Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
In- vitro- Untersuchungen zur
Kapazitation caniner Spermien und deren Regulation durch das Ovidukt
INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Katrin Simon aus Eschwege
Dr. rer. biol. hum. Dipl.- Phys. Anna Petrunkina
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer- Petersen 2. Gutachter: PD Dr. Kirchhoff
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11. 2002
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung...11
2 Literaturübersicht ...12
2.1 Die Samenzelle ... 13
2.1.1 Das Ejakulat ... 13
2.1.2 Morphologie des Spermiums... 13
2.1.3 Funktion der Spermienstrukturen ... 15
2.1.4 Posttestikuläre Reifungsvorgänge der Spermatozoen ... 18
2.1.5 Kapazitation in vitro... 19
2.2 Das Spermatozoon im weiblichen Genital... 28
2.2.1 Das Ovidukt... 29
2.2.2 Der Weg bis zum Eileiter... 32
2.2.3 Das Spermienreservoir im kaudalen Oviduktisthmus... 33
2.2.4 Kapazitation in vivo ... 35
2.3 In- vitro- Systeme zur Untersuchung der Spermienbindung an das Oviduktepithel ... 38
2.3.1 Oviduktepithelzellkulturen ... 38
2.3.2 Oviduktepithelzellexplante ... 39
2.4 Koinkubation von Oviduktepithelzellen mit Spermatozoen... 39
2.4.1 Bindung der Spermien an das Oviduktepithel ... 40
2.4.2 Einfluss auf Motilität und Vitalität... 41
2.4.3 Einfluss auf die Kapazitation ... 42
2.4.4 Mechanismus der Spermienbindung an das Oviduktepithel ... 44
2.4.5 Koinkubation von Spermien mit heterologen Oviduktepithelzellen... 45
3 Material und Methode ...46
3.1 Versuchstiere und Ejakulatgewinnung ... 46
3.2 Spermatologische Untersuchung ... 46
3.2.1 Makroskopische Beurteilung ... 47
3.2.2 pH- Wert... 47
3.2.3 Samenzelldichte... 47
3.2.4 Beimengungen und Anteil an Agglutinationen... 47
3.2.5 Motilität... 48
3.2.6 Anteil membrandefekter („toter“) Zellen ... 48
3.2.7 Morphologie ... 48
3.2.8 Computergestützte Motilitätsanalyse (CMA) ... 48
3.3 Erstellung von Oviduktepithelzellkulturen... 49
3.3.1 Gewinnung von Oviduktepithelzellen ... 49
3.3.2 Kultivierung der Oviduktepithelzellen auf mit Biomatrix- Lösung beschichteten Lab- Tek® Chamber Slides... 50
3.4 Hauptversuche ... 51
3.4.1 Aufbereitung des Ejakulats ... 51
3.4.2 Koinkubation von Oviduktepithelzellen und Spermien ... 52
3.4.3 Erfassung der Kapazitationsdynamik der Hundespermien... 53
3.4.4 Erfassung der Membranintegritätsveränderungen ... 54
3.4.5 Erfassung der Tyrosinphosphorylierung... 55
3.4.6 Erfassung der Veränderungen im cytosolischen Calciumionengehalt. 57 3.4.7 Quantifizierung der Spermienbindung und ihre Veränderung während der Koinkubation im heterologen System im Vergleich zur Koinkubation im homologen System... 58
3.5 Begleitende Versuche ... 62
3.5.1 Vergleich des Kapazitationsverhaltens in drei verschiedenen Medien mittels CTC- Färbung... 62
3.6 Statistische Auswertung ... 63
3.7 Dokumentation ... 63
Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse...64
4.1 Kapazitationsverhalten in drei verschiedenen Medien ... 64
4.1.1 Veränderungen bei den CTC- Fluoreszenzmustern... 64
4.1.2 Entwicklung der Vitalität ... 66
4.2 Kapazitationskinetik der Hundespermien im Tyrodemedium... 67
4.2.1 Kapazitationsdynamik der Hundespermien... 67
4.2.2 Entwicklung der Membranintegrität ... 68
4.2.3 Intrazellulärer Calcium- Gehalt... 70
4.2.4 Tyrosinphosphorylierung von Membranproteinen ... 72
4.2.5 Veränderungen der Motilität ... 80
4.3 Koinkubation von Hundespermatozoen mit Oviduktepithel-zellkulturen - Einfluss der Epithelbindung auf die Marker des Kapazitationsprozesses ... 84
4.3.1 Einfluss der Epithelbindung auf die Kapazitationsdynamik ... 85
4.3.2 Einfluss der Epithelbindung auf die Membranintegrität ... 87
4.3.3 Einfluss der Epithelbindung auf den intrazellulären Ca2+- Gehalt... 88
4.3.4 Einfluss der Epithelbindung auf die Tyrosinphosphorylierung... 91
4.3.5 Einfluss der Koinkubation auf die Motilität... 98
4.4 Bestimmung des Spermatozoen- Bindungsindex im Vergleich zwischen heterologem und homologem Spermatozoen- Explant- System im Zusammenhang mit den Veränderungen der Tyrosinphosphorylierung.... 100
4.4.1 Entwicklung des Bindungsindexes ... 100
4.4.2 Tyrosinphosphorylierung abhängig vom Spermienstatus - Vergleich beider Systeme ... 101
4.4.3 Kinetik der Tyrosinphosphorylierung im homologen und im heterologen System ... 106
5 Diskussion ...112
6 Zusammenfassung ...127
6a Summary...130
7 Literaturverzeichnis ...133
8a Anhang A ...153
8a.1 Materialien... 153
8a.2 Chemikalien ... 155
8a.3 Rezepte... 156
8b Anhang B ...162
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A. Arteria
Abb. Abbildung
ATP Adenosintriphosphat
Aqua dest. destilliertes Wasser
BI Bindungsindex
BSA Bovines Serumalbumin
°C Grad Celsius
ca. circa
Ca2+ Calcium, Calciumionen
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CCM Canine Capacitation Medium
cm Zentimeter
cm2 Quadratzentimeter
CMA Computergestützte Motilitätsanalyse
CO2 Kohlendioxid
CTC Chlortetracyclin
d. h. das heißt
d. i. das ist
Fa. Firma
DNA Desoxyribonucleinacid
Fluo- 3 AM Fluo-3 Acetomethoxyester
G gebundene Spermien
g Gramm, Erdbeschleunigung
h hour (Stunde)
HBF head beating frequency (Kopfschlagfrequenz)
HBS Hepes buffered saline
Hz Hertz
Ig Immunglobulin
Indo- 1 AM Indo- 1 Acetomethylester
kDa Kilodalton
LHD lateral head displacement (seitliche Kopfauslenkung) mCCM modifiziertes Canine Capacitation Medium
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimol
mm2 Quadratmillimeter
mOsm/ l Milliosmolar
µg Mikroliter
NaHCO3 Bikarbonat
ng Nanogramm
nm Nanometer
OEA Ovidukt- Explant- Assay
OEC Oviductal epithelial cell culture
o. g. oben genannte
P4 Progesteron
PBS Phosphate buffered saline
pH Wasserstoffionenkonzentration
PI Propidiumjodid
® eingetragenes Warenzeichen
RNA Ribonucleinacid
ROS reactive oxygen species
s. siehe
T in Tyrode- Medium inkubierte Spermien
U ungebundene Spermien
VAP average path velocity (mittlere Bahngeschwindigkeit) VCL curvolinear velocity (kurvolineare Geschwindigkeit) VSL straight linear velocity (lineare Geschwindigkeit)
z. B. zum Beispiel
Einleitung
1 Einleitung
Direkt nach der Ejakulation sind Samenzellen noch nicht befruchtungskompetent.
Um diese Fähigkeit zu erlangen, müssen sie weitere Reifungsschritte durchlaufen.
Diese Veränderungen an den Spermatozoen erfolgen im weiblichen Genitaltrakt und versetzen sie in die Lage, die Zona pellucida zu durchdringen und mit der Eizelle zu fusionieren. Alle diese physiologischen Vorgänge, die zur Befruchtungsfähigkeit des Spermiums führen, werden unter der Bezeichnung „Kapazitation“ zusammengefasst (AUSTIN 1951; CHANG 1951). Sie beinhalten eine Folge von Zell- und Membranveränderungen, die das Spermium zur Akrosomenreaktion befähigen. Mit der Kapazitation geht die Hyperaktivierung, eine Veränderung des Bewegungsmusters der Spermien, einher.
In vivo laufen die wesentlichen Schritte des Kapazitationsprozesses im Eileiter ab. In dessen kaudaler Region werden die Samenzellen nach dem Deckakt bis zum Zeitpunkt der Ovulation unter Bedingungen „gelagert“, die ihre Vitalität und Befruchtungsfähigkeit erhalten. Das Ovidukt nimmt Einfluss auf den Kapazitationsprozess, um die Spermienfunktion mit der Ovulation zu synchronisieren. Außerdem wird der Transport der Spermien zur Ampulle des Eileiters kontrolliert und damit einer Befruchtung der Eizelle durch mehrere Spermien vorgebeugt (TÖPFER- PETERSEN 2002). Die Befruchtungskompetenz erhaltende Funktion des Ovidukts ist insbesondere für diejenigen Tierarten von Bedeutung, bei denen zwischen Deckakt und Ovulation eine Zeitspanne von mehreren Tagen liegen kann, wie z. B. beim Hund.
Beim Hund ist bislang wenig über diese Vorgänge im weiblichen Genitale bekannt.
Genauso wenig ist über den Einfluss des Ovidukts auf Speicherung, Kapazitation und Transport der Samenzellen bekannt. Im Rahmen dieser Studie soll zunächst der Verlauf des Kapazitationsprozesses bei Hundespermien charakterisiert werden.
wie Veränderungen des cytosolen Calciumgehalts und der Tyrosinphosphorylierung von Membranproteinen untersucht. Mit Hilfe computergestützter Motilitätsmessung sollen Veränderungen im Bewegungsmuster aufgezeichnet werden. Anschließend erfolgt eine Untersuchung dieser kapazitationsbedingten Veränderungen im Umfeld des Eileiters durch Koinkubation mit porcinen Oviduktepithelzellkulturen. Darüber hinaus soll der Einfluss des Eileiters auf die Spermienkapazitation durch den Vergleich des heterologen mit dem homologen Koinkubationsystem untersucht werden.
