Tierärztliche Hochschule Hannover
Das Tiermodell des Morbus Parkinson - Verhaltensstudien und
morphologische Evaluation nach Transplantation neuronaler Progenitorzellen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades der Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Nina Christin Schulze, geb. Halfer Essen
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. rer. nat Claudia Grothe, Institut für Neuroanatomie, Medizinische Hochschule Hannover
2. Prof. Dr. rer. nat. Manuela Gernert,
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Manuela Gernert Prof. Dr. rer. nat. Claudia Grothe
2. Gutachter: Prof. Dr. Gerd Bicker
Tag der mündlichen Prüfung: 18.04.2013
III Für Opa Felix und Gerti
Für Mama und Papa Für Nicolai
Für Philipp Für mich
IV
Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits in folgenden Arbeiten publiziert:
Topology of intrastriatal dopaminergic grafts determines functional and emotional outcome in neurotoxin-lesioned rats.
Jungnickel J, Kalve I, Reimers L, Nobre A, Wesemann M, Ratzka A, Halfer N, Lindemann C, Schwabe K, Töllner K, Gernert M, Grothe C.
Behav Brain Res. 2011 Jan 1;216(1):129-35. Epub 2010 Jul 22.
V
Abkürzungsverzeichnis ... VIII
1 EINLEITUNG ... 1
2 SCHRIFTTUM ... 3
2.1 Die Parkinsonsche Erkrankung ... 3
2.1.1 Epidemiologie und Klinik ... 3
2.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie ... 4
2.1.2.1 Der physiologische Regelkreis der Basalganglien ... 5
2.1.2.2 Die Pathophysiologie des Regelkreises der Basalganglien bei Morbus Parkinson ... 9
2.1.3 Therapie ... 11
2.1.3.1 Medikamentelle Therapie ... 11
2.1.3.2 Operative Therapie ... 12
2.1.3.2.1 Tiefe Hirnstimulation ... 12
2.1.3.2.2 Transplantation – regenerativer Ansatz ... 12
2.2 Das Tiermodell des M. Parkinson ... 16
2.3 Transfektion als Methode zur genetischen Modifizierung von Säuger-Zellen . 18 2.4 Neurotrophe Faktoren – FGF-2 ... 20
2.4.1 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Neurone in vitro ... 21
2.4.2 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Zellen in vivo ... 22
2.5 Verhaltensstudien im Offenfeld und Elevated Plus-Maze ... 23
2.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ... 24
3 MATERIAL UND METHODEN ... 27
3.1 Chemikalien ... 27
3.2 Geräte ... 28
3.3 Antikörper ... 28
3.4 Sonstiges ... 29
VI
3.5 OP-Besteck ... 30
3.6 Puffer und Lösungen ... 30
3.7 Versuchsdesign Transplantationsversuche ... 32
3.8 Präparation der E12 Zellen ... 32
3.9 Zellkultur ... 33
3.10 Transfektion ... 34
3.11 Das unilaterale 6-OHDA Läsions-Modell... 34
3.12 Transplantation der E12 Zellen ... 35
3.13 Perfusion und histologische Aufarbeitung ... 35
3.14 Verhaltensstudien zur funktionellen Evaluation ... 37
3.14.1 Das Offenfeld ... 38
3.14.2 Das Elevated Plus-Maze ... 39
3.15 Statistik ... 40
4 ERGEBNISSE... 43
4.1 Transplantationsversuche ... 43
4.1.1 Überleben transfizierte Zellen die Transplantation? ... 44
4.1.2 Ist eine verstärkte Astrozytose auf die Transplantate zu beobachten? ... 44
4.1.3 Sind neuronale Progenitorzellen in den Transplantaten zu finden? ... 45
4.1.4 Sind Neurone in den Transplantaten nachzuweisen? ... 47
4.1.5 Sind TH-positive Neurone nachzuweisen? ... 48
4.1.6 Zusammenfassung ... 49
4.2 Verhaltensstudien ... 60
4.2.1 Das Offenfeld ... 60
4.2.2 Das Elevated Plus-Maze ... 64
VII
5 DISKUSSION ... 71
5.1 Transplantationsversuche ... 71
5.1.1 Einfluss der Transfektion ... 72
5.1.2 Einfluss von FGF-2... 75
5.1.3 Astrozytäre Reaktion ... 77
5.1.4 Nachweisbarkeit des flag-tags – Immunhistochemie... 78
5.1.5 Ausblick ... 79
5.2 Verhaltensstudien ... 80
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 91
7 SUMMARY ... 93
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... 95
9 TABELLENVERZEICHNIS ... 97
10 LITERATURVERZEICHNIS ... 99
VIII Abkürzungsverzeichnis
® eingetragenes Warenzeichen
°C Grad Celsius
% Prozent
µl Mikroliter
µm Mikrometer
Abb. Abbildung
A. dest. Aqua destillatum
AP anteror-posterior
ATP Adenosintriphosphat
BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor
BG Basalganglien
BMSC Knochenmark-Stammzellen
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CDNF Conserved Dopamine
Neurotrophic Factor
cm Zentimeter
CO2 Kohlendioxid
d Tag
D1 / D2 Dopamin 1/2
DA Dopamin, dopaminerg
Dapi 4`,6 Diamidino-2-phenyindol DMEM Dulbecco's Modified Eagle
Medium
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
d. h. das heißt
EPM Elevated Plus – Maze
hESC humane embryonale
Stammzellen et al. et alii (und andere)
etc. et cetera
FCS Fetales Kälberserum
FGF – 2 Fibroblast Growth Factor - 2
g Gramm
GABA Gamma-Aminobuttersäure
GDNF Glial Cell Derived Neurotrophic Factor
GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein
ggf. gegebenenfalls
Girk2 G-Protein activated invard rectifier potassium channel
G.p.e./i Globus pallidus externus / internus
hgr. Hochgradig
HMW high weight isoform
Hrsg. Herausgeber
kDa kilo-Dalton
KGW Körpergewicht
KM Körpermasse
l Liter
LAT lateral
L-Dopa 1-3,4 Dihydroxyphenylalanin LMW low weight isoform
MAO Monoaminooxidase
max. maximal
MFB mediales Vorderhirnbündel
mg Milligramm
min. Minute
mind. mindestens
mmol Millimol
MPP(+) 1-Methyl 4-Phenylpyridium MPTP 1-Methyl 4-Phenyl 1,2,3,6-tetra-
Hydropyridium
mRNA messanger ribonucleid acid
MW Mittelwert
IX
n Anzahl
N. c. Nucleus caudatus
n. s. nicht statistisch signifikant
NSC neuronale Stammzellen
NST Nucleus subthalamicus
NTF Neurotropher Faktor
o. ä. oder ähnliches
OF Offenfeld
p Wahrscheinlichkeit
PBS gepufferte physiologische Kochsalzlösung
P.c. Pars compacta
PET Positron-Emissions-
Tomographie
pH potentia hydrogenii
P.r. Pars reticularis
Pu Putamen
rpm rounds per minute
s Standardabweichung
S. Seite
S. n. Substantia nigra
s. o. siehe oben
TH Tyrosinhydroxylase
THS Tiefe Hirnstimulation VERT vertikal
z. B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
z. T. zum Teil
6-OHDA 6-Hydroxydopamin
X
Einleitung
1 1 Einleitung
Der Morbus Parkinson ist nach der Alzheimer Erkrankung die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung des Menschen und wird mit der zunehmenden Alterung der Gesellschaft ein immer wichtigeres Thema werden. Die Erkrankung geht mit einer progredienten Degeneration der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra Pars compacta einher. Dies führt zu einer Verarmung von Dopamin im Putamen und es kommt zu Störungen in den Regelkreisen der Basalganglien, die sich in starken motorischen Beeinträchtigungen ausdrücken. Die Kardinalsymptome sind Bradykinese, Tremor und Rigor. Daneben treten aufgrund weiterer beteiligter Gehirnareale und Regelkreise aber auch nicht-motorische Symptome auf, die somatische wie auch psychische Einschränkungen umfassen. Somit führt die Erkrankung zu einer deutlichen Minderung der Lebensqualität der Patienten.
