokolle, mit denen equine Spermien und Oozyten auf die IVF vorbreitet werden, ist eingeschränkt, da erzeugte frühembryonale Stadien sich bisher nicht über das 16-Zellstadium hinaus entwickeln konnten.
Die Lösung dieses Problems ist herausfordernd, da die komplexen reproduktionsbiologischen und biochemischen Veränderungen, welche die Gameten während der Vorbereitung auf die Fertilisation durchlaufen, derzeit noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Zudem weisen equine Gameten spezielle Eigenschaften im Vergleich zu den Gameten anderer Nutztierarten auf, sodass bestehende IVF-Protokolle nicht ohne Weiteres übernommen werden können.
Zur Optimierung von IVF-Verfahren mit equinen Gameten werden unterschiedliche Lösungsansätze verfolgt. So gilt es besonders, die fertilisationsassoziierten Spermien- reaktionen näher zu untersuchen, um sie effektiver und zeitgenau auslösen zu können.
Ebenfalls sind weiterführende Erkenntnisse nötig, um die In-Vitro-Maturation der Oozyten unter Vermeidung von Veränderungen der Zona pellucida, welche das Eindringen der Spermien behindern, zu optimieren. Im Weiteren sind zuverlässige Verfahren für die Koinkubation der Gameten und die Kultivierung frühembryonaler Stadien zu etablieren.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter Reaktionen bei equinen Spermien in vitro zu untersuchen.
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Zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen wurde die Effektivität eines Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen Mediums evaluiert und optimale Inkubationsbedingungen bestimmt. Darüber hinaus wurden die Reagenzien Kalzium- Ionophor A23187 und Procain auf ihre Wirkung in Bezug auf die Induktion der Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien untersucht. Dabei sollte gezeigt werden, ob und bei welcher Konzentration diese Reagenzien die Spermienreaktionen nach einer Zeit der Vorinkubation verstärkt induzieren können. Da die verwendeten Reagenzien nicht nur induzierende Effekte auf die Gameten zeigten, wurde außerdem überprüft, ob die Reagenzien in der Spermiensuspension nach der Induktion der Spermienreaktionen durch ein Zentrifugationsverfahren reduziert werden können und welche Auswirkungen dies auf die Gameten hat.
In einem heterologen Bindungsassay wurde die Bindungsfähigkeit der equinen Spermien an porzine Oozyten geprüft. In diesem Zusammenhang wurden die Einflüsse der Inkubationsmedien sowie des Zusatzes von Kalzium-Ionophor A23187 und Procain mit oder ohne nachfolgendem Zentrifugationsverfahren zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen auf die Spermien-Oozyten-Bindungsrate und die Oozytenmorphologie evaluiert.
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2 L
ITERATUR2.1. Vorbereitung von Spermien auf die Fertilisation
Die Fertilisationsergebnisse der In-Vitro-Verfahren für die assistierte Reproduktion beim Pferd liegen deutlich hinter denen der In-Vivo-Besamung zurück. Daher schenken die Arbeitsgruppen, die sich mit der In-Vitro-Fertilisation befassen, der Aufklärung der einzelnen Schritte besondere Beachtung, die sowohl Spermium als auch Eizelle von ihrer Genese bis zur Fertilisation und darüber hinaus durchlaufen. Orientiert an den Vorgängen in vivo sollen möglichst optimale Bedingungen mit dem Endziel der Fertilisation in vitro geschaffen werden.
Nach der Spermatogenese im Hodengewebe, wo der Aufbau von Zellorganellen und die DNA-Transkription abgeschlossen wurden, reifen die Spermien im Nebenhoden aus. Dabei finden v.a. Umordnungen der Plasmamembran statt, indem vom Nebenhodenepithel sezernierte Proteine und Lipide in die Membran aufgenommen werden, Zytoplasma abgegeben wird und die Spermien ihre Bewegungsfähigkeit erlangen (JOHNSON et al.
1980). Das reife Spermium weist eine sehr spezialisierte Zellstruktur auf: der Spermienkopf enthält die DNA, seine Plasma- und Akrosommembran sind essentiell für die Interaktion mit der Oozyte und die Mitochondrien des kaudal anschließenden Mittelstückes liefern die nötige Energie für die Antriebsbewegung der Flagelle als Endstück (VARNER et al. 2015).
Bei der Ejakulation kommen die Samenzellen in Kontakt mit dem Seminalplasma, welches Dekapazitationsfaktoren wie z.B. freies Cholesterol, Vitamin E und Phospholipid-Transfer- Proteine enthält, welche die Spermien an der vorzeitigen Auslösung fertilisationsassoziierter Reaktionen hindern (SUZUKI et al. 2002).
Unmittelbar nach der Ejakulation müssen die noch nicht befruchtungsfähigen Spermien die strukturellen, molekularen und funktionellen Veränderungen der Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion durchlaufen, um eine Eizelle aus eigener Kraft fertilisieren zu können. Diese Prozesse werden durch die Bedingungen im weiblichen Genitaltrakt ausgelöst (CHANG 1951). Nachdem die Spermien in den Uteruskörper der Stute ejakuliert wurden, gelangen sie durch die Eileiterpapille in den Eileiter, wo sich ein Reservoir nicht kapazitierter Spermien bildet. Um den Zeitpunkt der Ovulation kapazitieren die Spermien, lösen sich mit hyperaktivem Bewegungsmuster aus dem Reservoir und
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schwimmen durch den selektierenden Eileiter zur reifen Oozyte, an deren Zona pellucida sie nach Passage der Kumuluszellen binden (SUAREZ 2016). Diese Bindung löst die Akrosomreaktion aus, welche die Penetration der Zona pellucida und somit das Eindringen des Spermiums in den perivitellinen Raum der Oozyte ermöglicht, sodass die Fertilisation der Gameten stattfinden kann.
Auch in vitro sind die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion notwendig für die Fertilisation einer Oozyte durch Spermien. Nach der Ejakulation besitzen Spermien grundsätzlich die Voraussetzungen, um unter geeigneten Bedingungen diese Reaktionen zu durchlaufen (VISCONTI u. KOPF 1998). Demnach müssen entsprechende Bedingungen, die die Induktion der Spermienreaktionen ermöglichen, im Labor simuliert werden. Es ist jedoch zu beachten, dass es bei der Induzierbarkeit fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in vitro große inter- und intraindividuelle Unterschiede gibt (PATRAT et al. 2002).
2.1.1. Fertilisationsassoziierte Reaktionen equiner Spermien 2.1.1.1. Kapazitation
Der Begriff Kapazitation bezeichnet Stoffwechsel- und Plasmamembran-assoziierte Prozesse der Reifung von Spermien im weiblichen Genitale und ist Voraussetzung für die Induzierbarkeit weiterer fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen. Der größte Anteil dieser Vorgänge findet im kaudalen Isthmus des Eileiters statt (TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001). Nur kapazitierte Spermien sind in der Lage, fest und dauerhaft an Eizellen zu binden. In vivo werden diese Prozesse durch verschiedene, sogenannte
„Kapazitationsfaktoren“ (z.B. Änderungen des Ionenmilieus und Vorkommen Cholesterol bindender Lipoproteine) ausgelöst, sobald die Spermien in den weiblichen Genitaltrakt gelangen (GADELLA et al. 2001). Beim Hengst dauert dieser Vorgang mit 6−8 Stunden relativ lang, verglichen mit 1−2 Stunden beim Eber (YANAGIMACHI 1994).
