Einfluss von Haltezeiten während der Frühphase der Konservierung auf den Energiemetabolismus und die Qualität von Eberspermien

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss von Haltezeiten während der Frühphase der Konservierung auf den Energiemetabolismus und

die Qualität von Eberspermien

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae –

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Ulrike Wallner Heidenheim a. d. Brenz

Hannover 2015

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Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken/

Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorik

Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski

2. Gutachterin: Prof. Dr. Martina Hoedemaker, PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2015

Eine Arbeit aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen

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Meiner Familie

und Thomas

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Auszüge aus der vorliegenden Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit in Form einer Veröffentlichung und zwei Vorträgen vorgestellt:

 M. Schulze, H. Henning, K. Rüdiger, U. Wallner, D. Waberski (2013);

Temperature management during semen processing: Impact on boar sperm quality under laboratory and field condition

Theriogenology, 80, 990-998

 „Effects of holding times during boar semen processing on energy metabolism and bacterial growth“

U. Wallner, H. Henning, Q. T. Nguyen, D. Waberski

(47. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung, Gießen, 27.02.2014)

 „Revision of current protocols for boar semen processing:Retarded cooling of diluted semen enhances sperm quality“

U. Wallner, S. Kastens, A. Riesenbeck, H. Henning, D. Waberski

(48th Annual Conference on Physiology and Pathology of Reproduction, Zürich, 11.02.2015)

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 2

2.1 Kälteschock bei Eberspermatozoen ... 2

2.1.1 Einfluss von Kälteschock auf Plasmamembranen ... 2

2.1.2 Einfluss von Haltezeiten auf die Kälteschocksensibilität ... 4

2.2 Samenverarbeitungsverfahren in der Praxis ... 6

2.3 Energiemetabolismus bei Spermatozoen ... 7

2.3.1 ATP-Produktion und Energieladung ... 7

2.3.2 Einfluss der Lagerung auf den Energiemetabolismus ...11

3 Material und Methoden ...16

3.1 Versuchsübersicht ...16

3.2 Verbrauchsmaterialien und Geräte ...17

3.3 Lösungen und Chemikalien ...18

3.4 Tiere ...18

3.5 Samengewinnung ...19

3.6 Untersuchung des nativen Samens ...19

3.7 Monitoring der Probentemperatur ...20

3.8 Experimentelle Designs ...21

3.8.1 Experiment 1: Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden ...21

3.8.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten und Haltetemperaturen des vorverdünnten Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung ...24

3.8.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig hyperthermer Verdünnung ...27

3.8.4 Experiment 4: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach zweistufig hypothermer (Exp. 4 a) oder einstufig isothermer Verdünnung (Exp. 4 b) ...29

3.8.5 Experiment 5: Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung ...31

3.8.6 Experiment 6: Temperaturverlauf in der Prozesskette der Samenverarbeitung auf einer Besamungsstation und Vergleich mit Laborstandards ...33

3.8.6.1 Temperaturverlauf im Sperma während der Verarbeitung auf einer Besamungsstation bei Samenverarbeitung ...33

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3.8.6.2 Vergleich des Verdünnungsverfahrens einer Besamungsstation mit dem

Laborstandard ...35

3.9 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA) ...37

3.9.1 Testprinzip ...37

3.9.2 Gerät und Software ...38

3.9.3 Messung ...39

3.10 Membranintegrität in der Durchflusszytometrie ...40

3.10.2 Gerät und Farbstoffe ...41

3.10.3 Grundeinstellungen ...41

3.10.4 Messung und Auswertung ...43

3.11 Mitochondrienmembranpotential in der Durchflusszytometrie ...44

3.11.3 Grundeinstellungen ...45

3.12 Kinetik des Calcium-Influx ...47

3.12.3 Vorbereitung der Medien und Spermien ...48

3.12.3.1 Messung und Auswertung ...49

3.13 Bestimmung des ATP-Gehalts und der Energieladung ...51

3.13.2 Geräte und Vorbereitung ...52

3.13.3.1 Präparation der Spermien für die Lagerung bei -20 °C ...54

3.13.3.2 Erstellen der Standardkurve für die ATP-Messung ...54

3.13.3.3 Extraktion von ATP aus der gefrorenen Probe ...55

3.13.3.4 Messung der Lumineszenz und Berechnung der ATP-Konzentrationen ...55

3.13.3.5 Konvertieren der Nukleotide und deren Bestimmung ...56

3.13.3.6 Berechnung der Energieladung ...57

3.14 Bestimmung der Gesamtkeimzahl ...57

3.15 Statistische Auswertung ...57

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4 Ergebnisse ...59

4.1 Experiment 1: Vergleich von zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden ...59

4.1.1 Temperaturverlauf während der Samenverarbeitung...59

4.1.2 CASA-Motilitätsparameter ...61

4.1.3 Membranintegrität ...63

4.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten und -temperaturen des vorverdünnten Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung ...65

4.2.4 Mitochondrienmembranpotential ...71

4.2.5 Energiestoffwechsel ...73

4.2.6 Gesamtkeimzahlbestimmung ...75

4.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig hyperthermer Verdünnung ...79

4.3.2 Casa-Motilitätsparameter ...81

4.4 Experiment 4 a: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach zweistufig hypothermer Verdünnung ...84

4.4.3 Membranintegriät ...87

4.5 Experiment 4 b: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung...88

4.6 Experiment 5: Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlung des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung ...92

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4.7 Experiment 6: Temperaturverlauf in der Prozesskette der Samenverarbeitung auf

einer Besamungsstation und Vergleich mit Laborstandards ...96

4.7.4 Spezifische Reaktivität gegenüber Bikarbonat (Calcium-Influx) ... 100

5 Diskussion ... 101

6 Zusammenfassung ... 111

7 Summary ... 113

8 Literaturverzeichnis ... 115

9 Anhang ... 122

9.1 Tabellen und Grafiken ... 122

9.2 Chemikalien ... 146

9.3 Rezepte ... 147

9.3.1 Formolcitrat ... 147

9.3.2 HBS (HEPES^®- buffered saline) ... 147

9.3.3 Tyrode basierte Medien ... 148

9.3.3.1 Herstellung der Stammlösungen ... 148

9.3.3.2 Herstellung der Tyr _BikCa-Vormischung ... 148

9.3.3.3 Herstellung der Tyr_Ca-Vormischung ... 149

9.3.3.4 Komplettierung der Medien ... 149

9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 150

10 Abbildungsverzeichnis ... 153

11 Tabellenverzeichnis ... 159

Danksagung ... 161 Erklärung ... Fehler! Textmarke nicht definiert.

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Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter Abb. Abbildung

ADP Adenosindiphosphat AK Adenylatkinase

ALH gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn (amplitude of lateral head displacement)

AMP Adenosinmonophosphat ATP Adenosintriphosphat

BCF Frequenz des Kreuzens des gewundenen Bewegungspfades mit der gemittelten Bewegungsbahn (beat cross frequency)

BSA bovines Serumalbumin BTS Beltsville Thawing Solution bzw. beziehungsweise

Ca Calzium ca. circa

CASA computer-assistierte Spermienanalyse cm Zentimeter

D Tag (die)

DAP Länge der gemittelten Bahn (distance average path) DCL Länge der gewundenen Bahn (distance curved line) DNS Desoxiribonuleinsäure (desoxy ribonucleic acid) DSL Länge der direkten Strecke (distance straight line) EC Energieladung (energy charge)

EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii

Exp. Experiment Fa. Firma

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

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FL 1-4 Filter Nummer 1 – 4

FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter)

g Erdbeschleunigung (gravitational acceleration)

G Gate

h Stunde (hora)

HBS Hepes-gepufferte Salzlösung (hepes buffered saline)

Hz Hertz

Jagg Agglutinierte Form des Farbstoffs JC-1

JC-1 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbo-cyanine iodide l Liter

LIN Linearität (linearity)

M Mol

MAS Morphologisch abweichende Spermien mg Milligramm

min Minute Mio Millionen ml Milliliter mM millimol

MMP Mitochondrienmembranpotential Mrd Milliarden

ms Millisekunde MW Mittelwert

n Probandenzahl (numerus) neg. negativ

nm nanometer

p Irrtumswahrscheinlichkeit (probability) PEP Phosphoenolpyruvat

PI Propidiumiodid PK Pyruvatkinase pmol picomol

PNA peanut agglutinin, Lektin der Erdnuss (arachis hypogea)

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pos. positiv

PPi Pyrophosphat prog. progressiv PVA Polyvinylalkohol PVP Polyvinylpyrrolidon R Reaktivität

RLU relative light units RN Range

RT Raumtemperatur

s Sekunde

s. siehe

SD Standardabweichung (standard deviation) Sp. Spermien

SSC Seitwärtsstreulicht (sideward scatter) STR straightness

Tab. Tabelle

VAP Geschwindigkeit der gemittelten Bahn (velocity average path) VCL Geschwindigkeit der gewundenen Bahn (velocity curved line) VSL Geschwindigkeit der direkten Strecke (velocity straight line) WOB wobble

z.B. zum Beispiel

ZDS Zentralverband der deutschen Schweineproduktion e.V.

