Neue Wirkstoffe für die Therapie von Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Chorea Huntington

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Neue Wirkstoffe für die Therapie von Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Chorea Huntington

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Barbara Strohmeier

Ulm

Hannover 2017

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin H. Groschup

Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems

1.Gutachter: Prof. Dr. Martin H. Groschup

2.Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner

Tag der mündlichen Prüfung: 24. März 2017

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Für Constantin und Valentin

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INHALTSVERZEICHNIS I

1 INHALTSVERZEICHNIS

1 INHALTSVERZEICHNIS ... 1

2 EINLEITUNG ... 1

3 STAND DER DERZEITIGEN FORSCHUNG ... 3

3.1 Morbus Alzheimer ... 3

3.1.1 Definition und Epidemiologie ... 3

3.1.2 Pathogenese ... 4

3.1.3 Klinik ... 7

3.2 Morbus Parkinson ... 8

3.2.3 Klinik ... 11

3.3 Chorea Huntington ... 12

3.3.3 Klinik ... 15

3.4 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) ... 15

3.4.3 Klinik ... 16

3.5 Untersuchungen zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen ... 17

3.5.1 Hemmung der posttranslationalen Modifikation nativer Proteine ... 18

3.5.2 Stabilisierung der Monomere und Steigerung der Chaperon-Aktivität ... 21

3.5.3 Inhibition der Proteinaggregation und Auflösung bestehender Aggregate ... 22

3.5.4 Förderung des Abbaus und Abtransportes nativen oder fehlgefalteten Proteins .. 22

3.6 Untersuchung und Charakterisierung neurodegenerativer Erkrankungen in vitro und in vivo ... 24

3.6.1 In-vitro-Modelle neurodegenerativer Erkrankungen ... 24

3.6.2 In-vivo-Modelle neurodegenerativer Erkrankungen ... 25

4 ZIELSTELLUNG ... 32

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II INHALTSVERZEICHNIS

5 MATERIAL UND METHODEN ... 33

5.1 Tiere ... 33

5.1.1 Transgene Mäuse ... 33

5.1.2 Tierhaltung ... 33

5.1.3 Genotypisierung der Mäuse ... 34

Entnahme und Lyse der Mausschwanzbiopsien ... 34

5.1.3.1 PCR ... 34

5.1.3.2 DNA-Gelelektrophorese ... 35

5.1.3.3 Quantitative real time PCR (qPCR) ... 35

5.1.3.4 5.2 Methoden - In-vivo-Experimente ... 37

5.2.1 Vorbereitung und Durchführung der Tierversuche ... 37

Herstellung des Helmkrauttees (Scutellaria lateriflora) ... 37

5.2.1.1 Herstellung der Diphenylpyrazol-Suspension und der Benzylpiperazin-Lösung . 5.2.1.2 ... ... 37

Herstellung der Baicalein- und Baicalin-Lösungen ... 37

5.2.1.3 5.2.2 Euthanasie der Versuchstiere und Probenentnahme ... 39

5.2.3 Histologische Methoden zur Auswertung der in-vivo-Versuche ... 39

Zuschnitt der Gehirne (nach Frauke Junghans¹⁵⁴) ... 39

5.2.3.1 Herstellung der Gewebeschnitte ... 40

5.2.3.2 Immunhistochemische Färbung (IHC) ... 41

5.2.3.3 Auswertung der IHC ... 42

5.2.3.4 5.3 Methoden – In-vitro-Experimente ... 44

5.3.1 DNA-Extraktion aus Hirnmaterial ... 44

5.3.2 Vervielfältigung von DNA-Fragmenten durch PCR ... 44

5.3.3 Isolierung und Reinigung der DNA-Fragmente aus Agarosegelen ... 44

5.3.4 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ... 45

5.3.5 Enzymatischer Restriktionsverdau mit EcoRV und HindIII ... 45

5.3.6 Phosphorylierung von Nukleinsäuren ... 45

5.3.7 Dephosphorylierung des pcDNA3.1/Zeo(+)-Vektors ... 45

5.3.8 Ligation von DNA-Fragmenten in den pcDNA3.1/Zeo(+)-Vektor ... 46

5.3.9 Transformation von E.coli ... 46

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INHALTSVERZEICHNIS III

5.3.10 Auswahl der Klone ... 46

5.3.11 DNA-Sequenzierung ... 47

5.3.12 Vermehrung der Plasmide ... 47

5.3.13 Herstellung einer Glycerolkultur ... 47

5.3.14 Zellkultur ... 47

5.3.15 Auszählen und Aussäen von Zellen ... 48

5.3.16 Stabile Transfektion von N2a-Zellen ... 48

5.3.17 Einfrieren transfizierter Zellen ... 49

5.3.18 Inhibitionsversuche mit transfizierten Zellen ... 49

5.3.19 Zellernte ... 50

5.3.20 Herstellung von Zelllysaten ... 50

5.3.21 SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-Page) ... 50

5.3.22 Western Blot ... 51

5.3.23 Auswertung des Western Blot ... 51

5.4 Statistisk ... 51

6 ERGEBNISSE ... 52

6.1 Genotypisierung der transgenen Tiere ... 52

6.1.1 Morbus Alzheimer ... 52

Ergebnis der PCR ... 52

6.1.1.1 Ergebnis der quantitative real time PCR ... 53

6.1.1.2 6.1.2 Morbus Parkinson ... 53

Ergebnis der PCR ... 53

6.1.2.1 Ergebnis der quantitative real time PCR ... 53

6.1.2.2 6.2 In-vivo-Experimente ... 54

6.2.1 Morbus Alzheimer ... 54

Immunhistochemischer Nachweis β-Amyloid positiver Plaques ... 54

6.2.1.1 Einfluss von Helmkrauttee auf die Bildung β-Amyloid positiver Plaques ... 55

6.2.1.2 Einfluss von Baicalein und Baicalin auf die Bildung β-Amyloid positiver 6.2.1.3 Plaques ... 57

Einfluss von Benzylpiperazin (BZP) und Diphenylpyrazol (DPP) auf die 6.2.1.4 Bildung β-Amyloid positiver Plaques ... 61

6.2.2 Morbus Parkinson ... 67

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IV INHALTSVERZEICHNIS

Immunhistochemischer Nachweis α-Synuklein positiver Aggregate ... 67

6.2.2.1 Auswertung der Behandlungsversuche an transgenen Parkinson-Mäusen ... 67

6.2.2.2 Einfluss von Helmkrauttee, Benzylpiperazin und Diphenylpyrazol auf die 6.2.2.3 Überlebenszeit transgener Parkinson-Mäuse ... 69

6.2.3 Chorea Huntington ... 71

Immunhistochemischer Nachweis neuronaler intranukleärer Huntingtin 6.2.3.1 Ablagerungen im Gehirn transgener Huntington-Mäuse ... 71

Einfluss von Helmkrauttee auf die Bildung Huntingtin-positiver Aggregate ... 6.2.3.2 ... ... 73

6.3 In-vitro-Experimente ... 75

6.3.1 Etablierung eines zellbasierten In-vitro-Modells für Morbus Parkinson ... 75

6.3.2 Inhibitionsversuch mit Helmkrauttee, Baicalin und Baicalein, Benzylpiperazin und Diphenylpyrazol ... 75

7 DISKUSSION ... 76

7.1 Morbus Alzheimer ... 77

7.1.1 Orale Behandlung mit Helmkrauttee und seinen Inhaltsstoffen Baicalein und Baicalin ... 78

7.1.2 Orale Behandlung mit N-Benzyl-Piperazin (BZP) ... 80

7.1.3 Orale Behandlung mit Diphenylpyrazol ... 82

7.2 Morbus Parkinson ... 85

7.2.1 Orale Behandlung mit Helmkrauttee, Diphenylpyrazol und Benzylpiperazin ... 85

7.2.2 In-vitro-Studien zu Morbus Parkinson ... 86

Substanz-Versuche zur Inhibition der α-Synuklein-Produktion durch 7.2.2.1 transfizierte N2a-Zellen ... 86

7.3 Chorea Huntington ... 88

8 ZUSAMMENFASSUNG ... 90

9 SUMMARY ... 92

10 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 94

11 LITERATURVERZEICHNIS ... 99

12 ANHANG ... 118

12.1 Histologische Methoden ... 118

12.1.1 Protokolle ... 118

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INHALTSVERZEICHNIS V

12.1.2 Antikörper ... 119

12.1.3 Demaskierung der Antigene ... 120

12.2 Puffer und Lösungen ... 121

12.3 Oligonukleotide ... 126

12.4 Nukleinsäuren ... 127

12.5 Vektoren ... 127

12.6 Bakterien und Plasmide ... 127

12.7 Komplettsysteme ... 127

12.8 DNA-Größenstandards ... 127

12.9 Protein-Größenstandards ... 127

12.10 Enzyme ... 127

12.11 Zellmedium ... 128

12.12 Chemikalien und biologische Produkte ... 128

12.13 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 131

12.14 Ergebnistabellen ... 135

12.14.1 Morbus Alzheimer(AD) ... 135

Ergebnisse des Behandlungsversuches mit Helmkrauttee ... 135

12.14.1.1 Ergebnisse des Behandlungsversuches mit Baicalein und Baicalin ... 136

12.14.1.2 Ergebnisse des Behandlungversuches mit Benzylpiperazin, 12.14.1.3 Diphenylpyrazol und Helmkrauttee ... 140

12.14.2 Chorea Huntington ... 144

Ergebnisse des Behandlungsversuches mit Helmkrauttee ... 144

12.14.2.1 12.15 Tabellenverzeichnis ... 145

12.16 Abbildungsverzeichnis ... 146

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EINLEITUNG 1

2 EINLEITUNG

Bei einem stetig steigenden Altersdurchschnitt in unserer Gesellschaft stellen die zumeist im höheren Alter ausbrechenden neurodegenerativen Erkrankungen ein immer größeres gesundheitliches Problem dar. Trotz des hohen Vorkommens weltweit sind die genauen Mechanismen vieler Erkrankungen noch nicht gänzlich aufgeklärt und es besteht bislang keine Möglichkeit einer Heilung.