Die biochemischen Prozesse der Kapazitation sind sehr komplex und z.T. nicht im Detail aufgeklärt. In einem Review veranschaulichten FLESCH und GADELLA (2000) die Veränderungen in der Plasmamembran von Säugetierspermien während der Kapazitation und deren Zusammenhang mit weiteren fertilisationsassoziierten Prozessen. Demnach können Membrankomponenten wie Proteine, Phospholipide und Cholesterol nicht mehr von
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ejakulierten Spermien synthetisiert werden, sie können aber aus Genitalsekreten absorbiert, strukturell modifiziert oder abgespalten werden. Starken Einfluss auf den Gehalt und die Anordnung der Komponenten hat dabei in vivo das Mikromilieu des jeweiligen Abschnittes des weiblichen Genitaltraktes, in dem sich die Spermien befinden.
Ein wesentlicher Prozess während der Kapazitation ist die Änderung der Lipid- und Proteinordnung in der Plasmamembran des Spermiums, welche als Lipiddoppelschicht aus v.a. Phospholipiden, Cholesterol und eingelagerten Proteinen aufgebaut ist. Für den Hengst setzt sich die Lipiddoppelschicht zu 57% aus Phospholipiden, 37% Cholesterol und 6%
Glykolipiden zusammen (GADELLA et al. 2001).
Lipide sind transversal heterogen, inter- und intraindividuell unterschiedlich sowie asymmetrisch in den Phospholipidschichten der Plasmamembran angeordnet. Die Phospholipide selbst sind in den Membranschichten relativ ungeordnet, Sterole und Sphingolipide aber lagern sich mit bestimmten Membranproteinen in stabilen Domänen an.
Diese Lipiddomänen werden als 'lipid-rafts' bezeichnet und finden sich in den verschiedenen funktionalen Abschnitten des Spermienkopfes, sie strukturieren die Membran, machen sie funktionell variabel und sind vermutlich v.a. für Zell-Zell-Interaktionen notwendig (GADELLA u. BOERKE 2016). Während der Kapazitation werden die Phospholipide umgeordnet. Dies erfolgt entlang der Doppelmembran durch Transportproteine über einen Bikarbonat vermittelten Weg und wird auch als 'Scrambling' bezeichnet (HARRISON u.
MILLER 2000; RATHI et al. 2001).
Der Cholesterolgehalt der Spermien ist zwischen den Säugetieren sehr variabel und erscheint als ein wesentlicher Faktor im Zusammenhang mit der Kapazitationsdauer der Spermien unterschiedlicher Spezies (YANAGIMACHI 1994). Kennzeichnend für Hengstspermien ist ein relativ hoher Cholesterolgehalt (37%) in der Plasmamembran (GADELLA et al. 2001), wovon den Domänen ein großer Teil während der kapazitationsbedingten Phospholipidumverteilung entzogen wird. Dieser Cholesterolverlust wird in vivo unterdrückt, solange die Spermien vom Prostatasekret mit hohen Cholesterolkonzentrationen umgeben sind, während er im weiblichen Genitale durch Sterol bindende Proteine in den Sekreten gefördert wird (MINELLI et al. 1998). Die Verminderung des Cholseterolgehaltes in der Plasmamembran kapazitierter Spermien führt zu einem neuen Cholesterol-Phospholipid- Verhältnis. Dieses wiederum bedingt eine erhöhte Fluidität der Lipiddoppelschicht, wodurch
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die Bildung neuer Cholesterol reicher 'lipid-rafts' in der Plasmamembran des apikalen Bereichs des Spermienkopfes ermöglicht wird. Die resultierende kapazitationsassoziierte Umorganisation apikaler Membrandomänen geht einher mit einem Verlust von oberflächlichen Membranproteinen und einer Umverteilung von als Dekapazitationsfaktoren fungierenden Seminolipiden vom apikalen in den äquatorialen Kopfbereich.
Durch den Verlust oberflächlicher Membranproteine und des fusionshindernden Seminolipids im apikalen Bereich des Spermienkopfes werden Rezeptorproteine freigelegt, die später an der Zona pellucida-Erkennung und -Bindung der Spermien sowie der folgenden Akrosomreaktion beteiligt sind (GADELLA u. BOERKE 2016). Auch transmembrane Proteine ordnen sich während der Kapazitation über den Spermienkopf hinweg neu, sodass für die Gametenbindung und -fusion spezialisierte Domänen an der lateralen Kopfmembran entstehen (sog. 'lateral reorganization') (CHENG et al. 1998; FLESCH u. GADELLA 2000;
GADELLA u. BOERKE 2016). Ein Teil der v.a. transmembranen Proteine durchläuft zudem während des Kapazitationsprozesses die Tyrosin-Phosphorylierung (PTP), welche als Maß für den Anteil kapazitierter Spermien in der Gesamtpopulation herangezogen werden kann.
Diese Reaktion wird in erster Linie durch transmembranen Transport von extrazellulärem Bikarbonat in das Spermieninnere induziert. Dies aktiviert verbunden mit erhöhtem Kalziumeinstrom in die Zelle die spermale Adenylatzyklase zur Synthese von cAMP, wodurch die Protein-Kinase A aktiviert wird und letztlich die PTP erfolgt. Die PTP resultiert in einer Aktivierung oder Deaktivierung der transmembranen Proteine durch enzymatische Modifikation von Phosphatgruppen (VISCONTI u. KOPF 1998; DEMARCO et al. 2003).
Mit dem nach innen gerichteten Transport von Bikarbonationen ist neben der PTP eine Erhöhung des intrazellulären pH-Wertes der Spermien verbunden. Dies stellten LEEMANS et al. (2014) bei der In-Vitro-Bindung von equinen Spermien an isolierte Eileiterexplantate fest, da sie erhöhte pH-Werte in epithelialen Drüsenzellen und gebundenen Spermien in Verbindung mit höheren PTP-Werten beobachteten. Die Tyrosin-Phosphorylierung der Proteine ist also vom Ionentransport (v.a. Kalzium und Bikarbonat) und somit von den intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen sowie dem pH-Wert abhängig. So konnten im weiblichen Genitaltrakt aufsteigend in den Sekreten höhere Kalziumkonzentrationen und pH- Werte nachgewiesen werden (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012).
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Schon HARRISON et al. (1993) beschrieben, dass kapazitationsassoziierte Umbauprozesse in der Plasmamembran zu einem Status der vorübergehenden Instabilität mit erhöhter Fluidität und somit zu einer gesteigerten Ionenpermeabilität der Plasmamembran einer Subpopulation der Spermien führen. Die Spermien sind in vivo auf ihrem Weg vom Nebenhoden, in das Seminalplasma und durch das weibliche Genitale unterschiedlichen extrazellulären Ionenkonzentrationen ausgesetzt. Dies führt in der Spermienmembran zur Aktivierung verschiedener Ionenkanäle und durch sich ändernde Ionenverhältnisse zu Änderungen im Membranpotential (VISCONTI et al. 2011). Eine erhöhte Permeabilität der Membran für Kalium- und Natriumionen resultiert in einer Hyperpolarisation der Plasmamembran, welche wiederum spannungsabhängige Kalziumkanäle aktiviert und so einen verstärkten Kalziumeinstrom in die Samenzelle bedingt (VISCONTI u. KOPF 1998). Somit kennzeichnet auch ein Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes den Kapazitationsvorgang.
Kalziumreservoirs im Zytosol equiner Spermien wie das Endoplasmatische Retikulum aus denen endogen Kalziumionen freigesetzt werden können, sind bisher nicht nachgewiesen. Der intrazelluläre Kalziumgehalt hängt daher entscheidend vom extrazellulären Ionengehalt ab, dies erfordert den Zusatz von Kalziumverbindungen im Medium zur Induktion der Kapazitation in vitro (FLESCH u. GADELLA 2000).
Die dargestellten ionenabhängigen Reaktionen sind molekular bisher noch nicht vollständig aufgeklärt, machen aber zusammenfassend die Notwendigkeit einer spezifischen Konzentration von v.a. Kalzium und Bikarbonat in den Kapazitationsmedien in vitro deutlich, ebenso ist ein adäquater pH-Wert im Medium einzustellen.