Da die bisher vornehmlich angewandten Behandlungen gegen die motorischen Symptome – medikamentelle Therapie bzw. tiefe Hirnstimulation - zu einem gewissen Maß limitiert sind und vor allem nicht die Ursache der Erkrankung bekämpfen, liegt ein Forschungsschwerpunkt auf der Erarbeitung regenerativer Therapien. Im einzelnen bedeutet dies den Ersatz der im Rahmen der Erkrankung absterbenden dopaminergen Neurone durch fetale oder aus Stammzellen generierte Zellen, um die Informationsverarbeitung in den nachgeschalteten Basalganglien wieder reibungslos zu ermöglichen.
Dieses Konzept ist bereits seit vielen Jahren Gegenstand umfangreicher Studien, und sowohl im Tiermodell als auch klinisch konnten eine Reinnervation des Striatums und funktionelle Verbesserungen durch Zelltransplantationen erzielt werden. Jedoch ist der breite klinische Einsatz durch vielerlei Probleme bis dato nicht möglich:
Ethische Einwände gegen den Gebrauch fetaler Zellen, die limitierte Menge an geeigneten Spenderzellen, das schlechte Überleben der transplantierten Zellen im Empfängergewebe, divergierende Ergebnisse bezüglich der klinischen Wirksamkeit am Menschen und unzureichende Charakterisierung der implantierten Zellen in vivo.
Diese Arbeit beschäftigt sich vornehmlich mit dem Problem der schlechten
Einleitung
2
Überlebensraten der transplantierten Zellen: Unter anderem wird in diesem Zusammenhang ein Mangel an neurotrophen Faktoren als eine mögliche Ursache diskutiert. Um diesem zu begegnen, wurden in der Vergangenheit verschiedene Wachstumsfaktoren untersucht und auf verschiedenen Wegen appliziert, z.B. durch Vorbehandlung der zu transplantierenden Zellen, intracerebrale Infusionen oder Co- Transplantationen mit Wachstumsfaktor exprimierenden Zellen. Auf diesen Wegen konnten bereits bessere Ergebnisse erzielt werden als ohne neurotrophe Unterstützung, jedoch erscheint es sinnvoll, die zu transplantierenden Zellen selbst derartig genetisch zu verändern, dass sie ihren eigenen Wachstumsfaktor verstärkt exprimieren.
In unserem Institut konnte gezeigt werden, dass expandierte neuronale Progenitorzellen erfolgreich transfiziert werden können, so dass sie einen neurotrophen Faktor überexprimieren und eine intrastriatale Transplantation in ein Rattenmodell des Morbus Parkinson überleben und dass dopaminerge Zellen in den Transplantaten nachzuweisen sind. In der Folge soll diese Arbeit nun dazu beitragen, das Transplantationsprotokoll v.a. hinsichtlich der Expansions-, Differenzierungs- und Transfektionsmethodik derart zu optimieren, dass die Effizienz dieses Konzepts weiter gesteigert werden kann. Es wurden mesencephale neuronale Progenitorzellen mit FGF-2 transfiziert und in ein Rattenmodell des M. Parkinson transplantiert. In einer Kurzzeitstudie wurde anschließend die Morphologie und Integration im Empfängergewebe sowie die vorhandenen Zelltypen untersucht.
Zudem beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Symptom Angst, welches bei an M.
Parkinson erkrankten Menschen als eines der bereits erwähnten nicht-motorischen Symptome in hoher Prävalenz auftritt und die Lebensqualität der Patienten deutlich beeinflussen kann. Es soll hier untersucht werden, inwieweit Angst-assoziiertes Verhalten in dem von uns verwendeten Rattenmodell des M. Parkinson gezeigt wird.
In einer anschließenden Arbeit am Institut wurde auf diese Befunde aufbauend der Effekt der intrastriatalen Transplantation in diesem Kontext untersucht.
Schrifttum
3 2 Schrifttum
2.1 Die Parkinsonsche Erkrankung 2.1.1 Epidemiologie und Klinik
Bei Morbus Parkinson, der im Jahre 1817 zum ersten Mal von einem englischen Chirurgen namens James Parkinson als „Shaky Palsy“ beschrieben wurde, handelt es sich um die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung des Menschen, die ca.
1% der über 60jährigen betrifft (SAMII et al., 2004). Auch ein früheres Auftreten der Erkrankung ist beschrieben, in diesen Fällen spricht man von Early Onset Parkinson Disease. Dies tritt familiär gehäuft auf und macht ca. 5-10% der Fälle aus (SAMII et al, 2004). Für die übrigen Fälle der dann so genannten Late Onset Parkinson Disease kann gesagt werden, dass genetische Faktoren eher eine untergeordnete Rolle spielen (BERTRAM und TANZI, 2005).
Erste Symptome sind häufig Schmerzen in den Gliedmaßen, Riechstörungen sowie depressive Verstimmungen, erst im weiteren Verlauf entwickeln sich die Kardinalsymptome Rigor, Ruhe- bzw. Haltetremor und Bradykinese: Man beobachtet einen verstärkten Muskeltonus, ein Zittern zumeist in den distalen Gliedmaßen, das in Ruhe auftritt und in der einmal gestarteten Bewegung nicht mehr festzustellen ist, sowie eine starke Verlangsamung sämtlicher Bewegungen, die vor allem in einer zunehmenden Verarmung der Gesichtsmimik und dem damit verbundenen, krankheitstypischen `Maskengesicht` ihren Ausdruck findet.
Zu den motorischen Symptomen, zu denen auch posturale Instabilität zählt, kommen diverse nicht-motorische Symptome wie Depression, Demenz, autonome Dysfunktion, Ermüdung und Schlafstörungen (ZIEMSSEN und REICHMANN, 2007;
TRUONG et al., 2008).
Außerdem stellen Angstzustände ein weiteres Symptom dar, das häufig mit M.
Parkinson in Zusammenhang gesehen wird. Angst tritt oft gleichzeitig mit Depressionen auf und stellt möglicherweise einen Teil dieser dar (AARSLAND et al., 1999; CHAUDHURI und SCHAPIRA, 2009).