Neurodegenerative Erkrankungen gehören zu einer Gruppe spätmanifester Krankheiten mit einem breitgefächerten Spektrum an verschiedenen Symptomen, wie beispielsweise die Ausprägung der Demenz bei der Alzheimer-Krankheit, unkontrollierte Bewegungen bei Chorea Huntington und den für Morbus Parkinson typischen Verlust der Bewegungsfähigkeit¹.

Diese klinischen Symptome und der progressive Verlauf der Erkrankungen spiegeln die Funktionsstörung und das Absterben spezifischer Neuronengruppen wider². Die Ausprägung der Erkrankung ist abhängig von der Gruppe der betroffenen Neuronen bzw. den betroffenen Bereichen des Nervensystems³.

Nahezu jede der bedeutenden neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Chorea Huntington und Prion-Erkrankungen zeichnet sich pathologisch durch die fortschreitende Akkumulation unlöslicher filamentöser Aggregate normalerweise löslicher Proteine im zentralen Nervensystem (ZNS) aus⁴. Hierbei handelt es sich um körpereigene Proteine mit teilweise unbekannter Funktion, deren Strukturveränderung zur Ausbildung sich aggregierender Fibrillen, des charakteristischen Amyloid führen. Einen Überblick über neurodegenerative Erkrankungen und das jeweilige aggregierende Protein liefert Tab. 1.

Die Proteinaggregate entstehen auf unterschiedlichste Art und Weise. Hierzu zählen beispielsweise die fehlerhafte Faltung der Molekülketten, die veränderte Modifikation nach der Translation, die anormale proteolytische Spaltung, aber auch anormales Spleißen der RNA, die anormale Expression und die unzureichende Beseitigung abgebauter Proteine³. Trotz der gemeinsamen charakteristischen Eigenschaft, der Akkumulation unlöslicher Proteine, weisen diese Erkrankungen deutlich unterschiedlich ausgeprägte zeitliche und regionale Muster in der Ausbildung der Aggregate, Unterschiede bei betroffenen Zellen, Aggregationsorten und den Hauptbestandteilen der Proteinaggregate auf⁴.

Die Ursachen neurodegenerativer Erkrankungen sind vielfältig. Teilweise werden sie ausschließlich durch genetische Faktoren hervorgerufen wie z.B. bei Chorea Huntington, teilweise aber auch durch genetische und multifaktorielle Ursachen, z.B. Morbus Alzheimer.

Auch Ursachen infektiöser Natur wie z.B. bei Prion-Erkrankungen wie BSE und CJD sind möglich. Vielen neurodegenerativen Erkrankungen gemeinsam ist jedoch das vermehrte Auftreten im höheren Alter³.

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2 EINLEITUNG

Tab. 1 Einteilung der neurodegenerativen Erkrankungen

I. Extrazelluläre Proteinablagerungen Morbus Alzheimer (Aβ)

Prion-Erkrankungen (Creutzfeldt-Jakob-Disease, Bovine Spongiforme Enzephalopathie, Scrapie, u.a.)

II. Intrazelluläre Proteinablagerungen Tauopathien

Morbus Alzheimer Morbus Pick

Progressive supranukleäre Blickparese Kortikobasale Degeneration

Senile Demenz mit NFTs

Erkrankung mit argyrophilen Körnchen

Chromosom-17-assoziierte familiäre frontotemporale Demenzen mit Parkinson-Syndrom (FTDP-17)

α-Synukleinopathien Morbus Parkinson

Demenz mit Lewy-Körperchen Multiple Systematrophien

Ubiquitinkrankheiten

Amyotrophe Lateralsklerose

Frontalhirndegeneration mit Motoneuronenerkrankung

Polyglutaminkrankheiten Chorea Huntington

Spinale und bulbäre Muskelatrophie Spinozerebelläre Ataxie

(Quelle: Kretzschmar et al., Neuropathological diagnosis of neurodegenerative and dementing disorders, Der Pathologe, 2000 - 21:364-374⁵)

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LITERATURÜBERSICHT 3

3 LITERATURÜBERSICHT

3.1 Morbus Alzheimer

3.1.1 Definition und Epidemiologie

1906 beschrieb Alois Alzheimer erstmals ein bisher unbekanntes Krankheitsbild⁶. Er stellte den Fall der Auguste Deter vor, die nach Jahren schwerer Verwirrtheit und des Gedächtnisverlustes starb. Bei der folgenden Autopsie fand er dichte Ablagerungen rund um das Äußere der Nervenzellen, die sogenannten Plaques und im Inneren der Nervenzellen verdrehte Faserbänder (Fibrillen). Seit diesem Zeitpunkt trägt diese neurodegenerative Erkrankung seinen Namen⁷. Bis heute hat sich Morbus Alzheimer zu einer der bedeutendsten neurodegenerativen Erkrankung in unserer stetig alternden Gesellschaft entwickelt.

Weltweit sind derzeit schätzungsweise etwa 35,6 Millionen Menschen betroffen. Bis 2030 wird sich die Zahl Betroffener auf etwa 65,7 Millionen verdoppeln⁸. In Deutschland leben derzeit rund 1,2 Millionen an Demenz Erkrankte. 60-70 % dieser Betroffenen leiden unter der Alzheimer-Krankheit, der weltweit häufigsten Form der Demenz. Die mittlere Prävalenzrate der Demenz steigt von 1,2 % bei den 65-69 jährigen auf 34,6 % bei Betroffenen im Alter von 90 Jahren oder mehr⁹.

Aufgrund der höheren Lebenserwartung in der weiblichen Bevölkerung liegt die Prozentzahl an Demenz erkrankter Frauen bei 70 % und die der Männer bei 30 %. Die Wahrscheinlichkeit an Demenz zu erkranken ist jedoch bei Frauen und Männern gleichermaßen ausgeprägt⁹. Nur etwa 5-10 % der Alzheimer-Fälle sind auf einen genetischen Hintergrund, die FAD (Familial Alzheimer Disease) zurückzuführen¹⁰. Hierbei handelt es sich um Mutationen des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP, Amyloid Precursor Protein) auf Chromosom 21, des Präsenilin-1-Gens auf Chromosom 14 und schließlich des Präsenilin-2-Gens, das sich auf Chromosom 1 befindet¹¹. Diese Mutationen werden autosomal-dominant vererbt und führen zum Ausbruch der Alzheimer-Krankheit vor dem 65. Lebensjahr, der „early-onset“ Form des familiären Morbus Alzheimer. Ein weiterer Risikofaktor für das Auftreten dieser Form der Alzheimer-Krankheit stellt die Ausprägung des Down-Syndroms dar, da es sich hier um eine Trisomie 21 handelt, das Gen auf dem das APP-Gen lokalisiert also dreimal vorhanden ist.

Auch die Wahrscheinlichkeit an der ab dem 65. Lebensjahr auftretenden sporadischen

„late-onset“ Form zu erkranken, erhöht sich durch genetische Risikofaktoren. Einen dieser Risikofaktoren stellen beispielsweise bestimmte Polymorphismen des ApoE-Gens, das auf Chromosom 19 lokalisiert ist, dar. Dieses kodiert für das Apolipoprotein E, welches bei der Regulation des Lipidmetabolismus, der Cholesterinaufnahme und der intrazellulären Cholesterinfreisetzung eine Rolle spielt. ¹².

Vergleicht man die durch familiäre Häufung geprägte „early-onset“ Form mit der sporadischen „late-onset“ Form können keine Unterschiede in der Ausprägung klinischer Symptome und neuropathologischer Veränderungen festgestellt werden¹⁰.