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1 Einleitung

Da Eberspermien sehr kältesensibel sind, ist die Konservierung noch immer mit Schwierigkeiten verbunden. Die Verarbeitung von Ebersperma zu flüssigkonservierten Samenportionen hat in der Schweinezucht eine hohe Relevanz.

Inzwischen werden über 90% der Sauen künstlich besamt; mehr als 95 % der Besamungen werden mit flüssig konserviertem Samen durchgeführt, der bei + 17 °C gelagert wird (JOHNSON et al. 2000, RIESENBECK 2011). Eine hygienische und temperaturoptimierte Verarbeitung des Spermas gilt als maßgeblich für die Qualität des bis zu fünf Tagen gelagerten Spermas.

Es ist seit langem bekannt, dass Haltezeiten des vorverdünnten Samens bei höheren Temperaturen (20 – 32 °C) während der Frühphase der Verarbeitung positive Auswirkungen auf die Kältetoleranz der Zellen bei nachfolgender Abkühlung auf die Lagerungstemperatur haben (PURSEL et al. 1973 b, CASAS et al. 2013). Bei welcher Temperatur und innerhalb welcher Zeitspanne die bestmögliche Adaption der Zellen stattfindet, und ob Haltezeiten bei höheren Temperaturen möglicherweise negative Effekte auf Energiestoffwechsel und Bakterienwachstum in den Spermaportionen haben, ist noch weitestgehend unbekannt. Zudem sind Haltezeiten bis zu sechs Stunden während der Prozesskette der Spermaverarbeitung häufig unvermeidlich, ohne dass deren Auswirkung auf Spermaqualität und mikrobiellen Status bekannt ist.

Ziel der vorliegenden Studie war es daher, den Einfluss von Haltezeiten zwischen 30 min und 6 h bei 21 °C sowie 32 °C während der Frühphase der Konservierung auf die Qualität gelagerten Eberspermas unter Anwendung gängiger Praxisverfahren der Spermaverdünnung zu untersuchen. Dabei wurden neben spermatologischen Parametern, wie der Motilität und Membranintegrität, mögliche Einflüsse auf den Energiestoffwechsel und das bakterielle Wachstum betrachtet. Zusätzlich sollten die praxisüblichen Verarbeitungsmethoden überprüft und Temperaturprofile während der Verarbeitungskette erhoben werden.

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2 Literaturübersicht

2.1 Kälteschock bei Eberspermatozoen

2.1.1 Einfluss von Kälteschock auf Plasmamembranen

Eberspermien gelten im Gegensatz zu anderen Säugetierspermien als besonders sensibel gegenüber Abkühlung. Dabei spielt die Struktur der Plasmamembran der Samenzellen eine große Rolle. Wie alle biologischen Membranen besteht diese aus Lipiden (hauptsächlich Phospholipide), die sich in einer Doppelschicht anordnen, und Proteinen. Membranen sind fluide Strukturen, was bedeutet, dass sich Moleküle innerhalb der Ebene der Doppelschicht bewegen können. Sie sind asymmetrisch aufgebaut, das heißt die Lipid- und Proteinzusammensetzung der beiden Schichten ist unterschiedlich (DE LEEUW et al., 1991). Die Fähigkeit von Spermien, niedrige Temperaturen zu tolerieren, scheint vor allem von der Lipidzusammensetzung der Membran abzuhängen, welche tierartlich sehr verschieden ist (DE LEEUW et al., 1990; WATERHOUSE et al., 2006).

Ein relativ geringer Cholesteringehalt in der Plasmamembran unterscheidet die Samenzellen von temperaturempfindlichen Spezies wie z.B. dem Eber von denen temperaturresistenter Spezies (z.B. Mensch, Kaninchen). Der Cholesteringehalt von Eberspermien beträgt ca. 0,034 µmol/ 10⁹ Zellen, Bullenspermien enthalten ca.

0,893 µmol/ 10⁹ Zellen, während Spermien von Menschen und Kaninchen einen Cholesteringehalt von ca. 1,4 µmol/ 10⁹ Zellen haben (DARIN-BENNETT u. WHITE, 1977; NIKOLOPOULOU et al., 1985). Beim Eber ergibt sich daraus ein, im Vergleich zu anderen Arten, niedriges molares Cholesterin/ Phospholipid-Verhältnis von 0,12, welches die Temperaturempfindlichkeit der Zellen verstärkt. Beim resistenteren Bullen beträgt das Verhältnis 0,45, beim Menschen sogar 0,99 (DARIN-BENNETT u.

WHITE 1977, NIKOLOPOULOU et al. 1985; DE LEEUW et al., 1990). PARKS und LYNCH (1992) berichten von einem Verhältnis von 0,26 beim Eber.

Die Kombination aus niedrigem Gehalt an Cholesterin und dessen asymmetrischen Verteilung in der Membran - es befindet sich mehr in der äußeren Schicht als in der inneren - macht vor allem die innere Schicht sehr anfällig. PARKS und LYNCH (1992) fanden außerdem eine Beziehung zwischen der Kältesensitivität und dem

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Proteingehalt der Plasmamembran. Eberspermien zeigten einen höheren Gehalt an Membranproteinen als Spermien anderer Säugetierspezies.

Zudem besteht ein ungünstigeres Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren, welches bei Eberspermien > 2,5 im Vergleich zu ungefähr 1 bei humanen Spermien beträgt. Der relativ hohe Anteil an ungesättigten Fettsäuren macht die Samenzellen anfällig für Schäden durch Peroxidation, welche sich negativ auf Motilität, Metabolismus, Zellstruktur und Fertilität auswirken (WHITE, 1993). Ein hoher Anteil an ungesättigten Fettsäuren zusammen mit dem niedrigen Cholesteringehalt verursacht zusätzlich eine höhere Fluidität der Spermienmembran, und dadurch eine erhöhte Kälteschocksensibilität (LADBROOKE u. CHAPMAN, 1969; WATERHOUSE et al., 2006).

Kälteschock führt zu Schäden in der Membran der Samenzellen. Einige Veränderungen der Membran sind dabei reversibel, während andere fatal für die Zelle sind (GUTHRIE u. WELCH, 2005). Das offensichtlichste Zeichen eines ausgeprägten Kälteschocks ist ein irreversibler Motilitätsverlust. Dieser wird begleitet von erhöhter Permeabilität der Plasmamembran, welche zum Verlust von Kationen, ATP und Enzymen führt (PARKS u. LYNCH, 1992; DROBNIS et al., 1993).

Kälteschock bei Eberspermien entsteht, wenn frisch ejakulierte Samenzellen entweder schnell, mit einer Abkühlrate von 1 - 2 °C/ min oder schneller, abgekühlt werden (JOHNSON et al., 2000) und/ oder unter 15 °C gekühlt werden (DE LEEUW et al., 1991). Bei Temperaturen von < 15 °C treten bei einer Subpopulation von Spermien bereits Motilitätsverluste, verringerte Membranintegrität sowie eine erhöhte Permeabilität der Membran auf (DROBNIS et al., 1993; JOHNSON et al., 2000). Der Zusammenhang von Kälteschockverhalten und der Lipidzusammensetzung der Spermienmembran lässt darauf schließen, dass die Schädigung mit einem Phasenübergang (Phasentransition) der Membranlipide zusammenhängt (DROBNIS et al., 1993, reviewed in WATSON, 1996). Die Membranlipide wechseln bei der Abkühlung vom flüssigen in einen gelförmigen Zustand. Die verschiedenen Lipidgruppen innerhalb der Membran erreichen diesen Zustand der Phasentransition bei unterschiedlichen Temperaturen. Wenn dabei feste und flüssige Bereiche direkt nebeneinander auftreten, kann es zur Phasenseparation kommen, wobei

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Membranproteine irreversibel agglutinieren und dadurch ihre Funktion verlieren (DE LEEUW et al., 1990; DE LEEUW et. al., 1991). Diese Defekte sind geringer, wenn sich die Membran entweder in der flüssigen oder in der Gelphase befindet. Die Permeabilität erhöht sich aber stark durch die Reorganisation während der Phasentransition (DROBNIS et al., 1993). Da die Transition für jede Phospholipidgruppe bei einer anderen Temperatur stattfindet, kann nur ein Temperaturbereich für die Reorganisation der Membran angegeben werden. Bei Ebersamenzellen liegt der Bereich des Phasenübergangs bei 30 – 10 °C (DROBNIS et al., 1993; SCHMID et al., 2013).

