Tierärztliche Hochschule Hannover
Etablierung eines kompetitiven Ovidukt-Explant- Assays zur Bestimmung der
Eileiterbindungsfähigkeit konservierter Eberspermien in vitro
INAUGURAL–DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Benita Grünther
aus Essen
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med.vet. Dagmar Waberski
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken/
Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorik
Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. med.vet. Dagmar Waberski
2. Gutachter: PD Dr. Maike Heppelmann
Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2017
meiner Mutter meinem Vater meiner Schwester
meiner Oma meinem Stiefvater
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Das porcine Spermienreservoir im weiblichen Genitaltrakt 2
2.1.1 Bedeutung 2
2.1.2 Mechanismen der Etablierung 3
2.2 Spermien-Eileiter-Bindung in vitro 7
2.2.1 Methoden 7
2.2.2 Detektion von gebundenen Spermien in Eileiterbindungsassays 10
2.3 Fluoreszenzmarkierung von Spermien mit Hoechst 33342 und MitoTracker® 12 2.4 Kälteschock bei Eberspermien 14
3 Material und Methoden 17
3.1 Verbrauchsmaterialien und Geräte 17
3.2 Chemikalien und Lösungen 17
3.3 Tiere und Organe 17
3.3.1 Eber und Samengewinnung 17
3.3.2 Untersuchung des Nativspermas 18
3.3.3 Ovidukt-Explant-Assay 19
3.3.3.1 Herkunft und Gewinnung der Eileiter 19
3.3.3.2 Präparation der Oviduktexplante 19
3.3.3.3 Durchführung 20
3.3.3.4 Auswertung 21
3.4 Versuche mit einem Ovidukt-Explant-Assay 24
3.4.1 Versuchsteil 1: Etablierung des kompetitiven Ovidukt-Explant-Assays 24
3.4.1.1 Versuch 1.1: Einfluss einer Hoechst 33342-Färbung und des Zusatzes von Seminalplasma auf spermatologische Parameter
und Bindungsfähigkeit von Eberspermien 24
3.4.1.2 Versuch 1.2: Einfluss einer Färbung mit MitoTracker® auf spermatologische Parameter 31
3.4.1.3 Versuch 1.3: Einfluss der Koinkubationsdauer von Eberspermien und Explanten auf die Bindungsfähigkeit und –verhältnisse 34
3.4.2 Versuchsteil 2: Bindung im kompetitiven Ovidukt-Explant-Assay und spermatologische Parameter hypotherm gelagerter Eberspermien 37
3.4.2.1 Versuch 2.1: Bindungsfähigkeit und spermatologische Parameter von Eberspermien nach 5°C und 17°C Lagerung für 24 Stunden 37
3.4.2.2 Versuch 2.2: Bindungsfähigkeit und spermatologische Parameter von Eberspermien nach 5°C und 17°C Lagerung für 72 Stunden 42
3.4.2.3 Versuch 2.3: Bindungsfähigkeit und spermatologische Parameter von Eberspermien nach 5°C und 17°C Lagerung für 72 Stunden mit Vorinkubation der Spermien 43
3.4.3 Versuchsteil 3: Fixation der Oviduktexplante nach Spermienbindung 44 3.5 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA) 47
3.5.1 Testprinzip 47
3.5.2 Gerät und Software 47
3.5.3 Messung 49
3.6 Durchflusszytometrie 50
3.6.1 Membranintegrität 50
3.6.1.1 Testprinzip 50
3.6.1.2 Gerät und Farbstoffe 50
3.6.1.3 Grundeinstellungen 51
3.6.1.4 Messung und Auswertung 52
3.6.2 Reaktivität auf Bikarbonat 54
3.6.2.1 Testprinzip 54
3.6.2.2 Gerät und Farbstoffe 54
3.6.2.3 Vorbereitung der Medien und Spermien 54
3.6.2.4 Messung und Auswertung 55
3.6.3 Mitochondrienmembranpotential 57
3.6.3.1 Testprinzip 57
3.6.3.2 Gerät und Farbstoffe 58
3.6.3.3 Grundeinstellungen 58
3.6.3.4 Messung und Auswertung 60
3.6.4 Spermienchromatinstabilität 61
3.6.4.1 Testprinzip 61
3.6.4.2 Gerät und Farbstoff 62
3.6.4.3 Probenfixierung und Lagerung 62
3.6.4.4 Messung und Auswertung 63
3.7 Statistische Auswertung 64
4 Ergebnisse 66
4.1 Etablierung des kompetitiven Ovidukt-Explant-Assays 66
4.1.1 Versuch 1.1: Einfluss einer Hoechst 33342-Färbung und des Zusatzes von Seminalplasma auf spermatologische Parameter und Bindungsfähigkeit von Eberspermien 66
4.1.1.1 CASA-Motilitätsparameter 66
4.1.1.2 Membranintegrität 68
4.1.1.3 Bindungsindices 69
4.1.2 Versuch 1.2: Einfluss einer Färbung mit MitoTracker® auf spermatologische Parameter von Eberspermien 72
4.1.2.1 CASA-Motilitätsparameter 72
4.1.2.2 Membranintegrität 73
4.1.3 Versuch 1.3: Einfluss der Koinkubationsdauer von Eberspermien und Explanten auf die Bindungsfähigkeit und -verhältnisse 74
4.1.3.1 CASA-Motilitätsparameter 74
4.1.3.2 Membranintegrität 74
4.1.3.3 Bindungsindices 74
4.2 Lagerung von Eberspermien bei 5°C 78
4.2.1 Versuch 2.1: Bindungsfähigkeit und spermatologische Parameter von Eberspermien nach 5°C und 17°C Lagerung für 24 Stunden 78
4.2.1.1 CASA-Motilitätsparameter 78
4.2.1.2 Membranintegrität 84
4.2.1.3 Reaktivität auf Bikarbonat 86
4.2.1.4 Mitochondrienmembranpotential 87
4.2.1.5 Spermienchromatinstabilität 88
4.2.1.6 Akrosomintegrität (Mikroskopie) 89
4.2.1.7 Bindungsindices und Bindungsverhältnis 90
4.2.2 Versuch 2.2: Bindungsfähigkeit und spermatologische Parameter von Eberspermien nach 5°C und 17°C Lagerung für 72 Stunden 92
4.2.2.1 CASA-Motilitätsparameter 92
4.2.2.2 Membranintegrität 93
4.2.2.3 Reaktivität auf Bikarbonat 95
4.2.2.4 Akrosomintegrität (Mikroskopie) 96
4.2.2.5 Bindungsindices und Bindungsverhältnis 97
4.2.3 Versuch 2.3: Bindungsfähigkeit und spermatologische Parameter von Eberspermien nach 5°C und 17°C Lagerung für 72 Stunden mit Vorinkubation der Spermien 99
4.2.3.1 CASA-Motilitätsparameter 99
4.2.3.2 Membranintegrität 104
4.2.3.3 Bindungsindices und Bindungsverhältnis 105
4.3 Versuchsteil 3: Fixation der Oviduktexplante nach Spermienbindung 107
4.3.1 CASA-Motilitätsparameter 107
4.3.2 Membranintegrität 108
4.3.3 Ausbleicheffekt 109
5 Diskussion 111
6 Zusammenfassung 117
7 Summary 119
8 Literaturverzeichnis 121
9 Anhang 130
9.1 Tabellen und Grafiken 130
9.2 Chemikalien 146
9.3 Rezepte 150
9.3.1 Androhep ohne EDTA 150
9.3.2 Formolzitrat 150
9.3.3 HBS (HEPES-gepufferte Salzlösung) 151
9.3.4 Tyrode basierte Medien 152
9.3.4.1 Herstellung der Stammlösungen 152
9.3.4.2 Herstellung der TyrBikCa-Vormischung 152
9.3.4.3 Herstellung der TyrCa-Vormischung 153
9.3.4.4 Komplettierung der Tyrode-Medien 153
9.3.5 Percoll 154
9.3.5.1 zehnfach konzentrierte HBS-Stammlösung 154
9.3.5.2 Herstellung der Lösung 1 (L1) 154
9.3.5.3 Herstellung der Lösung 2 (L2) 155
9.3.5.4 Berechnung der Zugabemasse von Percoll® zu L2 155
9.3.5.5 Herstellung der 20%-igen Percoll®-Waschlösung 156
9.3.6 MitoTracker® Green FM 157
9.3.7 MitoTracker® Red FM 157
9.3.8 Hoechst 33342 (300 µg/ml) 157
9.3.9 Phosphat-buffered Saline (PBS) 158
9.3.9.1 Herstellung einer zehnfach konzentrierten PBS-Lösung 158
9.3.9.2 Herstellung der PBS-Lösung 158
9.3.10 Mowiol 159
9.3.11 n-Propylgallat 159
9.3.12 Medien für den 160
9.3.12.1Herstellung der Stammlösungen 160
9.3.12.2Herstellung der Gebrauchslösungen 161
9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien 162
10 Abbildungsverzeichnis 168
11 Tabellenverzeichnis 174
Danksagung 177
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ALH gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn (amplitude of lateral head-displacement)
AO Acridinorange
BCF Frequenz des Kreuzens der gewundenen Bahn mit der gemittelten Bahn (beat cross frequency)
BI Bindungsindex
BTS Beltsville Thawing Solution BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
CaCl2 Calcium-Dichlorid
CASA computerassistierte Spermienanalyse
cm Zentimeter
DAP Länge der gemittelten Bahn (distance average path) DCL Länge der gewundenen Bahn (distance curvilinear line) DFI DNA-Fragmentationsindex
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxy ribonucleic acid)
Dr. Doktor
DSL Länge der direkten Strecke (distance straight line) einschl. einschließlich
et al. et alii
EDTA Ethylendiamintetraacetat EFI extended focus image
Fa. Firma
FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL 1 – 4 Filter Nummer 1 bis 4
FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter)