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4 LITERATURÜBERSICHT

3.1.2 Pathogenese

Das Gehirngewicht eines von der Alzheimer-Krankheit betroffenen Patienten kann im Vergleich zu dem eines nicht betroffenen Menschen um bis zu 30 % reduziert sein. Dies ist auf eine im späteren Stadium der Erkrankung makroskopisch erkennbare Hirnatrophie zurückzuführen¹³. Betroffene Bereiche sind vor allem die Hirnrinde im Bereich des Temporal-, Parietal- und Frontallappens. Dort können schmalere Windungsfurchen (Sulcus) und weitere Ventrikel festgestellt werden¹⁴ (siehe Abb. 1).

Abb. 1 Makroskopisch sichtbare Veränderungen des Morbus Alzheimer (Quelle: Bright Focus Foundation, 2000; http://www.brightfocus.org/alzheimers/infographic/brain-alzheimers-disease)

Bis heute wird als Hauptursache für die klinische Ausprägung also auch die Hirnatrophie bei Morbus Alzheimer die fortschreitende Degeneration von Neuronen und Synapsen angenommen. Diese ist jedoch noch nicht vollständig geklärt¹⁵.

Bekannt ist, dass dieser Verlust der Neuronen und Synapsen von neurodegenerativen Prozessen wie der Bildung extrazellulärer Plaques aus Amyloid β-Peptid (Aβ) und intrazellulärer Neurofibrillen (neurofibrillary tangles, NFTs), welche vor allem im Neocortex, Hippocampus und im Limbischen System nachzuweisen sind, begleitet wird¹⁶ (siehe Abb. 2).

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Abb. 2 Entstehung der senilen Plaques und Neurofibrillenbündel (Quelle: International Journal of Alzheimer’s Disease)

Ein charakteristisches allerdings nicht spezifisches Merkmal für die Alzheimer-Krankheit ist die Ausbildung der NFTs. Diese entstehen durch die intrazelluläre Anhäufung abnormer Filamente aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein in den Nervenzellen. Für die Bildung dieses abnormen Tau-Proteins ist ein gestörtes Gleichgewicht bestimmter Kinasen und Phosphatasen verantwortlich¹⁷. Durch diese pathologische Veränderung kann das Tau-Protein seine eigentliche Funktion, die Stabilisierung der axonalen Mikrotubuli¹⁸, nicht mehr wahrnehmen. Es kommt zur Destabilisierung des Cytoskeletts und nachfolgender Störung des axonalen Transportes¹⁹. Aggregiert nun das abnorme hyperphosphorylierte Tau-Protein bilden sich paarige helikal gewundene Proteinfilamente (paired helical filaments, PHF). Bei weiterer Aggregation dieser PHFs entstehen die NFTs, welche nach dem Absterben der Neuronen auch extrazellulär als Ablagerungen zu finden sind²⁰. Die neuronalen und synaptischen Funktionen der Nervenzelle werden durch diese Prozesse gestört²¹. Durch NFTs in ihrer Funktion gestörte und angegriffene Axone und Dendriten werden als „dystrophe Neuriten“ bezeichnet²².

Die Ablagerung des 4 kDa großen β-Amyloides (Aβ) stellt ein weiteres charakteristisches pathologisches Merkmal dar. Aβ lagert sich vor allem im extrazellulären Raum des Gehirns, dem Neuropil, in Form der sogenannten senilen Plaques ab. Diese senilen Plaques bestehen

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aus einem zentralen Kern, der von einem Saum aus dystrophen Dendriten und Axonen umgeben ist. Weiterhin kann Aβ im Blutgefäßsystem des Gehirns nachgewiesen werden (Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA)¹⁰.

Aβ entsteht durch enzymatische Prozessierung des APP, einem glykosylierten, integralen Membranprotein (siehe Abb.3). Die proteolytische Umsetzung des APP durch die sogenannten Sekretasen kann auf zwei Wegen geschehen. Diese zwei Wege, der nicht-amyloidogene und der amyloidogene Weg, schließen sich gegenseitig aus.

Im ersten Schritt der nicht-amyloidogenen Prozessierung wird APP innerhalb der Aβ-Sequenz durch die α-Sekretase gespalten. Dadurch wird die extrazelluläre Domäne des APP als lösliches APP (sAPPα) freigesetzt und die Bildung des Aβ verhindert. Der in der Membran verbleibende Teil des APP (CT83) wird schließlich durch die γ-Sekretase gespalten.

Der amyloidogene Weg beginnt mit der Prozessierung des APP durch die β-Sekretase, wodurch ein membranständiges Fragment (CT99) und lösliches APP (sAPPβ) entstehen.

Durch Umsetzung des CT99 durch die γ-Sekretase wird Aβ freigesetzt¹³. Dieses Aβ kann sowohl in der Cerebrospinalflüssigkeit und im Plasma gesunder wie auch an Alzheimer erkrankter Menschen festgestellt werden^23,24.

Abb. 3 Prozessierung des APP (Quelle: Cárdenas-Aguayo et al., 2014²⁵)

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Durch die Variabilität der Sekretasen in ihrer Schnittstelle entstehen verschiedene Aβ-Formen, was auf die unterschiedlichen C-Termini zurückzuführen ist. Am häufigsten gebildet werden das Aβ1-40 und das Aβ1-42. Die Termini 1-40 und 1-42 bezeichnen dabei die Anzahl der Aminosäuren²⁶. Aβ1-42 weist eine stärkere Tendenz zur Aggregation und Bildung von Fibrillen auf²⁷ und ist im Vergleich zu Aβ1-40 resistenter gegenüber Degradation und lagert sich verstärkt im Gehirn ab. Es wird zudem eine höhere Neurotoxizität des Aβ1-42

angenommen.

Die vermehrte Produktion des Aβ1-42 bei der durch bestimmte Mutationen verursachten familiären Form des Morbus Alzheimer²⁸ und die Tatsache, dass Aβ1-42 als Hauptbestandteil der senilen Plaques gesehen werden kann, unterstützen die Theorie, dass die Entstehung und Ablagerung dieses um zwei Aminosäuren längeren Peptides im Gehirn zu den ersten pathologischen Schritten bei der Entstehung der Alzheimer-Krankheit gehört10,15,29,30.

Zusammengefasst gesehen kommt es zur neuronalen Dysfunktion, zur neuronalen und synaptischen Degeneration durch das Ungleichgewicht zwischen der Bildung und dem Abtransport (Clearance) des Aβ im Hirngewebe, welches zur Ansammlung des Peptides führt (Amyloid-Kaskaden-Hypothese). Der bereits erwähnte Verlust der Neuronen wird als unmittelbare Ursache für die Demenz angesehen, wobei der genaue zugrundeliegende Mechanismus noch aufzuklären ist. Zusätzlich scheinen Entzündungsprozesse, Veränderungen des Ionenhaushaltes und oxidative Schäden eine Rolle zu spielen¹⁵. Mittlerweile wird die neurotoxische Wirkung auch auf die löslichen oligomeren Aβ-Formen ausgedehnt. Diese korrelieren besser mit dem Krankheitsverlauf, als die Anzahl histologisch nachweisbarer Plaques, welche auch post mortem bei Menschen festgestellt werden können, die keinerlei Anzeichen für eine Demenz zeigten^31,32.

3.1.3 Klinik

Der Verlauf der Alzheimer-Krankheit, der im Allgemeinen durch eine stetige aber langsame Verschlechterung charakterisiert ist, kann in drei Stadien eingeteilt werden. In Stadium 1 zeigen sich zunächst Symptome wie Kraftlosigkeit und der Verlust der Spontaneität, die von den Patienten selbst und ihrer Umwelt oft nicht als Veränderung registriert werden. Hinzu kommen eine leichte Gedächtnisstörung und Gemütsschwankungen. Hierauf folgt der beginnende Verlust des Sprach- und Auffassungsvermögens in Stadium 2. Betroffene neigen zu erhöhtem Bewegungsdrang. Es wird eine zunehmende Beeinträchtigung des Kurzzeitgedächtnisses und später auch des Langzeitgedächtnisses deutlich. Auch Wesensveränderungen sowie allgemeine Verhaltensauffälligkeiten prägen das Erscheinungsbild der Alzheimer-Krankheit. Im Endstadium der Krankheit werden die Patienten meist bettlägerig und sind auf permanente Pflege angewiesen (Alzheimer Forschung Initiative e.V.).

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3.2 Morbus Parkinson

1817 beschrieb der britische Arzt James Parkinson in „An Essay on the Shaking Palsy“

erstmals die charakteristischen Symptome des nach ihm benannten Morbus Parkinson. Es handelt sich hierbei um eine Erkrankung des Zentralen Nervensystems, die durch das zunehmende Defizit des Neurotransmitters Dopamin in der Substantia nigra, pars compacta (SNc) des Mittelhirnes gekennzeichnet ist. Die drei typischen Symptome der auch als

„Schüttellähmung“ bezeichneten Erkrankung sind Rigor (Steifheit), Tremor (Zittern) und Akinese (Bewegungsarmut/ -starre) und betreffen die willkürliche Muskulatur.