In praktischer Hinsicht ist es wichtig, dass die Kälteschocksensibilität weniger von der Lagerungsdauer abhängig ist, sondern vielmehr von der Zieltemperatur und davon, in welcher Geschwindigkeit diese erreicht wird (JOHNSON et al., 2000; SCHMID et al. 2014).

2.1.2 Einfluss von Haltezeiten auf die Kälteschocksensibilität

Das Halten bzw. die Inkubation von verdünntem und frischem unverdünnten Eberspermien bei 24 – 26 °C (PURSEL et al., 1973 b) sowie bei 30 °C (PURSEL et al., 1972) für bis zu 7,5 Stunden vor der Endverdünnung führt zu einer graduellen Kälteschockresistenz für die weitere Abkühlung und Lagerung bei 5 °C. Die Autoren zeigten, dass vor allem die Spermien, die 4,5 h und 6 h gehalten wurden, gegenüber den direkt abgekühlten Proben bessere Motilität und Membranintegrität aufwiesen.

CASAS et al. (2013) zeigten, dass Proben, die einer Haltezeit von 24 h bei 17 °C ausgesetzt waren, bessere Motilität und höhere Membranintegrität bei der Abkühlung und während der 24-stündigen Lagerung bei 5 °C aufwiesen, als Proben, die ohne Haltezeit abgekühlt wurden. Dagegen beschrieben GUTHRIE und WELCH (2005), dass Haltezeiten von 24 h bei 15 °C von verdünntem Ebersamen vor dem Einfrieren der Proben zu verringerten Wurfgrößen führte.

Vor allem in der Kryokonservierung der Eberspermien werden mittlerweile die positiven Effekte einer Haltezeit bei Temperaturen über 15 °C beobachtet und genutzt. In den meisten Kryoprotokollen werden Haltezeiten von mindestens zwei bis vier Stunden nach der Verdünnung und vor der weiteren Abkühlung integriert, um die

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Schäden des Einfrierens und Auftauens zu minimieren (WATSON, 1996; ERIKSSON et al., 2001). Die Zeitspanne hat dabei größeren Einfluss als die Haltetemperatur.

Verlängerte Haltezeiten bei 17 °C von bis zu 10 h oder 20 h führen zu einer höheren Membranintegrität nach dem Auftauen (ERIKSSON et al., 2001). TAMULI und WATSON (1994) berichteten von erhöhter Kälteresistenz von Eberspermien nach Haltezeiten bis zu 16 h bei Raumtemperatur.

Die genauen Mechanismen, durch welche die Haltezeiten zu einer besseren Kältetoleranz der Membran führen, werden noch diskutiert. Vermutlich wird durch die Haltezeiten den Samenzellen die Möglichkeit zur Reorganisation der Membranlipide und somit zur Adaption an niedrige Temperaturbereiche gegeben. Während der Zeitspanne binden Komponenten aus dem Seminalplasma bzw. Verdünner an der Zellmembran und tragen zur Stabilisierung bei (PURSEL et. al., 1973 a; CASAS u.

ALTHOUSE, 2013; ERIKSSON et al., 2001). Substanzen, wie beispielsweise Phosphatidylserin, schützen dabei die Plasmamembran von Eberspermien gegenüber Kälteeinflüssen (BUTLER u. ROBERTS, 1975; NIKOLOPOULOU et al., 1985).

Im Gegensatz dazu stellen PETRUNKINA et al. (2005) die Verarbeitung von Spermien bei höheren Temperaturen in Frage. Spermien, die mit 32 °C warmen Verdünner verdünnt wurden, zeigten eine erhöhte Destabilisierung der Membran im Gegensatz zu mit 21 °C verdünnten Proben. Die Autoren nahmen an, dass die Spermien, die bei Temperaturen nahe der Körpertemperatur verarbeitet werden, nicht, wie bei niedrigen Temperaturen, ihren Stoffwechsel verringern. Dies könnte beispielsweise in Form von Membrandestabilisierungen zu Beeinträchtigungen der Spermienqualität führen, die die Kapazitation beeinflussen. Die genauen Vorgänge, wie bzw. ob sich die Haltezeiten, vor allem nahe der Körpertemperatur, beispielsweise auf Vorgänge wie den Energiestoffwechsel auswirken, sind nach Kenntnis der Autorin nicht beschrieben.

Nicht nur die Abkühlung, sondern auch der Verdünnungsgrad des Ejakulats während der Haltezeit beeinflusst die Kältesensibilität der Eberspermien. Proben, die 1:2 vorverdünnt einer Haltezeit für 1 h, 3 h oder 5 h bei 30 °C ausgesetzt und anschließend ausverdünnt wurden, zeigten höhere Motilität nach dem Kälteschock

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(5 °C), als die Proben, die vor der Haltezeit bereits ausverdünnt wurden (PURSEL et al., 1973 a).

2.2 Samenverarbeitungsverfahren in der Praxis

Grundsätzlich werden derzeit in der Praxis zwei unterschiedliche Methoden für die Verdünnung von flüssigkonservierten Eberspermien durchgeführt: Die einstufige und die zweistufige Verdünnung. Bei der einstufigen Verdünnung werden die Spermien isotherm, d.h. mit einem auf 32 °C (± 1 °C) temperierten Verdünner innerhalb von 30 min nach der Samengewinnung in einem Schritt auf die Endkonzentration ausverdünnt. Bei der zweistufigen Verdünnung wird das Ejakulat zunächst mit auf 32 °C (± 1 °C) angewärmten Verdünner im Verhältnis 1:1 vorverdünnt, und in einem zweiten Schritt entweder mit ebenfalls 32 °C (± 1 °C) warmen Verdünner (zweistufig isotherm) oder mit einem hypothermen, auf 21 °C (± 1 °C) temperierten Verdünner, ausverdünnt (zweistufig hypotherm) (WABERSKI, 2009). Vor allem bei der zweistufig hypothermen Verdünnung werden die Proben häufig vor der zweiten Verdünnung einer Haltezeit von bis zu 20 min bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die Vorverdünnung ist ein kritischer Schritt in der Samenverarbeitung und sollte nicht in einem niedrigeren Verhältnis als 1:1 durchgeführt werden, da sich sonst der stabilisierende Effekt auf die Samenzellen verringert (PURSEL et al., 1972; STÄHR et al., 2009; WABERSKI, 2009).

Die in der Praxis am häufigsten durchgeführte Verdünnung ist das zweistufig hypotherme Verfahren (LÓPEZ RODRÍGUEZ et a., 2012). Diese ist für den Ablauf der Samenverarbeitung in Besamungsstationen praktikabler, da an produktionsintensiven Tagen oder bei Transport von vorverdünnten Ejakulaten aus entfernten Eberställen in zentrale Labore zur Weiterverarbeitung ohnehin Haltezeiten bei Raumtemperatur auftreten, deren Dauer variabel ist. Aus wirtschaftlicher Sicht spielt außerdem eine Rolle, dass bei hypothermer Ausverdünnung weniger Energie für das Erwärmen des Verdünners benötigt wird. Ein weiterer Grund für die hypotherme Verdünnung ist das Ziel, die Samenproben schnellstmöglich auf die Lagerungstemperatur abzukühlen, da so ein zeitnaher Versand bei konstanten

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Temperaturen möglich ist (LÓPEZ RODRÍGUEZ et al., 2012). Weiterhin könnte durch beschleunigtes Abkühlen mögliches Bakterienwachstum verringert werden.

Festzustellen ist, dass Haltezeiten derzeit in der Praxis wenig standardisiert sind und keine gesicherten Informationen über das Abkühlverhalten (Temperaturprofile) in den verdünnten Samenproben während der Anwendung der unterschiedlichen Verdünnungsregime vorliegen.

Ob die Spermienqualität durch die zweistufig hypotherme Verdünnung und den damit verbundenen schnellen Temperaturabfall der Samenproben beeinträchtigt wird, wird noch diskutiert. Bei einem direkten Vergleich von zweistufig isothermer Verdünnung, mit zweistufig hypothermer Verdünnung, (Verdünnertemperatur 20 – 23 °C, nach isothermer Vorverdünnung im Verhältnis 1:1), konnte kein Einfluss des Verdünnungsregimes auf CASA-Motilitätsparameter festgestellt werden (PETRUNKINA et al., 2005; LÓPEZ RODRÍGUEZ et al., 2012). PETRUNKINA et al.