In vitro werden durch Zentrifugations- oder Waschverfahren zunächst die im Seminalplasma enthaltenen Dekapazitationsfaktoren entfernt. Ein geringer Teil der Spermien kapazitiert bereits nach Wegfall der inhibierenden Faktoren (YANAGIMACHI 1994; SUZUKI et al.
2002). Zum Zwecke der IVF ist allerdings eine weitere Stimulation fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen notwendig. Die Änderungen in der Plasmamembranorganisation werden v.a. durch die mehrstündige Inkubation der Spermien in bestimmten Medien provoziert.
Geeignete In-Vitro-Kapazitationsmedien (s. Tab. 2.1.) enthalten die Spermienmembran- veränderungen unterstützende Komponenten. Als (Chole-)Sterol-Akzeptor werden bovines Serumalbumin oder Cyclodextrine zugesetzt (VISCONTI et al. 1999; BROMFIELD et al.
2014). Bikarbonat fördert das 'Phospholipid-Scrambling' und die PTP und trägt zu einem
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erhöhten pH-Wert bei (FLESCH et al. 2001). Außerdem werden dem Medium i.d.R.
extrazelluläre Kalziumdonoren und eine Energiequelle (Glukose, Laktat, Pyruvat) zugesetzt (MC PARTLIN et al. 2008). Basismedien zur Negativkontrolle enthalten gewöhnlich kein BSA und Bikarbonat. Orientiert an den Ergebnissen von MC PARTLIN und Mitarbeitern (2008) gilt das modifizierte Whittens-Medium als Medium der Wahl zur Kapazitation equiner Spermien. Sie konnten nach vierstündiger Inkubation in diesem Medium die Akrosomreaktion und die PTP in hohem Maße auslösen. Mit demselben Medium wiesen ORTGIES et al. (2012) bereits nach 30 min Kapazitationsprozesse der Spermien nach.
BROMFIELD et al. (2014) konnten die Eignung eines Nicht-Kapazitationsmediums (ohne Bikarbonat) als Kurzzeittransport-Medium (ca. 4 Std.) belegen, obwohl auch in diesem Medium physiologische Kapazitationsprozesse in begrenztem Maße abliefen.
Die Inkubationsbedingungen für die Kapazitation unterscheiden sich zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen. In einigen Studien wird die Inkubation in angefeuchteter Luft mit 5% CO2 empfohlen, um eine unkontrollierte pH-Werterhöhung im Medium durch CO2- Abgasung und HCO3--Bildung zu vermeiden (ALM et al. 2001; HINRICHS et al. 2002).
Andere Arbeitsgruppen halten eine Inkubation der Spermiensuspensionen in Luft für geeignet, da eine bikarbonatvermittelte pH-Werterhöhung die PTP auslöst, was als Induktion der Kapazitation interpretiert werden kann (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012;
MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Die Temperatur beträgt zumeist 37−38°C und die Inkubationszeiten sind mit 30 min (ORTGIES et al. 2012) bis sechs Stunden (MC PARTLIN et al. 2008) sehr variabel.
Die Kapazitation equiner Spermien kann zusätzlich zur Inkubation in einem Kapazitationsmedium durch Zugabe von z.B. Phosphodiesterase-Inhibitoren und cAMP- Analoga, welche den Reaktionsweg der PTP beeinflussen, durch Kalzium-Ionophore (z.B.
A23187 und Ionomycin) sowie durch Erhöhung des extrazellulären pH-Wertes unterstützt werden (GONZALEZ-FERNANDEZ et al. 2012; ORTGIES et al. 2012; MORATÓ et al.
2013). Kalzium-Ionophore sind sehr effektive Kalziumdonoren, die als fettlösliche Moleküle ihr Kation durch Zellmembranen transportieren können. Sie fördern sowohl die Kapazitation, gemessen am intrazellulären Kalziumanstieg und folgender PTP, als auch die Akrosomreaktion. Allerdings behindern sie in höheren Konzentrationen massiv die Spermienmotilität. Mit Mausspermien konnte jedoch gezeigt werden, dass deren
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Motilitätsparameter wieder ansteigen und sogar hyperaktive Bewegungsmuster in hohem Maße provoziert werden, sobald das Reagenz abzentrifugiert wird (TATENO et al. 2013).
Ergänzend seien noch Kapazitationsmethoden erwähnt, die sich näher am In-Vivo-Modell orientieren: Gemessen an einem Anstieg in der PTP führt eine Koinkubation von equinen Spermien mit Eileiterepithel (LEEMANS et al. 2014), Follikelflüssigkeit (LEEMANS et al.
2015a) oder foetalem bovinen Serum (GONZÁLEZ-FERNÀNDEZ et al. 2015) zu einem erhöhten Anteil kapazitierter Spermien in der Gesamtpopulation. Nachteilig bei der Verwendung dieser Zusätze ist deren nicht definierte Zusammensetzung.
Aufgrund der vielschichtigen biochemischen Vorgänge während der Kapazitation besteht bisher kein Konsens für ein geeignetes Kapazitationsprotokoll equiner Spermien.
Der Erfolg der Kapazitationsinduktion kann im Labor auf vielfältige Weise quantifiziert werden: Die Analyse der Cholesterolumverteilung und des -effluxes kann mittels Filipin- Assay erfolgen, da dieses Fluoreszenzmolekül unveresterte Sterole bindet und deren Anordnung und Anteil in verschiedenen Lokalisationen der Plasmamembran visualisieren kann (FLESCH et al. 2001). Die Phospholipidumordnung bzw. das „Scrambling“ kann durch Anfärben mit dem Fluoreszenzfarbstoff Merocyanin 540, einem Marker für geänderte Lipid- Packungsdichte, durchflusszytometrisch evaluiert werden (RATHI et al. 2001). Die Ausprägung der PTP kann Antikörper vermittelt durch SDS-PAGE, Immunoblotting, Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie bestimmt werden (MC PARTLIN et al.
2008). Der kationische DiSC3- Fluoreszenzfarbstoff zeigt Änderungen des Membranpotentials an (LINARES-HERNÀNDEZ et al. 1998; PATRAT et al. 2002). Die kapazitationsbedingte Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes kann (an fixierten Präparaten) mikroskopisch mittels Chlortetracyclinfärbung erfasst werden, welche die Verteilung von Kalzium auf der Membranoberfläche der Spermien anzeigt (RATHI et al.
2001). Nach Färbung mit z.B. Fluo-3 kann der Kalziumeinstrom anhand eines Anstiegs der Fluoreszenzintensität durchflusszytometrisch bestimmt werden (HARRISON et al. 1993).
Der intrazelluläre pH-Wertanstieg kann durch z.B. BCECF-AM-Färbung festgestellt werden, da dieser pH-sensitive Fluoreszenzfarbstoff je nach pH-Wert unterschiedliche Spektren emittiert (LEEMANS et al. 2014). Eine Aussage über den pH-Wert der Gesamtspermienpopulation lässt auch der extrazelluläre Medien-pH zu.
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Für die Analyse von Kapazitationsparametern ist weniger das Erreichen von Schwellenwerten als vielmehr ein Anstieg ausgewählter Parameter ausschlaggebend, da immer nur eine Subpopulation der Spermien den Veränderungen durch Kapazitationsreaktionen unterliegt und nicht alle Spermien der Gesamtpopulation gleichzeitig. Letztlich bietet auch die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion (Kap. 2.1.1.3.) ein gutes Maß für die erfolgte Kapazitation der Spermien (ALM et al. 2001).
2.1.1.2. Hyperaktivierung
Der Begriff Hyperaktivierung beschreibt ein von der gleichmäßigen progressiven Bewegung von Säugerspermien abweichendes Bewegungsmuster mit erhöhter Schlagfrequenz, -amplitude und -asymmetrie der Flagelle.