Die Parkinson-Syndrome werden in drei unterschiedliche Gruppen eingeteilt. Den größten Anteil von 80-90 % macht das idiopathische Parkinson-Syndrom aus (Morbus Parkinson oder Parkinson-Krankheit, im Folgenden abgekürzt durch MP), verursacht durch Dopaminmangel in der SNc. Die Ursachen dieses Parkinson-Syndroms sind multifaktorieller Natur und noch nicht in Einzelheiten geklärt. Teilweise wird Umweltfaktoren eine ätiologische Bedeutung zugeschrieben, für einen kleinen Teil sind genetische Faktoren bekannt³³.

Die atypischen Parkinson-Syndrome verbunden mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Multi-Systematrophie und der Progressiven Supranukleären Blickparese und die beispielsweise bei cerebraler Mikroangiopathie oder Hydrocephalus vorkommenden sekundären Parkinson-Syndrome, auch als symptomatische Parkinson-Syndrome bezeichnet, bilden den kleinsten Anteil der Parkinson-Syndrome.

Morbus Parkinson gehört als häufigste neurodegenerative Erkrankung auch zu den häufigsten Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

Je nach Land und Region zeigt sich eine Häufigkeit zwischen 18 und 194 Fällen pro 100.000 Einwohner. In Deutschland wird von 150.000 Patienten, die Dunkelziffer nicht erfasster Fälle miteingerechnet von bis zu 300.000 an Morbus Parkinson erkrankten Menschen ausgegangen.

Besonders selten kommt die Erkrankung in Japan, China, Schweden, Polen, Dänemark, Südeuropa und Afrika vor. In Mitteleuropa und Nordamerika liegt die Häufigkeit bei 160 Patienten pro 100.000 Einwohner.

Betrachtet man die Verteilung der Erkrankung unter Männern und Frauen zeigt sich, dass beide etwa gleich oft erkranken. Es gibt jedoch Studien, die auf eine etwas höhere Erkrankungsrate bei Männern hinweisen.

Weltweit liegt die Zahl der Neuerkrankungen pro Jahr zwischen 2 und 24 Fällen pro 100.000 Einwohner. In Deutschland wird von 16 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner, also 13.000 neuen Fällen pro Jahr ausgegangen.

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Morbus Parkinson ist eine der häufigsten Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

Dennoch sind die Ursachen dieser neurodegenerativen Krankheit im Wesentlichen bis heute noch nicht geklärt. Es wird ein multifaktorielles Geschehen angenommen.

Dabei existieren mehrere Hypothesen zum Ursprung des MP. Unter anderem wird angenommen, dass ein vorzeitiger Alterungsprozess eine Rolle spielt³⁴. Eine Reduktion der dopaminergen Neurone, wie sie bei MP festzustellen ist, zeigt sich auch unter physiologischen Bedingungen während des natürlichen Alterungsprozesses bei gesunden Menschen (ca. 4 % pro Jahrzehnt des Erwachsenenlebens)³⁵. Bei MP sind bei Auftreten der ersten Symptome bereits 80 % der dopaminergen Neurone untergegangen. Da eine solch starke Reduktion der dopaminergen Neurone gemeinhin nicht innerhalb der Lebenszeit eines Menschen auftreten kann, ist zu vermuten, dass eine der Ursachen des MP ein beschleunigter Alterungsprozess ist^34,36. MP kann allerdings nicht als einfache Beschleunigung des Alterungsprozesses gesehen werden, da sich das Muster der Degeneration dopaminerger Neurone in der SNc von dem des physiologischen Alterungsvorganges unterscheidet. Bei MP konzentriert sich die Reduktion der dopaminergen Neurone vor allem auf ventrolaterale und kaudale Bereiche der SNc, während der Vorgang des normalen Alterns durch den Zellverlust in dorsomedialen Anteilen der SNc gekennzeichnet ist^37,38. Ein anderer Aspekt, der das vorzeitige Altern als alleinige Ursache ausschließt, ist, dass die Zahl der Neuerkrankungen zwischen dem 60. und dem 80. Lebensjahr stetig ansteigt, danach aber wieder absinkt.

Andere Faktoren, die bei der multifaktoriellen Pathogenese des MP eine Rolle spielen, sind eine genetische Veranlagung, Umwelteinflüsse, der Kontakt mit bestimmten Toxinen und verschiedene metabolische Störungen.

In den letzten Jahren sind mehrere Genorte (PARK1-15) bzw. Gene identifiziert worden, die bei der Entstehung des familiären Morbus Parkinson beteiligt sind (Gasser, Brockmann 2010). Mutationen, wie beispielsweise die Punktmutationen A53T und A30P (Austausch von Alanin gegen Threonin an Stelle 53 bzw. gegen Prolin an Stelle 30) im SNCA-Gen (PARK1), welches für das α-Synuklein codiert, sind ursächlich für die vererbten Formen des Morbus Parkinson. Bei α-Synuklein handelt es sich um ein präsynaptisches Protein, dessen physiologische Funktion laut mehrerer Studien^39-41 in einer Beteiligung an der synaptischen Plastizität dopaminerger Neurone, der Dopamin Biosynthese und dem Recycling synaptischer Vesikel liegen könnte. Seine genaue Funktion ist allerdings noch nicht geklärt. α-Synuklein liegt in nativem Zustand ungefaltet und ohne definierte Sekundärstruktur vor⁴². Erst durch Bindung an die synaptischen Vesikel nimmt es eine α-helikale Sekundärstruktur an^43,44. In hohen Konzentrationen tendiert es zur Bildung von Oligomeren mit β-Faltblattstruktur, sogenannten Protofibrillen. Diese wiederum können sich aneinanderlagern und machen so einen Hauptbestandteil der für Morbus Parkinson typischen Lewy Bodies aus. Die Punktmutationen A53T und A30P im SNCA-Gen erhöhen die Neigung des Proteins zur Bildung von Protofibrillen^45,46 (siehe Abb. 4).

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Abb. 4 Pathogenese des erblich bedingten Morbus Parkinson

Punktmutationen in dem für α-Synuklein codierenden SNCA-Gen und die daraus resultierende Ablagerung von Amyloid in Form von Lewy Bodies bei der erblichen Form des Morbus Parkinson

(Conway et al, Nat Med 1998; Conway et al, PNAS 2000; Conway and Landsbury, Nat Cell Biol 2001)

Insgesamt sind ca. 5-10 % der gesamten Parkinson-Erkrankungen in die Gruppe des familiären Morbus Parkinson einzuordnen⁴⁷.

Auch Umwelteinflüsse und die Exposition gegenüber bestimmten Toxinen werden als Ursache für ein erhöhtes Risiko einer Parkinson-Erkrankung angenommen. 1982 kam es durch einen Drogenunfall mit dem Neurotoxin MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) zur Ausprägung eines schweren Parkinson-Syndroms bei den Konsumenten. Mittlerweile wurden unterschiedliche Studien zur Erkrankungshäufigkeit in Verbindung mit der Exposition gegenüber verschiedenen Umweltgiften wie Kohlenmonoxid und Mangan oder Toxinen, die beispielsweise in Holzschutzmitteln oder Pestiziden enthalten sind, durchgeführt⁴⁸. Dennoch ist auch hier davon auszugehen, dass es sich nicht um die alleinige Ursache des MP handelt, da Personenkreise existieren, die diesen Stoffen ausgesetzt sind, aber nicht vermehrt an MP erkranken⁴⁸. Neuere Studien deuten auf einen

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Zusammenhang zwischen Umwelteinflüssen wie beispielsweise der Exposition gegenüber bestimmten Toxinen und der genetischen Prädisposition hin⁴⁹.

Einen weiteren Faktor, der das multifaktorielle Geschehen um MP ergänzt, bilden metabolische Störungen, wie zum Beispiel gestörte Entgiftungsmechanismen, die zur verstärkten Bildung freier Radikale führen und so vermehrt oxidativen Stress auslösen. Sie können die Lipide der Zellmembran oxidieren (Lipidperoxidation). Es kommt zur Schädigung der Zellwand und einem damit verbundenen Kalzium-Strom in die Zelle⁵⁰. Schließlich geht die Zelle daran zugrunde⁵¹.

Zusätzlich zur Erhöhung der Lipidperoxidation zeigen sich eine Verringerung der Antioxidantien und eine erhöhte Produktion freien Eisens (Fe²⁺, Fe³⁺), welches ebenfalls zur verstärkten Oxidation von Lipiden und Proteinen beiträgt. Auch dem Dopaminstoffwechsel wird eine Rolle bei der Produktion und dem Anstieg freier Radikale zugeschrieben. Hierbei wird Dopamin durch eine erhöhte Aktivität der Monoaminooxidase B im Striatum oxidiert.