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Die Samenzelle 2.1.1 Das Ejakulat
Bei der Ejakulation wird ein Gemisch aus Zellen und Flüssigkeit, das Seminalplasma, abgegeben. Das Ejakulat enthält neben einer überwiegenden Mehrheit ausdifferenzierter Samenzellen eine geringere Anzahl unreifer Spermien, sowie abgestoßene Epithel- und Rundzellen, kernlose Zytoplasmatropfen und auch Leuko- und Erythrozyten. Das Seminalplasma setzt sich aus den Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen zusammen. Beim Hund ist als einzige dieser Drüsen die Prostata ausgebildet (SCHUMMER u. VOLLMERHAUS 1987) Deren Sekret stellt ein Transportmittel dar, ist die Energiequelle für die Spermienmotilität und stimuliert die Aktivität und den Stoffwechsel der Spermien. Bei den meisten Tierarten sind als charakteristische Bestandteile Fruktose, Inositol, Sorbitol, Zitronensäure und Phospholipide enthalten (SCHNORR 1996). Das Seminalplasma des Hundes enthält dagegen nur unwesentliche Mengen an Monosacchariden wie Glukose, Fruktose, Sorbitol und Mannose (RIGEAU et al. 2001).
Die Gesamtmenge des Ejakulats und die darin enthaltene Menge an Spermien weisen beim Rüden erhebliche Schwankungen abhängig vom Körpergewicht und der damit verbundenen Hoden- und Prostatagröße auf. Bei Rüden zwischen 10 und 20kg Körpergewicht beträgt das Volumen des Ejakulats ca. 10- 15ml mit ca. 800 x 106 darin enthaltenen Samenzellen (GÜNZEL- APEL et al. 1994).
2.1.2 Morphologie des Spermiums
Das Spermium stellt das Endstadium der männlichen Gametogenese dar. Es dient als Transportvehikel der männlichen DNA zur weiblichen Eizelle. Der Aufbau der
ausdifferenziert, aber noch nicht befruchtungsfähig. Während der Passage durch den Nebenhoden werden die Spermien in einem Zustand der Anabiose gehalten.
Unterdessen vollzieht sich ein Reifungsprozess, der als Nebenhodenreifung bezeichnet wird und bei dem die Samenzellen ihre Befruchtungsfähigkeit erlangen.
Das Spermium stellt eine polarisierte Zelle dar, die sich aus einem Kopf und einem Schwanz zusammensetzt. Seine Gesamtlänge beträgt beim Hund ca. 60µm. Der Spermienkopf ist oval und im Profil stark abgeplattet (Länge: 6µm, Dicke: 3,5µm). Er wird nahezu vollständig vom Kern ausgefüllt, der weitgehend dicht kondensiertes Chromatin und einen immer haploiden Chromosomensatz (n= 39) enthält. Der Kern wird zu ⅔ kappenartig durch das Akrosom bedeckt. Es enthält hydrolytische Enzyme, Hyaluronidase, Neuraminidase und Akrosin. Der Gehalt an diesen Enzymen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Penetration der Zona pellucida der Eizelle durch die Samenzelle. Distal an das Akrosom schließen sich das Äquatorialsegment und die postakrosomale Region an.
Der Spermienschwanz setzt sich aus einem Hals-, Mittel-, Haupt- und Endstück zusammen. Das Halsstück bildet die gelenkige Verbindung zwischen Kopf und Schwanz. Es enthält den sogenannten Gelenkkopf. Dieser stellt über eine Basalplatte die Verbindung mit der Implantationsgrube des Kerns her. Distal wird der Gelenkkopf durch den Streifenkörper fortgesetzt, der dann in die Außenfibrillen einmündet. Von ihm eingeschlossen wird das proximale Zentriol, aus dem der Achsenfaden (Axonema) entspringt. Dieser weist die typische Geißelstruktur mit 2 zentralen Mikrotubuli und 9 umgebenden Doppelmikrotubuli auf und zieht zentral durch das Mittelstück. Den genannten Tubuli liegen dichte Außenfibrillen auf. Darauf folgt dann eine Scheide aus spiralförmig angeordneten Mitochondrien, die der Energielieferung für eine aktive Vorwärtsbewegung des Spermiums dienen. Die distale Begrenzung des Mittelstücks bildet der Schlussring. Daran schließt sich der längste Teil des Spermiums an, das Hauptstück (ca. 50µm). Zentral liegt immer noch der Achsenfaden in einem distal dünner werdenden Mantel aus Außenfibrillen.
Zusätzlich wird unter dem Plasmalemm von fibrillären Strukturproteinen eine aus zwei halbschalenförmigen Anteilen bestehende Ringfaserscheide gebildet. Das distale Ende dieser Faserscheide markiert den Beginn des Endstücks. Es enthält nur
Literaturübersicht
noch anfangs den zentralen Achsenfaden. Weiter distal geht diese geordnete Struktur verloren und die Mikrotubuli enden frei, umgeben von Plasmalemm.
(LIEBICH 1993a)
Die morphologische Beschaffenheit des Spermiums ist ein wichtiges Kriterium bei der Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit. Abweichungen von der normalen Gestalt entstehen während der Spermiogenese oder der anschließenden Nebenhodenpassage. Dabei kann es sich um Missbildungen, Deformationen und Beschädigungen an allen Anteilen des Spermiums handeln. Diese zeigen sich an einer abweichenden Kopfform, an Schäden am Akrosom oder der postakrosomalen Membran oder an Missbildungen des Schwanzes. Beim Hund sollen höchstens 30%
der im Ejakulat enthaltenen Samenzellen abnorm sein (GÜNZEL- APEL et al. 1994).
Bei höheren Anteilen verschlechtert sich das Befruchtungsvermögen des Spermas.
Die Fortbewegung der Samenzellen kommt durch rhythmisch peitschende Bewegungen der Geißel zustande. Die dafür notwendige Energie wird durch die Zellatmung und Glykolyse in Form von ATP und Kreatinphosphat bereitgestellt.
Normale Spermien legen 4- 5mm/ min zurück und besitzen die Fähigkeit, sich gegen einen Flüssigkeitsstrom fortzubewegen (positive Rheotaxis) (SCHNORR 1996). In einem gut befruchtungsfähigen Ejakulat des Hundes sollten mindestens 70% der Spermien motil sein (GÜNZEL- APEL et al. 1994).
2.1.3 Funktion der Spermienstrukturen
Die äußere Hülle des Spermiums bildet die Plasmamembran. Sie stellt eine extrem dynamische Struktur dar und unterliegt während der Nebenhodenreifung, der Ejakulation und der Wanderung im weiblichen Genitale zahlreichen Umbauvorgängen, die durch die wechselnden umgebenden Milieus verursacht werden (JONES 1989).
Nach SINGER und NICHOLSON bildet die Plasmamembran ein „Fluid Mosaic“, bestehend aus einer Phospholipiddoppelschicht. Zwischen den beiden Schichten sind die Phospholipide ungleichmäßig verteilt (GADELLA et al. 1999). Diese
Schichten als Tunnelproteine (ROBERTSON, 1983). Außerdem können wasserlösliche Proteine von außen an die Membranproteine oder an die Lipidschicht angelagert sein.
Diese Plasmamembran vermittelt den Kontakt mit dem extrazellulären Milieu und anderen Zellen. Die dafür wichtigste Eigenschaft ist eine selektive Permeabilität der Zellmembran. Sie ermöglicht einen aktiven und passiven Transport von Stoffen in die bzw. aus der Samenzelle. Lipidlösliche Stoffe passieren die Membran passiv entlang eines Konzentrationsgefälles, wasserlösliche unterliegen einem durch die Membranproteine kontrollierten Stofftransport (ROBERTSON 1983).
Die Eigenschaften der Spermienmembran werden durch die Aufgaben der Samenzelle bedingt. Diese differieren in den verschiedenen Abschnitten des Spermatozoons.
Nach GADELLA et al. (1994) werden entsprechend der Zellkompartimente vier Hauptareale der Plasmamembran differenziert. Diese werden dann wiederum in Subareale eingeteilt. Letztere unterscheiden sich in der Zusammensetzung ihrer Membranmoleküle und ihrer Glykoproteine an der Oberfläche und in ihren Aufgaben, die sie bei der Interaktion der Gameten übernehmen. Am Kopf des Spermiums wird die akrosomale Region im vorderen Kopfbereich von der sich dahinter anschließenden postakrosomalen Region, die sich bis zum Spermienhals erstreckt, unterschieden. Von BAUMGARTL (1980) wird die akrosomale Region wiederum in drei Anteile gegliedert: Der Bereich über dem vorderen Akrosomenrand bildet das Apikalsegment, den größten Anteil des Akrosoms stellt das Hauptsegment dar, an das sich dahinter das Äquatorialsegment anschließt.
Das Apikalsegment ist bei Kontakt mit der Zona pellucida der Eizelle an der Akrosomenreaktion beteiligt. Da nur akrosomenintakte Spermien den Cumulus oophorus passieren können, muss in der apikalen Membran ein Element vorhanden sein, das eine vorzeitige Akrosomenreaktion verhindert. Diese Aufgabe übernehmen periphere und membranintegrierte Glycoproteine über der akrosomalen Membran.
Proteine der periakrosomalen Plasmamembran vermitteln die Interaktion zwischen Spermium und Zona pellucida. An der an die Akrosomenreaktion anschließenden
Literaturübersicht
Fusion mit dem Oolemm ist als verbleibende Struktur der Spermienmembran das Äquatorialsegment beteiligt (GADELLA et al. 1999).
Während der Nebenhodenreifung, der Ejakulation, der Kapazitation und der Akrosomenreaktion unterliegt die Plasmamembran zahlreichen Umbauvorgängen, die für die jeweils notwendige Funktion erforderlich sind (TÖPFER- PETERSEN et al.
1996). Es erfolgen Veränderungen in der Anordnung, im Stoffwechsel und in der Zusammensetzung der Membranlipide. Dadurch ändern sich die Fluidität und die Permeabilität der Plasmamembran. Das Ausmaß der Fluidität ist abhängig vom Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und Cholesterol in der Membran. Cholesterol wird während der Nebenhodenpassage in die Spermienmembran eingelagert und dient als Stabilisator (SEKI et al. 1992). Je mehr gesättigte Fettsäuren und je mehr Cholesterol enthalten sind, desto „steifer“ ist die Membran (QUINN 1981; CHOW et al. 1986). Innerhalb der Lipiddoppelschichten ist eine Lateralbewegung der einzelnen Moleküle möglich, was als „membrane fluid mosaic“ bezeichnet wird (SINGER u.