(2005) konnten zusätzlich keine negativen Effekte der zweistufig hypothermen Verdünnung auf die Membranintegrität, sowie keine Veränderung der Reaktionsfähigkeit auf kapazitierende Stimuli zeigen.

In einem parallel zur vorliegenden Studie erfolgten Praxisversuch von mehreren europäischen Besamungsstationen (n = 23) wurden Verdünnungsmethoden und Spermaqualität untersucht. 30 % der Besamungsstationen verarbeiteten den Samen einstufig isotherm, bei 70 % erfolgte die Verdünnung zweistufig hypotherm (24 ± 3 °C). Hier konnte ein Einfluss des Verdünnungsregimes ermittelt werden. Die zweistufig hypotherm verdünnten Proben wiesen eine niedrigere Membranintegrität und niedrigere Aktivität der Mitochondrien im Vergleich zu den einstufig verarbeiteten Proben. Die Autoren führen dies auf den schnellen Temperaturabfall in den für Eberspermien kritischen Temperaturbereich zurück (SCHULZE et al., 2013).

2.3 Energiemetabolismus bei Spermatozoen

2.3.1 ATP-Produktion und Energieladung

Samenzellen von Säugetieren sind hochspezialisierte und funktionelle Zellen, deren Hauptaufgabe es ist, das paternale Genom zu der Eizelle zu bringen. Um diese

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Aufgabe zu erfüllen, ist zunächst die Entwicklung und Reifung der Spermien im Hoden notwendig. Während dieser Zeit sind die Spermien in der Regel immotil. Ein wichtiger Schritt während der Passage durch den Nebenhoden ist der Erwerb der progressiven Motilität, die in erster Linie energieabhängig ist. Diese wird aber gleichzeitig durch das Milieu der viskösen epididymalen Flüssigkeit gehemmt. In dieser verbleiben die Samenzellen bis zur Ejakulation (MISRO u. RAMYA, 2012).

Eine kontinuierliche Energiebereitstellung für energieverbrauchende Prozesse wie Motilität, Biosynthese, aktiver Ionentransport, Kapazitation und Akrosomenreaktion wird wie bei allen tierischen Zellen durch die Synthese von ATP ermöglicht. Der größte Teil der bereitstehenden Energie wird allerdings für die Motilität aufgewendet, die durch das Schlagen der langen Geißel erzeugt wird (BOHNENSACK u.

HALANGK, 1986). Die Geißel macht ca. 90 % der Länge des Spermiums bei Säugetieren aus. Energie in Form von ATP gilt als Notwendigkeit, damit die effiziente Geißelbewegung zur Vorwärtsbeweglichkeit führen kann. Veränderte Bewegungsmuster, aufgebrauchte Energieressourcen oder beides führen dazu, dass die Zellen die Fähigkeit der Vorwärtsbeweglichkeit verlieren und damit auch ihre Befruchtungsfähigkeit. Es ist daher wichtig, den Energiestatus der Spermien zu kennen, um deren Potential für Motilität und Überleben einzuschätzen.

Zum Verständnis des Energiestoffwechsels muss der Aufbau eines Spermiums bzw.

der Geißel betrachtet werden. Die Geißel untergliedert sich in drei Teile; dem Mittelstück, dem Hauptstück (ca. ¾ der Gesamtlänge) sowie dem Endstück. Sie besteht aus einem Axonem, welches aus neun Mikrotubuli-Paaren gebildet wird, die sich um ein zentrales Mikrotubulus-Paar gruppieren. Das Axonem erstreckt sich über die gesamte Länge des Flagellums (FAWCETT, 1975). Mitochondrien sind nur im Mittelstück der Geißel zu finden, wo sie das Axonem umhüllen. Hier kann unter aeroben Bedingungen Energiestoffwechsel stattfinden (TRAVIS et al., 1998).

In der fibrinösen Hülle der Geißel, die für die Stabilität und für die optimale Krümmung zuständig ist, wurden vor allem im Hauptstück Enzyme der Glykolyse (z.B. Hexokinase und Phosphofruktokinase) nachgewiesen.

Die benötigte Energie in Form von intrazellulärem Adenosintriphosphat (ATP) kann durch zwei verschiedene Stoffwechselwege generiert werden: Durch die Glykolyse

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und die oxidative Phosphorylierung, wobei die oxidative Phosphorylierung eine größere Energieausbeute vorweist. Bei der Glykolyse wird Glukose zu Pyruvat umgewandelt, wobei nur ein kleiner Teil des energetischen Potentials von Glukose freigesetzt wird: 2 Mol ATP pro Mol Glukose. Wenn Pyruvat in den Mitochondrien durch die oxidative Phosphorylierung weiter oxidiert wird, werden pro Mol Glukose 30 Mol ATP freigesetzt (FORD, 2006). Welche Art des Energiestoffwechsels in überwiegendem Maße in Spermien stattfindet, und welche Substrate in welchem Verhältnis dafür herangezogen werden, ist nach bisherigen Erkenntnissen abhängig von der Tierart (FORD, 2006; MISRO u. RAMYA, 2012).

ATP, welches in den Mitochondrien erzeugt wird, müsste auch bis in die distalen Segmente des Flagellums transportiert werden, um den Energiebedarf des Axonems zu decken. Die Distanz von Bildungs- zu Verbrauchsstätte erscheint allerdings zu groß, um ATP auf ganzer Länge der Geißel zur Verfügung zu stellen (TURNER, 2003). Die Mitochondrien von Eberspermien enthalten nur wenige innere Cristae, an welchen wichtige Schritte der ATP-Synthese stattfinden, im Gegensatz zu beispielsweise Mitochondrien von Leberzellen. Deshalb wird angenommen, dass diese wenig effizient und damit für die Hauptenergieversorgung nicht geeignet sind (RODRIGUEZ-GIL, 2013).

Es wird von einigen Forschern angenommen, dass die Glykolyse bei Eberspermien den wichtigsten Weg für die Energiegewinnung darstellt (MARIN et al., 2003; MISRO u. RAMYA, 2012). Obwohl die Ausbeute bei der Glykolyse wesentlich geringer ist als bei der oxidativen Phosphorylierung zeigten MARIN et al. (2003), dass nur 5 % der Energie von Eberspermien durch letztere erzeugt werden. Eine Erklärung dafür ist, dass sich die Samenzellen nach der Ejakulation im weiblichen Genitaltrakt unter hauptsächlich anaeroben Bedingungen fortbewegen müssen. Unter diesen Umständen ist die Glykolyse der effizientere Stoffwechselweg (RODRIGUEZ-GIL, 2013). Studien mit Mäusen zeigten, dass die Glykolyse unverzichtbar für die Funktionen der Spermien ist, aber die oxidative Phosphorylierung für die männliche Fruchtbarkeit nicht essentiell ist (MISRO u. RAMYA, 2012). Vor allem scheint die Glykolyse für die Kapazitation und speziell für die Hyperaktivierung wesentlich zu sein. Dies legt nahe, dass die Glykolyse den primären Stoffwechselweg darstellt und

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oxidative Phosphorylierung eine Reservefunktion erfüllt. Eine weitere Theorie ist, dass sich die Spermien ihrer Umwelt anpassen, also je nach verfügbarem Substrat den entsprechenden Syntheseweg wählen. Beispielsweise würde bei Mangel an Glukose und Fruktose mehr Laktat und Pyruvat in den Mitochondrien verarbeitet werden. Außerdem scheinen verschiedene Vorgänge in der Zelle unterschiedliche Energiequellen zu nutzen. So erfordert die Akrosomenreaktion bei Eberspermien wahrscheinlich eher Laktat oder Pyruvat für die ATP-Produktion in den Mitochondrien, während Energie für die Motilität wie oben erwähnt hauptsächlich über die Glykolyse gewonnen wird (MIKI, 2017; RODRIGUEZ-GIL, 2013).

FORD (2006) dagegen berichtet, dass der Austausch von ATP, Adenosindiphosphat (ADP) und Phosphat (Pi) zwischen dem Flagellum und den Mitochondrien mit Hilfe der Adenylatkinase, die als Shuttle fungiert, durchaus möglich ist und dadurch die Aufrechterhaltung der Motilität über den mitochondrialen Stoffwechsel gewährleistet werden kann. Außerdem zeigen seine Experimente, dass Spermien von Mäusen, bei denen die Glykolyse mit dem GAPDH-Inhibitor α-Chlorohydrin geblockt wurde, dennoch für lange Zeit motil waren. Weiterhin argumentiert der Autor, dass die Spermien der meisten Spezies auch in zuckerfreien Medien vollständig motil bleiben.