Dabei wird vermehrt H2O2 gebildet, welches durch die Anwesenheit von Eisen oder freien Superoxid-Radikalen zu freien toxischen Hydroxylradikalen reduziert wird. Durch einen erhöhten Dopaminstoffwechsel, wie er beispielsweise im fortschreitenden Alter festzustellen ist⁵², kommt es durch vermehrte Bildung von H2O2 zu einer Überlastung des Glutathionsystems, das für den Abbau des H2O2 zuständig ist. Ein Dopamin Mangel, wie er bei Morbus Parkinson der Fall ist, hat überdies einen kompensatorischen Anstieg des Dopamin Umsatzes zur Folge. Dadurch kommt es zusätzlich zu einer gesteigerten Bildung von H2O2, was zu einer weiteren Überlastung des Glutathionsystems führt⁵³.

Auch mitochondriale Funktionsstörungen insbesondere eine geringere Aktivität im Komplex I der Atmungskette führen durch eine Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials zum Untergang der dopaminergen Neurone und dadurch zur Ausbildung der durch einen Mangel an Dopamin verursachten Symptomtrias.

3.2.3 Klinik

Die Symptome des Morbus Parkinson können unterteilt werden in motorische und nicht-motorische Symptomgruppen.

Bei den motorischen Symptomen handelt es sich um die drei typischen Symptome wie Rigor, Tremor und Akinese. Häufig treten die Symptome zeitlich versetzt und mit einseitigem Beginn von Tremor und Rigor auf. Bei dem Tremor handelt es sich meist um einen Ruhetremor, der mit einem rhythmischen Zittern der Hand beginnt und auch oft als erstes motorisches Symptom registriert wird. Möglich sind aber auch ein Tremor des Kiefers oder des Kopfes. Ein permanent erhöhter Muskeltonus bezeichnet den Rigor und äußert sich durch eine gebückte Haltung, Ungeschicklichkeit und Muskelschmerzen. Die Akinese wird gekennzeichnet durch zunehmende Bewegungsarmut oder auch –starre, die im Verlauf des Morbus Parkinson zur Verlangsamung und Versteifung von Bewegungen führt. Dazu gehören auch Sprachstörungen und das für Parkinson typische Maskengesicht, verursacht durch die nachlassende Mimik.

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Diese Symptome vereinen sich in dem typischen Bild eines an Parkinson erkrankten Menschen mit vornübergebeugter Haltung und kleinschrittigem, schleifenden Gang ohne Bewegung der Arme. Auch die geringgradige Beugehaltung und Rotation der Extremitäten nach innen gehört zu diesem Erscheinungsbild.

Die nicht-motorischen Symptome bezeichnen vor allem Veränderungen der Psyche wie Entschlusslosigkeit und chronische Depressionen und vegetative Symptome wie beispielsweise Thermoregulationsstörungen, Schlafstörungen und gastrointestinale Störungen.

Im Spätstadium der Krankheit führen akinetische Krisen, also langanhaltende Bewegungsblockaden zu lebensbedrohlichen Zuständen, die nach längeren Episoden des geistigen und körperlichen Verfalls zum Tode führen können.

3.3 Chorea Huntington

Chorea Huntington ist eine autosomal vererbte⁵⁴, progressiv verlaufende neurodegenerative Erkrankung. 1872 wurde die schon vorher mehrmals beschriebene Krankheit durch eine Veröffentlichung von George Huntington bekannt.

Die Krankheit bricht meist zwischen dem 35. und 50. Lebensjahr aus, wobei auch Fälle des frühen Ausbruchs bis zum 5. Lebensjahr und Spätmanifestationen bis zum 70. Lebensjahr bekannt sind. Das klinische Bild dieser auch als „erblicher Veitstanz“ bekannten Erkrankung wird geprägt von Bewegungsstörungen und psychischen Veränderungen.

Ursächlich für die Erkrankung ist ein genetischer Defekt im sogenannten Huntingtin-Gen.

Hierbei handelt es sich um die Wiederholung (repeats) einer spezifischen Nukleotidsequenz (CAG) (siehe Abb. 5), die in der normalen Population in einer Anzahl von 11-34 repeats vorhanden ist. Bei Chorea Huntington Patienten ist sie auf mehr als 37 repeats erhöht⁵⁵. Die aus dem Basentriplett CAG resultierende mRNA codiert für die Aminosäure Glutamin Bei Huntington-Patienten liegt also eine erhöhte Zahl von Glutaminresten im Huntingtin-Protein vor. Durch diese Veränderung aggregiert das Protein, dessen Abbau mit großer Wahrscheinlichkeit gestört ist, in amyloidähnlichen Ablagerungen. Diese sind histologisch als sogenannte intranukleäre Einschlusskörperchen zu erkennen⁵⁶.

Chorea Huntington gehört zu den häufigsten erblich bedingten neurodegenerativen Erkrankungen. Die Prävalenz liegt bei 5-10 Fällen von 100.000 Personen. Dazu kommt die 2 bis 4-fache Zahl an noch gesunden Genträger der Erkrankung. In Japan und Finnland kommt die Erkrankung 10-mal seltener vor. Die Häufigkeitsverteilung bei Männern und Frauen ist ungefähr gleich.

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Abb. 5 CAG-Triplett repeats bei Chorea Huntington

(Quelle: National Institute of Standards and Technology, USA; http://www.nist.gov/mml/bmd/srm- 041211.cfm)

Chorea Huntington wird hervorgerufen durch eine abnorme Wiederholung des für die Aminosäure Glutamin codierenden Basentripletts CAG im Huntingtin-Gen. Das Huntingtin-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 4. In gesunden Populationen wird diese Polynukleotidsequenz 11 bis 34-mal wiederholt, bei Chorea Huntington-Patienten 37 bis 250-mal. Je häufiger das Basentriplett innerhalb des Gens wiederholt wird, desto früher bricht die Krankheit aus⁵⁷.

Das mutierte Huntingtin-Protein bildet amyloidähnliche Ablagerungen⁵⁸. Es wird angenommen, dass diese auch als intranukleäre Einschlusskörperchen bezeichneten Aggregate einen toxischen Effekt auf betroffene Zellen haben und diese dadurch zugrunde gehen⁵⁹. Eine andere Theorie sieht die Funktion dieser Einschlusskörperchen in einem Schutzmechanismus des Körpers, der helfen soll, den Spiegel des freien mutierten toxischen Huntingtin herabzusetzen⁵⁶ (siehe Abb. 6).

Es wird angenommen, dass die Toxizität des mutierten Huntingtin unter anderem durch eine Interaktion mit der äußeren mitochondrialen Membran betroffener Zellen zu Stande kommt⁵⁹. Die dadurch entstehende mitochondriale Dysfunktion äußert sich in einer Reduktion der Energieproduktion und des Membranpotentials und in Veränderungen des Calciumstoffwechsels. Zusätzlich wird die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress erhöht und die Caspase-vermittelte Apoptose ausgelöst⁵⁹.

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Mutiertes Huntingtin scheint außerdem die Effektivität des für den Abbau fehlgefalteter Proteine zuständigen Ubiquitin-Proteasom-Systems herabzusetzen⁵⁹. Die erweiterte Polyglutamin-Sequenz des Huntingtin wird hierbei im Proteasom gebunden und blockiert dieses so für andere Substrate. Es entstehen vermehrt Fragmente, die zur Aggregation in den intranukleären Einschlusskörperchen tendieren.

Ein weiterer Faktor, der bei der Beseitigung des mutierten Huntingtin eine Rolle spielt, ist die Autophagozytose. Studien haben gezeigt, dass eine Aktivierung dieses Mechanismus einen gesteigerten Abtransport des mutierten Huntingtin zur Folge hat⁵⁹.

Abb. 6 Pathogenese der Chorea Huntington (modifiziert nach Prospero et al., Nature Medicine 2000⁶⁰)

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3.3.3 Klinik

Die ersten Anzeichen der Chorea Huntington zeigen sich zwischen dem 30. und 50. Lebensjahr, in sehr seltenen Fällen auch schon in Kindheit oder Jugend. Zunächst äußert sich die Erkrankung durch psychische Veränderungen wie erhöhte Reizbarkeit und Unverträglichkeit. Eine gestörte Libido, die Vernachlässigung des Berufes und des sozialen Umfeldes gehören ebenfalls zu den ersten Symptomen. In späteren Stadien können die Betroffenen zu Gewalttätigkeit neigen. Sie verwahrlosen zunehmend. Dieser Zustand der Choreophrenie kann sich auch in der Ausbildung paranoider Psychosen äußern. Im weiteren Verlauf entwickelt sich eine Demenz.

Parallel zu den psychischen Veränderungen treten bei den Erkrankten Bewegungsstörungen auf. Charakteristisch für Chorea Huntington ist das Grimassieren der mimischen Muskulatur.