Bei bis zu 40% der an M. Parkinson erkrankten Personen treten Angstzustände
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4
klinisch in Erscheinung und zeigen sich als Panikstörungen (zumeist in sogenannten off-Phasen, das heißt, wenn bei auf L-Dopa eingestellten Patienten (s.u.) die therapeutische Konzentration unterschritten wird), phobische Zustände und generalisierte Angstzustände (AARSLAND et al., 2009; WALSH und BENNETT, 2001).
2.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie
Die Ätiologie des M. Parkinson ist in der Mehrzahl der Fälle unklar (LOTHARIUS und BRUNDIN, 2002). Für ca. 10% der Fälle kann eine Verbindung zu genetischen Defekten hergestellt werden, z.B. die autosomal dominante Mutation des α-Synuclein (PARK 1) in familiärem Parkinson oder die autosomal rezessive Mutation des Parkin (FEANY und BENDER, 2000; NUSSBAUM und ELLIS, 2003).
Außerdem werden unter anderem Defekte in der Komplex I Aktivität der Mitochondrien (dem ersten Schritt von vier an der Mitochondrienmembran mittels derer im Rahmen der Atmungskette ATP (Adenosintriphosphat) gewonnen wird) und oxidativer Stress für die Pathogenese von M. Parkinson diskutiert (BETARBET, 2002).
Für die Entstehung der typischen Symptome ist eine zunehmende Degeneration der dopaminergen (DA) Projektionsneurone in der Pars compacta (Pc) der Substantia nigra (Sn) und die damit einhergehende Verarmung an Dopamin (DA) im dorsalen Putamen verantwortlich (s.u.). Klinische Symptome sind jedoch erst zu beobachten, wenn das striatale DA um ca. 80% reduziert ist (FEARNLY und LEES, 1991;
BETARBET, 2002) bzw. 50% der nigralen Neurone zerstört sind (SAMII et al, 2004).
Auf histologischer Ebene ist hier das Absterben der DA Neurone und eosinophile, intracytoplasmatische, proteinartige Einschlusskörperchen in den überlebenden dopaminergen Zellen zu beobachten. Diese werden als Lewy-Körperchen bezeichnet und enthalten als einen Hauptbestandteil das Protein α-Synuclein (SPILLANTINI et.
al., 1997). α-Synuclein ist ein präsynaptisches Protein welches in der Neurotransmitter-Übermittlung eine Rolle spielt (OLANOW et al., 2004). Das zeitliche Auftreten von Lewy-Körperchen wird im Zusammenhang mit dem Auftreten nicht- motorischer Symptome gesehen, da sie bereits festzustellen sind, bevor eine
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klinische Diagnose anhand motorischer Symptome gestellt werden kann (CHAUDHURI und SCHAPIRA, 2009). Das Auftreten der Lewy-Körperchen bei M.
Parkinson wird im Zusammenhang gesehen mit einer Dysfunktion des Ubiquitin- Proteasom-Systems. Über dieses werden physiologischerweise (fehlerhafte) Proteine, die zum Abbau bestimmt sind, gekennzeichnet und abgebaut. Bei einem Defekt dieses Systems, der auch bei familiären Parkinson beobachtet wird, findet dieser Abbau nicht statt und die fehlerhaften Proteine sammeln sich u.a. als Lewy- Körperchen in den Neuronen (BURKE, 2004; SAMII et al., 2004).
Generell sind der Verlust von Zellen und das Auftreten von Lewy-Körperchen auch in anderen Regionen des Nervensystems zu beobachten, eingeschlossen sind hier cholinerge, serotonerge und noadrenerge Zellen in bestimmten Regionen des cerebralen Cortex, des olfaktorischen Systems, des basalen Vorderhirns, des Hirnstamms, des Rückenmarks und des peripheren Nervensystems (OLANOW et al., 2009). Diese Veränderungen könnten verantwortlich zeichnen für diverse der nicht- motorischen Symptome des M. Parkinson.
Im Einzelnen kann das Auftreten speziell von Depressionen und Angstzuständen zum einen eine psychische Reaktion auf die physischen Symptome der Erkrankung sein, zum anderen aber auch eine Folge gewisser neurochemischer Veränderungen.
Hier wird angenommen, dass Veränderungen im Stoffwechsel von Noradrenalin, Serotonin, Dopamin und γ-Aminobuttersäure (GABA) im Zusammenhang mit der Entstehung von Depressionen und Angstzuständen stehen (WALSH und BENNETT, 2001).
Der Zusammenhang zwischen medikamenteller Parkinsontherapie und Angstzuständen bleibt abzuklären (AARSLAND et al., 1999).
2.1.2.1 Der physiologische Regelkreis der Basalganglien
Bei den Basalganglien (BG) handelt es sich um Kerngebiete, welche im Hirnstamm gelegen sind und unter anderem für den reibungslosen Ablauf von Bewegungen eine wichtige Rolle spielen.
Die Initiierung einer Bewegung geht vom Cortex aus und wird an den Hirnstamm und spinale motorische Neurone weitergeleitet. Die Modulation einer Bewegung erfolgt
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auf dem Weg dorthin unter anderem in den Basalganglien. Die Regelkreise der BG (Abb.1) sind somit mitverantwortlich für die Ablaufsteuerung von Bewegungen, das heißt, sie lassen willkürliche Bewegungen zu oder inhibieren bzw. beenden diese, so dass fließende Bewegungsabläufe entstehen können (PURVES et al., 2004).
Zu den BG gehören der Nucleus caudatus (Nc) und das Putamen (Pu), zusammen als Corpus striatum (oder nur Striatum) bezeichnet, da sie aufgrund ihrer gemeinsamen Entwicklungsgeschichte streifenartig aussehen. Beide Kerne gehen aus dem Ganglienhügel hervor und werden während der Entwicklung durch Projektionsfasern so getrennt, dass nur noch Zellbrücken stehenbleiben, welche sich als Streifen darstellen. Desweiteren werden der Globus pallidus (Gp) mit seinem internen (i) und seinem externen (e) Anteil, der Nucleus subthalamicus (NST) und die Substantia nigra (Sn) mit ihrer Pars reticularis (Pr) und ihrer Pars compacta (Pc) zu den BG gezählt.
Physiologischerweise werden Informationen aus dem assoziativen, limbischen und motorischen Cortex über die BG zum Thalamus und von dort wieder zum Cortex geleitet. Man unterscheidet eine limbische, eine okkulomotorische, zwei assoziative und eine motorische Schleife (ALEXANDER und CRUTCHER, 1990; ALEXANDER et al., 1990), wobei ich mich im Folgenden mit der motorischen Schleife befassen werde.
Der „Eingangskern“ der BG ist das Striatum. Hierhin senden der motorische, der prämotorische, der supplementärmotorische und der sensomotorische Cortex ihre Efferenzen, via des Transmitters Glutatmat wird das Striatum exzitatorisch stimuliert.
Die „Ausgangskerne“ der BG sind die Sn Pr und der Gpi. Sie werden über einen direkten und einen indirekten Weg stimuliert.