g Erdbeschleunigung (gravitational acceleration)
h Stunde (hora)
HBS HEPES-buffered saline
HDS hohe DNA-Anfärbbarkeit (high DNA stainability)
Hz Hertz
IVF in vitro Fertilisation
JC-1 5,5’,6,6’-Tetrachloro-1,1’,3,3’-
tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide
KCl Kaliumchlorid
kg Kilogramm
KH2PO4 Kalium-Dihydrogen-Phosphat
KOH Kaliumhydroxid
LIN Linearität (linearity)
µl Mikroliter
µm Mikrometer
M Mol
mAH modifizierter, EDTA-freier Androhep-Verdünner MAS morphologisch abweichende Spermien
mg Milligramm
MgSO4 Magnesiumsulfat
min Minute
Mio Millionen
ml Milliliter
mmol Millimol
MMP Mitochondrienmembranpotential mOsmol Milliosmol
MT MitoTracker®
MW Mittelwert
n Probandenzahl (numerus)
NaCl Natriumchlorid
NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat
NaH2PO4*2H2O Natrium-Dihydrogenphosphat-Dihydrat
nm Nanometer
OEA Ovidukt-Explant-Assay
p Irrtumswahrscheinlichkeit (probability) PBS Phosphat-buffered Saline
PI Propidiumiodid
PNA peanut agglutinin, Lektin der Erdnuss (arachis hypogea)
Prof. Professor
progr. progressiv
RN Range
s. siehe
SCSA Spermien-Chromatinstruktur-Assay
SD Standardabweichung (standard deviation)
SGZ Spermiengesamtzahl
SSC Seitwärtsstreulicht (side scatter)
STR straightness
Tab. Tabelle
Tyr Tyrode
u.a. unter anderem
UTV uterotubale Verbindung
V Volumen
VAP Geschwindigkeit auf der gemittelten Bahn (velocity average path) VCL Geschwindigkeit auf der gewundenen Bahn (velocity curvilinear
line)
VSL Geschwindigkeit auf der direkten Strecke (velocity straight line)
WOB wobble
z.B. zum Beispiel
ZDS Zentralverband der deutschen Schweineproduktion
1
1 Einleitung
Die Verbesserung von Konservierungsverfahren für Eberspermien erfordert eine sensitive Diagnostik der Spermaqualität. Dies ist mit konventionellen spermatologischen Methoden zur Bestimmung von Motilität, Morphologie und Membranintegrität nicht ausreichend möglich. Daher stehen funktionelle Assays im Fokus, die relevante Eigenschaften von Spermien in der Befruchtungskaskade erfassen. Eine bewährte Untersuchungstechnik ist der Ovidukt-Explant-Assay (OEA), der die Bindungsfähigkeit von Spermien an Eileiterepithelzellen in vitro erfasst (SUAREZ et al. 1991; WABERSKI et al. 2005). Diese Eigenschaft gilt als essentiell für die Etablierung des Spermienreservoirs im kaudalen Eileiteristhmus (HUNTER 1984). Als ex vivo-System simuliert der OEA die in vivo-Situation eher als klassische Zellkulturen, hat jedoch den Nachteil, dass er durch die Verwendung von Eileiterexplanten unterschiedlicher Sauen schwer zu standardisieren ist.
Ziel der vorliegenden Studie war es daher, eine höhere Standardisierung des OEA zu erreichen und den modifizierten Assay zum Vergleich zweier unterschiedlicher Konservierungsverfahren bei Ebersperma zu testen. Dazu wurde ein kompetitiver Ansatz gewählt, bei dem Spermien unterschiedlich konservierter Proben differentiell markiert und simultan mit identischen Oviduktexplanten koinkubiert wurden. Mit Hilfe des kompetitiven OEAs sollte schließlich die Bindungsfähigkeit von hypotherm (5°C) im Vergleich zu konventionell (17°C) gelagerten Eberspermien bestimmt werden und die Aussage in Beziehung zu standardspermatologischen Testergebnissen gesetzt werden.
2
2 Literaturübersicht
2.1 Das porcine Spermienreservoir im weiblichen Genitaltrakt
2.1.1 Bedeutung
Nach der Insemination gelangt eine Subpopulation motiler und morphologisch intakter Spermien durch den Uterus und die uterotubale Verbindung (UVT) in den Eileiter. Im porcinen Isthmus findet eine fortschreitende Kolonisierung von Spermien statt, so dass sich innerhalb der ersten beiden Stunden nach der Insemination eine adäquate Population etabliert hat (HUNTER 1981). Die Akkumulation der Spermien erfolgt hauptsächlich in den kaudalen zwei cm des Isthmus (HUNTER 1984) und geschieht präovulatorisch (HUNTER et al. 1987).
Die Hauptfunktionen des Spermienreservoirs sind (SUAREZ 1997; SCOTT 2000):
- Aufrechterhaltung der Befruchtungskompetenz - Regulation der Kapazitation
- Kontrolle des Spermientransportes
Im unteren Oviduktisthmus sowie in der UTV überleben einzelne, porcine Spermien in vitro bis zu 72 Stunden nach der Insemination (HUNTER 1988). Der optimale Zeitpunkt für die Insemination und damit für die Überlebensfähigkeit einer ausreichend hohen Anzahl von Spermien im Spermienreservoir ist für flüssigkonservierte Spermien bis zu 12 Stunden und für tiefgefrorene Spermien bis zu 4 Stunden vor der Ovulation (WABERSKI et al. 1994). In diesen Zeiträumen wurden maximale Befruchtungsraten und normal entwickelte Embryonen erzielt. In einer anderen Studie konnte unter Feldbedingungen gezeigt werden, dass eine Insemination bis zu 24 Stunden vor der Ovulation gute Befruchtungserfolge bringt (SOEDE et al. 1995). Die Aufrechterhaltung der Befruchtungskompetenz wird durch einen cross talk (FAZELI u. HOLT 2016) zwischen den Spermien und dem Eileiterepithel vermittelt. So konnte gezeigt werden, dass in vitro mit Eileiterepithel inkubierte porcine Spermien länger befruchtungskompetent blieben als Spermien, die zur Kontrolle nur im Medium inkubiert wurden (SUAREZ et al. 1991; GUALTIERI u.
TALEVI 2000). Ein wesentlicher Mechanismus zur Aufrechterhaltung der
3
Befruchtungskompetenz im Spermienreservoir ist die Verhinderung einer frühzeitigen Kapazitation.
Die Regulation der Kapazitation ist notwendig, um die Spermienfunktion mit dem Zeitpunkt der Ovulation zu synchronisieren. Als Kapazitation werden die funktionellen Änderungen bezeichnet, die Spermien durchlaufen, um fähig zu sein, bei Kontakt mit der Zona pellucida der Oozyte mit der Akrosomreaktion zu reagieren. Frühzeitige Kapazitation führt zu einer Destabilisierung der Plasmamembran und nachfolgend zum Zelltod.
Die Kontrolle des Spermientransportes zur Ampulle, dem Ort der Befruchtung, hat Bedeutung für die zeitgerechte Ankunft der Spermien sowie für den Schutz vor Polyspermie. In einer Studie von HUNTER (1984) gab es Hinweise darauf, dass der Eileiter eine Kontrolle über den Spermientransport ausübt und eine Koordination der Passage von männlichen und weiblichen Gameten übernimmt.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die Interaktion zwischen Spermien und den Zellen des Eileiters synchronisierend und koordinierend wirkt, um sicher zu stellen, dass befruchtungsfähige Gameten zur richtigen Zeit am Ort der Befruchtung aufeinander treffen (TÖPFER‐PETERSEN et al. 2002).
2.1.2 Mechanismen der Etablierung
Der Spermientransport durch den Uterus erfolgt sowohl aktiv durch die Spermien selber als auch passiv. Der passive transuterine Spermientransport erfolgt mit Hilfe von koordinierten Myometriumskontraktionen (VIRING u. EINARSSON 1981). Das größte Hindernis stellt hierbei die UTV dar. Sie muss von den Spermien aktiv überwunden werden und übernimmt somit eine selektive Funktion (HUNTER 1995).
Die UTV ist eine physiko-chemische Barriere für die Spermien, da sie bei östrischen Tieren nur einen geringen Durchmesser hat und muköses Sekret enthält. In der späten Follikelphase ist die Schleimhaut im Eileiter auf Grund des indirekten Einflusses von Östrogen auf die Lymphgefäße stark ausdehnt. Dieses Ödem reduziert das Lumen deutlich und ist vor allem im unteren Isthmus und der UTV kurz vor der Ovulation der Fall. Dadurch wird der Spermientransport erschwert und der
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Motilität kommt hier als Selektionsmechanismus besondere Bedeutung zu (HUNTER 1988). Sie wird nur von motilen und formnormalen Spermien überwunden.
In einem Modell mit genetisch modifizierten Mäusen wurde gezeigt, dass die Wanderung durch die UTV ein kritischer Schritt im Spermientransport ist (TOKUHIRO et al. 2012).