Wie oben erwähnt, ist Energie in Form von ATP wichtig, um die für die Zellen lebenswichtigen Synthesereaktionen durchzuführen. Das Maß der Energieladung („Energy charge“, EC) ermöglicht eine Einschätzung der Wachstumsphasen, der Vitalität der Zellen und einen Vergleich von Zellpopulationen (FORD u. LEACH, 1998). Die Menge von metabolisch verfügbarer Energie, die vorübergehend im Adenylat-System gespeichert ist, hängt linear mit dem Stoffmengenanteil von ATP plus der Hälfte des Stoffmengenanteils von ADP zusammen (CHAPMAN et al., 1971). Dieser Parameter, definiert als Energieladung, und die Formel zur Berechnung wurden von ATKINSON (1967; 1968) wie folgt beschrieben:

Energy charge (EC) = [ATP] + 0,5[ADP]

[ATP] + [ADP] + [AMP]

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Die Grundvoraussetzung ist, dass Zellen/ Organismen versuchen, ein bestimmtes Verhältnis von ATP zu ADP und Adenosinmonophosphat (AMP) aufrechtzuerhalten, und dieses von den Wachstumsphasen der Zellen abhängt (WIEBE u. BANCROFT, 1975). CHAPMAN et al. (1971) zeigten, dass eine große Auswahl von Organismen, sowohl Eukarioten als auch Prokarioten, während derselben Wachstumsphase dieselbe Energieladung haben. Aktiv wachsende und sich teilende Zellen haben ein EC-Verhältnis von 0,8 - 0,95; Zellen, die sich in einer stationären Wachstumsphase befinden, zeigen ein Verhältnis von 0,6 und ruhende bzw. alternde Zellen haben ein Verhältnis von unter 0,5 (WIEBE u. BANCROFT, 1975).

CHULAVATNATOL et al. (1977) analysierten den Nukleotid-Gehalt von humanen Samenzellen mittels Biolumineszenz-Assay und zeigten, dass die physiologische Energieladung von humanen Samenzellen zwischen 0,8 und 0,9 liegt. Damit bestätigten sie ATKINSONS Aussage, dass jede normale, homöostatische Zelle eine physiologische Energieladung zwischen 0,8 und 0,95 hat (ATKINSON, 1968). Mittels Erhöhung des pH-Werts auf über 9 verursachten CHULAVATNATOL et al. (1977) einen drastischen Abfall der Motilität und des Nukleotid-Gehalts. Dennoch blieb die Energieladung stabil bei ca. 0,8. Bei einer pH-Wert-Erniedrigung auf unter 8 sank die Motilität ebenfalls drastisch ab, der Nukleotid-Gehalt und die Energieladung sanken aber nur geringgradig. Auch längere Inkubation bei 30 °C des Spermas verursachte einen Rückgang der Motilität und des Nukleotid-Gehalts, die Energieladung allerdings blieb bei über 0,6. Die Autoren schlossen aus den Ergebnissen, dass die Energieladung nicht direkt mit dem ATP-Gehalt gekoppelt ist und dass sie in humanen Samenzellen auch unter Stress stabil ist.

2.3.2 Einfluss der Lagerung auf den Energiemetabolismus

Mit zunehmender Lagerungsdauer nimmt die Befruchtungsfähigkeit der Eberspermien ab. Dies wird als Folge eines natürlichen, unvermeidbaren Alterungsprozesses angesehen. Neben der sinkenden Befruchtungsfähigkeit finden während der Lagerung auch strukturelle und funktionelle Veränderungen statt. Die Motilität wird hierbei häufig als Maßstab für einen intakten Metabolismus herangezogen. Für die Motilität wird ein Grenzwert von 60 – 70 % für die

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Verwendung in der künstlichen Besamung gesetzt (JOHNSON et al., 2000). Mit zunehmender Lagerungsdauer sinkt die Motilität und der Grenzwert wird im mit BTS verdünnten Samen teilweise sogar schon nach 48 h (KUMARESAN et al., 2009) oder nach 96 h (CEROLINI et al., 2000; WAERHOUSE et al., 2004) Lagerungsdauer unterschritten. Andererseits werden in einigen Studien auch nach einer Lagerung von über 100 h noch mehr als 60 % motile Spermien gefunden (WABERSKI et al., 1994, HENNING et al., 2012).

Die Abnahme der Motilität während der Lagerungsdauer wird unter anderem mit der zunehmenden Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies („reactive oxygen species“, ROS), oder von der sich anschließenden Lipidperoxidation in Verbindung gebracht (CEROLINI et al., 2000; GUTHRIE et al., 2008; KUMARESAN et al., 2009).

Eberspermien gelten wegen ihres hohen Gehalts an mehrfach ungesättigten Fettsäuren als sehr anfällig, da diese als Substrat für die ROS dienen. Diese wirken sich nicht nur auf die Motilität sondern vor allem auf den Energiestoffwechsel der Zellen aus. Der Angriff von freien Radikalen auf die ungesättigten Fettsäuren der Samenzellmembranen führt zu irreversibler Reduktion der Membranfluidität und zur Schädigung membranverbundener ATPasen, die für die Regulation der intrazellulären Ionenkonzentration verantwortlich sind, um die normale Spermienbeweglichkeit aufrechtzuerhalten. Es wurde gezeigt, dass niedrige Konzentrationen dieser Substanzen zahlreiche zelluläre Enzyme und metabolische Prozesse wie die Glykolyse hemmen, und dadurch die ATP-Produktion der Zelle limitieren (GOGOL et al. 2009).

Die Mitochondrien gelten als Hauptbildungsstätte der intrazellulären ROS. Ihr vermehrtes Auftreten führt zu einer Unterbrechung des Elektronentransports in den Mitochondrien. Da der Elektronentransport für die oxidative Phosphorylierung essentiell ist, führt eine Störung zur Reduktion des Mitochondrienmembranpotentials und damit zu einer verringerten mitochondrialen ATP-Produktion und in Folge dessen zu verringerter Motilität (CRAMER u. KNAFF, 1990; GUTHRIE et al., 2008).

ARMSTRONG et al. (1999) zeigten, dass ROS zu Membranschäden führen; dadurch wird der ATP-Gehalt reduziert und die Motilität der Samenzellen verringert sich. Sie wiesen nach, dass H2O2 die für humane Samenzellen aggressivste ROS ist. Der

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Zusatz von H2O2 (0,3 mM – 1,5 mM) in der Samenprobe führte zu einer Reduktion der Motilität und dosisabhängig zur Verringerung des ATP-Gehalts der Spermien.

Zudem konnten die Autoren bei hohen Konzentrationen von H2O2 einen Effekt auf das Mitochondrienmembranpotential nachweisen. Allerdings zeigten GUTRIE et al.

(2008) bei Eberspermien, dass der Zusatz von 300 µM H2O2 eine abrupte Reduktion der Motilität verursachte, aber keinerlei Veränderungen im ATP-Gehalt der Zelle festzustellen waren. Die Autoren vermuten, dass das H2O2 nicht zu einer Unterbrechung der Funktion der Mitochondrien geführt hat, sondern stattdessen die Nutzung von ATP im Axonem unterbrochen oder die Kontraktionsfähigkeit gestört wurde.

GOGOL et al. (2008) ermittelten mit Hilfe der Chemilumineszenzmessung den oxidativen Schaden von Eberspermien während der Lagerung und die Auswirkungen auf den ATP-Gehalt. In vorherigen Studien konnten die Autoren bei humanen Spermien zeigen, dass die induzierte Photonenemmission eng mit der Lipidperoxidation der Samenzellen zusammenhängt und somit als Indikator für oxidativen Stress dienen kann. Nach sieben Tagen Lagerung der mit BTS verdünnten Samenproben bei 15 °C erhöhten sich die Werte der Chemilumineszenz signifikant, parallel dazu sanken die Motilität und der ATP-Gehalt. Die Motilität sank innerhalb der ersten vier Tage um 8 %, der ATP-Gehalt um 25 %. Nach sieben Tagen Lagerung war die Motilität um 11 % gesunken, der ATP-Gehalt um 33 %. Die Autoren vermuten, dass die erniedrigte Motilität die Folge der herabgesetzten ATP- Produktion ist. LONG und GUTRHRIE (2006) analysierten den ATP-Gehalt mit Hilfe eines Biolumineszenz Assays und zeigten, dass keine signifikanten Veränderungen bei in mit BTS konservierten Ebersamenproben während der Lagerung über fünf Tage bei 17 °C auftraten. DZIEKONSKA et al. (2009) testeten den ATP-Gehalt von Ebersamenproben, die mit dem Verdünner Kortowo 3 (K3) verdünnt wurden, über eine Lagerungsdauer von drei Tagen bei 16 °C. Dem Verdünner wurde bei einem Teil der Proben Eigelb zugesetzt. Der ATP-Gehalt wurde ebenfalls mit einem Biolumineszenz-Assay bestimmt. Bei den Proben ohne Eigelb sank der ATP-Gehalt signifikant von 12,9 nmol/ 10⁸Spermien an Tag 0 auf 9,6 nmol/ 10⁸Spermien an

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Tag 3. Mit Zusatz von Eigelb waren keine signifikanten Veränderungen während der Lagerungsdauer zu messen.