Beim direkten Weg projizieren die Neurone des Striatums zu Sn Pr und Gpi. Die Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure (GABA) und Substanz P vermitteln hemmende Wirkung. Dadurch kommt es zu einer Inhibition des hemmenden Einfluss der Ausgangskerne auf den Thalamus, dessen Projektionsneurone wiederum den Cortex aktivieren können. Der indirekte Weg führt vom Striatum aus zum Gpe und weiter zum NST. Die Projektionen zum Gpe wirken mit GABA und Enkephalin inhibitorisch, vom Gpe aus inhibieren wiederum GABAerge Projektionen den NST. Der NST
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steigert über seine Projektionen zum Gpi und der Sn Pr mittels des Neurotransmitters Glutamat als einziger exzitatorischer Kern die Aktivität der Ausgangskerne und damit deren hemmende Wirkung auf den Thalamus und den Cortex.
Moduliert werden diese beiden Wege nun von der Sn Pc. Deren dopaminerge Neurone innervieren das Striatum, wo es durch unterschiedliche Rezeptoren unterschiedliche Wirkungen entfaltet (AIZMANN et al., 2000). Die Stimulierung der sogenannten D1-Rezeptoren durch Dopamin im Striatum führt zur Exzitation von Gpi und Sn Pr auf dem direkten Weg. Seine D2-Rezeptoren hingegen werden durch Dopamin inhibiert, es kommt zu einer Hemmung des Gpe. Damit fördert Dopamin die Aktivierung des Thalamus und damit des Cortex auf beiden Wegen: Erstens über eine Reduzierung der Erregbarkeit und zweitens über eine Förderung der Hemmung der hemmenden Ausgangsneurone Gpi und Sn Pr. Der Thalamus wird nicht gehemmt und kann somit seine Wirkung auf den Cortex entfalten: Bewegung wird initiiert.
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Abbildung 1: Der physiologische Regelkreis der Basalganglien
Transmitter Glutamat, exzitatorisch Transmitter GABA, inhibitorisch Transmitter Dopamin
Substantia nigra Pars compacta
Globus pallidus externus
motorik- hemmend
D2
Globus pallidus internus / Substantia nigra
Pars reticularis
Nuclues subthalamicus
motorik- fördernd
D1 Striatum
Cortex motorische
Cortexareale
Thalamus
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2.1.2.2 Die Pathophysiologie des Regelkreises der Basalganglien bei Morbus Parkinson
Im Falle des M. Parkinson kommt es zu Degeneration der dopaminergen Neurone der Sn Pc. Der Untergang der Zellen tritt zunächst unilateral auf, greift aber im Laufe der Erkrankung auch auf die zweite Seite über. Dennoch bleibt eine Körperseite bei Parkinson Patienten immer stärker betroffen als die andere.
Die Degeneration der Neurone führt zu einem Dopaminmangel im Striatum. So wird die ansonsten doppelte Sicherung der Aktivierung des Thalamus und so des Cortex verhindert: die mangelnde Aktivierung der D1-Rezeptoren führt zu mangelndem inhibitorischem Einfluss von Sn Pr und Gpi, wodurch sich deren hemmende Wirkung voll auf Thalamus und in der Folge den Cortex entfalten kann. Auch D2-Rezeptoren erfahren keine Stimulation durch Dopamin mehr. Hierdurch wird der indirekte Weg zu den Ausgangskernen umgekehrt und der NST wird nicht gehemmt. Die Hyperaktivität des NST führt zu einer verstärkten Hemmung des Thalamus durch die Ausgangsneurone und setzt die Aktivität des Cortex herab. Flüssige Bewegungsinitiation ist somit nicht möglich (Abbildung 2).
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Abbildung 2: Die Pathophysiologie des Regelkreises der Basalganglien bei M.
Parkinson
Transmitter Glutamat, exzitatorisch Transmitter GABA, inhibitorisch Transmitter Dopamin, fällt weg Verminderte hemmende Wirkung Verstärkte hemmende Wirkung Verstärkte erregende Wirkung
Substantia nigra Pars compacta
Globus pallidus externus
motorik- hemmend
D2
Globus pallidus internus / Substantia nigra
Pars reticularis
Nuclues subthalamicus
motorik- fördernd
D1 Striatum
Cortex motorische
Cortexareale
Thalamus
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11 2.1.3 Therapie
2.1.3.1 Medikamentelle Therapie
Die medikamentelle Therapie des M. Parkinson erfolgt zumeist unter Einsatz der Aminosäure L-Dopa (1-3,4 Dihydroxyphenylalanin). Diese kann über einen aktiven Transporter die Blut-Hirn-Schranke passieren und wird dann von noch intakten nigrostriatalen dopaminergen (aber auch anderen) Neuronen aufgenommen, und durch eine Dopa-Decarboxylase in Dopamin umgewandelt. Es wird dadurch der fehlende Transmitter ersetzt, um somit die Symptome zu unterdrücken. Durch die Therapie wird das Fortschreiten der Erkrankung allerdings nicht verhindert, auch wenn OLANOW gewisse Argumente für mögliche neuroprotektive Effekte anführt (OLANOW, 2009). Zudem lässt die Wirksamkeit des L-Dopa im fortgeschrittenen Zustand der Erkrankung nach. Desweiteren treten im Laufe der Behandlung zum Teil starke Nebenwirkungen auf. Hierzu zählen Bewegungsschwankungen, Dyskinesien wie unfreiwillige plötzliche Bewegungen sowie psychische Probleme (WINKLER et al., 2002; OLANOW, et al., 2004, DAMIER, 2009).
Aus diesem Grund werden soweit möglich v. a. in frühen Stadien der Erkrankung andere Dopamin-Agonisten, die die Rezeptoren direkt beeinflussen (also auch ohne die dopaminergen Neurone des Patienten wirken können), sowie Monoaminooxidase-B-Inhibitoren angewendet (Monoaminooxidase (MAO):
Membranproteine der äußeren Mitochondrien-Membran, die für den Abbau von Catecholaminen im zentralen Nervensystem (ZNS) zuständig sind). Als Beispiele sind hier Bromocriptin, Pergolid, Pramipexol und Ropinirol (WINKLER et al., 2002) bzw. Selegilin und Rasigilin zu nennen. Für diese Wirkstoffe werden weniger motorische Nebenwirkungen beschrieben, jedoch treten im Zusammenhang mit Dopamin-Agonisten neuropsychiatrische Probleme wie Halluzinationen, starke Schlaflosigkeit und Suchtverhalten auf und die anti-symptomatischen Effekte sind nicht so effektiv wie die von L-Dopa (HEDLUND und PERLMANN, 2009). Zwar werden auch für diese Wirkstoffe mögliche neuroprotektive Wirkungen diskutiert, jedoch erscheint dies in vivo bis dato sehr unsicher (OLANOW, 2009).
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12 2.1.3.2 Operative Therapie
2.1.3.2.1 Tiefe Hirnstimulation
Die tiefe Hirnstimulation (THS) hat sich seit 1987 zu einer routinemäßig angewendeten Therapie gegen die motorischen Symtome des M. Parkinson etabliert (Benabid et al., 2009). Waren in früheren Zeiten der Nucleus thalamicus und der Gpi Zielstrukturen dieses operativen Eingriffs, wird heute zumeist die Hochfrequenz- Stimulation des NST praktiziert (VOLKMANN, 2007; BENABID et al., 2009). Bei dieser wird durch Implantation einer Elektrode im Zielgebiet (bilateral) dieses mithilfe eines internen Pulsgenerators variabel stimuliert, mit hochfrequenten elektrischen Impulsen von 130 – 185 Hertz (HEDLUND und PERLMANN, 2009). Der abnormale Anstieg neuronaler Aktivität im NST wird somit durch die THS gehemmt, womit der Thalamus und seine corticalen Projektionsgebiete nicht mehr übermäßig gehemmt werden und eine Normalisierung der Bewegungen eintritt.