Auch eine verwaschene Sprache, unwillkürliche Bewegungen der Kau- und Zungenmuskulatur und eine damit verbundene gestörte Nahrungsaufnahme machen das Bild dieser Erkrankung aus.

Auch die Extremitäten sind von einer Hyperkinese betroffen, zunächst halbseitig, später dann beidseitig. Eine Zunahme dieser unwillkürlichen Bewegungen beim Gehen ist charakteristisch. Im Frühstadium der Chorea Huntington zeigen sich überdies okulomotorische Störungen wie zum Beispiel eine vertikale Blickparese.

Das Endstadium der chronisch fortschreitenden Erkrankung ist geprägt durch eine Versteifung der Muskeln und Gelenke mit hochgradiger Bewegungslosigkeit. Bei Jugendlichen zeigt sich schon frühzeitig Rigor und es kommt zu epileptischen Anfällen.

Betroffene erreichen nur selten das 60. Lebensjahr, da die Erkrankung innerhalb von 12 bis 15 Jahren zum Tode führt⁶¹.

3.4 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE)

Die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE), auch als Prion-Krankheiten bezeichnet, sind eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen, die sowohl bei Menschen als auch bei Tieren existieren.

Bei Tieren sind mehrere TSE bekannt. Scrapie, die älteste bekannte TSE, wurde 1732 zum ersten Mal in England entdeckt. Diese Erkrankung betrifft Schafe und Ziegen. 1985 wurde - ebenfalls in England – erstmals eine TSE bei Rindern diagnostiziert, die sogenannte Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE). Zusätzlich existieren noch die Chronic Wasting Disease (CWD) bei Hirschen, die Transmissible Mink Encephalopathy (TME) der Nerze, die Feline Spongiform Encephalopathy (FSE) der Katzen und die Exotic Ungulate Encephalopathy (EUE), die vor allem afrikanische Antilopenarten betrifft. Des Weiteren gelang die experimentelle Übertragung der TSE auch auf andere Tierarten, wie beispielsweise Ratten,

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Meerschweinchen, Hamster und verschiedene Mausarten. Auch Frettchen und mehrere Affenarten ließen sich experimentell mit den TSE infizieren.

Die TSE des Menschen können in drei Gruppen unterteilt werden: die übertragbaren, sporadischen und genetisch bedingten TSE. Kuru, eine in den 50er Jahren bei dem Stamm der Fore in Papua-Neuguinea entdeckte spongiforme Enzephalopathie, gehört sowie die infektiöse Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) zu den übertragbaren TSE.

Daneben existiert eine sporadische Form der CJD und das zur Gruppe der genetisch bedingten TSE gehörende familiäre Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) und die Fatale Familiäre Insomnie (FFI).

Die TSE gehören wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Chorea Huntington zu den degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Im Gegensatz zu diesen sporadisch auftretenden oder vererbten Erkrankungen sind TSE von infektiöser Natur. Neben der Übertragbarkeit gehören auch die Veränderungen der Gehirnsubstanz zu den charakteristischen Merkmalen der TSE. Hierbei handelt es sich um eine symmetrische schwammartige Vakuolenbildung, die die Neuronen direkt (intraneuronal), aber auch das umliegende Neuropil (extraneuronal) betrifft. Typisch für die TSE sind auch die Ablagerung des pathologischen Prion-Proteins (PrP^sc, sc steht für Scrapie). Diese sind fibrillär oder granulär angeordnet, kommen aber auch als amyloide Plaques vor. Zusätzlich zu diesen Strukturen kann eine Astrozytose festgestellt werden. Anzeichen für eine Entzündung oder Immunantwort sind in Gehirnen erkrankter Tiere und Menschen nicht zu finden.

3.4.3 Klinik

Die Symptome der TSE variieren je nach Erkrankung. Allen gemeinsam ist jedoch der progressive neurodegenerative und stets tödliche Verlauf.

Bei an TSE erkrankten Tieren setzen nach einer meist mehrjährigen Inkubationszeit Symptome wie Schreckhaftigkeit, Bewegungsstörungen und Tremor ein. Im Endstadium der Erkrankung kommt es dann zum vollständigen Verlust der Bewegungskoordination.

Die TSE des Menschen verlaufen ähnlich. Hier sind jedoch zusätzlich zu den physischen Symptomen wie einem schwankenden Gang, dem Verlust der Koordination, Muskelzuckungen und einem gestörten Empfindungsvermögen auch Symptome psychischer Natur festzustellen. Betroffene leiden unter starker Persönlichkeitsveränderung, Depressionen und Schlafstörungen. Im späteren Verlauf der Erkrankung kommt es zum Verlust des Erinnerungsvermögens und der Fähigkeit, sich zu bewegen und zu sprechen.

Die TSE sind unheilbar und führen innerhalb weniger Monate bis Jahre zum Tod.

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3.5 Untersuchungen zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen Viele der neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Chorea Huntington sind mit der Aggregation und Ablagerung eines fehlgefalteten Proteins verbunden⁶². Die Ablagerung fehlgefalteter Proteine führt zur Aggregation ursprünglich löslicher Proteine. Diese Aggregate gelten als zelltoxisch und mitverantwortlich für die charakteristische Pathologie der Erkrankungen. Bislang fehlen Therapieansätze zur Heilung dieser Erkrankungen, da die pathologischen Mechanismen nicht aufgeklärt sind. Dennoch gibt es zahlreiche Therapieansätze, die sich in den Wirkmechanismen und Angriffspunkten (Targets) der getesteten Substanzen unterscheiden. Die Ansätze zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen sind vielfältig (siehe Abb. 7). So wird beispielsweise versucht, die Aggregationsneigung der Proteine zu verringern, indem die posttranslationale Veränderung aber auch die Produktion des nativen Proteins gehemmt werden soll. Des Weiteren existieren Versuche, den Aggregationsprozess in verschiedenen Stufen zu unterbrechen. So sollen beispielsweise die am Anfang der Aggregation stehenden Monomere stabilisiert werden und die Aktivität der Chaperone, welche für die richtige Faltung neuentstandener Proteine verantwortlich sind, erhöht werden. Darüber hinaus wird durch Hemmung der weiteren Aggregation von Monomeren zu Multimeren, Fibrillen und schließlich Amyloid versucht, das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen aufzuhalten. Auch die Förderung des Abbaus und Abtransport nativen oder fehlgefalteten Proteins gehört zu den Therapieansätzen.

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Abb. 7 Ziele potentieller Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen

3.5.1 Hemmung der posttranslationalen Modifikation nativer Proteine

Zur posttranslationalen Modifikation der nativen Proteine zählen mehrere Mechanismen wie etwa die Prozessierung durch Proteasen, die Phosphorylierung durch Kinasen sowie Oxidationsprozesse, in deren Verlauf sogenannte ROS („reactive oxygen species“) entstehen^4,62.

Im Falle der Alzheimer-Krankheit wird beispielsweise versucht, durch Hemmung der β- und γ-Sekretase, welche für die proteolytische Spaltung des APP verantwortlich sind, die Produktion des bei der Prozessierung entstehenden β-Amyloid (Aβ) zu stoppen⁶². Ein Beispiel hierfür ist NN-[N-3,5-difluorophenylacetyl)-1-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl Ester, ein Isobutylester. Durch orale Gabe dieses γ-Sekretase-Inhibitors konnte der Aβ-Level im Gehirn APPV717F transgener Mäuse gesenkt werden⁶³. Andere Substanzen, die durch Inhibition der γ-Sekretase zur Verhinderung der Proteinaggregation beitragen sind NSAID⁶⁴ (Non steroidal anti inflammatory drugs – Schmerzmittel), Lithium⁶⁵ (Hemmer der Glycogen Synthase Kinase 3, GSK3), Gleevec⁶⁶ (Arzneimittel zur Behandlung maligner Erkrankungen;

Wirkstoff: Imatinib), MRK-560⁶⁷ (N-[cis-4-[(4-chlorophenyl)-sulfonyl]-4-(2,5-difluoropheny) cyclohexyl]-1,1,1-trifluoro-methansulfonamid) und R-flurbiprofen⁶⁸ (Flurizan; einzelnes Enantiomer des Razemates Flurbiprofen, einer NSAID). Auch die Hemmung der β-Sekretase (BACE1) hat einen reduzierenden Effekt auf die Bildung des sich ablagernden Aβ. Andere Untersuchungen haben gezeigt, dass Acylguanidine⁶⁹ und karbozyklische und heterozyklische Peptidomimetika⁷⁰ als Inhibitoren der BACE1 funktionieren.