NICHOLSON 1972). Dies ermöglicht die hohe Flexibilität und Dynamik der Spermienmembran. Im Vorfeld des Befruchtungsprozesses finden hier Umstrukturierungen statt, die durch den Efflux von 70- 80% des Cholesterolgehalts aus der Membran initiiert werden. (SUZUKI u. YANAGIMACHI 1989). Zusätzlich kommt es zu lateralen Verschiebungen der Membranlipide innerhalb einer Schicht und zwischen beiden Phospholipidschichten. Diese Veränderungen der Lipidschichten sollen durch einen Anstieg des intrazellulären Ca2+ Gehalts und daran gekoppelte enzymatische Vorgänge ausgelöst werden (HARRISON u. GADELLA 1995). Außerdem spielen die Membranlipide an sich ebenfalls eine Rolle als „second messenger“ (ROLDAN u. MURASE 1994).
Die Motilität der Spermien wird anscheinend durch Moleküle beeinflusst, die mit der Geißelplasmamembran assoziiert sind. Hier wird vermutet, dass die Anlagerung oder Integration spezifischer Glykoproteine eine vorzeitige Hyperaktivierung verhindert (YANAGIMACHI 1994).
2.1.4 Posttestikuläre Reifungsvorgänge der Spermatozoen
Die im Hoden gebildeten Spermien erlangen ihre Befruchtungsfähigkeit, d. h. ihre Beweglichkeit und ihre Fähigkeit zur Interaktion mit der Eizelle erst auf dem Weg dorthin. Somit findet dieser Prozess sowohl im männlichen, als auch im weiblichen Genitaltrakt statt. Während der posttestikulären Reifung vollziehen sich zahlreiche Veränderungen der Spermienoberfläche (BLAQUIER et al. 1989; GADELLA et al.
1994). Im Nebenhoden werden zahlreiche Proteine mit einem geringen Molekulargewicht sezerniert. Sie sind hochglykosyliert und hoch tierartspezifisch. Die Wechselwirkungen der Nebenhodensekrete mit den Samenzellen stellen einen wesentlichen Teil der Spermienreifung dar (KIRCHHOFF 1995). Es handelt sich dabei um strukturelle Ablösung, Modifizierung und Maskierung von Antigenen (KIRCHHOFF u. IVELL 1995).
Im weiblichen Genitaltrakt findet eine Aktivierung der Spermien statt, die Kapazitation. Dieser Begriff fasst sämtliche physiologische Vorgänge zusammen, die zur Befruchtungsfähigkeit der Spermien (AUSTIN 1951; CHANG 1951) führen, bzw.
die sie in die Lage versetzen, eine geordnete Akrosomenreaktion zu durchlaufen (MEYERS et al. 1995; PARRISH et al. 1988). Die Veränderungen im Laufe des Kapazitationsprozesses sind essentiell (BEDFORD 1983) und gipfeln in der Akrosomenreaktion. Dabei verschmilzt die Plasmamembran mit der äußeren Membran des Akrosoms und bildet so enzymhaltige Vesikel aus. Ausgelöst wird die Akrosomenreaktion bei Kontakt mit der Zona pellucida. Die Kapazitation wird einerseits durch Inhaltsstoffe des Seminalplasmas beeinflusst, andererseits durch die Sekrete im weiblichen Genitaltrakt. Es spielen auch enzymatische und hormonelle Einflüsse eine Rolle.
Bei der Ejakulation kommen die Spermatozoen mit den Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen in Kontakt. Neben Proteasehemmern (IRWIN et al. 1983) werden weitere Proteine an die Oberfläche assoziiert. Diese dienen wahrscheinlich als Dekapazitationsfaktoren, die während des Transports im weiblichen Genitaltrakt die Plasmamembran stabilisieren, einer verfrühten Akrosomenreaktion vorbeugen und mögliche Zona- Rezeptoren schützen (ROGERS u. BENTWOOD 1982; HAMNER u.
MCLAUGHLIN 1974).
Literaturübersicht
2.1.5 Kapazitation in vitro
Der Kapazitationsprozess kann in geeigneten Medien induziert werden, was die Untersuchung dieser komplexen Abläufe erlaubt. Dies kann mit Hilfe von Sekreten aus dem weiblichen Geschlechtstrakt, z.B. Follikelflüssigkeit oder speziellen Kapazitationsmedien geschehen. Während der Kapazitation vollziehen sich zahlreiche zelluläre und molekulare Veränderungen an der Samenzelle. Diese zeichnen sich durch eine zunehmend destabilisierende Umstrukturierung der Plasmamembran durch den Verlust von Cholesterol, eine Phosphorylierung der Membranproteine und einen Anstieg der intrazellulären Ionenkonzentrationen von Calcium und Bikarbonat aus. Zudem werden die Spermien hyperaktiviert (BALDI et al. 1996). Das Bewegungsmuster ändert sich dahingehend, dass die Spermien sich mit stark gekrümmten, peitschenartigen Schwanzschlägen und häufigen Richtungswechseln (KATZ et al. 1989; YANAGIMACHI 1994), verbunden mit einer starken Seitwärtsbewegung des Kopfes (lateral head displacement) (SUAREZ et al.
1992) fortbewegen. Hyperaktivierung und Akrosomenreaktion stellen Voraussetzungen für die Penetration der Zona pellucida und für die Fusion mit der Eizelle dar.
Ein Medium für die in vitro Kapazitation von Spermien muss Calcium- Ionen enthalten, da Kapazitation und Akrosomenreaktion calciumabhängige Vorgänge sind (FRASER 1982). Weiterhin muss ein lipidbindendes Protein, wie bovines Serumalbumin, enthalten sein, um den Efflux von Cholesterol aus der Membran zu erleichtern (DAVIS et al. 1979) und schließlich ist Bikarbonat als Initiator der kapazitationsbedingten Membrandestabilisierung ein essentieller Bestandteil des Kapazitationsmediums. (SUZUKI et al. 1994).
Umbau der Plasmamembran
Während der Ejakulation führt der Kontakt mit dem Seminalplasma zu einer Anlagerung von sogenannten Dekapazitationsfaktoren an das Spermium. Diese im
1996). 90% dieser Proteine werden während der Wanderung im weiblichen Genitaltrakt und während des Kapazitationsprozesses wieder entfernt (TÖPFER- PETERSEN 1996). Dies bereitet die folgende Umstrukturierung der Plasmamembran vor.
Während der Inkubation im Kapazitationsmedium findet eine Reorganisation der Zusammensetzung und Verteilung der Membranbausteine statt (GADELLA et al.
1999). Dies betrifft Lipide und Proteine gleichermaßen. Wichtigster Faktor für die Änderung der Membranarchitektur ist der Verlust von Cholesterol, der durch im Medium enthaltenes Albumin verursacht wird (GO u. WOLF 1985; DAVIS et al.
1979). Während der Kapazitation kommt es zu einer Auflockerung der Phospholipidmembran, indem sich das Verhältnis von Cholesterol zu Phospholipiden zugunsten letzterer verschiebt (DAVIS 1978). Neben einer gesteigerten Membranfluidität soll der Cholesterolverlust weitere Auswirkungen auf die Spermienfunktion haben. So wird diskutiert, ob ein Anstieg des intrazellulären pH- Werts im Vorfeld der Akrosomenreaktion durch den Cholesterolefflux bedingt ist (CROSS 1998), außerdem wird der Influx von Calciumionen erleichtert.
Neben dem für den Cholesterolefflux bedeutenden Albumin hat im Medium enthaltenes Bikarbonat ebenfalls großen Einfluss auf die Modifikation der Membranarchitektur (HARRISON et al. 1996). Bei Untersuchungen an porzinen Samenzellen konnte gezeigt werden, dass Bikarbonat sehr früh und rasch Änderungen in der Zusammensetzung der Lipidmembran bewirkt (GADELLA u.
HARRISON 2000; HARRISON u. MILLER 2000). Zusätzlich bewirkt es eine langsamer voranschreitende Umstrukturierung der Spermienoberfläche: daran assoziierte Substanzen gehen verloren und darunter liegende Glycokonjugate werden demaskiert (ASHWORTH et al. 1995).
Bei der Umstrukturierung der Lipidarchitektur treten partikelfreie Areale in den Phospholipidschichten auf und Aggregationen eingelagerter Partikel zwischen diesen Bereichen (SUZUKI u. YANAGIMACHI 1989; FLÉCHON et al. 1986). Die Änderungen im Aufbau der Membran führen zu einer Exponierung von Zona- Rezeptoren und zu veränderten Ionenfluxen in die und aus der Zelle. Zudem führen die membranumstrukturierenden Vorgänge zu einer erhöhten Fusogenität der
Literaturübersicht
Membran. Diese bildet die Voraussetzung für das Verschmelzen der äußeren akrosomalen Membran mit der Plasmamembran im Rahmen der akrosomalen Exozytose und für die anschließende Fusion mit der Eizelle (GADELLA et al. 1999).
Die Veränderungen in der Membranarchitektur werden wahrscheinlich über Kinase/
Phosphatase- Zyklen geregelt (HARRISON u. MILLER 2000).
Tyrosinphosphorylierungsaktivität
Ein weiterer Schritt im Prozess der Kapazitation ist die Phosphorylierung spezifischer Membranproteine. Über die Proteinphosphorylierung wird eine Vielzahl zellulärer Abläufe, wie z. B. Ionenfluxe oder Rezeptorfunktionen, reguliert. Als Reaktion auf veränderte Umgebungsbedingungen werden posttranslationale Veränderungen durch Proteinkinasen vermittelt. Diese wurden bisher in zwei Gruppen eingeteilt:
Serin-/ Threoninkinasen und Tyrosinkinasen. Darüber hinaus gibt es Kinasen, die in der Lage sind, alle genannten Reste zu phosphorylieren. In Eberspermatozoen liegt eine Tyrosinkinase vor, die vermutlich in die Regulation der verschiedenen zellulären und molekularen Abläufe während der Kapazitation involviert ist (BERRUTI 1994).
Eine Zunahme der Tyrosinphosphorylierung ist abhängig von der Anwesenheit von BSA, Ca2+ und Bikarbonat im Medium (VISCONTI et al 1995a). BSA bindet Cholesterol aus der Spermienmembran und hat damit insofern Bedeutung für die Tyrosinphosphorylierung, als der Cholesterolefflux in einen transmembranalen Signalmechanismus, der in Phosphorylierungen resultiert, eingebunden ist.