Die Vorteile dieser Methode sind die unter THS deutlich niedriger dosierbaren Medikamente und die dadurch reduzierten Nebenwirkungen, insgesamt wurde eine Steigerung der Lebensqualität um 25% beschrieben (BERNEY, VINGERHOETS et al., 2002; DEUSCHL, SCHADE-BRITTINGER et al., 2006). Limitierungen stellen jedoch die eingeschränkte Anwendbarkeit für bestimmte Patientengruppen sowie die zum Teil unzureichende Wirksamkeit dar: Für Patienten mit Demenz, akuten Psychosen sowie deutlichen Depressionen eignet sich die THS ebenso wenig wie für Patienten, die auf die Anwendung von L-Dopa nicht ausreichend ansprechen. Die motorischen Symptome, die sich mit L-Dopa nicht unterdrücken lassen, werden auch durch die THS keine Besserung erfahren (VOLKMANN, 2007). Zudem werden psychische Störungen (SAINT-CYR, TREPANIER et al., 2000) sowie Persönlichkeitsveränderungen unter dem Einfluss der THS beschrieben (BERNEY, VINGERHOETS et al., 2002, VOLKMANN, 2007; WITT, DANIELS et al., 2008).
2.1.3.2.2 Transplantation – regenerativer Ansatz
Die Limitierungen der bisher genannten therapeutischen Ansätze haben dazu geführt, dass intensiv an der Entwicklung regenerativer Therapiemöglichkeiten
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gearbeitet wird. Hier stehen Zelltransplantationen in die betroffenen Gehirnregionen im Fokus. Zellen verschiedener Quellen werden als mögliche Spenderzellen untersucht: fetale Zellen, genetisch modifizierte Zelllinien, embryonale oder somatische Stammzellen.
Dopaminerge Neurone, welche aus fetalen Mittelhirn gewonnen werden, wurden im Tierexperiment (BRUNDIN und BJÖRKLUND, 1987, NIKKHAH et al., 1994 (1,2,3), WINKLER et al., 2000, TORRES et al., 2007) und in klinischen Studien (LINDVALL und ODIN, 1994; LINDVALL und HAGELL, 2000; POLGAR et al., 2003) intrastriatal transplantiert. In der Folge konnte eine Reinnervation des Striatums mit Verbindungen von und zu den transplantierten Zellen beobachtet werden. Die transplantierten Zellen gaben gleichmäßig Dopamin ab und führten zu einer funktionellen Verbesserung.
In klinischen Studien wurde die Verbesserung der klinischen Bilder unterstützt durch den Nachweis einer gesteigerten Fluorodopa- Aufnahme in PET-Scans (Positron- Emission-Tomographie). Mit dieser Methode wird anhand der Fluorodopa-Aufnahme im Striatum auf die Menge an Dopamin geschlossen, da sich Fluorodopa genauso verhält wie Dopamin. (ANDRES und MEYER, 2008; BROOKS, 2010).
Es muss jedoch festgehalten werden, dass gerade in der Anwendung von fetalen Spenderzellen eine Reihe von Problemen bis dato nicht gelöst werden konnten, die die routinemäßige Anwendung ermöglichen würden. So ist zum einen die limitierte Verfügbarkeit von geeigneten Spenderzellen sowie deren unzureichende Standardisierung und Reinheit zu nennen, was sich folglich auch in sehr unterschiedlichen Erfolgen widerspiegelt (BJÖRKLUND, 2000). Ebenso stellen die mit der Transplantation von abortiertem fetalen Material verbundenen ethischen Einwände ein gewichtiges Problem bei der Weiterentwicklung dieser Methodik dar.
Desweiteren wurden in klinischen Doppel-Blind-Studien schwere Nebenwirkungen in Form von Dyskinesien beobachtet (FREED et al., 2001; HAGELL et al., 2002), wodurch vorherige Erfolge relativiert wurden. Folglich liegt der Fokus unter anderem auf der Entwicklung alternativer Zellquellen wie immortalisierte neuronale Zelllinien, embryonale und neuronale Stammzellen und genetisch modifizierte Zellen (GOLDMANN und WINDREM, 2006).
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2.1.3.2.2.1 Zellquellen für die Transplantationstherapie
Zellen, die für die Anwendung in der Transplantationstherapie in Betracht gezogen werden, sollten idealerweise folgende Eigenschaften aufweisen: Sie sollten die Transplantation in ausreichender Zahl überleben (LINDVALL und BJÖRKLUND, 2004), die Fähigkeit besitzen, Dopamin zu synthetisieren und in geregelter Art und Weise zu sezernieren, Axone zur Reinnervation auszubilden, Girk2 auszuprägen (G- Protein activated inward rectifier potassium channel-2, typisch vor allem für die dopaminergen Neurone der Sn Pc, s.u.) und motorische Defizite zu beheben (CORREIA et al., 2005).
Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die in der Lage sind zu proliferieren, sich zu reproduzieren und Progenitorzellen zu generieren, die wiederum in verschiedenste Zelltypen differenziert werden können. Im Detail untersucht werden embryonale Stammzellen (ESC), neuronale Stammzellen (NSC), Stammzellen aus adultem Knochenmark (BMSC), sowie Stammzellen aus Nabelschnurblut (MEYER und ANDRES; 2008). Auch Zellen aus der subventrikulären Zone Erwachsener werden auf ihre Eignung hin untersucht (CORREIA et al., 2005).
Humane ESC (hESC), die aus der inneren Masse von Blastozysten gewonnen werden (5-6 Tage nach Befruchtung), sind pluripotent. Sie lassen sich in großer Menge expandieren und gerichtet in jeden gewünschten Zelltyp differenzieren und werden deshalb als vielversprechende Möglichkeit in der Transplantationsforschung angesehen.
NSC (auch neuronale Progenitorzellen genannt) werden in bestimmten Regionen des sich entwickelnden aber auch des adulten zentralen Nervensystems gefunden, wie z.B. in der subventrikulären Zone, im Hippocampus, Cortex und Rückenmark.
Unter bestimmten Konditionen und unter dem Einfluss bestimmter Wachstumsfaktoren entwickeln sich diese multipotenten Zellen gerichtet in die verschiedenen neuronalen und glialen Zelltypen.
Sowohl Stammzellen als auch Progenitorzellen wurden vielfach im Tiermodell transplantiert und führten zu positiven Ergebnissen (BJÖRKLUND et al., 2002, ANDRES und MEYER, 2008; HAHN et al., 2009). Die Nachteile von embryonalen Stammzellen sind jedoch unter anderem die Gefahr der Tumor- bzw.