In vivo dient die Hyperaktivierung dem Ablösen des Spermiums vom Epithel des Eileiterreservoirs, dem Durchschwimmen des Eileitermukus sowie der Penetration von Kumuluszellen und der Zona pellucida der Oozyte (HO u. SUAREZ 2001). Außerdem erleichtert die stärkere seitliche Kopfauslenkung (amplitude of lateral head displacement = ALH) dem Spermium das Auffinden der Oozyte im Eileiter. Wie SUAREZ und HO (2003) darlegten, wird angenommen, dass diese Bewegungsmuster um den Zeitpunkt der Ovulation durch vom Ovidukt, der Oozyte und der Follikelflüssigkeit ausgehende Signale initiiert werden. In den weiblichen Genitalsekreten sind besonders zyklusbedingte Veränderungen des extrazellulären Kalziumgehaltes und des pH-Wertes an der Initiation der Hyperaktivierung beteiligt. Auch noch undefinierte, chemotaktische Aktivierungsreize durch den Ovulationsprozess werden in Betracht gezogen. Ebenso wird die Rolle von freien Sauerstoffradikalen im weiblichen Genitale diskutiert, welche eine Lipidperoxidation der Spermienmembran durch reaktive Sauerstoffspezies bedingen und so die Hyperaktivierung fördern (GADELLA et al. 2001).
Die biochemische Regulation der Hyperaktivierung ist noch nicht vollends aufgeklärt.
HINRICHS und LOUX (2012) fassten Erkenntnisse zur Hyperaktivierung von Hengstspermien in vitro zusammen: durch eine extrazellulär bedingte intrazelluläre pH- Erhöhung gelangt Kalzium aus dem Medium über den Spermien spezifischen, pH-aktivierten CatSper-Kalziumkanal in die Samenzelle. Dadurch wird über die Aktivierung von Calmodulin-Kinase die flagellare Dyneinfunktion geändert. Die Dyneinärmchen lassen die
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Mikrotubuli der Flagelle aneinander entlang gleiten, sodass die spezifische Schlagbewegung entsteht (MC PARTLIN et al. 2009).
MC PARTLIN et al. (2009) und ORTGIES et al. (2012) beschrieben, dass in vitro eine Subpopulation von ca. 25−30% der in Kapazitationsmedium inkubierten Spermien spontan hyperaktivierte Bewegung zeigt, die als biphasische Suchbewegung der Spermien mit abwechselnd kreisender und progressiver Bewegung erscheint. Gezielt induziert werden kann die Hyperaktivierung sowohl kapazitierter als auch nicht kapazitierter equiner Spermien (55−75%) mittels Applikation des Lokalanästhetikums Procain. So aktivierte Spermien zeigen bei mikroskopischer Betrachtung unter dem Deckglas allerdings kein biphasisches, sondern ein konstant kreis- bzw. sternförmiges Bewegungsmuster, wobei die kapazitationsassoziierte Protein-Tyrosin-Phosphorylierung, die Plasmamembranordnung und die Akrosomreaktion unbeeinträchtigt bleiben. Procain aktiviert CatSper-Kanäle, wirkt aber unabhängig von einem Kalziumeinstrom und erhöht den intrazellulären pH-Wert. Ein hoher Medium-pH oder 4- Aminopyridin können zur Induktion der Hyperaktivierung eingesetzt werden (LOUX et al.
2013). Auch durch Applikation von Ionomycin und die Vorselektion von Hengstspermien kann die Hyperaktivierung ausgelöst werden (MORATÒ et al. 2013). Nach Inkubation in vorbehandelter Follikelflüssigkeit konnten LEEMANS et al. (2015a) pH- und Kalzium- (extrazellulär) abhängige Mechanismen nachweisen, die mit der Hyperaktivierung von Hengstspermien verbunden waren.
Nach bisherigen Erkenntnissen stehen hyperaktive Bewegungsmuster nicht in direktem Zusammenhang mit den Kapazitationsprozessen der Spermien, sodass die Induzierbarkeit der Hyperaktivierung keine Auskunft über eine vorangegangene Kapazitation erlaubt (RATHI et al. 2001).
Die computerassistierte Spermienananalyse liefert fünf Parameter, über die Hyperaktivierung bestimmt werden kann: Anstieg der Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (curvilinear velocity = VCL) und der ALH sowie Verminderung der Geschwindigkeit auf gerader Strecke (straight line velocity = VSL), der Linearität (= LIN) und der Bewegung auf der geraden Linie (straightness = STR). RATHI et al. (2001) stellten für Hengstspermien Mindestwerte von VCL ≥180 µm s−1 und ALH ≥12 µm für hyperaktive Bewegung auf, ein deutlicher Anstieg dieser Parameter zum Basalwert ist aber ebenso aussagekräftig für die Induktion dieser fertilisationsassoziierten Spermienreaktion.
22 2.1.1.3. Akrosomreaktion
Das Akrosom liegt dem Spermienkopf als große, vesikuläre Struktur apikal auf und enthält hydrolytische Enzyme, welche essentiell für die Penetration der Zona pellucida (ZP) der zu befruchtenden Eizelle sind.
Die Akrosomreaktion wird physiologisch durch die Bindung des Kopfes eines kapazitierten und akrosomintakten Spermiums an die Eizelle ausgelöst (YANAGIMACHI 1994). Die Rezeptor-Protein-Bindung zwischen den Membranen der Gameten fördert den Kalziumeinstrom in den Spermienkopf über spannungsabhängige Kanäle, was zur multifokalen Fusion der Plasmamembran mit der äußeren Akrosommembran führt. Aus beiden Membranen entstehen Vesikel, welche die hydrolytischen Enzyme des Akrosoms (v.a.
Akrosin und Hyaluronidase) enthalten. Diese Vesikel werden exozytotisch Richtung ZP abgegeben und ermöglichen eine fokale Lyse dieser. Somit ist der Weg zur Plasmamembran der Oozyte für das Spermium frei. Am Kopf akrosomreagierter Spermien ist die innere Akrosommembran mit Proteinbindungsstellen für Integrine der Eizelle freigelegt. Die Bindung dieser Membran an die Oozyte erfolgt zunächst mit der Kopfspitze des Spermiums.
Darauf bindet es sekundär fest mit dem äquatorialen Bereich, was in Verbindung mit hyperaktivem Flagellenschlag das Eindringen des Spermienkopfes in den perivitellinen Raum ermöglicht (GADELLA et al. 2001). Aufgrund ihres destabilisierten Membranstatus (Kap.
2.1.1.1.) sind kapazitierte Spermien besonders anfällig für Faktoren, die die Akrosomreaktion auslösen (GADELLA u. HARRISON 2000). Daher weist ein geringer Anteil in vitro kapazitierter Spermien eine spontane oder durch geringe Umweltreize (z.B. Temperatur- schwankungen) ausgelöste Akrosomreaktion auf. Somit ist die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion ein guter Index für die erfolgte Kapazitation und kann sogar als Endpunkt der Kapazitation interpretiert werden (MC PARTLIN et al. 2008).
In vitro kann die Akrosomreaktion in Bikarbonat-haltigem Medium kapazitierter Hengstspermien durch Zugabe von CaIP (Kalzium-Iononophor A23187) induziert werden, indem die transmembrane Kalziumpassage erleichtert wird (RATHI et al. 2001; RUNCAN et al. 2013). Andere Kapazitationsbehandlungen wie z.B. die Inkubation der equinen Spermien mit Cholesterol bindenden Cyclodextrinen erhöhen ebenfalls die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion (BROMFIELD et al. 2014). Progesteron, welches in hohem Maße in der Flüssigkeit präovulatorischer Follikel vorkommt, löst nach Hyperpolarisation der
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Plasmamembran und Öffnung spannungsabhängiger Kalziumkanäle die akrosomale Exozytose ebenfalls aus (PATRAT et al. 2002; MC PARTLIN et al. 2008).