Der Nukleotid-Gehalt wurde von KAMP et al. (2003) im frischen Eberejakulat, sowie in 1:2 mit BTS verdünnten Ejakulat nach einer Haltezeit von 60 min bei 35 °C mittels eines Spektrofluorometers gemessen. Für dieselbe Zeit wurde unverdünntes Ejakulat bei 15 °C gehalten. Außerdem wurden die Messungen mit neunfach verdünnten Samenproben nach einer Lagerungsdauer von 48 h bei 15 °C durchgeführt. Die Energieladung (EC) wurde nach der in Kapitel 2.3.1 genannten Formel berechnet. Im frischen Ejakulat wurde eine EC von 0,82 ermittelt. Nach 60 min bei 35 °C sank bei den 1:2 verdünnten Proben die EC auf 0,33. Dagegen betrug bei den unverdünnten Proben, die 60 min bei 15 °C gehalten wurden, die EC 0,58; nach 48 h Lagerung wurde bei den neunfach verdünnten Proben mit 0,59 ein sehr ähnlicher Wert ermittelt. Die Autoren vermuten, dass diese großen Unterschiede vom Sauerstoffverbrauch der Samenzellen abhängen. Ihre Berechnungen ergaben, dass beim Halten der Ebersamenprobe in einem geschlossenen Gefäß bei 35 °C nach 10 min der Sauerstoff aufgebraucht ist. Durch die Abkühlung werden die Samenzellen immotil und der Verbrauch reduziert sich um 98,6%. Deshalb kann eine höherer EC aufrechterhalten werden.

Dass die Auswirkungen der Lagerung auf die Spermien auch von dem Einzeltier abhängen können, zeigten YI et al. (2008). Sie verglichen die Samenproben eines kältschockresistenten Ebers mit den Samenproben eines kälteschockempfindlichen Ebers bezüglich der Lagerungsfähigkeit bei 17°C. Als kälteschockresistent galt ein Eber, wenn nach zwei Tagen Lagerung bei 4 °C noch mehr als 70 % motile Spermien vorhanden waren. Als Parameter wurde unter anderem der ATP-Gehalt der Samenzellen mittels Biolumineszenzmessung analysiert. Während der Lagerung sank der ATP-Gehalt bei dem kälteschockresistenten Eber von 2,26 µM/ 2 x 10⁷ Spermien auf 0,74 µM/ 2 x 10⁷ Spermien, beim kälteschockempfindlichen Eber von 1,57 µM/ 2 x 10⁷ Spermien auf 0,11 µM/ 2 x 10⁷ Spermien nach vier Tagen Lagerung bei 17 °C. Die für die Befruchtungsfähigkeit kritische Motilität von 60 % wurde vom kälteschockresistenten

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Eber nach vier Tagen, vom kälteschockempfindlichen Eber nach drei Tagen Lagerung bei 17 °C erreicht.

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3 Material und Methoden

3.1 Versuchsübersicht

Das übergeordnete Ziel war es, die Einflüsse der Verdünnertemperatur, der Abkühlgeschwindigkeit der Samenproben und von verschiedenen Verarbeitungsregimes, wie zum Beispiel dem Halten des 1:1 (v:v) verdünnten oder ausverdünnten Spermas bei 32 °C und 21 °C, auf die Qualität flüssig konservierter Eberspermien während der Lagerung bei 17 °C zu untersuchen.

Zunächst wurden im Experiment 1 zwei im ZDS-Handbuch für Besamungsstationen (STÄHR et al., 2009) beschriebene und in der Praxis gängige Verarbeitungsverfahren verglichen. Im Anschluss wurden Ansätze zur Optimierung der Prozesskette getestet, die auf verschiedenen Ebenen der Spermaverdünnung ansetzten.

In den Experimenten 2 bis 4 wurden die Auswirkungen von Haltezeiten bei 21 °C und 32 °C des vorverdünnten (Exp. 2 und 3) bzw. ausverdünnten (Exp. 4) Samens auf die Qualität der gelagerten Samenprobe untersucht. In Experiment 3 wurden zusätzlich zwei Verdünnungsverfahren - zweistufig isotherm vs. zweistufig hypertherm - vergleichend untersucht.

Experiment 5 diente zur Untersuchung der Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung.

In Experiment 6 wurde der Temperaturverlauf während der Prozesskette in einer Besamungsstation dokumentiert und in Beziehung zu Laborstandards gesetzt.

Zusätzlich wurde die Verarbeitungsmethode auf der Besamungsstation im Labor nachgestellt und die Spermaqualität mit der nach im Laborstandard verarbeiteten Samenproben verglichen.

Die Inhalte der Experimente sind als Übersicht in Abb. 1 und in Kapitel 3.8 detailliert dargestellt.

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17 Abb. 1: Übersicht aller durchgeführten Experimente

3.2 Verbrauchsmaterialien und Geräte

Alle verwendeten Materialien und Geräten sind im Anhang aufgelistet (Kapitel 9.4).

Experiment 6

Temperaturverlauf in der Prozesskette der Samenverarbeitung auf einer Besamungsstation und Vergleich mit Laborstandards

Experiment 2

Auswirkungen von Haltezeiten und Haltetemperaturen des vorverdünnten Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung

Experiment 3

Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hyperthermer Verdünnung nach Haltezeiten bei 21 °C

Experiment 5

Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung

Experiment 4 a

Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach zweistufig hypothermer Verdünnung

Experiment 4 b

Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung

Experiment 1

Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden

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3.3 Lösungen und Chemikalien

Die Rezepte für die verwendeten Lösungen sowie eine Liste der dazugehörigen Chemikalien mit deren Bezugsquellen befinden sich im Anhang dieser Arbeit (Kapitel 9.2 und 9.3).

Das Wasser wurde über eine Ionenaustauschersäule (Fa. Landgraf, Langenhagen) aufbereitet und danach durch eine Milipore Express PLUS Membran (Polyethersulfon, hydrophil, 0,22 µm Porendurchmesser, 47 mm Filterdurchmesser) sterilfiltriert (Druckfiltrationseinheit Sartobran 300, Fa. Landgraf, Langenhagen).

3.4 Tiere

Für die Versuche im Labor der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken standen zwölf institutseigene, klinisch gesunde und im Sinne der Gewährschaftsbestimmungen des Zentralverbandes der deutschen Schweineproduktion (ZDS, 2005) normosperme Eber zur Verfügung. Voraussetzung für die Normospermie waren mindestens 70 % motile Spermien und weniger als 25 % morphologisch abweichende Spermien (MAS) im Ejakulat.

Es handelte sich um fertile Eber der Rassen Pietrain (n=8), Deutsche Landrasse (n=2) und Duroc (n=2) im Alter zwischen einem und fünf Jahren.

Für jeden Versuch wurden, sofern nicht anders beschrieben, sechs Ejakulate von verschiedenen normospermen Ebern verwendet.

Für die Untersuchungen auf einer Besamungsstation standen elf klinisch gesunde, fertile Eber zur Verfügung. Für diese Messungen wurden teilweise Ejakulate von Ebern verwendet, die zu diesem Zeitpunkt nicht für den Verkauf bestimmt waren.

Fünf von diesen elf Ejakulaten waren nicht normosperm.

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3.5 Samengewinnung

Die Samengewinnung fand mit der sogenannten „Handmethode“ mit Hilfe eines kunststoffüberzogenen Stahlphantoms statt. Nach Abgang des Vorsekrets wurde die spermienreiche und spermienarme Phase in einem auf ca. 36 °C vorgewärmten Samenauffangbecher (Fa. Minitüb, Tiefenbach) aufgefangen, der mit einem Samenauffangbeutel (US Bag^TM, Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen war. Eine im Beutel integrierte Gaze separierte das Bulbourethraldrüsensekret vom übrigen Ejakulat. Die Gaze wurde nach der Samenentnahme abgetrennt und der verschlossene Beutel in einer ebenfalls auf ca. 36 °C vorgewärmten Styroporkiste in das naheliegende Labor transportiert.