Ein weiterer Selektionsschritt ist die Bindung an das Oviduktepithel. Hierbei spielen Morphologie, Membranintegrität und Kapazitationsstatus der Spermien eine wichtige Rolle. Gebundene Spermien zeigen weniger morphologische Abweichungen als die Population der ungebundenen Spermien (PETRUNKINA et al. 2001). In vitro-Studien zeigen, dass initial vorwiegend membranintakte (PETRUNKINA et al. 2001) und noch unkapazitierte (FAZELI et al. 1999) Spermien binden. In Untersuchungen von TÖPFER-PETERSEN et al. (2002) wurde gezeigt, dass der Anteil membrandefekter Spermien in der Population der nicht gebundenen Spermien höher war als in der Population der gebundenen Spermien. Die Kapazitation reduziert die Fähigkeit der Spermien an das Oviduktepithel zu binden (LEFEBVRE u. SUAREZ 1996).
Die Bindung erfolgt bei porcinen Spermien mit der akrosomalen Region der Plasmamembran überwiegend an zilientragende Epithelzellen und an Zellen in den Krypten (HUNTER 1984; SUAREZ 1991; PETRUNKINA et al. 2001). Sie beruht auf einer Interaktion zwischen Kohlenhydraten und Proteinen. Sowohl die Spermien als auch das Eileiterepithel exprimieren eine Glykokalix (WALTER u. BAVDEK 1997;
KIRCHHOFF u. SCHRÖTER 2001) und lektinähnliche Moleküle (BIERMANN et al.
1997; TÖPFER-PETERSEN 1999; JANSEN et al. 2001), wobei die Oligosaccharide die Liganden und die lektinähnlichen Moleküle die Rezeptoren darstellen. In mehreren Studien von SUAREZ (1997, 2001) gibt es Hinweise darauf, dass die epithelialen Glukokonjugate bestimmte Oligosaccharide präsentieren, welche von oberflächenassoziierten Spermienlektinen erkannt werden. Das porcine Spermienreservoir wird wahrscheinlich durch die Interaktion von Mannosyl- Oligosaccharid-Liganden des Eileiterepitheliums gebildet, die von Molekülen erkannt werden, die in der Samenblase und in der Prostata synthetisiert werden und bei der
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Ejakulation an die Spermienoberfläche gebunden werden (TÖPFER‐PETERSEN et al. 2002). Andere Mechanismen zur Entstehung des porcinen Spermienreservoirs können jedoch nicht ausgeschlossen werden. Beteiligte Proteine sind die Spermadhäsine, welche Galaktose in komplexen Oligosacchariden auf dem Oviduktepithel erkennen (TÖPFER-PETERSEN 1999). Im porcinen Seminalplasma gibt es sechs verschiedene Fraktionen, die als Spermadhäsin identifiziert werden konnten; PSP-1, PSP-2, AWN-1, AWN-2, AQN-1 und AQN-3 (EKHLASI- HUNDRIESER et al. 2005). Zudem wurde ein Nachweis für Mannose-bindende Fraktionen im Eberseminalplasma erbracht. Der dominierende Anteil waren PSP-1 und PSP-2, deutlich war auch AQN-1 in seiner aggregierten Form nachweisbar und mit geringerer Intensität ebenfalls AQN-3 und AWN-1. Im Vergleich verschiedener Zucker wurde Mannose bevorzugt gebunden. Da in der Western-Blot-Analyse AQN-1 eine sehr hohe Affinität zu alpha-D-Mannose gezeigt hat, unterstreicht dies die These, wonach die Bindung porciner Spermien an das Oviduktepithel durch eine Bindung der Spermadhäsine an mannosehaltige Oligosaccharide des Oviduktepithels vermittelt wird (EKHLASI-HUNDRIESER et al. 2005).
In einer neueren Studie konnte gezeigt werden, dass alle Glykane, an die porcine Spermien gebunden sind, eines von zwei Mustern umfasste. Dies war entweder das Lewis-X-Trisaccharid oder eine verzweigte Struktur mit einem Mannosekern und verzweigten Strukturen, die entweder in sialylierten Laktosamin-Trisacchariden oder in einfachen Laktosaminen endeten (KADIRVEL et al. 2012). Hierbei wurde das zweifach verzweigte 6-sialylierte Laktosamin am meisten gebunden. Aus den Ergebnissen wurden geschlussfolgert, dass es auf der Oberfläche des Spermienkopfes einen entsprechenden Rezeptor gibt.
Die Ergebnisse neuerer Studien (KADIRVEK et al. 2012; MACHADO 2014) bestätigen die vorherigen Ergebnisse und liefern detailliertere Aussagen zum Aufbau der Strukturen.
MACHADO (2014) fand ebenfalls die oben genannten Glykane mit den entsprechenden Mustern am porcinen Spermienkopf. In allen Sialinsäure enthaltenden Strukturen, an die Spermien gebunden waren, war Sialinsäure eher an die sechste als an die dritte Position von Galaktose gebunden. Des Weiteren war die
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verzweigte Struktur am Mannosekern notwendig. Einzelne sialylierte Laktosamin- Trisaccharide banden keine Spermien. Generell weisen die Ergebnisse darauf hin, dass unkapazitierte Eberspermien sehr spezifisch an Glykane binden, die Lewis-X oder verzweigte sialylierte Laktosamin-Muster aufweisen (KADIRVEL et al. 2012;
MACHADO 2014). Es wurde ebenso untersucht, welche Glykane auf der Epitheloberfläche des Eileiters zu finden sind. Es gab eine große Menge Oligomannose-Glykan-Strukturen. Die meisten der Oligosaccharide hatten zwei verzweigte Strukturen und einen Sialylrest an einem Ende, einige hatten einen Sialylrest an einem Ende und eine Lewis-Struktur am anderen. Die 6-sialylierten Laktosamine kommen im Ovidukt-Epithel am häufigsten vor; von diesen binden vorwiegend die Glykane mit zwei verzweigte Strukturen an den Spermienkopf.
Die Mechanismen zur Entstehung und Aufrechterhaltung des Spermienreservoirs sowie zur Loslösung der Spermien sind durch in vitro-Studien weitestgehend geklärt.
Es gibt nur wenige Studien, die die Mechanismen des Spermienreservoirs in vivo untersuchen. ENGLAND et al. (2013) untersuchten die Eileiter von Hündinnen im Anschluss an die Bedeckung und konnten als Ort des Spermienreservoirs die distale UTV bestimmen. Der Mechanismus der Loslösung der Spermien aus dem Reservoir in vivo konnte noch nicht vollständig geklärt werden. In vitro scheint die Loslösung eng mit der Kapazitation und Hyperaktivierung der Spermien verknüpft zu sein (SUAREZ 2000). Bei in vitro an Eileiterepithelzellen gebundene Bullenspermien konnte mit Heparin, welches ein Kapazitationsinduktor für bovine Spermien ist, und Penicillamin eine Ablösung vom Oviduktepithel sowie eine Hyperaktivierung erzielt werden (TALEVI u. GUALTIERI 2001; GUALTIERI et al. 2013). Beim Schwein konnte nach Zugabe von Calciumionophor, welches die Permeabilität der Plasmamembran für Calciumionen stark erhöht, eine vermehrte Ablösung von Spermien beobachtet werden, die an Vesikeln aus Oviduktepithel-Zellkulturen gebunden waren (BUREAU et al. 2002). Ebenso konnte bei porcinen Spermien durch Pronase eine Lösung vom Oviduktepithel in vitro erreicht werden (RAYCHOUDHURY u. SUAREZ 1991). Eine Hypothese ist, dass die mit der Kapazitation einhergehenden Änderungen der Spermienmembran die
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kohlenhydratbindenen Lektine modifizieren oder reduzieren und es dadurch zu einer Lockerung der Spermien-Oviduktepithel-Bindung kommt (SUAREZ et al. 1998).
Die hyperaktivierte Motilität der Spermien wurde als ein Mechanismus bei der in vitro Loslösung muriner Spermien aus dem Reservoir beschrieben (DEMOTT u. SUAREZ 1992). Sie führt zu einer modifizierten Flagellenbewegung (SUAREZ et al. 1992), welche in einer kräftigeren und schnelleren Vorwärtsbewegung resultiert. Hierdurch ist es den kapazitierten, hyperaktivierten Spermien in vitro möglich, schneller als frisch ejakulierte Spermien durch die visköse Umgebung im Eileiter bis zum Ort der Befruchtung zu gelangen (SUAREZ u. DAI 1992).
Hinzu kommen wahrscheinlich endokrine Einflüsse. HUNTER (1995) stellte einen engen zeitlichen Zusammenhang zwischen Kapazitation mit Hyperaktivierung und Ovulation fest. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Kapazitation durch Hormone wie Östradiol und Prostaglandin F induziert wird, die um den Zeitpunkt der Ovulation im Eileiter vorhanden sind. Ovulation und Freisetzung der Spermien aus dem Reservoir werden dadurch zeitlich koordiniert.
2.2 Spermien-Eileiter-Bindung in vitro
2.2.1 Methoden
Um die Spermien-Eileiter-Bindung in vitro untersuchen zu können, wurden OEA entwickelt. Ein Explant ist definiert als Gewebe, das aus seiner ursprünglichen Lokalisation entnommen wurde, und zum Wachstum oder zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit in ein künstliches Medium übertragen wurde (SCHAFFER u.
ASSOCIATION 1990).