Im Hinblick auf die IVF ist zu beachten, dass ein gezieltes Auslösen der Akrosomreaktion terminiert erfolgen muss, da Spermien, die bereits vor Erreichen der Oozyte reagierten, ihre Penetrationsfähigkeit verlieren (GADELLA et al. 2001).
Die Akrosomreaktion kann fluoreszenmikroskopisch unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten, Glykoproteine bindenden Lektinen oder von Chlortetracyclinen erfasst werden, welche an die akrosomalen Membranen binden oder diese penetrieren (RATHI et al.
2001; AITKEN 2006). Fluorisothiozyanat-konjugiertes Peanut Agglutinin (FITC-PNA) oder auch PNA-Alexa sind gebräuchliche Lektine, welche an ß-Galaktose-Reste der äußeren Akrosommembran von Hengstspermien binden, deren Integrität anzeigen und somit intakte, reagierende oder reagierte Akrosome detektieren (RATHI et al. 2001; MC PARTLIN et al.
2008).
2.2. Kalzium-Ionophor A23187
Wie bereits in Kapitel 2.1.1.1. erwähnt, finden Kalzium-Ionophore biotechnologisch Anwendung bei der Induktion von Kapazitationsvorgängen und der Akrosomreaktion.
Ebenfalls werden sie für die Oozytenaktivierung (Kap. 2.7.) genutzt. Dabei macht man sich die Löslichkeit der hydrophoben Ionophore in der Lipiddoppelschicht zum Nutzen. Sie erhöhen die Membrandurchlässigkeit für anorganische Ionen entlang des elektrochemischen Gradienten, indem sie die Ladung des transportierten Ions maskieren. Ionophore können als Kanalbildner oder mobile Ionen-Carrier wirken (ALBERTS et al. 1995). In der Reproduktionsbiologie wird zumeist das CaIP A23187 genutzt, welches als mobiler Carrier bivalente Kationen (z.B. Ca2+, Mg2+) transportiert und somit deren intrazellulären Gehalt erhöhen kann. Intrazelluläres Kalzium bindet u.a. an Calmodulin, welches dann Enzyme und Membranproteine aktiviert oder auch über Ca2+-Calmodulin-abhängige Kinasen die Phosphorylierung von Proteinen auslöst (ALBERTS et al. 1995).
24 2.3. Procain
Procain ist ein Lokalanästhetikum des Esther-Typs, welches in der Lage ist, sich aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften in die Plasmamembran von Zellen einzulagern und so v.a. spannungsabhängige Natrium- und in höheren Konzentrationen Kaliumkanäle zu blockieren. Dies führt zur Störung der elektrochemischen Vorgänge an der Zellmembran oder in der Zelle selbst. Durch das Blockieren von Natriumkanälen kann z.B. die Depolarisation von (Nerven-) Zellmembranen behindert werden. MC PARTLIN et al. (2009) zeigten, dass Procain in vitro die Hyperaktivierung equiner Spermien (Kap. 2.1.1.2.) hervorruft und vermuteten, dass dies in der durch Procain erhöhten Permeabilität der Plasmamembran für Kalziumionen begründet ist. Außerdem erhöht Procain als schwache Base den intrazellulären pH-Wert und aktiviert so möglicherweise den pH-abhängigen Kalziumeinstrom durch Cat- Sper Kanäle (LOUX et al. 2013). Im Detail sind die hyperaktivierenden Eigenschaften von Procain auf Spermien jedoch noch nicht aufgeklärt.
Tabelle 2.1.: Zusammensetzung von Inkubationsmedien zur Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen in vitro.
Arbeitsgruppe Patrat et al.
2002
Lopez- Gonzalez et al. 2014
Tateno et al.
2013
Rathi et al.
2001
Mc Partlin et al. 2007
Mc Partlin et al. 2008
Gonzales- Fernandez 2012
Bromfield et al.
2014
Rau et al. 2016
Spezies Mensch Mensch Maus Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd
Medium BWW HSM Tyrode Tyrode sp TALP MW MW BWW MW
Komponenten (mM)
NaCl 95 120 119.4 96 100 100 100 91.5 100
KCl 4.8 4 4.8 3.1 3.1 4.7 4.7 4.6 4.7
CaCl 1.7 1.7 2 2 1.7 2.4
KH2PO4 1.2 1.2 0.3 0.3 1.2
NaH2PO4
MgSO4 1.2 1.2 0.4 1.2
MgCl2 1 0.4 1.2 1.2 1.2
Glucose 5.6 5 5.6 5 5 5.5 5.6 5
Na-Pyruvat 0.25 1 1 1 1 1 1 0.27 1
HEPES 20 10 20 10 22 22 20 22
NaHCO3 25 15 25 15 25 25 25 25 24.9
Laktat 20 10 21.7 21.6 4.8 2.4 44 2.4
BSA (mg mL-1) 5 4 7 7 7 7 3 7
Antibiotika 50µg mL-1
Streptomycin 75µg mL-1 Penicillin G
50µg mL-1 Kanamycin
5 I.E L-1 Penicillin 5mg mL-1 Streptomycin
Besonderheit 1mg mL-1 PVA
Grau unterlegt: derzeit bevorzugt verwendetes Medium ('MW') zur Kapazitationsbehandlung equiner Spermien.
Letzte Spalte: Zusammensetzung des in der vorliegenden Studie verwendeten modifizierten Whittens-Mediums, die Abweichungen von 'MW' sind durch Umrandung hervorgehoben. Die genauen Bezeichnungen der Medien sind dem Abkürzungsverzeichnis zu entnehmen.
26 2.4. Vorbereitung von Oozyten auf die Fertilisation
Die Oozyten von Säugetieren wachsen in den Follikeln der Ovarien heran, welche sich von Primär- über Sekundär- und Tertiärfollikeln zu präovulatorischen Graafschen Follikeln entwickeln. Bei den physiologisch uniparen Equiden geht aus den FSH stimulierten Follikelwellen i.d.R. nur ein präovulatorischer Follikel je Zyklus hervor. Im präovulatorischen Follikel ist die Oozyte bereits vollständig ausgebildet mit einem von Ooplasma umgebenen diploiden Zellkern und einer von Follikelepithelzellen (Corona radiata) und Kumuluszellen umgebenen Zona pellucida. Die Oozyten befinden sich im Ruhestadium der ersten Meiose (Dictyotänstadium), bis dieses durch die präovulatorische Reifungsinduktion unterbrochen wird. Einige Stunden vor der Ovulation ist die erste meiotische Reifeteilung der Eizelle beendet, wobei ein Polkörper mit einem einfachen Chromosomensatz in den perivitellinen Raum abgeschnürt wurde. Unter Einfluss von FSH und LH erfolgt schließlich die Ovulation.
Die Eizelle verlässt den Follikel mit den umgebenen Kumuluszellen als Kumulus-Oozyten- Komplex und wird vom Fimbrientrichter des Eileiters aufgenommen. Gleichzeitig beginnt, getriggert vom periovulatorischen LH-Peak, die zweite Reifeteilung der Meiose, welche in der Metaphase II arretiert, bis die Oozyte von einem Spermium fertilisiert wird. Eine befruchtungsfähige Oozyte zeichnet sich demnach durch den Kernstatus der Metaphase II und einen Polkörper aus. Sobald ein Spermium in die Eizelle eindringt, wird die zweite Reifeteilung fortgesetzt und ein weiterer Polkörper abgeschnürt. Im Zellkern liegt dann ein haploider Chromosomensatz vor, welcher mit dem des Spermiums verschmelzen kann. Die Fertilisation findet beim Pferd am Übergang von Eileiterampulle und -isthmus statt (BEZARD et al. 1989). Nicht befruchtete, equine Eizellen verbleiben im Eileiter und werden dort resorbiert. Für fertilisierte Zygoten aber erfolgt eine Zellteilungsphase von etwa fünf bis sechs Tagen im Eileiter, woraufhin sie als Morula in den Uterus gelangen und dort ihre frühembryonale Entwicklung fortsetzen (FLOOD et al. 1979).