(VISCONTI u. KOPF 1998) Es wird diskutiert, ob durch die Fluiditätsänderungen der Plasmamembran die Permeabilitäten für Calcium und Bikarbonat modifiziert werden.
Letztgenannte Ionen sind in der Lage, die Adenylcyclase der Spermien zu aktivieren.
Daraus folgt ein erhöhter cAMP- Spiegel, der wiederum eine erhöhte Aktivität der Proteinkinase A und damit einen Anstieg der Tyrosinphosphorylierung nach sich zieht (VISCONTI et al. 1999, HAYASHI et al. 1987, GALANTINO- HOMER et al.
1997).
Unter kapazitierenden Bedingungen konnte eine Tyrosinphosphorylierung
1991, Makaken: MAHONY u. GWATHMEY 1999, Haus- und Wildkatzen:
PUKAZHENTHI et al. 1996, 1998, Schwein: FLESCH et al. 1999, Rind:
GALANTINO- HOMER et al. 1997).
Weiterhin sollen auch oxidierende Bedingungen eine gesteigerte Aktivität der Tyrosinkinasen auslösen. So soll eine erhöhte intrazelluläre Produktion von ROS (reactive oxygen species) mit einer vermehrten Ausbildung von Phosphotyrosin assoziiert sein (AITKEN et al. 1995). LECLERC et al. (1998) vermuten für humane Spermien, dass der Anstieg der intrazellulären Calciumionenkonzentration eine Zunahme der cAMP- Konzentration bewirkt. Dies soll wiederum eine gesteigerte Produktion von Superoxid- Anionen (ROS) auslösen, die dann schließlich die Tyrosinphosphorylierung stimulieren.
Die Phosphorylierungsaktivitäten und die Änderungen in der Lipidarchitektur der Spermienmembran laufen gleichzeitig ab (GADELLA et al. 1999). So werden beim Eber drei spezifische Proteine der Plasmamembran phosphoryliert, während gleichzeitig die Membranfluidität steigt (FLESCH et al. 1999). HARRISON und MILLER (2000) fanden außerdem bei Eberspermien, dass die Umorganisation der Plasmamembran über eine cAMP- abhängige Proteinkinase geregelt wird, die wiederum ein bestimmtes Protein phosphoryliert. Eine Proteinphosphatase Typ 1 vermittelt anschließend die Dephosphorylierung. Eine Funktion der phosphorylierten Membranproteinstrukturen könnte die Vermittlung der Spermienbindung an die Zona pellucida sein (GADELLA et al. 1999).
Während VISCONTI et al. (1995a, b) bei Mausspermien eine Abhängigkeit der cAMP- regulierten Tyrosinphosphorylierung von extrazellulärem Calcium fanden, soll dies laut LUCONI et al. (1996) für in- vitro- kapazitierte menschliche Spermien nicht zutreffen. Die Zunahme der Phosphorylierungsaktivitäten soll unabhängig vom Gehalt an extrazellulärem Calcium sein, bzw. sollen Ca2+- Ionen die Aktivität der Tyrosinkinase sogar negativ beeinflussen. Dies wird durch Beobachtungen von CARRERA et al. (1996) an humanen Spermatozoen unterstützt. Dabei handelte es sich um eine calciuminduzierte und calmodulinabhängige Dephosphorylierung tyrosinenthaltender Proteine. Calmodulin regelt in Verbindung mit Calcium den
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intrazellulären cAMP- Gehalt über die Aktivierung einer Adenylatcyclase (GROSS et al. 1987).
Die cAMP- vermittelte Phosphorylierung und Dephosphorylierung von Proteinen sind auch bei der Regulation der Spermienmotilität von Bedeutung (TASH u. MEANS 1983; CARRERA et al. 1996). So soll die Beweglichkeit bei Spermien der Regenbogenforelle abhängig sein von der Phosphorylierung eines bestimmten Polypeptids (HAYASHI et al. 1987). TASH et al. (1988) fanden, dass eine Hemmung der Spermienmotilität durch Calcium mit dem Rückgang der calmodulinabhängigen Phosphorylierungsaktivität einhergeht. Auch beim Bullen konnte ein Zusammenhang zwischen Tyrosinphosphorylierung eines spezifischen Proteins am Spermienschwanz und der Motilität festgestellt werden (VIJAYARAGHAVAN et al.
1997). Es wurde ebenfalls vermutet, dass die Regulation dieser Prozesse über das Zusammenspiel von Calcium, cAMP und Tyrosinkinase geschieht. SI (1999) fand bei Versuchen mit Hamsterspermien, dass eine temperaturabhängige Hyperaktivierung mit der Phosphorylierung eines bestimmten Geißelproteins einherging.
Neben der Tyrosinphosphorylierung laufen während der Kapazitation weitere Phosphorylierungsprozesse an der Samenzelle ab. NAZ (1999) beschrieb die Serin- und die Threoninphosphorylierung, die bei der Kapazitation humaner Spermatozoen auftreten. Diese Phosphorylierungstypen können auch in Kombination mit der Tyrosinphosphorylierung vorliegen. Welche Rolle die Aktivitäten von Serin- und Threoninkinasen im Rahmen der Kapazitation spielen, ist noch nicht geklärt.
Die tyrosinphosphorylierten Proteine können auf zwei Wegen nachgewiesen werden.
Zahlreiche Untersucher (AITKEN et al. 1995; CARRERA et al 1996; LUCONI et al.
1996; VIJAYARAGHAVAN et al. 1997; LECLERC et al. 1998; FLESCH et al. 1999;
NAZ 1999; SI 1999) bedienten sich der Elektrophorese. Außerdem wird die Immunfluoreszenz angewandt (CARRERA et al. 1996; NAZ 1999). Dabei kann mit Hilfe immunzytochemischer Methoden die Verteilung der phosphorylierten Proteine im Spermium sichtbar gemacht werden.
Intrazellulärer Calciumgehalt
Calcium spielt bei der Regulation der verschiedenen Komponenten des Kapazitationsprozesses eine essentielle Rolle. So beeinflusst der intrazelluläre Calciumgehalt die Tyrosinphosphorylierungsaktivität, die Hyperaktivierung und die Akrosomenreaktion wesentlich. Die beiden letztgenannten Vorgänge laufen allerdings unabhängig voneinander ab. Hyperaktivierte Zellen weisen im Bereich des Mittelstücks, akrosomenreagierte dagegen im Kopfbereich, höhere Calciumkonzentrationen auf (SUAREZ u. DAI 1995). Daraus soll folgen, dass der intrazelluläre Calciumgehalt in zwei Phasen ansteigt. Zunächst wird die Hyperaktivität eingeleitet, später die akrosomale Exozytose. Auch ADEOYA- OSIGUWA und FRASER (1993) beschreiben einen biphasischen Calciumeinstrom in die Spermienzelle. Ein erster Höhepunkt der intrazellulären Calciumkonzentration trat bei Mausspermien während der ersten Inkubationsstunde auf, ein zweiter nach zwei Stunden Inkubation. Der erste Anstieg soll die kapazitationsbedingten Veränderungen des intrazellulären Calciumgehalts widerspiegeln, der zweite tritt im Zuge der akrosomalen Exozytose auf (FRASER 1995). DRAGILEVA et al. (1999) konnten dies in ihren Versuchen mit Spermien vom Bullen und vom Schafbock ebenfalls feststellen. Während der Kapazitation stieg zuerst die intrazelluläre Calciumkonzentration im Spermienkopf und danach im Mittelstück. Eine zweite stärkere Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgte dann bei der Akrosomenreaktion.
PARRISH et al. (1999) vermuten, dass der anfängliche Calciuminflux für das Beladen eines im Akrosom liegenden Calciumspeichers genutzt wird. Wird die Ca2+- ATPase, die für die Calciumaufnahme in die Zellorganelle verantwortlich ist, gehemmt, werden Calciumionen über die Kanäle der Speicherorganellen in das Zytoplasma entlassen. Dies führt dann möglicherweise zur Öffnung von speicherregulierten Calciumkanälen in der Plasmamembran. So kann erklärt werden, dass bei Hemmung der mikrosomalen Ca2+- ATPase mit Thapsigargin die akrosomale Exozytose bei Bullen- und Menschenspermien ausgelöst wird (PARRISH et al. 1999). Auch DRAGILEVA et al. (1999) beobachteten einen ATP- abhängigen Ca2+- Transporter, der aktiv Ca2+ in entsprechenden Speichern anhäuft. Nach
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Blockade dieser ATPase steigt der intrazelluläre Calciumgehalt rasch an. Dieser Calciuminflux ist bei kapazitierten Spermien doppelt so hoch wie bei frisch ejakulierten und ist bei ersteren von akrosomaler Exozytose gefolgt.
Die Kontrollfunktion für die Aufnahme von extrazellulärem Calcium zu Beginn der Kapazitation liegt bei der Plasmamembran, deren Umstrukturierung zur Folge hat, dass sich ihre Permeabilität für Ionen ändert. So stellten YANAGIMACHI und USUI (1974) bei Untersuchungen mit wechselnden Ca2+- Konzentrationen an Meerschweinchenspermien fest, dass die Änderung der Plasmamembran- permeabilität für Ca2+ ein sehr frühes Signal zur Einleitung der Akrosomenreaktion darstellt. HARRISON et al. (1993) konnten in ihren Versuchen mit Eberspermien zeigen, dass Bikarbonat einen spezifischen destabilisierenden Effekt auf die Plasmamembran hat, der zu einem Calciumeinstrom in die Spermienzelle führt.
Dieser Calciuminflux wurde mit Hilfe des calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoffs Fluo- 3 Acetomethoxyester sichtbar gemacht und hatte nach ca. 30min seinen Höhepunkt.
An Spermatozoen der Maus konnten FRASER et al. (1993) zeigen, dass vor der akrosomalen Exozytose ein Influx von Natriumionen stattfindet, der wiederum eine Reihe ionischer Veränderungen im Spermatozoon nach sich zieht. Durch diese Veränderungen werden schließlich die Calciumkanäle aktiviert.
Auch beim Einsatz von Heparin als kapazitierendem Agens kann ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration beobachtet werden (HANDROW et al. 1989).
