Histologische Methoden zur Auswertung der in-vivo-Versuche

5.2.3.1

Zur Erhaltung der für die Auswertung der immunhistologischen Schnitte relevanten Gehirnareale wurden die Gehirne durch die Schnitte bei 1 bis 4 (Abb. 8) jeweils in fünf Abschnitte geteilt.

Abb. 8 Zuschnitt der Mäusehirne - Schnittebenen

Gezeigt ist die Lage der Schnittebenen 1 bis 4 (links: dorsale Ansicht, rechts: ventrale Ansicht).

Quelle: Dissertation Frauke Junghans, 2004¹⁶⁵

40 MATERIAL UND METHODEN

Schnitt 1: Ebene D’ (caudaler Anteil) und D (rostraler Anteil)

Geschnitten wurde an der Fissura prima, der größten Kleinhirnzirkumferenz.

Schnitt 2: Ebene D

Hier wurde dorsal in der Mitte des vorderen Vierhügels (Colliculus superior) beginnend nach ventral durch den caudalen Bereich des Corpus mamillare geschnitten. Die caudale Seite der dadurch abgetrennten Gehirnscheibe bildete Ebene D.

Schnitt 3: Ebene C

Schnitt ca. 1 mm rostral der Spitze des vom Colliculus superior sichtbaren Dreiecks senkrecht nach ventral zur Mitte des Infundibulums. Der caudale Teil dieses Zuschnittes bildete Ebene C.

Schnitt 4: Ebene A und B

Hierfür wurde ventral beginnend direkt vom Chiasma opticum aus nach dorsal geschnitten.

An der caudalen Seite der abgetrennten Gehirnscheibe war Ebene B, an dem verbleibenden rostralen Gehirnstück Ebene A zu sehen

Herstellung der Gewebeschnitte 5.2.3.2

Nach Fixierung der Gewebeproben in 4 % neutral gepufferter Formalin-Lösung für mindestens 3 Tage und anschließendem Zuschnitt der Proben (siehe 5.2.3.1) wurden diese in Einbettkassetten überführt und über Nacht im Entwässerungsautomat nach dem Standardprotokoll (siehe 12.1.1) entwässert. Im Anschluss erfolgte die Einbettung des Gewebes in vorgewärmte Gießformen mittels Einbettgerät und die anschließende Härtung der Paraffinblöckchen auf einer Kühlplatte.

Nach Anschneiden der mindestens eine Stunde tiefgekühlten Blöckchen mittels Rotationsmikrotom wurden pro Block je 10 bis 15 Gewebeschnitte mit einer Dicke von je 3 μm angefertigt und nach einer kurzen Streckungsphase in einem ca. 40 bis 42°C warmen Wasserbad auf Objektträger gezogen. Für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E., ROMEIS 1989) bestimmte Gewebeschnitte wurden auf Superfrost-Objektträger überführt.

Gewebeschnitte, die für die immunhistochemische Färbung vorgesehen waren, wurden, um eine höhere Haftungsbeständigkeit der Schnitte während dieser mechanisch beanspruchenden Methode zu erreichen, auf Superfrost Plus-Objektträger gezogen.

Schließlich erfolgte die Glättung und Trocknung der Gewebeschnitte für zwei Tage bei 60°C in einem Wärmeschrank. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die histologischen Präparate bei Raumtemperatur aufbewahrt.