Ein OEA bietet im Vergleich zu Eileiterzellkulturen viele Vorteile. Da es sich um ein ex-vivo-System handelt, weisen die Explante weitestgehend die Eigenschaften des Originalgewebes auf. Ein entscheidender Nachteil von Zellkulturen ist die Entdifferenzierung der Zellen, die bei nicht kultivierten Explanten nicht stattfindet. Die Spezies Schwein eignet sich besonders gut für den OEA, da die Eileiter gut verfügbar sind und in jedem Zyklus alle Vorgänge auf beiden Seiten des Reproduktionstraktes parallel ablaufen (OBSTRETICS 1986). Daher können für den
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Assay beide Eileiter benutzt werden, so dass eine größere Menge an Gewebe zur Verfügung steht. Mit einem OEA ist es möglich, die Bindungsfähigkeit von Spermien an Eileiterepithel zu überprüfen, womit ein funktioneller Spermienparameter zur Verfügung steht. Nichtsdestotrotz hat der OEA auch seine Grenzen. Da für jede Studie Eileiter von anderen Sauen verwendet werden, ist der Assay schlecht standardisierbar. Die gewonnenen Explante haben nur eine geringe Überlebensdauer von weniger als zehn Stunden, so dass lediglich Kurzzeitstudien möglich sind. Im Vergleich zum in vivo-System fehlt auch der endokrine Einfluss der Ovarien auf Eileiter und Spermien, so dass die Übertragbarkeit von in vitro- Explantstudien auf die in vivo-Situation stets kritisch zu sehen ist (HUNTER 2003).
Neue Zellkulturverfahren in 3D-Mikrofluidic-Systemen ermöglichen die Simulation dynamischer, hormoneller Verhältnisse in Langzeiteileiterkulturen. Diese sind jedoch technisch sehr aufwändig. XIAO et al. (2017) verwendeten ein Mikrofluidic- Zellkultursystem, um das humane Hormonprofil im 28-Tage-Zyklus nachzustellen.
Das System simulierte nicht nur den weiblichen Reproduktionstrakt, sondern auch den endokrinen Kreislauf zwischen Ovar, Eileiter, Uterus, Zervix und Leber. Es gelang einen vollständigen Zyklus inklusive Ovulation mit diesem System nachzustellen.
In der Literatur wird diskutiert, ob die Bindungsfähigkeit der Spermien durch das Alter der Sau (Jungsau – Altsau), das Zyklusstadium sowie durch die Lokalisation der Explantentnahme (Isthmus – Ampulle) beeinflusst wird. PETRUNKINA et al. (2001) zeigten, dass es keine Unterschiede zwischen Jungsauen und Altsauen sowie zwischen Explanten, die aus dem Isthmus gewonnen wurden, und Explanten, die aus der Ampulle gewonnen wurden, gibt. SUAREZ et al. (1991) zeigten ebenfalls in ihrer Studie mit porcinen Spermien sowie porcinen Eileitern, dass die Bindung unabhängig von der Eileiterregion erfolgt.
Über den Einfluss der Hormone auf die Spermien-Eileiter-Bindung in vitro wurde unterschiedlich berichtet (RAYCHOUDHURY u. SUAREZ 1991; SUAREZ et al.
1991). In der Studie von SUAREZ et al. (1991) banden mehr Spermien in der Anwesenheit von Östradiol, wohingegen in den Untersuchungen von RAYCHOUDHURY und SUAREZ (1991) weniger Spermien während des Östrus und
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damit in Anwesenheit von Östradiol banden. Diese Unterschiede liegen vermutlich in den unterschiedlichen in vitro-Systemen begründet. RAYCHOUDHURY und SUAREZ (1991) kultivierten die Explante für zwei Wochen unter Anwesenheit von Östradiol und Progesteron im Medium. Die Koinkubation mit den Spermien erfolgte für zehn Minuten, 24 Stunden und 42 - 44 Stunden. Die von SUAREZ et al. (1991) verwendeten Explante wurden dagegen für 24 Stunden in MEM [Eagle’s Minimal Essential Medium modifiziert nach Basha et al. (1979)] mit und ohne Östradiol inkubiert. Die Koinkubation erfolgte für zehn Minuten. Es ist möglich, dass die Zellen der von RAYCHOUDHURY und SUAREZ (1991) verwendeten Explante einer Veränderung in Form einer Entdifferenzierung unterlagen.
In porcinen Oviduktepithelzellkulturen wurden mit unterschiedlichen Dosierungen der Hormone Progesteron und Östradiol Östrus und Diöstrus nachgestellt. An die Zellen, mit denen der Östrus simuliert wurde, banden bis zu doppelt so viele Spermien wie an die Zellen, mit denen der Diöstrus simuliert wurde (CHEN et al. 2013). Diese Ergebnisse und die Ergebnisse von SUAREZ et al. (2001) zeigen, dass in vitro Östradiol die Spermienbindung beeinflusst und lassen vermuten, dass der Zyklusstand auch in vivo die Bindungsfähigkeit der Spermien beeinflusst.
Um einen Wert für die Bindungsfähigkeit zu erhalten, wurde der Bindungsindex eingeführt und definiert als die Summe der gebundenen Spermien aller untersuchten Regionen dividiert durch die Summe der Fläche dieser Regionen (PETRUNKINA et al. 2001). Folgende Formel zur Berechnung des Bindungsindex gibt dies wieder:
Bindungsindex (BI) = (N1 + N2 + N3) / (S1 + S2 + S3)
Es liegt eine starke lineare Beziehung zwischen der Anzahl zum Explant zugegebener Spermien und der Anzahl gebundener Spermien vor (PETRUNKINA et al. 2001). Ebenso zeigen sich eberindividuelle Unterschiede (PETRUNKINA et al.
2001); die Explantgröße hat dagegen keinen Einfluss auf den Bindungsindex (WABERSKI et al. 2006).
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Die Beziehung zwischen dem Bindungsindex und verschiedenen spermatologischen Parametern wurde in unterschiedlichen Studien untersucht. Der Anteil morphologisch abweichender Spermien, vor allem solche mit erhöhtem Plasmatropfenanteil, und der Bindungsindex haben eine negative Korrelation zueinander (PETRUNKINA et al.
2001; WABERSKI et al. 2005; WABERSKI et al. 2006). Diese drei Studien zeigten ebenfalls, dass es keine Korrelation zwischen dem Bindungsindex und der Motilität gibt. Zusätzlich konnten WABERSKI et al. (2005; 2006) darstellen, dass es auch zwischen der Plasmamembranintegrität und dem Bindungsindex keine Korrelation gibt. WABERSKI et al. (2005) konnten sogar zeigen, dass bei vier von fünf subfertilen, nicht normospermen Ebern der Bindungsindex reduziert war und schlussfolgerten daraus, dass der Assay potentiell subfertile Eber identifizieren kann.
Für ein prädiktives, spermatologisches Screening ist der OEA allerdings wegen des hohen Aufwandes nicht geeignet.
WABERSKI et. al. (2006) konnten darüber hinaus einen Zusammenhang zwischen der Bindungsfähigkeit und der in-vitro-Alterung bei Kurzzeitlagerung von Eberspermien nachweisen. Nach 72 Stunden Spermalagerung hatten signifikant weniger Spermien gebunden als nach 24 Stunden Spermalagerung. In der Standardspermatologie zeigten sich nur geringe Unterschiede bei den Werten zwischen den für 24 Stunden und den für 72 Stunden gelagerten Spermien. Somit ist der OEA sensitiver als die in der Standardspermatologie erhobenen Parameter.
2.2.2 Detektion von gebundenen Spermien in Eileiterbindungsassays
Die Detektion der an die Epithelien gebundenen, ungefärbten Spermien und die Detektion der Spermien in allen Ebenen der Explante stellt eine Herausforderung dar. Explante sind dreidimensionale Gewebe, so dass die Spermien in unterschiedlichen Ebenen binden. Deswegen wurden in den oben genannten Studien Videoaufnahmen der untersuchten Gesichtsfelder aufgenommen, in denen durch die verschiedenen Ebenen fokussiert wurde.
SUAREZ et al. (1991) fixierten die kultivierten Explante mit den gebundenen Spermien mit Glutaraldehyd bzw. Formaldehyd. Ausgewertet wurde die
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Spermienbindung an die Explante anhand von Videosequenzen von fünf Gesichtsfeldern, die unter einem Hellfeldmikroskop mit 320-facher Vergrößerung erstellt wurden. PETRUNKINA et al. (2001) untersuchten die Explante mit den gebundenen Spermien unter einem Inversmikroskop. Es wurde von drei Gesichtsfeldern mit 320-facher Vergrößerung je ein Video aufgenommen.
RAYCHOUDHURY und SUAREZ (1991) fixierten die Zellkultur mit den gebundenen und ungefärbten Spermien mit Glutaraldehyd. Anschließend wurden die Explante auf einem Objektträger unter einem Deckgläschen fixiert. Unter einem Hellfeldmikroskop mit 320-facher Vergrößerung wurde von fünf Gesichtsfeldern je eine Aufnahme angefertigt. Die Untersuchung erfolgte unter einem inversen Mikroskop. Die Arbeitsgruppen um WABERSKI et al. (2005; 2006) verwendeten ebenfalls ungefärbte Spermien und fixierten die Explante zwischen einem Objektträger und einem Deckgläschen.
Die Darstellung ungefärbter Spermien auf Eileitergewebe ist schwierig, so dass zur besseren Detektion von SUAREZ et al. (1991) eine Färbung der Spermien mit Hämatoxylin nach Gill im Anschluss an die Bindung durchgeführt wurde. Dies ist ein violett-roter Farbstoff, der Zellkerne, Mitochondrien, Myelin, Elastin und Kollagenfasern anfärbt. Problematisch hierbei ist, dass auch die Oviduktepithelzellen und deren Kompartimente mit angefärbt werden und dies eine Differenzierung zwischen Epithelzellen und Spermien erschwert.