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Teratombildung. In Kulturen wurden Chomosomenabberationen beobachtet (DRAPER et al., 2004, LI et al. 2008), auch in vivo wurden Neoplasien nachgewiesen (NISHIMURA et al., 2003). Desweiteren stellen immunologische Unterschiede zwischen Spender und Empfänger sowie ethische Aspekte eine Limitierung für den ungehinderten Einsatz embryonaler Stammzellen in der regenerativen Parkinson Therapie dar (TIMMER et al., 2006). Progenitorzellen weisen diese Nachteile nicht auf. Zudem sind sie gut expandierbar (STUDER et al., 1998) sowie erfolgreich genetisch zu verändern (CESNULEVICIUS et al., 2006).
Immortalisierte Linien neuronaler Progenitorzellen stellen eine weitere mögliche Zellquelle für Transplantationen dar. Theoretisch ist hier das Problem des Zellnachschubs gelöst, auch lassen sich diese Zellen anhand von Reporter-Genen im Zielgewebe gut identifizieren. Solche Zelllinien wurden bereits in Tierversuchen untersucht und teilweise konnte eine Differenzierung der Zellen in vivo nachgewiesen werden. Jedoch bleiben auch bei diesem Ansatz Probleme bestehen, vor allem hinsichtlich der Entstehung von Neoplasien (MEYER und ANDRES; 2008)
2.1.3.2.2.2 Limitierungen der bisherigen Ansätze
Es wurden bereits einige ungelöste Probleme angesprochen, namentlich ethische Einwände bei der Verwendung fetaler und embryonaler Stammzellen, unzureichende Standardisierung des nur limitiert vorhandenen zu transplantierenden fetalen Materials sowie die Gefahr von tumorösen Entartungen bei der Verwendung pluripotenter embryonaler Stammzellen.
Im Folgenden wird auf diese und einige weitere Aspekte im Detail eingegangen.
Zunächst sind die schlechten Überlebensraten und die mangelnde funktionelle Integration transplantierter Zellen in vivo zu nennen: 1-5% der transplantierten fetalen Zellen überleben die Transplantation (FREEMAN et al., 1995; ROSENSTEIN, 1995, BARKER et al., 1996; WINKLER et al., 1999, SORTWELL et al., 2000). Es wird jedoch geschätzt, dass mindestens 100.000 Zellen überleben müssen um eine funktionelle Erholung zu induzieren (CORREIA et al., 2005), so dass ein Drittel bis zu der Hälfte des Putamenvolumens reinnerviert ist und eine Fluorodopa-Aufnahme von ca. 50% erfolgt (LINDVALL und BJÖRKLUND, 2004). Die Verbesserung der
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motorischen Funktion steht in Korrelation mit dem Maß der Reinnervation des Striatums. NIKKHAH et al. stellten 1994 bezüglich des Maßes der Reinnervation des Striatums heraus, dass multiple Injektionsstellen die axonale Integration der denervierten Gegend verbessern können (NIKKHAH et al., 1994(1)).
Als mögliche Ursache der geringen Überlebensraten wird unter anderem ein Mangel an neurotrophen Faktoren diskutiert, weshalb die Einbindung diverser neurotropher Faktoren in Transplantationsversuchen vielfach untersucht wird. Hier spielen vor allem die Wachstumsfaktoren Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), Glial Cell Derived Neurotrophic Factor (GDNF), Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2) und Conserved Dopamine Neurotrophic Factor (CDNF) eine Rolle (s.u.).
Desweiteren sind bis dato mangelnde Kenntnisse über Faktoren, die die Migration, das Wachstum und die Differenzierung der transplantierten Zellen beeinflussen als unzureichend gelöste Probleme zu nennen. Hierzu ist es wichtig, die transplantierten Zellen in vivo eindeutig identifizieren zu können (SØRENSEN et al., 2010).
Als weitere Punkte, deren Einfluss auf die Ergebnisse von Transplantationen vor allem in klinischen Studien noch nicht ausreichend geklärt sind, sind die Auswahl der Patienten, die exakte Transplantat-Platzierung sowie – Zusammensetzung und immunologische Reaktion des Empfängers auf die Spenderzellen (LINDVALL und BJÖRKLUND, 2004).
2.2 Das Tiermodell des M. Parkinson
Für M. Parkinson sind diverse Tiermodelle etabliert, die sich in ihren Qualitäten und Anwendungsgebieten unterscheiden.
Als erstes wurden vornehmlich Stoffe angewendet, die im Tiermodell selektiv das catecholaminerge System angreifen und somit Charakteristika des M. Parkinson hervorrufen. Hier sind z.B. Reserpin, Metamphetamin und auch MPTP (1-methyl 4- Phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridin) zu nennen. Letzteres wird, nachdem es von nicht- dopaminergen Zellen in seinen toxischen Metaboliten MPP(+) (1-Methyl-4- Phenylpyridium) umgewandelt worden ist, von dopaminergen Neuronen per Dopamin-Transporter aufgenommen, zerstört die nigrostriatalen Bahnen und führt vor allem bei Primaten zu motorischen Defiziten wie Bradykinese, Rigidität und Haltungsanomalien (PRZEDBORSKI et al., 2001). Diese Symptome sind denen des
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an M. Parkinson erkrankten Menschen so ähnlich, dass dieses Modell für die Entwicklung neuer symptomatischer Behandlungsstrategien herangezogen werden kann.
Neuere Entwicklungen sind Modelle mit landwirtschaftlichen Chemikalien wie Paraquat und Rotenon. Rotenon inhibiert systemisch den Komplex I der Mitochondrien, führt aber dennoch zu einer selektiven Zerstörung der nigrostriatalen Bahnen, einschließlich der Bildung Lewy-Körperchen-ähnlicher Einschlüsse sowie oxidativer Schäden (BETARBET et al, 2002). Zukünftig werden auch genetische Modelle weiter in den Vordergrund rücken. Sie orientieren sich an bei familiärem Parkinson auftretenden Mutationen. Hier sind z.B. transgene Mauslinien zu nennen, die humanes α-Synuclein überexprimieren bzw. wo dieses in sogenannten Knock-out Linien gar nicht exprimiert wird (Betarbet et al. 2001). Diese Modelle zeigen unterschiedliche Ausprägungen verschiedener Parkinson-Symptome und werden daher auch jeweils für spezielle Fragestellungen eingesetzt.
Bei dem in dieser Arbeit eingesetzten 6-OHDA Modell der Ratte kommt es zur permanenten, selektiven Degeneration der dopaminergen Zellen der nigrostriatalen Bahnen durch 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) (UNGERSTEDT, 1968). 6-OHDA wird in einer stereotaktischen Operation in das Rattengehirn injiziert, da es nicht in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren. Die Injektion kann in das Striatum erfolgen, das mediale Vorderhirnbündel (MFB) oder auch in die Sn. Es kann somit eine partielle oder eine komplette Läsion erfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Toxin in das MFB injiziert. Das 6-OHDA zerstört die dopaminergen Projektionen durch retrograden axonalen Transport (HUDSON et al., 1993). Die Zellen nehmen es via der eigenen Catecholamin-Transportmechanismen in sich auf. Durch die dort stattfindende Oxidation entstehen freie Radikale und Wasserstoffperoxid, welche Proteine, Membranen und Nucleinsäuren angreifen (FULCERI et al., 2006). Zumeist werden die Tiere in diesem Modell nur unilateral lädiert, weil es sonst zu zu schweren motorischen Schäden kommt (UNGERSTEDT, 1971). Zudem dient die gesunde Seite als interne Kontrolle.