Dieser Calciuminflux beginnt etwa nach einer Inkubationsdauer von drei Stunden und korreliert zeitlich mit einem cAMP- Anstieg und beginnenden Tyrosinphosphorylierungsaktivitäten. CORDOBA et al. (1997) konnten bei der in vitro- Kapazitation von Bullenspermien mit Hilfe von Heparin feststellen, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration bereits 15min nach Inkubationsbeginn 60% über den Ausgangswerten lag. Dieser Calciumeinstrom konnte zu 60 % mit Hilfe von Verapamil gehemmt werden. Daraus schlossen die Autoren, dass neben der Beteiligung anderer Membransysteme, der Calciuminflux hauptsächlich (60%) über
BLACKMORE und EISOLDT (1999) berichten von weiteren Mechanismen für den Calciumeinstrom. Sie stellten bei humanen Spermien einen T- Typ- Calciumkanal fest, der vermutlich durch Mannose- BSA aktiviert wird. Diese Wirkung des Mannose- BSA ist durch Mibefradil, einem spezifischen T- Typ- Calciumkanalblocker, zu blockieren. Progesteron induziert ebenfalls einen Calciumeinstrom in die Samenzelle, der nicht durch Mibefradil blockierbar ist, aktiviert also nicht den Kanal vom T- Typ. Dies ist ein Hinweis darauf, dass bei humanen Spermien mindestens zwei verschiedene Calciumkanäle existieren.
Um den intrazellulären Calciumgehalt zu untersuchen, werden calciumsensitive Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Dies sind Fluo-3 AM oder Indo-1 AM (DRAGILEVA et al. 1999; HARRISON et al. 1993; SUAREZ et al. 1993; SUAREZ u. DAI 1995). Bei Anwesenheit von extrazellulärem Calcium kann mit Hilfe des Calciumionophors A 23178 ein Influx nachgewiesen werden (FLÉCHON et al. 1986; SUAREZ et al. 1987;
ROLDAN u. HARRISON 1989). Die Existenz von Calciumkanälen kann mittels spezifischer Calciumkanalblocker nachgewiesen werden (FRASER 1993;
CORDOBA et al. 1997; BLACKMORE u. EISOLDT 1999).
Hyperaktivierung
Die Umstrukturierungen der Plasmamembran gehen mit Veränderungen im Bewegungsmuster der Spermien, einer Hyperaktivierung, einher. Dies zeigt sich in einer peitschenartigen, stark gekrümmten, asymmetrisch und weit ausladenden Bewegung des Schwanzes. Diese Biegung der Schwänze ist wesentlich stärker ausgeprägt als bei frisch ejakulierten, noch unkapazitierten Spermien (SUAREZ et al.
1992). Der Kopf zeigt eine starke Seitwärtsbewegung, das „lateral head displacement“. Aus diesem Bewegungsmuster folgt in einem Medium geringer Viskosität nur wenig Fortbewegung der Spermien. Allerdings wird durch die hyperaktivierte Bewegung die hydrodynamische Kraft vervielfacht, was zu einer kräftigeren und schnelleren Vorwärtsbewegung in viskösem Medium führt (SUAREZ et al. 1991a). Molekulare Veränderungen während der Kapazitation sind Auslöser der Hyperaktivierung. Zuerst werden blockierende oberflächenassoziierte Substanzen von der Samenzelle entfernt. Durch die Reorganisation der
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Spermienoberfläche werden Calciumkanäle geöffnet, die den Einstrom von Calciumionen ermöglichen (RINK 1977). Der cAMP- Spiegel in der Samenzelle wird durch die Aktivierung einer Ca2+- abhängigen Adenylatcyclase erhöht und ruft dann die hyperaktivierte Bewegung hervor (FENG et al. 1988). Die Calciumabhängigkeit der Hyperaktivierung konnte FRASER (1982) in Experimenten an Mausspermien nachweisen. Mit Hilfe des Calciumionophors A 23178 bei gleichzeitiger Anwesenheit von extrazellulärem Calcium konnten sie eine Hyperaktivierung bei in vitro kapazitierten Samenzellen auslösen. Dieser Effekt ist durch Zugabe von BSA rückgängig zu machen. BSA entfernt das Ionophor von den Calciumkanälen, der Influx stoppt, und die Calciumkonzentration im Zellinneren wird reduziert. Es wird angenommen, dass in diesem Stadium noch keine Membrandestabilisierungen stattgefunden haben und die Spermien zum Bewegungsmuster von epididymalen Spermatozoen zurückkehren (SUAREZ et al. 1987). Bei hyperaktivierten Spermien ist die Calciumkonzentration im Bereich des Kopfes und des Schwanzes erhöht und oszilliert abhängig von der Geißelkrümmung in diesen beiden Abschnitten (SUAREZ et al. 1993). Bei menschlichen Spermien spielt bei der Regulation der Hyperaktivierung durch Calcium eine calmodulinabhängige Proteinphosphatase eine wichtige Rolle (AHMAD et al. 1995). SI (1999) fand bei seinen Untersuchungen an Hamsterspermien, dass die Phosphorylierung eines 80- kDa Proteins essentiell für die Hyperaktivierung ist.
Die hyperaktivierte Motilität hat entscheidende Bedeutung für die Befruchtung (SUAREZ u. DEMOTT 1991) und scheint für die Penetration der Zona pellucida essentiell zu sein (SUAREZ et al. 1991a).
Vitalität
Der Kapazitationsprozess kann auch verstanden werden als eine Serie positiv destabilisierender Veränderungen, die letztendlich zum Zelltod führen. Der
„kapazitierte“ Zustand bildet in dieser voranschreitenden Destabilisierung ein Fenster, in dem die Hyperaktivierung und eine zonainduzierte Akrosomenreaktion
zunehmend destabilisierend auf die Spermienzellmembran und führen zwangsläufig zum Zelltod. Da nur intakte Membranen die Aufrechterhaltung aller Zellfunktionen gewährleisten, ist deren Integrität ein verlässliches Merkmal für die Beurteilung der Spermienvitalität (HARRISON u. VICKERS 1990).
2.2 Das Spermatozoon im weiblichen Genital
In vivo laufen die wesentlichen Schritte der Kapazitation im Eileiter ab. Dieser ist im Fortpflanzungsgeschehen von zentraler Bedeutung. Als paariges schlauchförmiges Organ stellt er die Verbindung zwischen Gebärmutter und Eierstock her. Überdies bietet er für die Eizelle, die Samenzellen und deren Verschmelzungsprodukte optimale Stoffwechselbedingungen. Er dient dem Transport der Keimzellen, der Endreifung der männlichen Samenzellen und bei einigen Tierarten, wie z. B. beim Hund, der Enddifferenzierung der weiblichen Eizelle. Das Infundibulum des Ovidukts nimmt die Eizelle auf, in der Ampulle findet anschließend die Befruchtung statt. Der kaudale Teil des Eileiteristhmus wird auch als „funktionelles Spermienreservoir“
bezeichnet (HUNTER et al. 1987) und erfüllt drei Aufgaben (SUAREZ 1998): Er dient der Erhaltung der Lebens- und Befruchtungsfähigkeit in der Zeitspanne zwischen Deckakt und Befruchtung. Der Kapazitationsprozess und die Entwicklung hyperaktivierter Motilität werden im Oviduktisthmus moduliert. Durch Bindung der Samenzellen am Eileiterepithel geschieht eine Selektion intakter Spermien, und schließlich wird einer Polyspermie vorgebeugt, indem immer nur wenige Spermien aus dem Reservoir die Ampulle, den Ort der Befruchtung, erreichen.
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2.2.1 Das Ovidukt
Anatomie des Ovidukts
Kaudal der Ovarien öffnen sich die Eileiter mit ihren Infundibula in die Bauchhöhle.
Sie verlaufen dann als enger, gewundener Schlauch in der Wand der Bursa ovarica, einer Gekrösefalte, die bei der Hündin den Eierstock taschenartig umgibt, und münden auf einer vorspringenden Papille in die Spitzen der Uterushörner ein. Bei der Hündin beträgt die Länge der Eileiter 6- 10cm, bei der Sau 19- 22cm. Der Isthmus verläuft sehr stark geschlängelt im Gekröse des Ovidukts (SCHUMMER und VOLLMERHAUS 1987).
Von außen nach innen ist die Wand des Eileiters aus folgenden Schichten aufgebaut: Der gesamte Eileiter ist von einer einschichtigen Tunica serosa überzogen, die auf der Tela subserosa aufliegt. In dieser Schicht verlaufen Blutgefäße und im Bereich des Eileiteristhmus longitudinale Muskelfasern. Darunter liegt die in den verschiedenen Abschnitten des Eileiters unterschiedlich stark ausgeprägte Muskelschicht. Die glatte Muskulatur der Ampulle und des Infundibulums ist auffallend dünn. Sie besteht aus einer inneren zirkulären Schicht und einer äußeren Schicht longitudinal oder auch spiralig schräg verlaufender Muskelfasern. Im Isthmus ist die Tunica muscularis enorm verstärkt und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Zirkulärschicht und eine zweite Schicht mit vorrangig spiraligem Verlauf aus. Unter der Muskelschicht folgt die bindegewebige Lamina propriae mucosae, der dann die Tunica mucosa als innere Schicht folgt. Diese besteht aus einem hochprismatischen Epithel, in dem zwei Zellformen unterschieden werden können: kinozilientragende Flimmerzellen und ekkrin sezernierende Drüsenzellen. Zusätzlich können noch als vermutlich inaktive Drüsenzellen sogenannte Stiftchenzellen und als Reservezellen der Basalmembran eng aufliegende Basalzellen unterschieden werden.
Um für die komplexen Aufgaben des Eileiters im Reproduktionsgeschehen ein optimales Milieu zu bieten, wird die stoffwechselaktive Oberfläche durch
werden. Die Höhe dieser Schleimhautfalten nimmt im Verlauf des enger werdenden Isthmus kontinuierlich ab, bis sie vor dem Übergang in die Uterusschleimhaut ganz verstreichen. (LIEBICH 1993b)
Die Versorgung des Eileiters mit arteriellem Blut erfolgt über Ramii tubarii, die aus der Arteria ovarica entspringen. Der Abtransport des venösen Blutes erfolgt über gleichnamige Venen. Die Endäste der A. ovarica bilden, bevor sie in das Ovar eintreten, ein kegelförmiges Gefäßkonvolut. Über diesem Plexus liegt in enger Nachbarschaft ein Geflecht der Eierstocksvenen (SCHUMMER u. VOLLMERHAUS 1987). Im Gegenstromprinzip können hier Stoffe ausgetauscht werden, indem sie entlang eines Konzentrationsgefälles diffundieren. So ist zu erklären, dass im arteriellen Blut des Eileiters 5- 10fach höhere Konzentrationen an Hormonen aus der Follikelflüssigkeit gemessen werden können als im systemischen Blut (HUNTER u.