Alternativ ist es möglich die Spermien vor der Koinkubation mit den Explanten zu färben. Wobei der Farbstoff weder die Bindungsfähigkeit noch die Viabilität der Spermien beeinträchtigen darf.
Die Färbung von Spermien vor der Koinkubation erleichtert die Detektion, sofern kein Farbstoff an das Eileiterepithel übertritt. Darüber hinaus sind weitere Spermienbeurteilungen in der gebundenen Subpopulation möglich. In einer Untersuchung mit Bullensperma wurden die Zellen mit Hoechst 33342 (10 µg/ml), einem membranpermeablen, blauen DNA-Farbstoff, markiert und auf eine Ovidukt- Monolayer-Zellkultur gegeben (GUALTIERI et al. 2013). Nach der Koinkubation
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wurde die Spermien-Ovidukt-Kokultur fixiert und die gebundenen Spermien in der Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Mit den DNA-Farbstoffen SYBR 14 und Propidiumiodid (PI), einer Lebend-Tot-Färbung, kann zudem die Viabilität der gebundenen Spermien beurteilt werden. SYBR 14 ist membrangängig, bindet an DNA und zeigt eine Grünfluoreszenz, wohingegen PI nur plasmamembrandefekte Spermien penetriert und zu einer Rotfluoreszenz der Spermienköpfe führt. In einer Studie mit einem OEA bei Pferden wurde zusätzlich JC-1 eingesetzt (LEEMANS et al. 2014). JC-1ist ein membrangängiger Farbstoff, der in zwei Formen vorliegen kann und entsprechend zwei unterschiedliche Fluoreszenzspektren aufweist. Es bindet an Mitochondrienmembranen und fluoresziert als Monomer grün und in seiner aggregierten Form mit steigendem Mitochondrienmembranpotential organge-rot.
JC-1 wird zur Bestimmung des Mitochondrienmembranpotentials verwendet.
2.3 Fluoreszenzmarkierung von Spermien mit Hoechst 33342 und MitoTracker®
Hoechst 33342 ist ein membrangängiger Fluoreszenzfarbstoff, welcher an doppelsträngige DNA bindet und nach Anregung eine blaue Fluoreszenz zeigt.
Hoechst 33342 wird routinemäßig für das sex sorting (JOHNSON et al. 1987) von Spermien vor der Besamung verwendet. Der Farbstoff wird darüber hinaus nicht nur in der spermatologischen Diagnostik eingesetzt, sondern findet vielfältige Verwendung zur Markierung anderer Zellarten wie humane Lymphozyten, Lungenfibroblasen von Hamstern und humane neutrophile Granulozyten (SHAPIRO 1981; DURAND u. OLIVE 1982; BELLOC et al. 1994). Es gibt keine Hinweise auf gravierende Einflüsse von Hoechst 33342 auf die Qualität der untersuchten Zellen.
Die Hoechstvariante 33252 wurde als ein weiterer Marker in einem Besamungsversuch beim Schwein eingesetzt. Ziel der Studie war die Hypothese zu testen, ob es im Eberejakulat Subpopulationen gibt, die als erstes das Spermienreservoir besiedeln. Das Ejakulat wurde in zwei Portionen aufgeteilt, wovon die Spermien der einen Portion fluoreszenzmarkiert wurden und die Spermien der anderen Portion ungefärbt blieben. Nach Insemination und Spülen des Uterus und
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Eileiters wurde das Verhältnis fluoreszierender zu nicht fluoreszierenden Spermien in der Spülflüssigkeit bestimmt (RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ et al. 2005).
MitoTracker® sind membrangängige Fluoreszenzfarbstoffe, die sich in der Zelle an die Mitochondrienmembran anlagern. Sie besitzen eine thiolreaktive Chloromethyl- Gruppe, die kovalente Bindungen mit freien Thiol-Gruppen der Cystein-Reste der Mitochondrienproteine eingeht (PRESLEY et al. 2003). Sie sind nicht toxisch und können zuverlässig die Mitochondrien in kultivierten Säugetierzellen markieren (KALBÁČOVÁ et al. 2003). Die Färbung mit MitoTracker® wurde in einer Konzentration von 30 nM für fünf Minuten bei 37°C und 5 % CO2 durchgeführt. Der exakte Färbemechanismus ist bisher nicht eindeutig geklärt. Es gibt jedoch die Hypothese, dass diese kationischen, lipophilen Farbstoffe im leicht negativ geladenen Inneren der Mitochondrien akkumulieren (PERRY et al. 2011), wo sie in einen stark fluoreszierenden Farbstoff oxidieren.
MitoTracker® Green FM ist ein grün fluoreszierender Farbstoff, der Mitochondrien unabhängig vom Mitochondrienmembranpotential in lebenden Zellen anfärbt (Fa. thermofischer). MitoTracker® Green FM wurde erfolgreich als spezifischer Marker für Mitochondrienproteine in einer Konzentration von 1µM in NS-1-Zellen eingesetzt. Die Färbung erfolgte für 15 Minuten bei 37°C (PRESLEY et al. 2003).
Mitochondrien von Bullenspermien wurden mit MitoTracker® Green FM (Konzentration 400 nM) markiert, um sie während der Inkorporation in die Eizelle und die Einbettung in die Strukturen während der in vitro Fertilisation verfolgen zu können. Die Färbung erfolgte für zehn Minuten bei 39°C (SUTOVSKY et al. 1996).
Negative Einflüsse des Farbstoffes auf die Spermien und ihre Funktion wurden nicht beschrieben. Mitochondrien von Eberspermien wurden mit MitoTracker® Green FM (Konzentration 200 nM) markiert, um den Zerfall der paternalen Mitochondrien in porcinen Oozyten nach in vitro Fertilisation verfolgen zu können. Die Färbung erfolgte für zehn Minuten bei 37°C (SUTOVSKY et al. 2003). Informationen zum Färbeverhalten und mögliche Effekte auf die Qualität der gefärbten Zellen werden für beide MitoTracker®-Farbstoffe in den zitierten Studien nicht geliefert.
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MitoTracker® Red FM ist ein rot fluoreszierender Farbstoff, der Mitochondrien abhängig vom Mitochondrienmembranpotential in lebenden Zellen anfärbt (Fa. thermofischer). Er akkumuliert nur in metabolisch aktiven Mitochondrien von Neuronen (DE LA MONTE et al. 2000). In der zugänglichen Literatur gibt es keine Angaben zum Einsatz von MitoTracker® Red FM als Marker bei Spermien.
2.4 Kälteschock bei Eberspermien
Es ist bekannt, dass Eberspermien sensibler auf niedrige Temperaturen reagieren als Spermien anderer Spezies. Daher werden sie bei einer Temperatur von 17°C gelagert. Diese Kältesensibilität resultiert aus mehreren zusammenwirkenden Faktoren. Zum Einen haben Eberspermien einen relativ geringen Cholesterinanteil (TARDIF et al. 2003), was zu einem niedrigen Cholesterol-Phospholipid-Verhältnis führt (PARKS u. LYNCH 1992). Zum Anderen liegt das Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren beim Eber bei > 2,5, wohingegen es bei weniger temperaturempfindlichen Spezies wie Kaninchen, Hund und Mensch bei ca. 1 liegt (WHITE 1993). Beides führt dazu, dass die Membran von Eberspermien eine höhere Fluidität besitzt und auf Grund dessen eine geringere Resistenz gegenüber Temperaturschwankungen aufweist (SCHILLING u. VENGUST 1985; TARDIF et al.
2003). Die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran ist scheinbar ausschlaggebend für die Fähigkeit von Spermien, niedrige Temperaturen zu tolerieren, was, wie bereits erwähnt, tierartlich sehr unterschiedlich ist (DE LEEUW et al. 1990; WATERHOUSE et al. 2006).
Zudem haben Eberspermien im Vergleich zu anderen Säugetierspezies einen höheren Anteil an membranständigen Proteinen. PARKS und LYNCH (1992) konnten zeigen, dass zwischen dem Proteingehalt der Plasmamembran und der Kältesensibilität ein Zusammenhang besteht.
Kälteschock tritt auf, wenn Spermien schnell, das heißt mit einer Abkühlrate von mindestens 1°C - 2°C pro Minute, abgekühlt werden (JOHNSON et al. 2000), oder auf unter 15°C abgekühlt werden (DE LEEUW et al. 1991). Die Kältesensibilität der Eberspermien ist hauptsächlich von der gewünschten Zieltemperatur und der Abkühlgeschwindigkeit abhängig (JOHNSON et al. 2000; SCHMID et al. 2013b). Bei
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einer Temperatur von unter 15°C treten in einem Teil der Spermienpopulation der Verlust von Motilität und Membranintegrität sowie eine erhöhte Membranpermeabilität auf (PURSEL et al. 1973; DROBNIS et al. 1993; JOHNSON et al. 2000). Die Lipide der Plasmamembran wechseln während der Abkühlung vom flüssigen in einen gelförmigen Zustand, welches für die unterschiedlichen Lipide bei unterschiedlichen Temperaturen passiert. Daher legten DROBNIS et al. (1993) einen Bereich von 30°C bis 10°C des Phasenüberganges für Eberspermien fest. Da während der Abkühlphase dann flüssige und gelförmige, also festere, Membranabschnitte direkt nebeneinander liegen, kann es zur Phasenseparation kommen, wodurch membranständige Proteine irreversibel agglutinieren und somit ihre Funktion verlieren (DE LEEUW et al. 1990, DE LEEUW et al. 1991). Durch die Reorganisation während des Phasenübergangs erhöht sich zusätzlich die Permeabilität der Spermienzelle (DROBNIS et al. 1993).