Die Samengewinnung auf der Besamungsstation fand unter ähnlichen Bedingungen statt. Die spermienreiche und spermienarme Phase wurden in einem vorgewärmten 500 ml Schraubglas aufgefangen und mit Rohrpost direkt in das Labor verbracht.

Das Bulbourethraldrüsensekret wurde hier mittels eines auf das Glas aufgesetzten Milchfilters getrennt.

3.6 Untersuchung des nativen Samens

Nach Ankunft im Labor wurde die Ejakulate in einen auf 36 °C vorgewärmten 500 ml Glaszylinder umgefüllt und standardspermatologisch untersucht. Es wurden das Volumen, die Farbe, die Konsistenz, die Spermienkonzentration, die Spermiengesamtzahl, der pH-Wert, der Anteil motiler Samenzellen nach subjektiver Schätzung und der Anteil der morphologisch abweichenden Spermien bestimmt.

An einem Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (Axiostar Plus, Fa. Zeiss, Jena) wurde bei 38 °C und 200-facher Vergrößerung (Phase 2) der Anteil motiler Samenzellen geschätzt, indem mindestens drei Gesichtsfelder in drei unterschiedlichen Tropfen (1,5 – 5 µl) ausgewertet wurden. Die hierfür verwendeten Objektträger, Deckgläschen und Pipettenspitzen wurden auf einer Heizplatte (HT 200, Minitüb GmbH, Tiefenbach) auf 38 °C vorgewärmt.

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Die Spermienkonzentration wurde mit der Zählkammer „Thoma-neu“ (Fa. Jürgens, Hannover) im Phasenkontrastmikroskop (Axiostar Plus, Zeiss, Jena) ermittelt (400- fache Vergrößerung, Phase 2). In Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966) erfolgte die Auswertung, wobei in jeder Kammerhälfte alle 16 Felder ausgezählt wurden. Für ein valides Ergebnis mussten in jeder Hälfte mindestens 100 Spermienköpfe vorhanden sein, der Toleranzbereich zwischen den Hälften lag bei einer Differenz von 10 %. Die Spermiengesamtzahl errechnete sich aus dem Produkt von Volumen und Spermienkonzentration des Ejakulates. Der pH-Wert wurde mit einem pH-Meter (Multiplex 3000/ pMX, Fa. WTW, Weilheim) gemessen.

Die Bestimmung des Anteils morphologisch abweichender Spermien wurde in Anlehnung an die Klassifikation nach KRAUSE (1966) durchgeführt. Abhängig von der Spermienkonzentration wurden zwischen 5 – 30 µl des nativen Samens in 300 µl 4 %-iges Formolcitrat pipettiert. Je 200 Zellen wurden bei 1000-facher Vergrößerung (Ölimmersion, Phase 3) mikroskopisch beurteilt.

3.7 Monitoring der Probentemperatur

Das Abkühlverhalten der Samenproben bei der Anwendung der verschiedenen Verdünnungsarten wurde durch den Temperaturlogger Micromec^® multisens (Fa.

Technetics, Freiburg) dokumentiert. Dieser verfügt über acht flexible, zwei bis fünf Meter lange Temperatursonden (TK700C, Messbereich -200 bis +600 °C, Messgenauigkeit 0,1 °C, Technetics, Freiburg), die auch in Flüssigkeiten zur Temperaturmessung eingesetzt werden können. Da während der Versuche die Temperaturmessung nicht möglich war, erfolgten die Messungen in einem separaten Ansatz mit wassergefüllten Ebersamenflaschen. In einem Vorversuch konnte gezeigt werden, dass das Abkühlverhalten einer Ebersamenprobe mit 20 Mio Spermien/ ml dem Abkühlverhalten von Wasser entspricht. Für jedes Experiment wurde die Temperatur in je 3 Probengefäßen (500 ml Glaszylinder bzw. aufrechtstehende Ebersamenflaschen) mit einer Doppelmessung (je zwei Sonden pro Probengefäß, mittig angebracht) aufgezeichnet. Über 6 Stunden erfolgte einmal pro Minute die Aufzeichnung der Probentemperatur, zeitgleich wurde mit einer weiteren Sonde die

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jeweilige Umgebungstemperatur dokumentiert. Das Auslesen der Daten am PC erfolgte mit der Software MM-grafix (Version 7.1, Technetics, Freiburg). Die Daten wurden in Excel exportiert, wo die weitere Auswertung und Erstellung der Grafiken stattfand.

3.8 Experimentelle Designs

3.8.1 Experiment 1: Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden

Hypothese:

Bei zweistufigem Verdünnungsverfahren weisen Samenproben, die im zweiten Verdünnungsschritt isotherm verdünnt wurden, eine bessere Qualität während der Lagerung bei 17 °C auf, als solche die hypotherm verdünnt wurden. Der negative Effekt einer zweistufig hypothermen Verdünnung ist stärker ausgeprägt bei einer Samenprobe mit höherem Verdünnungsgrad (10 x 10⁶ Spermien/ ml) als bei einem Verdünnungsgrad von 20 x 10⁶Spermien/ ml.

Versuchsdurchführung:

Nach der standardspermatologischen Untersuchung und Dichtebestimmung erfolgte die isotherme Verdünnung des Samens mit auf 32 °C vorgewärmten BTS (Beltsville Thawing Solution, ca. 330 mOsmol/ kg, pH 7,05-7,11 bei Raumtemperatur; Fa.

Minitüb, Tiefenbach) im Verhältnis 1:1 (v:v). Um ein vergleichbares Temperaturverhalten der Proben zu erreichen wurden stets konstante Volumina von 200 ml Ejakulat und 200 ml BTS in einem auf 32 °C vorgewärmten 500 ml Glaszylinder vermischt. Nach einer erneuten Dichtebestimmung wurde die Samenprobe zu gleichen Teilen in zwei auf 32 °C vorgewärmte 250 ml Glaszylinder überführt und die Zylinder mit Parafilm verschlossen.

Für die zweistufig isotherme Verdünnung die nach den Vorgaben für die

„zweiphasige Verdünnung“ des ZDS-Handbuchs (2009) durchgeführt wurde, wurde einer der Zylinder während der zweiten Dichtebestimmung (für ca. 15 min) bei 32 °C im Wasserbad gehalten. Anschließend erfolgte die Verdünnung in

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Ebersamenflaschen (100 ml, Fa. Minitüb, Tiefenbach) mit auf 32 °C temperiertem Verdünner auf eine Endkonzentration von 20 x 10⁶ Spermien/ ml bzw.

10 x 10⁶Spermien/ ml. Hierzu wurde die entsprechende Menge des vorverdünnten Samens in die Flaschen vorgelegt und mit BTS auf 100 ml aufgefüllt. Nachdem verbleibende Luft so weit wie möglich entfernt wurde, wurden die Flaschen verschlossen, für 90 min bei 21 °C gehalten und daraufhin bei 17 °C im Klimaschrank gelagert. Die Abkühlung bzw. Lagerung der Flaschen erfolgte immer stehend und mit ca. 2 cm Abstand zueinander, um für alle Proben eine möglichst gleiche Abkühlungsrate zu gewährleisten.

Der zweite Glaszylinder wurde für die zweistufig hypotherme Verdünnung, die nach den Vorgaben für die „zweiphasige Verdünnung“ des ZDS-Handbuchs (2009) durchgeführt wurde, für 20 min in einem auf 21 °C temperierten Klimaschrank (Fa.

Minitüb, Tiefenbach) gehalten. Danach fand die Ausverdünnung wie oben beschrieben statt, mit dem Unterschied, dass ein auf 21 °C temperierter Verdünner verwendet wurde. Wie bei der isothermen Variante kühlten die Proben 90 min bei 21 °C ab. Die Lagerung erfolgte ebenfalls wie oben beschrieben bei 17 °C.

Die Messung der Motilitätsparameter mittels computerassistierter Spermienanalyse (CASA; siehe Kapitel 3.9) und der Integrität der Plasma- und Akrosommembran (siehe Kapitel 3.10) der zweistufig isothermen verdünnten Probe fand unmittelbar nach der Verdünnung der Proben auf die finale Konzentration statt. Die weitere Analyse aller Proben erfolgte nach 24 h, 72 h und 144 h.

Der Ablauf von Experiment 1 ist in Abb. 2 dargestellt.