NICHOL 1983). Durch diesen als „Counter- Current- Transfer“ bezeichneten Austausch gelangen die Hormone aus dem Eierstock in ausreichender Konzentration zum Ovidukt und können dort das Epithel und die dort gelagerten Spermatozoen beeinflussen (HUNTER et al. 1983), ohne dass systemische Wirkungen durch solch hohe Konzentrationen eintreten (KRZYMOWSKI et al. 1990). Es handelt sich dabei um die Hormone Prostaglandin, Relaxin und Oxytocin, für die im Isthmus des Ovidukts Rezeptoren nachgewiesen sind. HUNTER (1995) vermutet, dass auf diese Art das Voranschreiten des Kapazitationsprozesses dem Zeitpunkt der Ovulation zeitlich angepasst wird. Weiterhin können in Isthmus und Ampulle zyklusabhängig schwankende Konzentrationen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren in Abhängigkeit der Blutkonzentration dieser Hormone nachgewiesen werden (STANCHEV et al. 1985).
Das Oviduktepithel
Wie bereits beschrieben, setzt sich das Epithel des Eileiters hauptsächlich aus zwei verschiedenen Zelltypen zusammen. Die apikale Membran der sekretorischen Zellen ist zur Oberflächenvergrößerung in Form von Mikrovilli ausgestülpt (WEISS 1988).
Die Drüsenzellen produzieren einen schwach sauren Schleim, der Nährstoffe zur Versorgung der Keimzellen enthält. Dies sind Proteine, Zucker, Aminosäuren,
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Enzyme, Elektrolyte und Albumine (LIEBICH 1993b). Zahlreiche weitere Sekretbestandteile, wie z.B. Growth Factors und Oviduktine (WOLLENHAUPT et al.
1997) beeinflussen durch direkten Kontakt den Transport der Spermatozoen und deren Funktion (RODRIGUEZ u. KILIAN 1998). Im Eileiter entsteht durch diese Sekretion ein uteruswärts gerichteter Flüssigkeitsstrom.
Die zweite typische Zellgruppe des Oviduktepithels zeichnet sich durch Zilien und häufig auch Mikrovilli an der apikalen Membran aus. Solche Flimmerzellen kommen an Oberflächen vor, die dem Transport einer Substanz dienen (WEISS 1988). So wird der Flüssigkeitsstrom in Richtung auf den Uterus aktiv durch die rhythmische Bewegung der Kinozilien des Flimmerepithels unterstützt (LIEBICH 1993b). Diese rhythmischen Bewegungen werden vom Kinetosom der Zilie koordiniert. In diesem ist der Achsenfaden, ein mikrotubuläres Gerüst mit zwei zentralen Tubuli und neun umgebenden Tubuluspaaren, verankert. Kinozilien ragen zwischen 5- 10µm über die Zelloberfläche hinaus (LIEBICH 1993c). Sämtliche Flimmerhärchen eines Organs schlagen gleichsinnig, was zu einer wellenförmigen Bewegung über große Epithelflächen führt und einen gerichteten Sekretstrom ermöglicht (LEONHARDT 1990). Bei den meisten Säugetieren ist die Zilienbewegung von der Ampulle in Richtung auf den Isthmus des Ovidukts gerichtet (BLANDAU u. VERDUGO 1976).
Dies lässt auf eine große Bedeutung für den Transport der Eizelle, bzw. der Blastozyste, schließen (ROPERTO et al. 1991).
Beide Zelltypen unterliegen in hohem Maße zyklischen Veränderungen. Diese beinhalten zum einen strukturelle Veränderungen (WU et al. 1976) und zum anderen Änderungen der Aktivität. Im Östrus und frühen Metöstrus ist diese bei beiden am höchsten. Während des Diöstrus stoppt die Sekretion, um in der nachfolgenden Proöstrus- und Östrusphase wieder anzusteigen (STAHLHEIM et al. 1975). Was die Aktivität der Zilien anbelangt, kann z. B. für das Schwein kein Einfluss des Zyklusstandes festgestellt werden. Sie wird aber durch die Geschlechtsreife deutlich beeinflusst. So zeigen Altsauen eine höhere Zilienaktivität als präpuberale Sauen (GADDUM- ROSSE u. BLANDAU 1973).
2.2.2 Der Weg bis zum Eileiter
Für die Samenzellen beginnt der Weg durch den weiblichen Genitaltrakt abhängig von der Tierart in der Scheide oder direkt im Uterus. Der Rüde setzt die spermienreiche Phase in der Scheide vor der Zervix ab. Anschließend wird das Ejakulat mit dem Prostatasekret in den Uterus gespült (ENGLAND u. PACEY 1998).
Bis zur uterotubalen Verbindung legen die Spermien den Weg weitgehend passiv zurück. Sie werden hauptsächlich durch Kontraktionen der Uteruswand und eine daraus entstehende Sogwirkung transportiert. Dies wird durch den Deckakt ausgelöst (BAKER und DEGEN 1972; EVANS 1933). Bis zum Erreichen des Befruchtungsortes müssen die Spermien Barrieren in Form von Schleimhautfalten und Mukus überwinden. Dabei wird ihre Zahl drastisch vermindert. Von den einigen Millionen Spermien, die beim Deckakt ejakuliert werden, erreichen z. B. beim Schwein nach aktivem Überwinden der ödematisierten Schleimhautfalten der uterotubalen Verbindung nur noch einige Tausend den Oviduktisthmus. Dort verbleiben die meisten Samenzellen im Reservoir und nur wenige (ca. 102) kommen noch in der Ampulle zum Zeitpunkt der Befruchtung an (HUNTER 1988). Vermutlich handelt es sich dabei um eine Selektion befruchtungskompetenter Spermien (HUNTER 1988). Während die Samenzellen den Uterus passieren, verlieren sie weitgehend die oberflächenassoziierten Substanzen aus dem Seminalplasma, was mit den ersten Schritten der Kapazitation einhergeht (EINARSSON et al. 1980).
Im Eileiter der Sau können erste Samenzellen schon 15min nach der Bedeckung nachgewiesen werden (BAKER u. DEGEN 1972). Bei Stuten gelingt dies erst nach 2h (BADER 1982) und bei Schafen und Rindern erst 6- 8h nach der Bedeckung (HUNTER et al. 1980; HUNTER u. WILMUT 1983). Bei der Hündin konnten bereits innerhalb der ersten Minute nach der Ejakulation Spermien in der Uterushornspitze nachgewiesen werden (EVANS 1933). Bis das Ovidukt- Reservoir vollständig besiedelt ist, vergehen aber auch beim Schwein 1- 2h (HUNTER 1981).
Die Spermien, die den Eileiter erreicht haben, befinden sich in engem Kontakt zum Oviduktepithel. In dieser Phase bereiten sie sich auf die Akrosomenreaktion und das anschließende Verschmelzen mit der Eizelle vor (TÖPFER- PETERSEN et al. 1996).
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2.2.3 Das Spermienreservoir im kaudalen Oviduktisthmus
Bei zahlreichen Säugetierarten wird vor der Ovulation ein Spermienreservoir im kaudalen Oviduktisthmus etabliert. Zum Beispiel wurde dies bei Schafen (HUNTER et al. 1982), Schweinen (HUNTER 1984) und Rindern (HUNTER u. WILMUT 1984) beobachtet. Auch bei Hamstern (SMITH u. YANAGIMACHI 1991) und bei Pferden (THOMAS et al. 1994b) konnten an der apikalen Oberfläche des Epithels gebundene Spermien gefunden werden. DOAK et al. (1967) schrieben den Uterindrüsen der Hündin eine Reservoirfunktion zu. Im Bereich des Drüsenhalses fanden sie die Spermien mit ihren Köpfen parallel um einen zentralen Punkt herum angeordnet. In den ersten 24h nach dem Deckakt waren derartig besetzte Drüsen hauptsächlich im Uteruskörper zu finden, später mehr im Bereich der Uterushörner. Es ist noch nicht vollständig geklärt, in wie weit der Oviduktisthmus auch bei der Hündin Reservoirfunktion hat. ENGLAND und PACEY (1998) konnten 10 bis 12 Stunden nach dem Deckakt wenige Spermien im Eileiter nachweisen. Diese lagen entweder frei im Lumen oder waren in kleinen Gruppen an das Oviduktepithel gebunden.
Beim Schwein finden sich präovulatorisch zwischen den Schleimhautfalten des Ovidukts gehäuft Spermien mit intakter Plasmamembran, die bevorzugt an die Mikrovilli der Epithelzellen binden (HUNTER et al. 1987). Abhängig vom Aufenthaltsort der Spermien kann der Eileiter in drei unterschiedliche Kompartimente, sogenannte „microenvironments“, eingeteilt werden (SMITH u.
YANAGIMACHI 1990). Im viskösen Schleim des Lumens befinden sich nur unbewegliche oder morphologisch abweichende Spermien. Am zilienbesetzten Epithel der in Längsfalten liegenden Schleimhaut und schließlich in deren Krypten binden vitale und motile Spermatozoen.
Die Bindung an die apikale Oberfläche der Oviduktepithelzellen bildet den Hauptmechanismus für die präovulatorische Speicherung der Samenzellen im Eileiter. Daneben sind aber noch weitere Faktoren gefunden worden, die dies unterstützen. Präovulatorisch wird das Lumen des Oviduktisthmus durch einen viskösen Schleim verschlossen (HUNTER et al. 1987). Dies führt zu einer deutlich
Außerdem besteht präovulatorisch ein östrogenbedingter erhöhter Muskeltonus verbunden mit einer Ödematisierung der Schleimhaut. Dies führt zu einer
„physiologischen Striktur“ des Isthmus und damit zu einer Behinderung der Passage (HUNTER 1977; HUNTER 1995).
Nach der Ovulation nimmt der Muskeltonus ab und das Sekret verliert an Viskosität, was die Hemmung der Spermienbeweglichkeit zum Zeitpunkt der Befruchtung wieder aufhebt (HUNTER 1995).