Das Phänomen der Kältesensibilität mit den entsprechenden Veränderungen der Spermienzelle wurde zunächst nach dem Auftauen eingefrorener Proben beobachtet. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass während der Abkühlung in die Zelle einströmende Calciumionen Signalkaskaden induzieren, die mit der Kapazitation vergleichbar sind, und die Plasmamembran somit in einen Zustand von gesteigerter Fusionsneigung gebracht wird (WATSON 1995a). Für tiefgefrorene Spermien wurde daher der Begriff „Kryokapazitation“ geprägt (WATSON 1995b). In nachfolgenden in vitro-Studien mit hypotherm konservierten Eberspermien wurde zwischen einer unspezifischen Destabilisierung und der spezifischen Reaktivität auf Kapazitationssignale differenziert. Dabei zeigte sich, dass bei Abkühlung auf 5°C eine Zellpopulation destabilisiert, während bei der Subpopulation der membranintakten, stabilen Zellen eine verminderte Reaktivität auf den Kapazitationsstimulus Bikarbonat zu verzeichnen war (HENNING et al. 2012;
SCHMID et al. 2013a). Hypotherme Flüssigkonservierung und Kryokonservierung von Eberspermien führt zu einer beschleunigten Reaktivität der Spermien auf Kapazitationssignale (GUTHRIE u. WELCH 2005) und damit zu einer frühzeitigen Destabilisierung der Spermienzelle. In einer Studie, die verschiedene Lagerungstemperaturen miteinander verglich, wurde festgestellt, dass die
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Membranintegrität der bei 5°C gelagerten Proben ähnlich den bei 16°C und 25°C gelagerten Proben war. Die progressive Motilität der bei 5°C und der bei 16°C gelagerten Spermien war im Vergleich zu den bei 25°C gelagerten Spermien deutlich reduziert. Einhergehend damit war ebenfalls das Mitochondrienmembranpotential deutlich herabgesetzt (GACZARZEWICZ et al. 2015).
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3 Material und Methoden
3.1 Verbrauchsmaterialien und Geräte
Sämtliche während dieser Arbeit verwendeten Verbrauchsmaterialien und Geräte sind im Anhang aufgelistet (Kapitel 9.4).
3.2 Chemikalien und Lösungen
Im Anhang finden sich die Liste der verwendeten Chemikalien inklusive Bezugsquelle und die Rezepte der gebrauchten Lösungen (Kapitel 9.2 und Kapitel 9.3).
Das für die Herstellung der Lösungen verwendete Wasser wurde über eine Ionenaustauschersäule (Fa. Landgraf, Langenhagen) gefiltert und anschließend steril filtriert (Milipore Express PLUS Membran, Polyethersulfon, hydrophil, 0,22 µm Porendurchmesser, 47 mm Filterdurchmesser, Druckfiltrationseinheit Sartobran 300, Fa. Landgraf, Langenhagen).
3.3 Tiere und Organe
3.3.1 Eber und Samengewinnung
Zur Gewinnung der Ejakulate standen elf institutseigene, klinisch gesunde Eber im Alter von anderthalb bis sechs Jahren der Rassen Piétrain, Deutsche Landrasse, Deutsches Edelschwein und Duroc zur Verfügung. Es wurden ausschließlich normosperme Ejakulate gemäß den Gewährschaftsbestimmungen des Bundesverbandes Rind und Schwein (2005) verwendet. Dies beinhaltet eine Motilität von mindestens 70 % und maximal 25 % morphologisch abweichende Spermien.
Die Samengewinnung fand im institutseigenen Stallgebäude statt. Die Ejakulatentnahme erfolgte am Phantom mit der behandschuhten Handmethode. Die spermienreiche sowie spermienarme Phase wurden unter Abtrennung des Bulbourethraldrüsensekretes in einem auf 38°C vorgewärmten
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Samenauffangbehälter (Fa. Minitüb, Tiefenbach) mit eingestecktem und ebenfalls auf 38°C vorgewärmten Samenauffangbeutel (Fa. Minitüb, Tiefenbach) aufgefangen.
Für den Transport ins Labor wurde eine auf 38°C vorgewärmte Styroporkiste verwendet.
3.3.2 Untersuchung des Nativspermas
Nach Ankunft im Labor wurden die Ejakulate aus dem Samenauffangbeutel in einen auf 38°C vorgewärmten, sterilen 500-ml-Glaszylinder umgefüllt. Anschließend fand eine Untersuchung hinsichtlich Volumen, Farbe, Konsistenz, Motilität, Dichte, Spermiengesamtzahl (SGZ), pH-Wert und Morphologie statt. Die Bestimmung der Motilität wurde mikroskopisch vorgenommen. Das hierbei verwendete Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (38°C) war das Axiostar plus (Fa. Zeiss, Jena) mit 200-facher Vergrößerung (Objektiv: 20x, A-Plan, Okular: 10x, Phase 2).
Objektträger, Deckgläschen und Pipettenspitzen wurden auf einem Heiztisch (HT 200, Fa. Minitüb, Tiefenbach) auf 38°C vorgewärmt.
Die Spermienkonzentration wurde in den Versuchen 1.2, 1.3 und 3 mit dem Photometer SDM 5 (Fa. Minitüb, Tiefenbach) bestimmt und in den Versuchen 1.1, 2.1, 2.2 und 2.3 mit Hilfe einer Zählkammer (Thoma neu, Fa. Brand GmbH und Co.
KG, Wertheim) ermittelt. In Anlehnung an die Methode nach KRAUSE (1966) wurden in jeder Kammerhälfte die Spermienköpfe entweder in fünf oder in 16 Feldern gezählt, wobei in den 16 ausgezählten Feldern mindestens 100 Spermienköpfe pro Kammerhälfte gezählt wurden. Die Auszählung fand am Phasenkontrastmikroskop (SIP 54045, Fa. Zeiss, Jena) bei 400-facher Vergrößerung (Objektiv: 40x, Okular:
10x, Phase 2) statt.
Der pH-Wert wurde mit dem pH-Meter Microprocessor pH/ION Meter pMX 3000 (Fa.
WTW, Weilheim) bestimmt.
Zur Ermittlung des Anteils morphologisch abweichender Spermien wurden bis zu 30 µl des Nativejakulates in 300 µl 1,48 %-igem Formolzitrat fixiert. Daraus wurde ein µl auf einen Objektträger pipettiert und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Untersuchung von 200 Samenzellen erfolgte am Phasenkontrastmikroskop (SIP 54045, Fa. Zeiss, Jena) bei 1000-facher Vergrößerung (Objektiv: 100x, Okular: 10x,
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Phase 3, Ölimmersion). Die Bewertung der Spermien erfolgte in Anlehnung an das Klassifikationsschema nach KRAUSE (1966).
3.3.3 Ovidukt-Explant-Assay
3.3.3.1 Herkunft und Gewinnung der Eileiter
Die für den OEA verwendeten Eileiter wurden jeweils am Tag der Durchführung des Assays frisch vom Schlachthof geholt. Die Eileiter wurden ausschließlich von Altsauen mit Follikeln oder Gelbkörpern auf den Ovarien und adspektorisch unauffälligen Uteri, Eileitern und Ovarien gewonnen.
Mit einer Schere wurde ein vier bis fünf cm großes Gewebestück im Bereich des Übergangs von Uterushorn und Eileiter herausgeschnitten. Hierbei wurden ca. zwei cm der Uterushornspitze bis ca. drei cm des Eileiters entnommen. Die so gewonnenen Gewebestücke wurden nach Sauen getrennt in Schottgefäße mit ca.
4°C kaltem PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) gegeben und in einer Styroporbox mit Kühlakkus ins Labor transportiert.
3.3.3.2 Präparation der Oviduktexplante
Im Labor wurden die Gewebestücke in eine rechteckige Metallschale verbracht, die mit ca. 4°C kaltem PBS gefüllt war. Jedes Ovidukt wurde mit einem Longitudinalschnitt eröffnet, mit der inneren Epithelseite nach oben in einer mit Paraffin gefüllten Petrischale mit Stecknadeln befestigt und mit ca. 4°C kaltem PBS bedeckt. Zur weiteren Kühlung wurde die Petrischale auf einen Kühlakku gelegt.
Es folgte die Explantgewinnung unter dem Stereomikroskop (MDG 17, Fa. WILD HEERBRUGG, Gais, Schweiz) mit Hilfe einer Präparationsschere (Mini-Vannas Spring Scissors, Fa. Fine Science Tools GmbH, Heidelberg) und einer Pinzette. Die erhaltenen Explante wurden nach Sauen getrennt in kleine, mit Tyrodemedium gefüllte Petrischalen (PS, 35/10 mm, mit Nocken, Fa. Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen) sortiert. Unter dem Mikroskop (Axioskop 50, Fa. Zeiss, Jena) wurden die Explante bei 200-facher Vergrößerung auf Zilienschlag kontrolliert. Explante, die
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Zilienschlag aufwiesen, wurden nach Sauen getrennt, in eine weitere mit 4°C kaltem Tyrodemedium gefüllte kleine Petrischale gegeben. Explante ohne Zilienschlag wurden aussortiert. Während des gesamten Vorganges wurden die Explante in 4°C kaltem Tyrodemedium gelagert.