MATERIAL UND METHODEN 41

Immunhistochemische Färbung (IHC) 5.2.3.3

Alle Gewebeschnitte wurden durch die absteigende Alkoholreihe (siehe Kap. 12.1.1) entparaffiniert und rehydriert. Im Anschluss daran folgte die Demaskierung der Antigene (siehe Tab. 13). Nach der 3-minütigen Inkubation in konzentrierter Ameisensäure wurden die Schnitte für 5 min gewässert und direkt im Anschluss für 30 min in Methanol mit 3 %igem Wasserstoffperoxid überführt. Diesem Schritt folgte ein dreimaliges Spülen der Schnitte in 1xTBS und das Einspannen der Präparate in Cover Plates mit anschließender Testung des ordnungsgemäßen Sitzes der Schnitte. Bei Durchführung aller vorangegangenen Schritte befanden sich die Schnitte in dafür vorgesehenen Küvetten. Es wurden nun pro Schnitt vorgesehen für den MAK 6E10 100 μl Serumblock (1xTBS und Ziegenserum 1:1) und direkt im Anschluss ohne Spülschritte 100 μl des ersten Antikörpers aufgetragen. Alle anderen Präparate erhielten den jeweiligen ersten Antikörper in entsprechender Verdünnung ohne vorausgehenden Serumblock. Die Erstantikörper wurden in 10 %iger Ziegenserum-TBS-Lösung mit 0,03 % Natriumazid verdünnt. Für jeden Schnitt mitgeführte Negativkontrollen erhielten je 100 μl 10 %ige Ziegenserum-TBS-Lösung mit 0,03 % Natriumazid. Nach einer Inkubationszeit von 2 folgten drei Spülschritte mit 1xTBS in deren Anschluss der Zweitantikörper (siehe Tab. 12) aufgetragen wurde. Gewebeschnitte mit monoklonalem Erstantikörper erhielten je 100 μl Dako EnVision+System-HRP. Auf Schnitte mit polyklonalem Erstantikörper wurden je 100 μl anti-rabbit IgG in einer Verdünnung von 1:200 mit 10 %iger Ziegenserum-TBS-Lösung aufgetragen, für 30 min inkubiert und im Anschluss daran dreimal mit 1xTBS gewaschen. Schließlich folgten 30 min Inkubation mit je 100 μl Avidin-Biotin-Complex (20 μl Lsg. A + 20 μl Lsg. B/ ml 1xTBS) und anschließendem dreifachem Waschen mit 1xTBS und Überführung der Schnitte von den Cover Plates in die Küvetten. Während des letzten Inkubationsschrittes wurde die 30 %ige DAB-Lösung hergestellt. Direkt vor Einbringen einer Küvette in 200 ml DAB-Lösung wurde diese frisch mit 70 μl Wasserstoffperoxid versetzt. Nach der 10 minütigen Inkubation in DAB erfolgten drei Waschschritte in 1xTBS, ein kurzer Waschschritt mit Aqua dest. und die 10-minütige Färbung in Hämatoxylin mit anschließender 15 minütiger Wässerung in kaltem Wasser.

Schließlich wurden die Gewebeschnitte mittels aufsteigender Alkoholreihe (siehe Kap.

12.1.1) entwässert und mittels Eindeckelautomat mit Entellan^® eingedeckelt.

42 MATERIAL UND METHODEN

Auswertung der IHC 5.2.3.4

IHC - Morbus Alzheimer

Die Auswertung erfolgte mittels Image-Pro^® Plus (Version 5.1 für Windows™, Media Cybernetics, Inc.) am Institut für Pathologie der Universitätsmedizin Greifswald.

Zunächst wurden folgende Areale der linken Gehirnhälfte fotografiert (siehe Abb. 9):

Ebene A: 4 Gesichtsfelder des FC (Cortex Ebene A; Vergrößerung 100x) Ebene B: 4 Gesichtsfelder des PC (Cortex Ebene B; Vergrößerung 100x) Gesamter Hippocampus (Hi; 100x Vergrößerung)

Ebene C: 4 Gesichtsfelder des OC (Cortex Ebene C; Vergrößerung 100x) Ebene D: 3 Gesichtsfelder Cerebellum (Ce; 100xVergrößerung)

Der Bildausschnitt betrug 768 x 576 Pixel (entspricht 0,057 mm²) pro Gesichtsfeld. Mittels manueller Auswahlfunktion wurden die Plaques markiert und dann durch Image-Pro^® Plus ausgezählt. Für FC, PC und OC wurde die Plaquezahl der je vier Gesichtsfelder, für das Cerebellum die Plaquezahl der 3 Gesichtsfelder addiert. Der Hippocampus wurde komplett ausgezählt (Werte siehe Tab. 17 bis 23).

Die Daten wurden in Excel überführt und erst hier den jeweiligen Versuchsgruppen zugeteilt, so dass eine blinde Auswertung der Präparate zu jeder Zeit gegeben war.

IHC - Chorea Huntington

Mittels eines Plugins für ImageJ (siehe oben) wurden die punktförmigen intranukleären Huntingtin-Ablagerungen gezählt.

Hierzu wurden folgende Bildausschnitte fotografiert:

Ebene A: 4 Gesichtsfelder des FC (Cortex Ebene A; Vergrößerung 400x)

2 Gesichtsfelder 400x Vergrößerung des Endhirns, genauer Nucleus caudatus/ Putamen (EH)

Ebene B: 4 Gesichtsfelder des PC (Cortex Ebene B; Vergrößerung 400x) 2 Gesichtsfelder 400x Vergrößerung des Zwischenhirns (ZH) Ebene C: 4 Gesichtsfelder des OC (Cortex Ebene C; Vergrößerung 400x)

2 Gesichtsfelder 400x Vergrößerung des Mittelhirns (MH) Ebene D: 3 Gesichtsfelder 400x Vergrößerung des Hirnstammes/

Medulla oblongata (HS)

MATERIAL UND METHODEN 43

Abb. 9 Gehirnebenen A bis D eines Mäusehirns

(Abbildungen modifiziert nach High Resolution Mouse Brain Atlas Quelle:

http://www.hms.harvard.edu/research/brain/atlas.html)

44 MATERIAL UND METHODEN

5.3 Methoden – In-vitro-Experimente