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Abb. 2: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 1. Vergleich von hypothermer und isothermer Verdünnung mit Haltezeiten bei zwei Haltetemperaturen (21 °C/

32 °C) und zwei Verdünnungsstufen (10 x 10⁶ Spermien/ ml; 20 x 10⁶ Spermien/ ml).

Sp = Spermien zweistufig hypotherm

zweistufig isotherm Vorverdünnung 1:1

isotherm BTS, 32 °C 200 ml

Haltezeit bei 21 °C 20 min

200 ml Haltezeit bei 32 °C

15 min

Haltezeit 90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C 200 ml Nativsperma

Ausverdünnung: BTS, 21 °C 100 ml

10 Mio Sp/ ml

100 ml 20 Mio Sp/ml

Ausverdünnung: BTS, 32 °C 100 ml

10 Mio Sp/ ml

100 ml 20 Mio Sp/ml

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3.8.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten und Haltetemperaturen des vorverdünnten Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung

Hypothese:

Haltezeiten des 1:1 (v:v) verdünnten Spermas bis 60 Minuten bei 32 °C haben im Gegensatz zu Haltezeiten bei 21 °C einen positiven Einfluss auf die Qualität der bei 17°C gelagerten Samenproben.

Längere Haltezeiten (> 60 min bis 6 h) bei 32 °C haben dagegen einen negativen Einfluss auf den Energiestoffwechsel und das Keimwachstum der später bei 17 °C gelagerten Samenproben.

Da in der Prozesskette der Samenverarbeitung in Besamungsstationen Verzögerungen während der Verarbeitung und damit Haltezeiten der Ejakulate unterschiedlicher Länge auftreten können, wurde in diesem Versuch das Hauptaugenmerk auf die Auswirkungen von Haltezeiten (30 min, 60 min, 3 h und 6 h) von 1:1 (v:v) verdünntem Samen bei 32 °C auf die Qualität der gelagerten Samenproben gelegt. Hierbei wurden neben den Motilitätsparametern und der Membranintegrität zusätzlich der ATP-Gehalt und die Energieladung der Spermien, der Anteil der Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential, sowie der Effekt auf die mikrobiologische Qualität analysiert. Die Verdünnung des Samens erfolgte zweistufig isotherm.

Für diesen Versuch wurden insgesamt zwölf Ejakulate von neun verschiedenen Ebern verwendet. Der Versuch wurde zweimal mit jeweils sechs Ejakulaten durchgeführt. Da der zeitliche Abstand der Versuche bei ca. einem Jahr lag, wurde jedes Ejakulat trotz der Verwendung der gleichen Tiere eigenständig gewertet.

Die Vorverdünnung, die zweistufig isotherme Verdünnung sowie die Abkühlung und Lagerung der Samenproben wurde wie in Kapitel 3.8.1 beschrieben, durchgeführt.

Die vorverdünnten Samenproben wurden vor der Ausverdünnung Haltezeiten ausgesetzt, mit Ausnahme der Kontrollproben, die direkt ausverdünnt wurden. Eine Hälfte der 1:1 (v:v) vorverdünnten Samenproben (Zylinder 1) wurde für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h Haltezeiten bei 32 °C gehalten. Die Ausverdünnung fand direkt nach jeder Haltezeit statt.

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Der zweite Zylinder wurde für dieselben Haltezeiten im Klimaschrank bei 21 °C gehalten. Um auch hier eine zweistufig isotherme Verdünnung gewährleisten zu können, wurde ein 500 ml Glaszylinder mit einem auf 32 °C vorgewärmtem Verdünner zeitgleich in den Klimaschrank verbracht und kühlte parallel mit der Probe ab. Die isotherme Ausverdünnung fand ebenfalls nach jeder Haltezeit statt. Die Abkühlung und Lagerung der Proben entsprachen den bei 32 °C verarbeiteten Proben.

Die Messung der Membranintegrität (s. Kapitel 3.10) und der Motilitätsparameter (s. Kapitel 3.9) wurde bei allen zwölf Ejakulaten direkt nach jeder Haltezeit sowie nach 24 h und 72 h durchgeführt. Sechs Ejakulate wurden einer weiteren Untersuchung nach 144 h Lagerung unterzogen.

Das Mitochondrienmembranpotential wurde bei sechs Ejakulaten zu denselben Zeitpunkten wie die Membranintegrität und die Motilität analysiert (s. Kapitel 3.11).

Die Probenentnahme für die Bestimmung der ATP-Konzentration und der Energieladung im nativen Samen erfolgte zunächst direkt nach der standardspermatologischen Untersuchung (s. Kapitel 3.13). Dazu wurde eine zusätzliche Samenprobe (100 ml, 20 x 10⁶ Spermien) direkt nach der standardspermatologischen Untersuchung isotherm mit vorgewärmtem BTS verdünnt, um eine vergleichbare Menge Samenzellen für die Messung eines Kontrollwerts der ATP-Konzentration zur Verfügung zu haben. Die weitere Probenentnahme fand zu den oben genannten Messzeitpunkten, also nach jeder Haltezeit sowie nach 24 h, 72 h, und 144 h Lagerung statt.

Der Einfluss der Haltezeiten auf die mikrobiologische Qualität der Proben wurde durch eine Gesamtkeimzahlbestimmung ermittelt. Von 4 Ejakulaten wurde je 1 ml des nativen Samens entnommen. Am Tag der Verdünnung erfolgte des Weiteren die Beprobung des 1:1 (v:v) verdünnten Samen der Kontrolle (nach ZDS-Handbuch verarbeitete Probe) sowie nach 60 min und 6 h Inkubation bei 32 °C sowie 21 °C.

Nach 72 h Lagerungsdauer wurde in den ausverdünnten Proben erneut eine Gesamtkeimzahlbestimmung durchgeführt. Alle Proben für die mikrobiologische Untersuchung wurden nach der Entnahme gekühlt (< 10°C, Styroporbox mit

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Kühlakkus) ins Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht und dort untersucht (s. Kapitel 3.14).

Abb. 3: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 2. Vergleich von Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen (21 °C/ 32 °C) bei zweistufig isothermer Verdünnung.

*15 min: Kontrolle, Verarbeitung nach ZDS - Empfehlung (STÄHR et al., 2009) zweistufig

isotherm zweistufig

isotherm

Vorverdünnung 1:1 isotherm BTS 32 °C

200 ml

Haltezeiten bei 32 °C 15 min*, 30 min, 60 min, 3 h, 6 h

Ausverdünnung BTS, isotherm

Haltezeit 90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C 200 ml Nativsperma

Ausverdünnung BTS, isotherm 200 ml

Haltezeiten bei 21 °C 30 min, 60 min, 3 h, 6 h

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3.8.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig hyperthermer Verdünnung

Hypothese:

Die Ausverdünnung mit im Vergleich zur Samenprobe hyperthermen Verdünner hat einen negativen Einfluss auf die Qualität des bei 17 °C gelagerten Samens.

Während des Betriebsablaufs in einer Besamungsstation kann es zu Verzögerungen kommen und damit zu Haltezeiten bei Raumtemperatur, so dass der vorverdünnte Samen allmählich abkühlt. Der Verdünner wird hingegen in der Regel auf einer konstanten Temperatur von 32 °C gehalten. Daraus kann sich unter Praxisbedingungen eine hypertherme Ausverdünnung ergeben. Im Experiment wurde die zweistufig hypertherme Verdünnung der im Kapitel 3.8.1 untersuchten zweistufig isothermen Verdünnung als Kontrolle gegenübergestellt.

Die Vorverdünnung sowie die Abkühlung und Lagerung erfolgten wie in Kapitel 3.8.1 beschrieben, die zweistufig isotherme Verdünnung mit Haltezeiten analog zu der Beschreibung in Kapitel 3.8.2.

Für die zweistufig hypertherme Verdünnung wurde ebenfalls ein 250 ml Glaszylinder mit 200 ml vorverdünntem Sperma für die angegebenen Haltezeiten, mit Ausnahme der Kontrollprobe, bei 21 °C gehalten. Ein 500 ml Zylinder mit BTS wurde während des Versuchs bei 32 °C gehalten. Die hypertherme Ausverdünnung erfolgte nach jeder der Haltezeiten mit dem auf 32 °C temperierten Verdünner.

Die untersuchten spermatologischen Parameter waren auch in diesem Experiment die Membranintegrität (s. Kapitel 3.10) sowie die Messung CASA – Motilitätsparameter (s. Kapitel 3.9). Die Messungen wurden jeweils direkt nach der Verdünnung auf die Endkonzentration und nach 24 h und 72 h Lagerungsdauer durchgeführt.