Eine weitere Funktion des viskösen Sekrets als Lumenverschluss ist, das Eindringen von Uterussekret zu verhindern. In diesem Sekret sind bald nach der Bedeckung polymorphkernige Leukozyten enthalten mit der Aufgabe, die Fremdkörper darstellenden Spermienzellen zu phagozytieren. Aufgrund des Mukuspfropfens im Oviduktlumen können diese nicht einwandern.
Weitere regionale Besonderheiten, die zur Ausbildung des Reservoirs beitragen, sind unter anderem unterschiedliche Lactat- und Glucosekonzentrationen in Isthmus und Ampulle, die sich postovulatorisch angleichen (NICHOL et al. 1992). Außerdem besteht präovulatorisch ein Temperaturunterschied von ca. 0,75°C zwischen diesen beiden Eileiterregionen (HUNTER u. NICHOL 1986). Die geringere Temperatur im Isthmus lässt sich durch regionale Unterschiede in der Blut- und Lymphversorgung und der Aktivität der Eileitermuskulatur erklären. Diese Temperaturdifferenz beeinflusst die Strukturproteine der Samenzellen direkt (HUNTER u. NICHOL 1986) und gleicht sich kurz vor der Ovulation wieder aus. Beides, Ionen- und Temperaturveränderungen, können die Spermienmotilität beeinflussen.
Für das Erhalten der Spermienvitalität ist die Bindung der Spermatozoen an das Epithel im Eileiter ein entscheidender Faktor (SMITH u. YANAGIMACHI 1990;
SUAREZ et al. 1991b; HUNTER 1995). Die Lebensdauer, gemessen an der Motilität, der gebundenen Spermien wird im Vergleich zu der ungebundener Samenzellen verlängert (SMITH u. YANAGIMACHI 1990).
Dies ist insbesondere für solche Tierarten von Bedeutung, bei denen zwischen Brunstbeginn und Ovulation ein Zeitraum von mehreren Tagen liegen kann.
Beispielsweise bei der Sau sind noch 36 Stunden nach dem Deckakt vitale Spermien im Ovidukt nachzuweisen (HUNTER 1984).
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In der Zeit vor der Ovulation bleiben die Plasmamembranen der epithelgebundenen Spermien intakt (RODRIGUEZ- MARTINEZ et al. 1990; MBURU et al. 1997), während die im Lumen liegenden Spermien schon deutliche alterungsbedingte Membranveränderungen aufweisen. Bei der Maus konnte gezeigt werden, dass die Akrosomen gebundener Zellen durchweg intakt sind, während die der ungebundenen häufig akrosomale Schwellungen oder Auflösungen zeigten (ESPONDA u. MORENO 1998). Nach der Ovulation sind auch bei den gebundenen Samenzellen Membranveränderungen zu finden, die auf eine Akrosomenreaktion hindeuten (MBURU et al. 1997). Was die Integrität der Plasmamembranen betrifft, konnte beim Rind gezeigt werden, dass vor der Ovulation die Mehrheit der im Isthmus gespeicherten Samenzellen membranintakt sind, wohingegen postovulatorisch der Anteil an Zellen mit Membrandefekten steigt (HUNTER et al. 1991).
2.2.4 Kapazitation in vivo
Im kaudalen Isthmus erfolgt eine präovulatorische Speicherung von Samenzellen mit herabgesetzter Motilität und stabilen Plasmamembranen, die sich wahrscheinlich in einem „präkapazitierten“ Zustand befinden (HUNTER et al. 1987). In diesem Abschnitt des Eileiters findet dann der letztendlich zur Befruchtungsfähigkeit führende Kapazitationsprozess statt.
Die Spermienbindung an das Eileiterepithel spielt nicht nur wie bereits beschrieben für die Aufrechterhaltung der Vitalität eine bedeutende Rolle, sondern auch für den Ablauf der Kapazitation. Einen Hinweis auf einen derartigen Einfluss des Oviduktisthmus bieten die Ergebnisse von HUNTER et al. (1998). Sie konnten bei chirurgisch in den Eileiter besamten Jungsauen zeigen, dass Spermien, die um die Ovulation herum in den Isthmus eingeführt wurden, ein bis zwei Stunden früher befruchtungsfähig waren als die, die gleichzeitig in die Ampulle eingebracht wurden.
SMITH u. YANAGIMACHI (1991) stellten beim Hamster und FAZELI et al. (1999) beim Schwein fest, dass nur unkapazitierte Samenzellen an der Oviduktschleimhaut binden, während die kapazitierten sich wieder lösen. Durch die Bindung am
einhergehenden Veränderungen der Spermienoberfläche für die Aufhebung der Bindung verantwortlich zu sein (SMITH u. YANAGIMACHI 1991). Kapazitation und Hyperaktivierung stehen in einem engen zeitlichen Zusammenhang zur Ovulation.
Bis kurz vor dem Eisprung werden die Samenzellen im Eileiter festgehalten. Die bevorstehende Ovulation bewirkt eine epitheliale Sekretion, die die Spermienkapazitation fördert (KERVANCIOGLU et al. 1994). MAHMOUD u.
PARRISH (1996) konnten für Bullenspermien zeigen, dass lösliche Faktoren aus dem Eileiter die Kapazitation beschleunigen können. Die durch die damit einhergehenden Membranveränderungen verminderte Bindungsaffinität (DEMOTT u.
SUAREZ 1992) kombiniert mit den kräftigeren Bewegungen des hyperaktivierten Spermiums führt schließlich zur Lösung vom Epithel (SUAREZ et al. 1991a). Zu Beginn dieser Phase lösen sich die Spermien vom Epithel, schwimmen eine kurze Strecke in Richtung Ampulle und heften sich wieder an (DEMOTT u. SUAREZ 1992).
Solche Spermien, die schon vor der Ovulation ohne zwischenzeitlichen Epithelkontakt freigesetzt werden, sind nicht mehr befruchtungsfähig (HUNTER 1995). Um die Lebens- und Bindungsfähigkeit zu erhalten, darf die Lösungsphase also nur sehr kurz sein (MBURU et al. 1997). Die losgelösten Samenzellen sind hyperaktiviert und können schneller durch das visköse Sekret zur Ampulle gelangen als nicht aktivierte Spermien (SHALGI et al. 1992; DEMOTT u. SUAREZ 1992).
Transluminale Untersuchungen an Hamstereileitern erbrachten die Erkenntnis, dass hyperaktivierte Spermien gegenüber nicht hyperaktivierten Spermien einen mechanischen Vorteil im viskösen Sekret des Eileiters haben (SUAREZ u. DEMOTT 1991). Sie können viskoelastisches Material effektiver durchdringen als nicht aktivierte Samenzellen (SUAREZ u. DAI 1992).
Mit der beginnenden Lösung der Spermien vom Epithel ändert sich periovulatorisch die Verteilung der Spermatozoen im Isthmus. Die Anzahl der Spermien im Lumen sowie im kranialen Teil des Isthmus und in der Ampulle nimmt zu (MBURU et al.
1996; 1997).
Auch HUNTER (1995) vermutet, dass Kapazitation und Ovulation über das hormonell beeinflusste Oviduktepithel zeitlich koordiniert werden. Unmittelbar vor der Ovulation steigt die Progesteronsekretion des reifen Graafschen Follikels an. Dies
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führt zu einer Abnahme des Muskeltonus, das Schleimhautödem im Isthmus geht zurück und das Lumen wird dadurch erweitert. Damit wird das Vorwärtskommen der Spermienzellen in Richtung Befruchtungsort erleichtert (HUNTER 1977). Grundlage für diese hormonelle Regulation der Aktivierung und Lösung der Samenzellen aus dem Reservoir bildet laut HUNTER (1997) der „Counter- Current- Transfer“, wie er bereits in 2.2.1 beschrieben wurde. Daneben erreichen auch in geringeren Konzentrationen Hormone aus dem systemischen Kreislauf das Oviduktgewebe. Der Progesteroneinfluss auf das Epithel vermittelt dann schließlich die Lösung der Spermatozoen. Zusätzlich erleichtert ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration bei den gebundenen Spermien die Ablösung vom Epithel (HUNTER et al. 1999).
2.3 In- vitro- Systeme zur Untersuchung der Spermienbindung an das Oviduktepithel
Um die Bindung der Spermatozoen an das Eileiterepithel detailliert untersuchen zu können, werden In- vitro- Systeme eingesetzt. Als Untersuchungssysteme werden unter anderem Zellkulturen und Explante, die aus Oviduktepithel erstellt werden, benutzt.
2.3.1 Oviduktepithelzellkulturen
Unter dem Begriff Zellkulturen versteht man eine Form der Haltung und Kultivierung von Zellen in vitro. Die Zellen befinden sich dann nicht mehr in einem organisierten Gewebeverband (SCHAEFFER 1990).
Um die notwendigen Oviduktepithelzellen zu gewinnen, verwendet man bei den Nutztierarten gewöhnlich Schlachthofmaterial (Rind: JOSHI 1988; Schwein:
BOERJAN et al. 1993; Schaf: GUTIERREZ et al. 1993; WATSON et al. 1994; Pferd:
LEFEBVRE u. SAMPER 1993). Es kommt aber auch laparatomisch entnommenes Material zum Einsatz wie z. B. beim Hund (ELLINGTON et al. 1995). Die Zellen werden dann entweder enzymatisch oder mechanisch gewonnen. Die enzymatische Ablösung der Zellen kann mit Hilfe von Trypsin (GUTIERREZ et al. 1993; WATSON et al. 1994) oder Kollagenase (JOSHI 1988) erfolgen. Um eine Schädigung der Oviduktepithelzellen zu vermeiden, müssen diese Reaktionen durch Serumzugabe gestoppt werden. Die mechanische Zellgewinnung kann durch Spülung der Eileiter mit einer Salzlösung erfolgen (ELLINGTON et al. 1990, 1995). Andere Methoden sind das Ausschaben des geöffneten Eileiters mit einer Skalpellklinge (BOERJAN et al. 1993; GUTIERREZ et al. 1993) oder das vorsichtige Ausstreifen des Ovidukts mit Hilfe einer Pinzette (LEFEBVRE u. SAMPER 1993). Die so gewonnenen Zellen werden aufbereitet und in einem Kulturmedium über mehrere Tage inkubiert. Das Zellwachstum zeigt eine charakteristische Wirbelform (BOERJAN et al. 1993) und bildet nach 4- 7 Tagen eine konfluente Monolayer (ELLINGTON et al. 1990;
BOERJAN et al. 1993; GUTIERREZ et al. 1993).