3.3.3.3 Durchführung
Für jedes Explant wurden drei Wells einer 24-Well-Platte (TC-Platte 24 Well. Cell + .F, Fa. Sarstedt, Nürnberg) mit 490 µl des für eine Stunde im CO2-Inkubator (MCO-17AC, Fa. Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd., Bad Nenndorf) äquilibrierten Tyrodemediums befüllt. Jedes Explant wurde einzeln in ein Well geben und für 15 Minuten bei 5 % CO2-Sättigung, 100 % Luftfeuchte und 38°C vorinkubiert.
Anschließend wurden zehn µl der gefärbten Spermaproben zu einem Explant gegeben. Vor dem Eintauchen in das Well mit dem Tyrodemedium wurde die Pipettenspitze vorsichtig außen abgewischt, ohne den Inhalt der Pipettenspitze zu aspirieren. Die Koinkubation von Explanten und Spermien erfolgte für jeweils 15 Minuten bei 5 % CO2-Sättigung, 100 % Luftfeuchte und 38°C.
Die Explante wurden nach Koinkubation in einem abgedunkelten Raum unter dem Fluoreszenzmikroskop (BX 41, Fa. Olymps, Hamburg; Okular: WHSZ20x-H/12,5;
Adapter: U-TV1x-2) untersucht. Für die Aufnahmen wurde die Software cellSens® Dimension (Version 1, Fa. Olympus, Hamburg) verwendet. Der Mikroskoptisch, der Heiztisch (HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach), die Objektträger, die Deckgläschen sowie die Pipettenspitzen wurden auf 38°C vorgewärmt. Vier Silikontropfen wurden auf einen Objektträger gegeben, in deren Mitte 60 µl des vorgewärmten und äquilibrierten Tyrodemediums pipettiert wurde. Die Explante wurden zunächst zweimal in mit Tyrode (38°C) befüllten Waschwells gewaschen und anschließend auf den vorbereiteten Objektträger gegeben und mit einem Deckgläschen fixiert. In drei Sichtfeldern wurde jeweils eine Aufnahme angefertigt, währenddessen manuell durch die Ebenen des Präparates fokussiert wurde. Ein Sichtfeld wurde als geeignet definiert, wenn das Oviduktepithel das komplette Sichtfeld ausfüllte und kein Randbereich sichtbar war und gebundene Spermien aufwies. Eine Mindestanzahl
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gebundener Spermien wurde nicht festgelegt, da je nach Versuchsdesign auch sehr wenige Spermien gebunden sein konnten.
In Versuch 1.1 wurden die Lampe CoolLED pE 300, Fa. Olympus, Hamburg und der Filter F37-350, Fa. AHF Analysentechnik, Tübingen verwendet.
In den Versuchen 1.2, 1.3 und 3 wurden die Lampe CoolLED pE 300, Fa. Olympus, Hamburg und der Triplebandfilter F66-412, Fa. AHF Analysentechnik, Tübingen verwendet.
In den Versuchen 2.1, 2.2 und 2.3 wurden eine HBO-Lampe (U-RFL-T-200, Fa.
Olympus, Hamburg) und der Dualbandfilter (F56-019, Fa. AHF Analysentechnik, Tübingen) und verwendet.
In den Versuchen 1.1, 1.3 und 3 wurden sogenannte Instant-EFI (Extended Focus Image) erstellt. Hierbei sind in einem Bild alle Ebenen fokussiert zusammengefügt.
In den Versuchen 2.1, 2.2 und 2.3 wurden Videodateien (Dateiformat .avi) erstellt.
3.3.3.4 Auswertung
Für die Auswertung wurde die Anzahl gebundener Spermien pro Sichtfeld bestimmt und daraus der Bindungsindex (BI) für jedes Explant berechnet. Der absolute BI wurde mit folgender Formel nach PETRUNKINA et al. (2001) errechnet:
BI = (N1 + N2 + N3) / (S1 + S2 + S3)
Hierbei steht N für die Anzahl der gezählten Spermien pro Sichtfeld und S für die Fläche des Sichtfeldes.
Die Berechnung der BI in Versuch 1.1 erfolgte nach o.g. Formel.
In Versuch 1.3 wurden für jedes Explant zwei BI (Berechnung s.o.) berechnet; einmal für die grünen und einmal für die roten Spermien. Es ergaben sich folgende BI pro Sau und Eber:
22 BIE1S1 grün
BIE1S1 rot
Hierbei steht BI für Bindungsindex, E für Eber und S für Sau.
Anschließend wurden hieraus die Mittelwerte der BI über beide Sauen für die grünen und roten Spermien für jeden Eber berechnet.
BIE1 grün = (BIE1S1X1 grün + BIE1S2X1 grün) / 2
BIE1 rot = (BIE1S1X1 rot + BIE1S2X1 rot) / 2
Als letztes wurde der Mittelwert über alle Eber und alle Sauen gebildet.
BI grün = (BIE1 grün + BIE2 grün + BIE3 grün + BIE4 grün + BIE5 grün + BIE6 grün) / 6
BI rot = (BIE1 rot + BIE2 rot + BIE3 rot + BIE4 rot + BIE5 rot + BIE6 rot) / 6
Es wurden ebenso die relativen Bindungsindices berechnet. Dazu wurde die Summe aus dem Mittelwert aller Bindungsindices für die grünen Spermien (BI grün) und dem Mittelwert aller Bindungsindices für die roten Spermien (BI rot) gebildet und als 100 % definiert.
SummeBIgrün+BIrot = BI grün + BI rot = 100 %
Anschließend wurde der prozentuale Anteil des BI grün und des BI rot berechnet.
Anteil [%] gebundener grüner Spermien = 100 x BI grün / SummeBIgrün+BIrot
Anteil [%] gebundener roter Spermien = 100 x BI rot / SummeBIgrün+BIrot
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In den Versuchen des Versuchsteils 2 erfolgte die Berechnung des absoluten Bindundsindex wie oben beschrieben.
Für jede Koinkubation von 5°C- und 17°C-Sperma gab es zwei Explante (einmal 5°C grün und 17°C rot und das andere Mal 5°C rot und 17°C grün). Demnach gibt es für jeden Eber pro Sau zwei BI. Hieraus wurde separat für jede Sau und jede Lagerungstemperatur der Mittelwert wie folgt berechnet.
BIE1S1 5°C = (BIE1S1X1 5°C + BIE1S1X2 5°C) / 2
BIE1S1 17°C = (BIE1S1X1 17°C + BIE1S1X2 17°C) / 2
Hierbei steht E für Eber, S für Sau und X für Explant.
Anschließend wurde für jeden Eber der Mittelwert über beide Sauen für das 5°C-Sperma und das 17°C-Sperma berechnet.
BIE1 5°C = (BIE1S1 5°C + BIE1S2 5°C) / 2
BIE1 17°C = (BIE1S1 17°C + BIE1S2 17°C) / 2
Als letztes wurde noch der Mittelwert über alle Eber und alle Sauen für das 5°C-Sperma und das 17°C-Sperma gebildet.
BI 5°C = (BIE1 5°C + BIE2 5°C + BIE3 5°C + BIE4 5°C + BIE5 5°C + BIE6 5°C) / 6
BI 17°C = (BIE1 17°C + BIE2 17°C + BIE3 17°C + BIE4 17°C + BIE5 17°C + BIE6 17°C)/6
Es wurden ebenso die relativen Bindungsindices berechnet. Dazu wurde die Summe aus dem Mittelwert aller 5°C-Bindungsindices (BI 5°C) und dem Mittelwert aller 17°C- Bindungsindices (BI 17°C) gebildet und als 100 % definiert.
SummeBI5°C+BI17°C = BI 5°C + BI 17°C = 100 %
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Anschließend wurde der prozentuale Anteil des BI 5°C und des BI 17°C berechnet.
Anteil [%] gebundener 5°C-Spermien = 100 x BI 5°C / SummeBI5°C+BI17°C
Anteil [%] gebundener 17°C-Spermien = 100 x BI 17°C / SummeBI5°C+BI17°C
3.4 Versuche mit einem Ovidukt-Explant-Assay Die Versuche gliederten sich in drei Teile:
- Etablierung des kompetitiven OEA
- Bindung hypotherm gelagerter Eberspermien im kompetitiven OEA - Fixation der Oviduktexplante nach Spermienbindung
3.4.1 Versuchsteil 1: Etablierung des kompetitiven Ovidukt-Explant- Assays
3.4.1.1 Versuch 1.1: Einfluss einer Hoechst 33342-Färbung und des Zusatzes von Seminalplasma auf spermatologische Parameter und Bindungsfähigkeit von Eberspermien
Fragestellungen:
Haben die Färbung mit Hoechst 33342 und die Percollzentrifugation einen destabilisierenden Effekt auf Eberspermien?
Hat der Zusatz von 10 % homologem Seminalplasma im Verdünner einen stabilisierenden Effekt auf gefärbte Eberspermien nach Percollzentrifugation?
Hat die Konservierungsdauer einen Einfluss auf die Bindungsfähigkeit gefärbter Eberspermien an Eileiterepithel?
Korreliert der Bindungsindex mit standardspermatologischen Parametern in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer?