In Vorbereitung auf die In-Vitro-Fertilisation müssen die Oozyten zunächst aus den Ovarien von Spendertieren gewonnen, selektiert und aufbereitet werden. Daraufhin erfolgt die In- Vitro-Maturation, sodass schließlich eine reife Oozyte zur Fertilisation mit aufbereiteten Spermien zur Verfügung steht.
27 2.4.1. Oozytengewinnung
Oozyten müssen für In-Vitro-Verfahren zunächst als Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) aus den Follikeln isoliert werden.
Für Nutztierarten wie Rind und Schwein ist für gewöhnlich Schlachthofmaterial zugänglich.
Von aus dem Tier isolierten Ovarien können die Oozyten aus Follikeln durch Aspiration über eine Kanüle, die mit einem Unterdrucksystem verbunden ist, oder durch Eröffnen des Follikels mittels Skalpell und anschließendes Ausspülen oder Auskürettieren gewonnen werden. Eine weitere Methode ist die des sog. `Slicing`, bei der die Ovaroberfläche mehrfach mit Klingen eingeritzt wird und die KOKs aus den so eröffneten Follikeln ausgewaschen werden. Bei der Gewinnung equiner KOKs ist zu beachten, dass diese mit breiter Basis über ihre Kumuluszellen an der Follikelinnenseite befestigt sind und daher durch intensives Spülen oder Kürettieren abgelöst werden müssen (ALM et al. 1997).
Bei wertvollen Individuen und geringer Verfügbarkeit von Schlachthofmaterial, wie es häufig beim Pferd der Fall ist, kann der Follikelinhalt auf verschiedene Weise am lebenden Tier gewonnen werden. Mit der Technik des Ovum Pick Up (OPU) können die Follikel auf den Ovarien in situ punktiert werden. Dies kann entweder chirurgisch von der Flanke des Tieres aus (PALMER et al. 1987) oder transvaginal ultraschallgeleitet (KANITZ et al. 1995) durch Aspiration des Inhalts über eine lange Nadel vorgenommen werden. Aufgrund der geringeren Invasivität ist die transvaginale Methode zu bevorzugen. Ein Vorteil des OPU ist außerdem, dass nach regelmäßiger Follikelkontrolle des Spendertieres selektiv immature oder präovulatorische Follikel gewonnen werden können.
Das erhaltene Follikelmaterial wird i.d.R. in isotonen Lösungen (z.B. PBS) sedimentiert und die KOKs daraus isoliert. Zur weiteren Verarbeitung werden KOKs mit gleichmäßigen Kern- und Zytoplasmastrukturen sowie intakten Kumuluszellschichten selektiert. Ebenso können die gewonnenen KOKs nach kompakten und expandierten Kumulustypen selektiert werden. Bis zum Einbringen in das Reifungsmedium verbleiben die KOKs in der zur Gewinnung verwendeten Spülflüssigkeit (z.B. PBS) oder in dem für die Reifung vorgesehenen Medium (DELL` AQUILA et al. 1995).
28 2.4.2. Oozytenreifung
Die Oozytenreifung beginnt mit dem Überwinden des Dictyotänstadiums der ersten meiotischen Teilung und endet in vivo nach der Ovulation mit dem Erreichen des Kernstatus der Metaphase II. Allerdings ist nicht nur die Kern- sondern auch die Zytoplasmareifung Teil dieses Prozesses.
Im Dictyotänstadium liegen die Chromosomen noch ungeordnet mit einem Nukleolus im Kernplasma vor. Nach LH-aktiviertem Start des Kernreifungsprozesses wird der Nukleolus aufgelöst, die Chromosomen kondensieren, die Kernmembran wird abgebaut und ein Spindelapparat entsteht (GRONDAHL et al. 1995). Nach der Chromatinkondensation werden die Kernstadien der Metaphase I, Anaphase und Telophase, in der sich auch der erste Polkörper abschnürt, durchlaufen, worauf die Metaphase II erfolgt.
Gleichzeitig wird im Zuge der Zytoplasmareifung der perivitelline Spaltraum erweitert, die Mitochondrien und Lipidvesikel ordnen sich zentral an, der Golgiapparat wird reduziert und kortikale Granula werden entlang des Oolemms angeordnet (GRONDAHL et al. 1995).
Des Weiteren zeigen die umgebenden Kumuluszellen eine zunehmende Expansion während der Reifungsphase. Sie sind aufgrund ihrer nutritiven und protektiven Funktion essentiell für eine erfolgreiche Maturation (BRACKETT u. ZUELKE 1993).
Die Reifung der aus Ovarien isolierten unreifen Oozyten bzw. KOKs unter Laborbedingungen wird als In-Vitro-Maturation (IVM) bezeichnet. Die Reifungszeit der gewonnenen KOKs ist tierartspezifisch unterschiedlich, ebenso wie die Anforderungen der KOKs an die Zusammensetzung der Inkubationsmedien.
Für die IVM von Nutztieroozyten werden häufig industriell hergestellte Medien wie das (TC)M 199, das Ham’s bzw. DMEM F-12 oder auch das SOFM mit Protein-, Hormon- und Antibiotikazusätzen verwendet (Tab. 2.2.). Auch die Maturation equiner Oozyten in Flüssigkeit aus präovulatorischen Follikeln war erfolgreich (HINRICHS et al. 2002; DOUET et al. 2014a). Als Proteinzusätze in den Medien werden i.d.R. bovine Seren wie das fetale Kälberserum (FCS) genutzt, für equine Oozyten finden auch homologe Seren Verwendung (ALM et al. 2001). Diese Seren enthalten u.a. Hormone. Weitere Hormonzusätze sind zumeist GnRH und Gonadotropin-Analoga, Östradiol 17ß, Wachstumshormon (GH) und Wachstumsfaktoren wie EGF oder IGF-1 (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002). Auch der
29
Zusatz von Granulosa,- Theka- oder Eileiterepithelzellen zum Medium kann die Eizellreifung und Kumulusexpansion unterstützen (ALM et al. 1994).
Die Kultivierung zur IVM wird stets in Oozytengruppen vorgenommen. In feuchter Luft mit 5% CO2 werden equine Oozyten bei 37.5–39°C für 24–36 Std. und bovine Eizellen für 20–24 Std. bei 39°C inkubiert. Für porzine Oozyten sind Angaben von 37–39°C für 36–48 Std. zu finden (Tab. 2.2.). Für selektiv präovulatorisch gewonnene equine KOKs ist eine verkürzte Inkubationsdauer von 12–18 Std. als ausreichend beschrieben (HINRICHS et al. 2000).
PALMER et al. (1991) gelang es, mit präovulatorischen KOKs nach 6–12 Std. IVM ein lebendes Fohlen nach IVF hervorzubringen (Kap. 2.6.). Eseloozyten reifen im direkten Vergleich zu Pferdeoozyten mit 34 Std. etwas langsamer, stellen aber die gleichen Anforderungen an die IVM-Bedingungen (GOUDET et al. 2016). Allgemein benötigen Oozyten mit kompaktem Kumulus eine längere Maturationszeit als Eizellen mit expandiertem Kumulus, was sich für die Fertilisationsraten aber als unbedeutend erwies (HINRICHS et al.