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2.3.2 Oviduktepithelzellexplante
Ein Explant ist ein Gewebestück, das aus dem ursprünglichen Gewebe entnommen wurde und zur Erhaltung oder Kultivierung in ein künstliches Medium verbracht wird (SCHAEFFER 1990). Als Ausgangsmaterial dienen ebenfalls meist Schlachthoforgane, es werden aber auch Organe chirurgisch entnommen (Schwein:
RAYCHOUDHURY u. SUAREZ 1991; SUAREZ et al. 1991b; Hund: PACEY et al.
2000; KAWAKAMI et al. 2001). Mit Hilfe mikrochirurgischer Instrumente werden aus dem eröffneten Eileiter 0,5- 1mm2 große Epithelstückchen herausgeschnitten (RAYCHOUDHURY u. SUAREZ 1991; SUAREZ et al. 1991b). Nach Eröffnen des Eileiters können die Epithelzellen auch von der bindegewebigen Unterlage abgeschabt werden (KAWAKAMI et al 2001) und diese Stücke dann noch in kleinere Teilchen geschnitten werden (PACEY et al. 2000). Beim Rind werden durch Ausstreifen des Eileiters bläschenförmige Zellaggregate gewonnen, deren äußere Oberfläche wie die oben beschriebenen Explante eingesetzt werden kann (LEFEBVRE u. SUAREZ 1996). Explante können außer zur direkten Verwendung im Versuch (SUAREZ et al. 1991b; PETRUNKINA et al. 2001b; PACEY et al. 2000;
KAWAKAMI et al. 2001) auch zur Züchtung einer Zellkultur eingesetzt werden (RAYCHOUDHURY u. SUAREZ 1991).
2.4 Koinkubation von Oviduktepithelzellen mit Spermatozoen
Um beobachten zu können, in welcher Art und Weise Spermatozoen durch die Bindung an das Eileiterepithel beeinflusst werden, koinkubiert man diese beiden Komponenten in vitro. Unter Kapazitationsbedingungen können die Vitalität, die Entwicklung der Motilität, die verschiedenen Teilprozesse der Kapazitation und die Bindungs- und Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen untersucht werden. Aus den Ergebnissen kann dann auf die Situation in vivo geschlossen werden.
2.4.1 Bindung der Spermien an das Oviduktepithel
Die Bindung der Spermien erfolgt rostral mit intaktem Akrosom an die Zilien und Mikrovilli. Bei Samenzellen, die nach dreißig Minuten Koinkubation nicht an die Oviduktepithelzellkulturen gebunden haben, geht man davon aus, dass sie zum großen Teil beschädigt sind (ELLINGTON et al. 1993a). Vermutlich spielt das Oviduktepithel hier eine Rolle hinsichtlich der Selektion intakter Spermatozoen.
Bullenspermien heften sich bevorzugt zwischen zwei Zellen so an, dass sie von den Zilien bedeckt scheinen (POLLARD et al. 1991). Canine Spermien heften sich bevorzugt in den kryptenartigen Spalten innerhalb der Epitheloberfläche an (ENGLAND u. PACEY 1998). Spermatozoen von Hengsten nehmen ebenfalls engen Kontakt zum Epithel auf, der über Mikrovilli und Sekretionsprodukte vermittelt wird.
Sie binden dabei an beide Zelltypen des Eileiters (THOMAS et al. 1994a).
Eberspermien hingegen binden nur an zilientragende Zellen (SUAREZ et al. 1991b).
ELLINGTON et al. (1991) zeigten bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen an Bullenspermien, dass die in- vitro- Bindung wesentlich mit der in- vivo- Situation übereinstimmt. Dabei liegen für das Ausmaß der Bindungsaffinität gewisse regionale Unterschiede vor. So binden Eberspermien laut RAYCHOUDHURY u. SUAREZ (1991) in höherem Maße an Epithelzellen aus dem Isthmus als an ampulläre Oviduktepithelzellen. PETRUNKINA et al. (2001b) fanden allerdings beim Schwein keinen Einfluss der Herkunftsregion der Oviduktepithelzellen und des Zyklusstandes des Spendertieres auf die initiale Spermienbindung. Eine Abhängigkeit der Bindungsaffinität von der Herkunftsregion der Oviduktepithelzellen kann auch bei Hengstspermien beobachtet werden. Sie binden ebenfalls besser an Zellen aus dem Isthmus (THOMAS et al. 1994a). Nur für bovine Spermatozoen konnte dies nicht festgestellt werden (LEFEBVRE et al. 1995a). Weiterhin spielen zyklusbedingte hormonelle Einflüsse eine Rolle beim Ausmaß der Epithelbindung. Eberspermien binden bei Vorliegen östrischer Hormonkonzentrationen in größerer Zahl am Epithel als in Abwesenheit von Steroidhormonen (RAYCHOUDHURY u. SUAREZ 1991).
Auch equine Spermien zeigen eine größere Bindungsaffinität an Oviduktepithelzellen, die während der follikulären oder kurz postovulatorischen Phase gewonnen wurden (THOMAS et al. 1994a). Bei der Koinkubation von
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Explanten aus bovinem, bzw. porcinem Eileiterepithel verschiedener Zyklusabschnitte mit den entsprechenden Spermien konnte allerdings kein Einfluss des Zyklustages auf die Bindungsaffinität der Samenzellen festgestellt werden (SUAREZ et al. 1991b; LEFEBVRE et al. 1995a).
2.4.2 Einfluss auf Motilität und Vitalität
Die Koinkubation von Spermien mit Oviduktepithelzellen verlängert ihre Lebensdauer und damit die Aufrechterhaltung der Motilität erheblich im Vergleich zur alleinigen Inkubation in Medium. Ebersamenzellen (SUAREZ et al. 1991b), Schafspermatozoen (GUTIERREZ et al. 1993) und Bullenspermien (POLLARD et al. 1991) bleiben bei der Koinkubation mit Oviduktepithelzellen länger motil als ohne Epithelkontakt. Dabei zeigten CHIAN u. SIRARD (1995), dass bovine Spermatozoen, die an Zellkulturen des Isthmus oder des gesamten Eileiters gebunden sind, nach 48 Stunden eine ausgeprägtere Beweglichkeit besitzen als solche, die mit Kulturen rein ampullärer Herkunft koinkubiert wurden. Dies gilt auch für Bullenspermien, die in Kontakt zu Oviduktepithelzellkulturen stehen, die mit 17β- Östradiol vorbehandelt wurden (BOQUEST u. SUMMERS 1999). THOMAS et al. (1994b) konnten auch bei equinen Samenzellen eine positive Beeinflussung der Motilität feststellen, die zudem abhängig vom Zyklusstand des Oviduktepithels variiert. Spermien, die an Epithel aus der follikulären Phase binden, zeigen in den ersten 24 Stunden intensivere Beweglichkeit als Spermien, die in Kontakt zu postovulatorischem oder interöstrischem Epithel stehen. Zudem bleiben mit Oviduktepithelzellkulturen koinkubierte Hengstspermien, im Gegensatz zu lediglich in Medium inkubierten mit einer Lebensfähigkeit von weniger als 24 Stunden, bis zu 4Tage motil und vital (ELLINGTON et al. 1993b). Die gebundenen Spermatozoen weisen einen deutlich höheren Anteil an motilen und vitalen Zellen auf als die Spermien der ursprünglich zur Kultur gegebenen Population (THOMAS et al. 1994b). Ein derartiger Effekt kann auch bei der Koinkubation von humanen Spermien mit Oviduktepithelzellkulturen beobachtet werden. So zeigen die ungebundenen Spermien eine schlechtere
eine Aufrechterhaltung der Motilität und Vitalität beobachtet werden. Dabei waren am sechsten Tag der Koinkubation mit Oviduktepithelzellkulturen noch 10% der Spermien beweglich. Hundesamenzellen, die lediglich in Medium inkubiert wurden, büßten hingegen nach bereits 24 Stunden deutlich an Bewegungsaktivität ein und waren nach 36 Stunden vollkommen bewegungslos (ELLINGTON et al. 1995). Aus den dargestellten Beobachtungen lässt sich schließen, dass die Bindung am Eileiterepithel einen Mechanismus zur Selektion vitaler und motiler Samenzellen bildet.
2.4.3 Einfluss auf die Kapazitation
Während die Samenzellen mit dem Eileiterepithel in Kontakt stehen, wird die Kapazitation zunächst unterdrückt oder zumindest verlangsamt (SMITH 1998). Erst nach einiger Zeit lösen sich die Spermien aus der Bindung. Andere Untersucher konnten beobachten, dass der Kapazitationsprozess durch die Koinkubation mit Oviduktepithelzellen induziert werden kann (BOICE et al. 1990; ELLINGTON et al.
1993a; CHIAN u. SIRARD 1995; FAZELI et al. 1999). Bei Bullenspermien wurde nicht nur eine Zunahme akrosomenreagierter Zellen festgestellt, sondern auch die Auslösung hyperaktivierter Bewegung (ELLINGTON et al. 1991). Bei Eberspermien kann bei Kontakt mit Oviduktepithelzellen akrosomale Exozytose beobachtet werden (GUTIERREZ et al. 1993). Dabei waren die Ergebnisse aus der Koinkubation von porcinen Samenzellen mit homologen und mit Hamsteroviduktepithelzellen vergleichbar. Bei der Inkubation von bovinen Samenzellen in einem konditionierten Medium- d. i. ein Medium, das zuvor mit Oviduktepithelzellen vorinkubiert wurde, diese dann aber nicht mehr enthält- steigt der Anteil an Spermien, die zur Fusion mit der Eizelle fähig sind (CHIAN u. SIRARD 1995). MAHMOUD und PARRISH (1996) konnten zeigen, dass mit Hilfe von Oviduktsekret kapazitierte Spermien ähnliche Oberflächenveränderungen zeigen wie beim Zusatz von Heparin zum Medium. Den kapazitierenden Effekt eines konditionierten Mediums, bzw. der Koinkubation mit Oviduktepithelzellen, konnten YAO et al. (1999) auch für humane Spermien nachweisen. Eine ähnliche Beobachtung wurde von PETRUNKINA et al. (2001a) gemacht: Während der dreistündigen Koinkubationszeit von Eberspermien mit