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Eine weitere Möglichkeit ist die Hemmung der von Kinasen induzierten Phosphorylierung. So wird beispielsweise versucht die (Hyper-)phosphorylierung des τ-Proteins bei diversen Tauopathien wie der Alzheimer-Krankheit und des α-Synuklein bei Morbus Parkinson zu verhindern. Als potentielle Inhibitoren der Phosphorylierung bei Morbus Alzheimer gelten zum Beispiel die Glykogensynthase-Kinase-3 (GSK-3)-Hemmer Lithium⁷¹, NP12⁷² (Thiazolidon-Derivat) und TRH⁷³ (Thyreotropin Releasing Hormon). Zusätzlich zu diesen drei Substanzen werden auch noch andere die GSK3 beeinflussende Wirkstoffe getestet⁷¹. Die Phosphorylierung des α-Synuklein bei Morbus Parkinson, speziell die Hyperphosphorylierung an Ser-129 (Serin an Position 129 der α-Synuklein-Sequenz), korreliert mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Inglis et al. haben gezeigt, dass die PLK 2 (Polo-like Kinase 2) einen großen Anteil an der Phosphorylierung des α-Synuklein hat. Ferner wiesen sie eine Hemmung der Phosphorylierung durch den PLK-Hemmer (PLK – Polo-like Kinasen) BI 2356 nach⁷⁴. Da die für die Phosphorylierung des α-Synuklein verantwortlichen Kinasen ubiquitär vorkommen, bleiben die Selektivität der Kinase-Hemmer und deren Hirngängigkeit das Ziel der Folge- Studien⁷⁵. Ein anderer Ansatz ist die Verwendung allosterischer Aktivatoren, die die Dephosphorylierung des α-Synuklein an Ser-129 unterstützen.

Eicosanoyl-5-Hydroxytryptamid (EHT) beispielsweise steigert die Methylierung der Phosphoprotein Phosphatase 2A, wodurch deren Phosphatase-Aktivität gegenüber α-Synuklein verbessert wird⁷⁶. Transgene Mäuse, die mit EHT enthaltendem Futter ernährt wurden, wiesen eine reduzierte Phosphorylierung an Ser-129 und eine geringere Aggregation des α-Synuklein auf. Gleichzeitig verbesserte sich deren neuronale Leistungsfähigkeit⁷⁷. Ein anderer wichtiger Ansatzpunkt bei der Suche nach potentiellen Wirkstoffen ist die Reduktion der während der Proteinaggregation stattfindenden Oxidationsprozesse. Bei der Bildung von Amyloidfibrillen entstehen sogenannte reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS - Reactive Oxygen Species). Sie lösen zusätzlich oxidativen Stress aus, beschleunigen den Aggregationsprozess und tragen so zur Schädigung der betroffenen Neuronen bei⁷⁸. Bisher wurden zahlreiche Antioxidantien als potentielle Therapeutika getestet⁷⁸. Für Vitamin E (α-Tocopherol), Vitamin C, Karotinoide wie ß-Carotin und Vitamin B12 beispielsweise konnten in präklinischen Studien neuroprotektive Eigenschaften nachgewiesen werden. Auch Enzyme wie Glutathionperoxidasen, Superoxid-Dismutasen wie die Mangan-Superoxid-Dismutase und Reparaturenzyme wie Lipasen, Proteasen und DNA-Reparaturenzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Vorbeugung und dem Schutz der Neuronen gegenüber oxidativem Stress⁷⁸. Untersuchungen haben gezeigt, dass diese antioxidativ wirkenden Enzyme eine Möglichkeit zur Behandlung kognitiver Symptome und der für die Alzheimer-Krankheit typischen Verhaltensstörungen bieten⁷⁸. Neben gut charakterisierten Antioxidantien wie beispielsweise Vitamin C oder Vitamin E existieren noch andere antioxidative Substanzen. Sie sind speziell auf die mitochondriale Dysfunktion ausgerichtet, die bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen Teil der Pathogenese ist. Die mitochondriale Zerstörung und veränderte Verteilung der Mitochondrien verursacht durch oxidativen Stress wurde bereits in vitro nachgewiesen. Die verstärkte Produktion von ROS durch die Mitochondrien ist daher das Ziel vieler auf Mitochondrien ausgerichteter

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Substanzen, die bereits getestet wurden oder sich noch in der Entwicklung befinden. Beispiele hierfür sind das Coenzym Q10 (CoQ10) und die R-α-Liponsäure (LA). NADH (reduzierte Form des Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid), Mito Q (ein Ubiquinon-Analog) und Szeto-Schiller-Peptide (SS Peptide; zellpermeable kleine Peptide) sind ebenfalls potentielle Therapeutika neurodegenerativer Erkrankungen, deren antioxidative Wirkung in präklinischen Studien gezeigt werden konnte. Auch diese Substanzen wirken, indem sie der mitochondrialen Dysfunktion entgegensteuern⁷⁸.

Neben diesen auf Mitochondrien ausgerichteten Antioxidantien existieren auch noch andere Gruppen antioxidativ wirkender Substanzen, deren Potential als Therapeutikum für neurodegenerative Erkrankungen untersucht wurde. Viele traditionelle Heilkräuter beispielsweise enthalten Substanzen mit antioxidativer Wirkung. Den drei Hauptalkaloiden des chinesischen Goldfadenerdsprosses (Coptidis Rhizoma) – Groenlandizin, Berberin und Palmatin – zum Beispiel wurden ROS und RNS (Reactive Nitrogen Species) hemmende Eigenschaften nachgewiesen⁷⁸. Zusätzlich haben sie speziell für die Alzheimer-Krankheit wichtige Effekte wie etwa die Hemmung der Cholinesterase und Aβ-Bildung. Auch viele Flavonoide, eine Gruppe sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe, sind Gegenstand von In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen im Hinblick auf potentielle Therapeutika für neurodegenerative Erkrankungen. Silibinin, ein Flavonoid aus der Mariendistel (Silybum marianum) verhinderte durch Aβ verursachte Beeinträchtigungen des Gedächtnisses und oxidative Schäden bei transgenen Mäusen⁷⁸. Auch Nahrungsmittel enthalten Substanzen mit antioxidativem und damit neuroprotektivem Potential. So gehören beispielsweise Omega-3-Fettsäuren⁷⁹, Koffein und Curcumin, der Hauptbestandteil des Curry-Gewürzes, aber auch Epigallocatechingallat, die Hauptkomponente des grünen Tees, und Resveratrol, ein Polyphenol aus Rotwein zu den antioxidativ wirksamen Nahrungsbestandteilen. In-vitro- und In-vivo-Studien haben gezeigt, dass Koffein⁸⁰, Epigallocatechingallat⁸¹ und Resveratrol⁸² hemmend auf die Produktion und die Ablagerung des Aβ wirken. Eine Untersuchung an transgenen Alzheimer-Mausmodellen zeigte, dass Curcumin antioxidative und antiinflammatorische Wirkung besitzt und die mit der Alzheimer-Krankheit assoziierte Neuropathologie durch Hemmung der Lipoxygenasen und Cyclooxygenase 2 reduziert⁸³. Diese Enzyme spielen eine Rolle bei der Synthese entzündungsfördernder Leukotriene, Prostaglandine und Thromboxane. Eine andere In-vivo- Studie zeigte, dass Curcumin Carbonylverbindungen reduziert und so die Aggregation des Aβ hemmt⁸⁴.

Andere getestete Antioxidantien sind Melatonin, ein Hormon zur Steuerung des menschlichen Tag- und Nachtrhythmus, der Monoaminooxidase B Hemmer Selegilin und Östrogen, ein weibliches Steroidhormon⁷⁸.

Auch das ursprünglich aus Nordamerika stammende Helmkraut (Scutellaria lateriflora)

enthält antioxidativ wirksame Bestandteile⁸⁵. Baicalin (5,6-Dihydroxyflavon-7-O-D-glucuronid) und sein Aglykon Baicalein (5,6,7-Trihydroxyflavon) sind zwei der in der Helmkrautpflanze enthaltenen natürlichen Flavonoide^86-88. Durch die umfangreiche Erforschung dieser Wirkstoffe konnten neben anti-oxidativen Wirkungen auch anti-inflammatorische, anti-bakterielle und krebshemmende

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Wirkungen nachgewiesen werden⁸⁹. Helmkraut ist schon seit langem Teil der traditionellen Naturheilkunde. Als nervenstärkendes, mild sedierendes und krampflösendes Mittel wird es bei der Behandlung von Epilepsien, aber auch anderer neurologischer Erkrankungen wie Angstzuständen, Schlafstörungen⁹⁰ und Neuralgien angewendet⁹¹. Es enthält zahlreiche Inhaltsstoffe, darunter ätherische Öle, Diterpenoide, Aminosäuren und Flavonoide⁸⁶. Die relevantesten als Biomarker fungierenden Flavonoide sind Baicalein, Baicalin, Wogonin und Wogonosid. Baicalein und Baicalin beispielsweise konnten in unterschiedlichen Studien an In-vitro- und In-vivo-Modellen neurodegenerativer Erkrankungen neuroprotektive Eigenschaften nachgewiesen werden^92-94. Auch die beiden Flavonglykoside Scutellarin und Ikonnikosid I sind Bestandteile des Helmkrautes. Gafner et al. konnten nachweisen, dass beide in der Lage sind an den Serotonin-Rezeptor 5-HT7 zu binden⁹⁰. Sie könnten so die Bindung freier Radikale an diesen Rezeptor, also dessen posttranslationale Modifikation verhindern. Es wird vermutet, dass die Degeneration bestimmter serotonerger Signalwege unteranderem bei der Alzheimer-Krankheit eine Rolle spielt^95,96.