Zur Überprüfung des Modells kommen u. a. zwei sogenannte Rotationstests in Frage: Zum einen wird Amphetamin systemisch angewendet: als präsynaptischer,
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also indirekter Dopamin-Agonist kann es bei einem unilateral lädierten Tier nur auf der gesunden Seite wirken: die Dopaminausschüttung der gesunden Seite wird gesteigert, zusätzlich wird die Wiederaufnahme des Dopamins gehemmt. Das gesteigerte Dopaminaufkommen am postsynaptischen Rezeptor führt somit zu einer Rotation des Tieres ipsilateral zur Läsion. 6.-20 Umdrehungen pro Minute können für zwei Stunden nach der Injektion beobachtet werden (TORRES und DUNNETT, 2006).
Im Gegensatz dazu kommt es nach der systemischen Applikation von Apomorphin zu Rotationsverhalten contralateral zu lädierten Seite. Die Dopamin-Rezeptoren (D1 und D2, s.u.) werden hier durch den Dopamin-Agonisten direkt stimuliert. Durch die Degeneration der dopaminergen Zellen kommt es zu einer Hypersensitivität der postsynaptischen Rezeptoren auf der denervierten Seite und im Falle einer Stimulierung durch Apomorphin zu einer Rotation contralateral zur lädierten Seite, da das Apomorphin hier aufgrund der empfindlicheren Rezeptoren stärker wirken kann als auf der gesunden Seite (SCHWARTING und HUSTON, 1996). Bereits geringe Dosen Apomorphin reichen aus, um bei maximal lädiertem Striatum und Sn Rotationen auszulösen. Damit ist Apomorphin besser geeignet, um maximale Degenerationen sicher anzuzeigen (HUDSON et al., 1993).
2.3 Transfektion als Methode zur genetischen Modifizierung von Säuger- Zellen
Als Transfektion bezeichnet man das Einschleusen fremder Nucleinsäuren in das Genom der Empfängerzelle. Sie hat zum Ziel, die Empfängerzelle genetisch zu modifizieren, zum Beispiel die Überexpression eines Wachstumsfaktors zu bewirken.
Prinzipiell sind zwei methodische Ansätze zu unterscheiden, due virale und die nicht- virale Transfektion. Bei der viralen Transfektion werden aus Viren gewonnene Vektoren in die Empfängerzelle eingeschleust. Diese Methode bietet den Vorteil hoher Transfektionsraten, ist aber aufgrund verschiedener Limitierungen nicht gut geeignet für den Einsatz in klinischen Studien: Die Produktion der Vektoren ist sehr aufwendig und teuer, die Sicherheitsanforderungen sehr hoch. Zudem ist die Größe der einzuschleusenden Partikel begrenzt und es besteht die Gefahr immunologischer
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19 Reaktionen (GRESCH et al., 2004).
Bei den nicht-viralen unterscheidet man nach physikalischen und chemischen Methoden. Erstere umfassen
1.Elektroporation (WELLS et al., 2004),
2.ballistischer Gentransfer (WELLS et al.,2004), 3.Mikroinjektion (DAVIS et al., 2000).
Bei der Elektroporation wir die Zellmembran (sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen) mittels eines elektrischen Impulses kurzfristig permeabel für die Aufnahme verschiedener biologischer Moleküle gemacht, so auch für DNA (GRESCH et al., 2004). Diese Methoden führte aufgrund niedriger Transfektionsraten und hoher Zellverluste jedoch nicht zu ausreichend zufriedenstellenden Ergebnissen (GRESCH et al., 2004).
Die chemischen Methoden umfassen
1.Liposom-basierten Gentransfer oder Lipofektion ( FELGNER et al., 1987; WU et al., 2000),
2.Calciumphosphat-mediierten Gentransfer (CHEN und OKAYAMA, 1988), 3.DEAE-dextran Transfektionstechnik (PARI und XU, 2004),
4.Polyethyleneeimine (PEI)-mediierten Gentransfer (CORSO et al., 2005), 5.Nukleofektion (GRESCH et al., 2004; CESNULEVICIUS et al., 2006).
Bei der Lipofektion binden kationische Liposome, die einen Komplex mit der einzuschleusenden DNA bilden, an die zu transfizierenden Zellen. Ihre Lipidmembran fusioniert mit der Plasmamembran der Zelle und schleust so die DNA in die Zelle ein. Nachteile dieser Methode sind die recht geringen Transfektionsraten in Zellsuspensionen und die Abhängigkeit von Zellteilung und hoher Endozytoserate (GRESCH et al., 2004). Für die Transfektion von neuronalen Progenitorzellen wurde von CESNULEVICIUS et al. 2006 eine neue, nicht-virale Methode erarbeitet. Die Nukleofektion erwies sich hier im Vergleich mit Lipofektion und Elektroporation als effizienteste Art und Weise, eine Überexpression neurotropher Wachstumsfaktoren zu erreichen (CESNULEVICIUS et al., 2006). Bei der Nukleofektion handelt es sich um eine auf der Elektroporation basierenden Methode, bei der das Plasmid mittels einer speziellen Nukleofektor-Lösung und unter bestimmten Spannungsparametern
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direkt in den Zellkern eingeschleust wird. Hiermit wird es möglich, auch aufgrund ihrer niedrigen Teilungsrate sonst schwer zu transfizierende Zellen effizient genetisch zu modifizieren (5-fache Steigerung der Transfektionseffizienz im Vergleich mit Elektroporation und Lipofektion, bis zu 47% Transfektionsrate). Zudem wird durch diese Methode die Fähigkeit zur Differenzierung in dopaminerge Zellen nicht beeinflußt und die Transfektion ist transient (CESNULEVICIUS et al., 2006).
In einem ersten Versuch wurden derartig genetisch modifizierte Zellen in ein 6- OHDA-Modell des M. Parkinson transplantiert. Die Zellen überlebten die Transplantation, prägten den Marker Tyrosinhydroxylase (TH) für dopaminerge Zellen aus und exprimierten das auf dem Plasmid kodierte Protein. Jedoch war die Anzahl der die Transplantation überlebenden Zellen sehr gering und auch die Reinnervation war nicht sehr deutlich ausgeprägt (CESNULEVICIUS et al., 2006).
2.4 Neurotrophe Faktoren – FGF-2
Wie bereits oben genannt könnte einer der Gründe für das geringe Überleben transplantierter Zellen ein Mangel an neurotrophen Faktoren (NTF) sein.
Es konnten für diverse NTF positive Effekte auf kultivierte dopaminerge Neurone in vitro gezeigt werden (KRIEGLSTEIN, 2004), v. a. vier Faktoren wurden im Hinblick auf ihre physiologische und funktionelle Relevanz in vivo untersucht: BDNF, GDNF, FGF-2 (BEAN et al., 1992; GROTHE und WEWETZER, 1996; GROTHE und TIMMER; 2007) und CDNF (LINDHOLM et al., 2007).
Bei den FGFs handelt es sich um eine Familie von Wachstumsfaktoren mit 23 Mitgliedern, von denen 10 im Gehirn nachgewiesen werden konnten. (REUSS und v.