25 Versuchsdurchführung:
Spermaverarbeitung und Färbung:
Nach Spermagewinnung (s. Kapitel 3.3.1, n = acht einzelne Ejakulate von acht verschiedenen Eber) und Erstellung eines Standardspermiogramms (s. Kapitel 3.3.2) wurde eine verdünnte Spermaprobe (100 ml) mit modifiziertem, EDTA-freiem Androhep (mAH-Verdünner) in einem Verdünnungsgrad von 20 Mio/ml und zwei verdünnte Spermaproben (100 ml) mit mAH-Verdünner in einem Verdünnungsgrad von 100 Mio/ml hergestellt.
Es schloss sich die Zentrifugation des Seminalplasmas an. Pro Eber wurden zwei Zentrifugenröhrchen (50 ml, Fa. Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen) mit jeweils 50 ml Ejakulat gefüllt und für zehn Minuten bei 3.360 g zentrifugiert (Megafuge 2.0 R, Fa. Heraeus Instruments GmbH). Anschließend wurde der Überstand aus zwei Röhrchen bis auf ca. zehn ml mit einer Glaspipette in ein weiteres Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zentrifugation wurde noch zweimal wiederholt.
Das gewonnene Seminalplasma wurde in ein weiteres Zentrifugenröhrchen pipettiert und unter dem Mikroskop (Axiostar plus, Fa. Zeiss, Jena) bei 200-facher Vergrößerung auf Spermienfreiheit untersucht. Dazu wurden pro Probe drei Tropfen und in jedem Tropfen zehn Gesichtsfelder unter dem Mikroskop untersucht.
Spermienfreiheit wurde so definiert, dass maximal zehn Spermien in den 30 untersuchten Gesichtsfeldern detektiert wurden. Zur Herstellung des sogenannten Seminalplasmaverdünners wurden neun Teile des mAH-Verdünners mit einem Teil homologem Seminalplasma gemischt, so dass ein Seminalplasmaanteil von 10 % im Verdünnermedium erreicht wurde.
Nun wurden zwei Ansätze von je 50 ml der auf 100 Mio/ml vorverdünnten Proben mit 200 µl Hoechst 33342 (Konzentration der Stammlösung 300 µg/ml, Endkonzentration 1,2 µg/ml, Lösungsmittel Aqua dest.) gefärbt. Außerdem wurden zwei Ansätze von je 50 ml der auf 100 Mio/ml vorverdünnten Proben mit je 200 µl Aqua dest. versetzt.
Diese Proben dienten zur Kontrolle, da sie das Lösungsmittel des Farbstoffes enthielten und mit ihnen gleich verfahren wurde wie mit den gefärbten Proben. Die Färbung erfolgte für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde der Färbeerfolg unter dem Fluoreszenzmikroskop (BX 41, Fa. Olymps, Hamburg; Filter:
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F37-350, Fa. AHF Analysentechnik, Tübingen; Lampe: CoolLED pE 300, Fa.
Olympus, Hamburg; Objektiv: LUCPlan 20x/0,45; Okular: WHSZ20x-H/12,5; Adapter:
U-TV1x-2) kontrolliert. Wenn alle Spermien eine ausreichende Färbeintensität zeigten, wurden ca. 45 ml der Suspension vorsichtig auf 20 %-iges Percoll geschichtet.
Es folgte eine Zentrifugation in zwei Schritten. Zunächst wurde für zehn Minuten bei 300 g und direkt im Anschluss ohne Herunterfahren der Zentrifuge erneut für zehn Minuten bei 750 g zentrifugiert. Nach Beenden der Zentrifugation wurde mit Hilfe der Wasserstrahlpumpe (Fa. Landgraf, Langenhagen) der Überstand bis auf ca. einen ml abgesaugt. Die entstandenen Pellets wurden wie folgt resuspendiert: eine ungefärbte und eine gefärbte Probe mit jeweils zehn ml des Seminalplasma enthaltenden mAH- Verdünners und eine ungefärbte und eine gefärbte Probe mit jeweils zehn ml des mAH-Verdünners ohne Seminalplasma. Es folgte die Bestimmung der Spermienkonzentration mit der Thomazählkammer (Fa. Jürgens, Hannover).
Abschließend wurde die Endverdünnung auf 20 Mio/ml bei zwei Proben (einmal ungefärbt, einmal gefärbt) mit dem Seminalplasma enthaltenden mAH-Verdünner und bei zwei Proben (ungefärbt und gefärbt) mit dem seminalplasmafreien mAH- Verdünner vorgenommen und erneut eine Kontrolle der Färbung durchgeführt.
Die Proben wurden für 90 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann in den 17°C-Klimaschrank (Seriennummer: 960028, Fa. Minitüb, Tiefenach) umgelagert.
In Abb. 1 ist die beschriebene Spermaaufbereitung schematisch dargestellt.
27 Proben:
Kontrolle (K): nicht zentrifugiert + mAH-Verdünner
A: Hoechst 33342 + Zentrifugation + mAH-Verdünner mit 10 % Seminalplasma
B: Hoechst 33342 + Zentrifugation + mAH-Verdünner ohne Seminalplasma
C: Aqua dest. + Zentrifugation + mAH-Verdünner mit 10 % Seminalplasma
D: Aqua dest. + Zentrifugation + mAH-Verdünner ohne Seminalplasma
28 Abb. 1:
Schema der Spermaaufbereitung in Versuch 1.1, Färbung mit Hoechst 33342
29 Spermatologie:
Die Motilität wurde mittels computerassistierter Spermienanalyse (CASA, siehe Kapitel 3.5) nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden Spermalagerung untersucht.
Die Plasmamembran- und Akrosomintegrität wurde mittels Durchflusszytometrie (siehe Kapitel 3.6.1) nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden Spermalagerung untersucht.
Ovidukt-Explant-Assay:
Nach 24 Stunden und nach 72 Stunden Spermalagerung wurde ein OEA durchgeführt. Dazu wurden Explante aus den Eileitern von zwei verschiedenen Sauen verwendet.
Der OEA wurde wie in Kapitel 3.3.3. beschrieben mit folgenden Modifikationen durchgeführt:
Jede Spermaprobe wurde zu jedem Untersuchungszeitpunkt mit je einem Explant von zwei Sauen getestet. Es ergaben sich bei acht Ebern, 16 Spermaproben und zwei Sauen insgesamt 32 Explante pro Untersuchungszeitpunkt. Ein Beispiel für die mikroskopische Ansicht eines Explantes mit gebundenen und gefärbten Spermien ist in Abb. 3 abgebildet. Einen Überblick über die Verteilung der mit Hoechst 33342 gefärbten Spermaproben auf den Explanten gibt Abb. 2.
30 Abb. 2:
Überblick über die Verteilung der mit Hoechst 33342 gefärbten Spermaproben auf die Explante in Versuch 1.1
Probe A: Hoechst + Zentrifugation + mAH-Verdünner mit 10 % Seminalplasma Probe B: Hoechst + Zentrifugation + mAH-Verdünner ohne Seminalplasma
Abb. 3:
Explant mit gebundenen Spermien nach der Koinkubation, 400-fache Vergrößerung
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3.4.1.2 Versuch 1.2: Einfluss einer Färbung mit MitoTracker® auf spermatologische Parameter
Fragestellung:
Haben die Färbung von Eberspermien mit MitoTracker® Green FM und MitoTracker® Red FM und die Percollzentrifugation einen destabilisierenden Effekt auf Eberspermien?
Versuchsdurchführung:
Spermaverarbeitung und Färbung:
Die Spermagewinnung erfolgte wie unter Kapitel 3.3.1, die Erstellung eines Standardspermiogramms wie unter Kapitel 3.3.2 beschrieben. Es wurden sechs einzelne Ejakulate von sechs verschiedenen Ebern verwendet.
Es wurden drei verdünnte Spermaportionen (Fa. Minitüb, 100 ml) mit mAH-Verdünner jeweils in einem Verdünnungsgrad von 20 Mio/ml hergestellt.
Es schloss sich die Zentrifugation des Seminalplasmas an. Jeweils 50 ml der vorverdünnten Proben wurden in vier Zentrifugenröhrchen (50 ml, Fa. Greiner Bio- one GmbH, Frickenhausen) gefüllt und für zehn Minuten bei 3.360 g zentrifugiert (Megafuge 2.0 R, Fa. Heraeus Instruments GmbH). Anschließend wurden aus je zwei Röhrchen 25 ml Überstand mit einer Glaspipette in ein weiteres Zentrifugenröhrchen überführt, so dass pro Ejakulat zwei Zentrifugenröhrchen mit jeweils 50 ml resultierten. Diese wurden erneut für zehn Minuten bei 3.360 g zentrifugiert. Danach wurden wieder je Röhrchen 25 ml Überstand abpipettiert und in ein weiteres Zentifugenröhrchen überführt, so dass 50 ml Überstand entstanden. Zur Untersuchung des Seminalplasmas auf Spermienfreiheit und Herstellung des Seminalplasmaverdünners siehe Kapitel 3.4.1.1.
Nun wurden jeweils 50 ml der vorverdünnten Proben mit zehn µl MitoTracker® Green FM (Konzentration der Stammlösung 672,0 µg/ml, Endkonzentration 0,13 µg/ml, Lösungsmittel Dimethylsulfoxid) und jeweils 50 ml mit zehn µl MitoTracker® Red FM (Konzentration der Stammlösung 724,6 µg/ml, Endkonzentration 0,15 µg/ml, Lösungsmittel Dimethylsulfoxid) gefärbt. Außerdem wurden zu weiteren 50 ml zehn µl Dimethylsulfsoxid (DMSO) hinzugegeben. Diese Probe diente zur Kontrolle, da sie