1997). ALM et al. (2001) empfehlen für bereits expandierte equine KOKs eine Maturationszeit von 18–24 Std. und für kompakte KOKs von 26–40 Std.. GONZÁLEZ- FERNÁNDEZ et al. (2015) konnten für expandierte equine KOKs eine bessere Maturationsrate verzeichnen, wenn diese in TCM 199 statt in MW maturiert wurden, während sich für kompakte KOKs kein wesentlicher Unterschied ergab.
GOUDET et al. (1997) beschrieben die In-Vivo-Reifung von aus Spenderstuten gewonnenen, immaturen Oozyten nach Injektion in einen präovulatorischen Follikel einer Empfängerstute.
Die reifen Oozyten wurden anschließend kurz vor der Ovulation durch OPU aspiriert.
Die Beurteilung der Oozytenreifung erfolgt anhand der Kern- und Zytoplasmareifung sowie der Kumuluszellexpansion. Der Kernstatus denudierter Oozyten (Kap. 2.5.) wird an fixierten Präparaten phasenkontrastmikroskopisch nach Färbung mit Orzein oder Lacmoid beurteilt (CHOI et al. 1993; DELL´ AQUILA et al. 1996). Auch fluoreszenzmikroskopisch ist dies nach Anfärbung mit HOECHST, einem DNA-spezifischen Farbstoff, möglich (HINRICHS et al. 1993). Die Reifungsprozesse im Zytoplasma können elektronenmikroskopisch beurteilt werden (NEUMANN et al. 1996). Das Ausmaß der Kumulusexpansion wird stereomikroskopisch erfasst.
Die Reifungsraten sind je nach Tierart, Gewinnungsmethode und Inkubationsbedingungen sehr unterschiedlich. Für equine Oozyten werden allgemein IVM-Raten von 60–80%
30
verzeichnet (MUGNIER et al. 2009a; AMBRUOSI et al. 2013; GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ et al. 2015).
2.5. Spermien-Zona pellucida Bindung
Wie bereits in Kapitel 2.1.1.1. erwähnt wurde, sind nur kapazitierte Spermien in der Lage, fest und dauerhaft an die Zona pellucida (ZP) von Eizellen zu binden.
Nachdem das akrosomintakte Spermium die ZP der Oozyte mit seiner Kopfspitze kontaktiert hat, erfolgt eine Rezeptor-Protein-Bindung, welche die Akrosomreaktion und so die fokale Lyse der ZP auslöst (YANAGIMACHI 1994) (Kap. 2.1.1.3.). Eine Bindung zwischen Proteinen der freigelegten inneren Akrosommembran und Integrinen der ZP folgt zunächst mit der Kopfspitze des Spermiums, darauf bindet das Spermium mittels einer sog.
ʹHaarnadelstrukturʹ fest mit dem äquatorialen Bereich. Dies ermöglicht in Verbindung mit hyperaktivem Flagellenschlag das Eindringen des Spermienkopfes in den perivitellinen Raum der Oozyte, seine Bindung an das Oolemm und schließlich die Fertilisation (FLESCH u.
GADELLA 2000).
Die Bestimmung der Rate von an der ZP von Oozyten gebundenen Spermien gibt Auskunft über die Bindungsfähigkeit der Spermien. Da die Spermien-Zona pellucida Bindung essentiell für die Fertilisation ist, geht man davon aus, dass die Bindungsfähigkeit von Spermien etwas über ihre Fertilisationspotenz aussagt. FAZELI et al. (1995) beschrieben diesbezüglich eine Korrelation von Bindungsraten equiner Spermien mit den Fertilitätsindices von Hengsten.
Außerdem lassen die Bindungsraten Rückschlüsse auf den Erfolg der Induktion der Kapazitation und z.T. auch der Akrosomreaktion zu (CLULOW et al. 2010).
Die Koinkubation von Spermien mit Oozyten (meist in vitro maturiert) zur Bestimmung von Bindungsraten wird auch als ʹBindungsassayʹ bezeichnet. Bindungsassays können mit Gameten heterologer oder homologer Herkunft durchgeführt werden. Aufgrund der besseren Verfügbarkeit von Schlachthofmaterial und etablierten Maturationsverfahren werden häufig porzine oder bovine Oozyten für heterologe Bindungsassays mit equinen Spermien genutzt.
Das Spermium erkennt die Oozyte an ihrer Oberflächenstruktur (Protein-Rezeptor Interaktion). Die ZP weist jedoch speziesspezifische Unterschiede in der oberflächlichen Glykoproteinzusammensetzung und in der elektronenmikroskopischen Struktur (z.B. Dicke,
31
Porendichte) auf, sodass die speziesspezifische Zusammensetzung und -struktur der ZP ein bestimmender Faktor für die Spermienbindung ist (MUGNIER et al. 2009b; ACCOGLI et al.
2014). MUGNIER et al. (2009b) fanden für equine Spermien schlechtere Bindungsraten an porzine als an equine Oozyten, während porzine Spermien keinen Bindungsunterschied zwischen den Oozyten zeigten. BALAO DA SILVA et al. (2013) führten einen Bindungsassay mit equinen Spermien (sex sorted) und in vitro maturierten porzinen Oozyten durch. Sie stellten fest, dass die Bindungsrate unabhängig von der Koinkubationszeit (1.5 vs.
3 Std.) der Gameten ist, aber sehr stark zwischen den Hengsten variierte.
MACÍAS-GARCÍA et al. (2015) beschrieben höhere Bindungsraten für equine Spermien an bovinen Oozyten, die in mit BSA oder Methyl-ß-Cyclodextrin supplemetierten Medien inkubiert waren. Auch sie stellten starke hengstindividuelle Unterschiede heraus. MORAES et al. (2015) verwendeten die Perivitellinmembran von Hühnereiern in einem Bindungsassay für equine Spermien und bewerteten dieses Substrat als genauso effektiv wie bovine Oozyten.
Ein direkter Vergleich der Bindungsraten zweier Spermienproben an derselben Oozyte kann erfolgen, indem diese halbiert und ein sog. 'Hemizona Assay' durchgeführt wird (FAZELI et al. 1995).
Um die Anzahl der ZP-gebundenen Spermien und somit die Bindungsrate bestimmen zu können, müssen die Eizellen von ihren Kumuluszellen befreit werden. Das sogenannte Denudieren kann mechanisch durch wiederholtes Aufziehen in eine englumige Pipette, durch Vortexen oder enzymatisch durch Inkubation der KOKs mit Hyaluronidase erfolgen (CHOI et al. 1993; MACÍAS-GARCÍA et al. 2015). Nach Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen können die gebundenen Spermien mikroskopisch gezählt werden (Tab. 2.2.). Dies kann mit Quetschpräparaten oder nach dem Einbetten der Oozyten für die einzelnen mikroskopischen Ebenen erfolgen. HOECHST 33342 ist der zu diesem Zweck gebräuchlichste Fluoreszenzfarbstoff, da er das Kernchromatin der einzelnen Spermienköpfe deutlich und spezifisch färbt.
32 2.6. Fertilisation
Der Begriff der Fertilisation beschreibt die Fusion einer männlichen und weiblichen Keimzelle und ihrer Zellkerne.
In vivo findet die Fertilisation bei den Säugetieren im Eileiter statt. Nachdem das kapazitierte Spermium an die Zona pellucida der Oozyte gebunden hat, penetriert es diese nach erfolgter Akrosomreaktion (Kap. 2.1.1.3.) und gelangt in den perivitellinen Spalt der reifen Oozyte.
Diese setzt nun ihre zweite Reifeteilung fort. Der Spermienkopf wird nach Bindung mit der Äquatorialregion an das Oolemm und Fusion der Membranen in die Eizelle aufgenommen, wobei sowohl die Flagelle als auch die Zellmembranen entfernt werden. Allein der Zellkern dringt als haploider männlicher Vorkern zu dem Kern der Oozyte vor und verschmilzt mit diesem (Karyogamie). So entsteht die diploide Zygote, welche nun in die Prophase der ersten mitotischen Furchungsteilung eintritt.