3.5.2 Stabilisierung der Monomere und Steigerung der Chaperon-Aktivität

Eine weitere Möglichkeit, Fehlfaltungen zu verhindern, ist die Stabilisierung der nativen Konformation des zur Aggregation tendierenden Proteins und die Steigerung der Chaperon-Aktivität⁴.

Transthyretin (TTR) beispielsweise ist ein Protein, das im Serum und der zerebrospinalen Flüssigkeit (ZSF) vorkommt und unter anderem für die Bindung des Schilddrüsenhormons Thyroxin (T4) zuständig ist⁹⁷. Studien haben gezeigt, dass physiologische ZSF die Amyloid-Entstehung durch Bildung stabiler Aβ-TTR Komplexe hemmt⁹⁸ und somit in der Lage ist die Bildung von Fibrillen zu hemmen und bestehende Fibrillen aufzulösen⁹⁹. Ferner wurde nachgewiesen, dass es durch rekombinantes und aus humanem Serum isoliertes TTR zu einer proteolytischen Spaltung des Aβ kommt¹⁰⁰. Dabei entstehen neue Aβ-Peptide (1-14) und (15-42) mit einem geringeren amyloidogenen Potential als Aβ 1-42¹⁰⁰. Die Verstärkung der durch Transthyretin vermittelten anti-amyloidogenen Wirkungen stellt einen potentiellen Ansatz dar. In In-vitro- und Ex-vivo-Untersuchungen konnte eine Steigerung der Bindung des TTR an Aβ durch verschiedene Substanzen nachgewiesen werden¹⁰¹. Dazu zählen Iodoflunisal, 3-Dinitrophenol, Resveratrol, [2-(3,5-Dichlorophenyl)amin] (DCPA), [4-(3,5-Difluorophenyl)] (DFPB). DCPA und DFPB verbesserten außerdem die proteolytische Aktivität des TTR¹⁰².

Die Steigerung der Chaperon-Aktivität stellt eine weitere Möglichkeit dar, in die Proteinaggregation einzugreifen⁴. Chaperone sind sowohl in der Lage, bestehende Aggregate aufzulösen, als auch inhibierend auf die Aggregation fehlgefalteter Proteine zu wirken. Hsp70 beispielsweise ist ein bei zellulärem Stress gebildetes Protein, dessen Funktion als Chaperon die Überwachung der korrekten Faltung neusynthetisierter Proteine und die Neufaltung fehlgefalteter Proteine ist¹⁰³. Es konnte gezeigt werden, dass Hsp70 außerdem auch die toxischen Eigenschaften des aggregierten α-Synuklein in transgenen Mäusen mindert¹⁰⁴. Geldanamycin, ein Ansamycin Antibiotikum, verringerte in Drosophila Fliegen die durch

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α-Synuklein verursachte Neurotoxizität durch Steigerung der Hsp70-Produktion¹⁰⁵. Celastrol, ein Pflanzeninhaltsstoff, induziert die Genexpression der Hitzeschockproteine durch Aktivierung des Hitzeschocktranskriptionsfaktors 1 (HSF1) und steigert dadurch unter anderem die Hsp70-Produktion¹⁰⁶. Eine weitere Studie an transgenen Mäusen und Ratten ergab, dass Morphin, ein Opioid, durch Induktion der Östradiol-Freisetzung die Hochregulation des Hsp70 auslöst und so eine schützende Wirkung gegenüber intrazellulärer Aβ-Toxizität entwickelt¹⁰⁷.

3.5.3 Inhibition der Proteinaggregation und Auflösung bestehender Aggregate Die Reduktion von Aβ-Ablagerungen im Gehirn mittels Immuntherapie stellt einen weiteren potentiellen Therapieansatz dar. Hierzu wurden in präklinischen Studien zunächst transgene Mäuse und in der Folge Patienten in klinischen Studien aktiv mit einem Impfstoff (AN1792) bestehend aus einem synthetisch hergestellten Aβ1-42 Peptid immunisiert^108,109. Die Studien an transgenen Mäusen ergaben eine Verbesserung der kognitiven Leistung und darüber hinaus eine Reduktion der mit Aβ verbundenen Neuropathologie¹⁰⁸. Auch in den klinischen Studien konnte eine Reduktion der Plaques im Gehirn der immunisierten Alzheimer-Patienten festgestellt werden¹⁰⁹. Die klinischen Studien mussten jedoch in Phase 2a abgebrochen werden, da die Immunisierung bei einem Teil der Patienten starke Nebenwirkungen wie eine Meningoenzephalitis und eine Leukenzephalopathie hervorrief¹⁰⁹. Die passive Immunisierung mit einem intravenös verabreichten monoklonalen anti-Aβ-Antikörper (Bapineuzumab IV) wurde aufgrund mangelnder Wirksamkeit des Antikörpers in Phase III abgebrochen. Im Anschluss wurden die Träger des Apolipoprotein E4 (ApoE4)-Gens unter der Annahme, dass sie resistent gegenüber der Behandlung mit Bapineuzumab sein könnten, getrennt von den Nichtträgern behandelt und beurteilt¹¹⁰. Auch durch die Unterscheidung zwischen Trägern und Nichtträgern des ApoE4-Gens, einem Risikofaktor der Alzheimer-Krankheit, ergab sich kein signifikantes Ergebnis¹¹¹.

Neben Bapineuzumab wurde auch die passive Immunisierung mit Solanezumab, einem weiteren monoklonalen Antikörper in klinischen Studien mit Alzheimer-Patienten getestet.

Dieser Antikörper weist im Unterschied zu Bapineuzumab eine große Affinität zu löslichem Aβ und nahezu keine zur fibrillären Form des Aβ auf. Er erkennt Aβ13-28 im Zentrum des Peptides und verursacht im Gegensatz zu Bapineuzumab weniger Nebenwirkung das zentrale Nervensystem betreffend¹¹⁰.

3.5.4 Förderung des Abbaus und Abtransportes nativen oder fehlgefalteten Proteins

Wie in Kap. 3.1.2 bereits beschrieben wird der Amyloid-Kaskaden-Hypothese ein Ungleichgewicht zwischen der Bildung und der Clearance des Aβ zugrunde gelegt. So leuchtet es ein, dass auch die Förderung des Abbaus und des Abtransportes von nativem oder

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fehlgefaltetem Protein Bestandteil vieler Untersuchungen zu potentiellen therapeutischen Ansätzen ist.

Ein wichtiger Fokus wird dabei auf die Transporter-Proteine der Blut-Hirn-Schranke (BHS) gelegt. Hier sind zum Beispiel LRP-1 (Low density lipoprotein receptor-related protein 1) und P-Glykoprotein (ABCB1, P-gp) von größerer Bedeutung¹¹². Es konnte bereits mehrfach nachgewiesen werden, dass LRP-1 als Efflux-Transporter der BHS fungiert^113,114.

Auch P-Glykoprotein in seiner Funktion als Efflux-Transporter für Aβ ist bereits bestätigt.

Lam et al. identifizierten durch In-vitro-Experimente Aβ als Substrat des P-gp¹¹⁵. Vogelgesang et al. gelang es, eine inverse Korrelation zwischen vaskulärem P-gp und der Menge Aβ-positiver Plaques im Gehirn nicht-dementer älterer Verstorbener zu zeigen¹¹⁶. Auch in vitro ließ sich die regulierende Funktion des P-gp auf den Aβ-Spiegel im Gehirn nachweisen¹¹².

Auf Grundlage der nachgewiesenen Funktion als Efflux-Transporter wurde in aktuellen Studien die Möglichkeit einer Induktion des P-gp als neuer therapeutischer Ansatz für die Alzheimer-Krankheit untersucht¹¹⁷. Brenn et al. nutzten Johanniskraut als bekannten Induktor des P-gp^118-120, um diese Hypothese in vivo zu untermauern. Sie verabreichten transgenen Alzheimer-Mäusen mit Johanniskraut angereichertes Futter. Im Ergebnis der Experimente zeigte sich neben einer signifikanten Reduktion löslichen Aβ 1-42 und Aβ 1-40 und 1-42 positiver Plaques auch eine deutliche Steigerung der P-gp Expression im Gehirn der behandelten Tiere¹¹⁷.

Neben den in den vorangegangenen Kapiteln beschriebenen Möglichkeiten stellt die Förderung des Abbaus und des Abtransportes von Aβ eine weitere ernstzunehmende Variante eines potentiellen Therapieansatzes dar.