Bereits während der Fusion der Plasmamembran des Spermiums und des Oolemms kommt es durch Depolarisation der Eizelle und Anstieg des intrazellulären Kalziumgehaltes zur Entleerung am Oolemm befindlicher, kortikaler Granula in den perivitellinen Raum. Dieser Vorgang löst den sogenannten ʹPolyspermieblockʹ bzw. das ʹZona hardeningʹ aus, sodass das Eindringen weiterer Spermien in die Eizelle verhindert wird. Außerdem werden die Rezeptorproteine für die Spermienbindung auf der Eizelloberfläche durch in den Granula enthaltene Enzyme reduziert (YANAGIMACHI 1994).
In vitro wird die Fertilisation durch Koinkubation von Spermien mit Eizellen in Fertilisationsmedien durchgeführt. Die in vivo ablaufenden Fertilisationsprozesse verdeutlichen die Notwendigkeit der Induktion fertilisationsassoziierter Spermienreaktionen (Kapazitation, Akrosomreaktion, Hyperaktivierung) und der Oozytenmaturation in vivo oder in vitro als Voraussetzung für die IVF. Das Ziel der IVF ist es, aus Spermien und Oozyten unter Laborbedingungen präimplantative und transfertaugliche Embryonen zu erzeugen (KANITZ 2008).
Ist die Induktion der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen nicht erfolgreich bzw.
stehen nur befruchtungsunfähige Spermien zur Verfügung oder ist die ZP nach der in vitro Aufbereitung durch vorzeitiges `Zona hardening` so verändert, dass die Spermien sie nicht durchdringen können, kann dieses mithilfe der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) umgangen werden. Der Vorteil der IVF gegenüber ICSI ist die natürliche Selektion
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befruchtungsfähiger Spermien und Oozyten sowie der deutlich geringere technische Aufwand.
Die Koinkubation der Gameten erfolgt in speziellen Fertilisationsmedien. Die tierartspezifischen Inkubationsbedingungen entsprechen bezüglich der Temperatur und Atmosphäre i.d.R. denen, wie sie für die Maturation angewendet werden (Kap. 2.4.2.). Häufig werden Maturationsmedien mit Serumproteinen ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren und Hormonen als IVF-Medien verwendet. Beispiele sind: TALP (Tyrode supplementiert mit Albumin, Laktat und Pyruvat), SOFM, DMEM und TCM 199. Gelegentlich werden auch Kapazitationsmedien (MW) zur Koinkubation der Gameten genutzt (Tab. 2.2.). GONZÁLEZ- FERNÁNDEZ et al. (2015) machten allerdings deutlich, dass bei der Auswahl des Fertilisationsmediums in erster Linie die Ansprüche der Eizellen an das Medium und weniger die der Spermien zu berücksichtigen sind.
Equine Spermien werden in Konzentrationen von 1–5x106 Spermien mL–1 für 18–24 Std. bei 38–39°C in angefeuchteter Luft mit 5% CO2 mit Eizellen koinkubiert (Tab. 2.2.).
Vergleichend werden für die IVF beim Rind Spermienkonzentrationen von 0.5–6x106 Spermien mL–1 im Fertilisationsmedium über denselben Zeitraum zur Koinkubation genutzt.
Auch eine Kombination aus In-Vivo- und In-Vitro-Verfahren ist möglich, indem z.B.
Oozyten gewonnen, in vitro maturiert und anschließend in die Eileiter oder in präovulatorische Follikel besamter Empfängertiere eingesetzt werden (KASSENS et al.
2015). Ebenso können Zygoten direkt nach ICSI in die Eileiter transferiert werden, wo die weitere Embryonenentwicklung stattfindet. Beide Methoden resultierten in einer Trächtigkeitsrate von etwa 40% beim Pferd (CARNEVALE et al. 2004).
Der Fertilisationserfolg kann anhand einer Penetrations-, Fertilisations- oder Embryonalentwicklungskontrolle beurteilt werden. Nach Orcein-, HOECHST-, Lacmoid-, DAPI- oder Mito Tracker Green-Färbung kann der Spermienkopf nach der Penetration in der Oozyte sowie die fortgesetzte Reifung des Eizellkerns detektiert werden. Nach erfolgter Fertilisation können beide Vorkerne, Polkörper oder frühembryonale Teilung dargestellt werden (ALM et al. 2001; MUGNIER et al. 2009a; TABENER et al. 2010; LEEMANS et al.
2015b).
Wie in Kapitel 2.1.1. erläutert, kann die Induktion der fertilisationsassoziierten Spermienreaktionen auf sehr unterschiedliche Weise mit variierendem Ergebnis erfolgen.
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Gleiches gilt für die Vorbereitung der Oozyten auf die Fertilisation (Kap. 2.4.), was in den stark variierenden IVF-Raten der bisher veröffentlichten Studien von 0–72% zum Ausdruck kommt (Tab. 2.2.).
BLUE et al. (1989) waren eine der ersten Arbeitsgruppen, die sich mit der IVF equiner Gameten beschäftigten. Sie testeten verschiedene Kapazitationsbehandlungen equiner Spermien mit denen sie Zona pellucida freie Hamster- und tiefgefrorene Pferdeoozyten koinkubierten und erzielten eine Penetrationsrate von bis zu 46%. MC PARTLIN et al. (2009) zeigten, dass die Koinkubation equiner Oozyten mit nicht kapazitierten Hengstspermien in einer IVF-Rate von 0% resultierte. In dieser Studie waren in Kapazitationsmedium inkubierte Spermien nur nach Procain-induzierter Hyperaktivierung in der Lage zu fertilisieren (61%) (Kap. 2.1.1.2.). Nicht kapazitierte hyperaktivierte Spermien waren nicht befruchtungsfähig.
Mit einem vergleichbaren Protokoll wurden für die IVF mit Eselgameten lediglich zu 15%
zwei Vorkerne erreicht (GOUDET et al. 2016). LANGE-CONSIGLIO et al. (2011) konnten nach Induktion der Hyperaktivierung und Akrosomreaktion durch Inkubation equiner Spermien in präovulatorischer Follikelflüssigkeit (FF) equine Oozyten fertilisieren. Dabei schien Progesteron der ausschlaggebende Faktor in der FF zu sein.
Die Herkunft der Oozyten aus in vivo- oder Schlachthofmaterial hat ebenso wie das Ausmaß der Kumulusexpansion keinen wesentlichen Einfluss auf den Fertilisationserfolg, sofern die längere Maturationsdauer (26–40 Std.) für kompakte KOKs berücksichtigt wird (ALM et al.
2001).
HINRICHS et al. (2002) konnten mit Oozyten, die in reiner FF maturiert wurden, deutlich bessere IVF-Raten erzielen als mit in Maturationsmedium gereiften Eizellen (12 vs. 3%). Die embryonale Entwicklung nach Eileitertransfer zeigte allerdings gegenläufige Ergebnisse (22 vs. 63% Teilungsrate). Durch eine der IVF vorausgehende 30-minütige Inkubation der in vitro maturierten Oozyten mit homo- und heterologen Eileiterepithelzellen (MUGNIER et al.
2009a) oder in Eileiterflüssigkeit (AMBRUOSI et al. 2013) konnten die Raten ebenfalls verbessert werden. MUGNIER et al. (2009a) zeigten außerdem, dass sich die Fertilisationsfähigkeit equiner Spermien bei Koinkubation mit KOKs oder denudierten Oozyten nicht unterschied.
Trotz der z.T. recht vielversprechenden IVF-Raten beim Pferd ist zu beachten, dass in vitro erzeugte frühembryonale Entwicklungsstadien das 8-Zellstadium selten überschreiten.