BOHLEN UND HALBACH, 2003). Es sind vier Rezeptoren bekannt, FGR 1-4.
FGFs spielen wichtige Rollen sowohl im sich entwickelnden als auch im adulten ZNS (DONO, 2003). Für diese Arbeit von besonderem Interesse ist FGF-2. FGF-2 findet sich natürlicherweise in Neuronen und Glia-Zellen in vielen Bereichen des ZNS, unter anderem in Medulla, Pons, Thalamus und Hirnstamm, aber auch in der Sn und im Striatum (REUSS und v. BOHLEN UND HALBACH, 2003).
Als Regulator pränataler ebenso wie postnataler und adulter Neurogenese induziert FGF-2 die Proliferation neuronaler Progenitorzellen im Hippocampus und der
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subventrikulären Zone (REUSS und v. BOHLEN UND HALBACH, 2003). Es ist desweiteren während der Entwicklung des nigrostriatalen Systems wirksam (BEAN et al., 1992) und hat einen Einfluss auf die Anzahl dopaminerger Neurone (TIMMER et al., 2007). Für Hippocampus und Cortex konnte gezeigt werden, dass FGF-2 die axonale Verzweigung von Neuronen begünstigt (REUSS und v. BOHLEN UND HALBACH, 2003).
Bei FGF-2 lassen sich sogenannte hoch-und niedermolekulare Isoformen (high und low weight isoforms, HMW und LMW), also Isoformen mit 18kDa bzw. 21 und 23 kDa Molekulargewicht unterscheiden. Sie alle werden generiert von verschiedenen Regionen einer mRNA und werden sowohl im Striatum als auch in der Sn adulter Ratten exprimiert (GROTHE und TIMMER, 2007). Claus et al. konnten zudem zeigen, dass im Verhältnis eher HMW-FGF-2 im Striatum und in der Sn von intakten Ratten auftritt, LMW-FGF-2 dort ebenso, jedoch in geringerem Umfang nachzuweisen ist. Die Rezeptoren für FGF-2 (FGFR 1-3) sind ebenso in den genannten Strukturen vorhanden und lassen sich auch nach einer Läsion mit 6- OHDA noch nachweisen (CLAUS et al., 2004).
2.4.1 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Neurone in vitro
Untersucht man die Effekte von FGF-2 auf dopaminerge Zellen in vitro, können unter anderem folgende Beobachtungen gemacht werden: HMW und LMW FGF-2 fördern die Proliferation und das Überleben von Kulturen mesencephaler dopaminerger Neurone und begünstigen das Auswachsen von Neuriten. So zeigen sich nach 6 Tagen in Kultur signifikant mehr TH-positive Zellen in mit verschiedenen Isoformen von FGF-2 versetzten Kulturen als in der Kontrollkultur (GROTHE et al., 2000;
JENSEN et al., 2008). Auch in einer Kultur von mesencephalen Neuronen mit HMW- FGF-2 überexprimierenden Schwann Zellen wurde eine signifikant höhere Anzahl TH-Positiver Neurone vorgefunden als in der Kontrollkultur (GROTHE et al., 2000).
Zusätzlich bietet FGF-2 in verschiedener Hinsicht Schutz vor Zytotoxizität: Versetzt man oben genannte Kulturen mit 6-OHDA, so gehen ca. 55% der dopaminergen Neurone zugrunde. Werden diese Kulturen mit FGF-2 vorbehandelt, sinkt die Verlustrate nach Zusatz von 6-OHDA um 15% (GROTHE et al., 2000). Darüber
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hinaus zeigten mit FGF-2 behandelte mesencephale dopaminerge Neurone eine erhöhte Resistenz gegenüber L-Glutamat vermittelter Toxizität (CASPER und BLUM, 1995). Auch die Morphologie der dopaminergen Neurone wird durch die Behandlung mit FGF-2 Isoformen positiv beeinflusst. Für sowohl HMW als auch LMW FGF-2 konnten Grothe et al. 2000 zeigen, dass die Neuritenbildung in Kulturen fetaler dopaminerger Neurone begünstigt wird, die totale Faserlänge pro Neuron wird signifikant größer. HMW FGF-2 verstärkt die Ausbildung der neuronalen Soma, LMW FGF-2 fördert die Ausbildung von Verknüpfungspunkten (GROTHE et al., 2000).
2.4.2 Effekte von FGF-2 Isoformen auf dopaminerge Zellen in vivo
Auch in vivo wurden die Effekte von FGF-2 untersucht. So zeigten DATE et al. 1993, dass FGF-2 im MPTP-Mausmodell positive Effekte auf DA-Neurone hat. Intrastriatale Infusionen von FGF-2 führte zu einer Erholung der dopaminergen Fasern und des Dopamin-Gehalts und schützte das nigrostriatale System vor Neurotoxizität. Ähnliche Beobachtungen machten TIMMER et al. 2007 im Bezug auf ein weiteres Maus- Modell: Unterzog man FGF-2 Knockout Mäuse einer 6-OHDA Behandlung, so überlebten signifikant weniger dopaminerge Neurone als im Wildtyp, der FGF-2 normal exprimieren kann. FGF-2 schützt also auch hier vor Neurotoxizität. Auch der Einfluss von FGF-2 auf das Überleben von transplantierten Zellen bestätigt die neurotrophen Effekte des Faktors. Das Überleben transplantierter dopaminerger Zellen wurde durch wiederholte intracerebrale Infusion von FGF-2 ebenso verbessert wie nach Vorbehandlung der Zellen mit FGF-2 (MAYER et al., 1993).
Ferner wurden im Rattenmodell des M. Parkinson fetale dopaminerge Neurone mit FGF-2 überexprimierenden Fibroblasten (TAKAYAMA et al., 1995) bzw. Schwann Zellen (TIMMER et al., 2004) co-transplantiert. Die dopaminergen Zellen zeigen erhöhte Überlebensraten nach der Transplantation und eine bessere Reinnervation des Striatums. Zudem ist eine Verbesserung der Funktion im Rotationstest festzustellen. TIMMER et al konnten daneben zeigen, dass die FGF-2 vermittelten Effekte bei unmittelbaren Co-Transplantationen deutlicher ausgeprägt sind als bei räumlich und zeitlich versetzten Transplantationen (TIMMER et al., 2004).
Auch eine Vorbehandlung der zu transplantierenden Zellen mit FGF-2 vermittelt
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ähnliche Effekte. Werden Zellen aus dem ventralen Mesencephalon von 12 Tage alten Rattenembryonen über vier bzw. acht Tage in der Gegenwart von FGF-2 kultiviert und nach anschließender Differenzierung im Rattenmodell des M. Parkinson transplantiert, zeigen sich bessere Überlebensraten, höhere TH-Immunoreaktivität und verbesserte Funktionalität als im entsprechenden Kontrollversuch (JENSEN et al., 2008)
2.5 Verhaltensstudien im Offenfeld und Elevated Plus-Maze
Wie bereits zu Anfang erläutert, stellen Angstzustände ein häufiges nicht motorisches Symptom bei an M. Parkinson erkrankten Menschen dar. Sie treten oft mit Depressionen, aber auch mit anderen psychischen Beschwerden zusammen auf und mindern daher die Lebensqualität der Patienten zum Teil erheblich (AARSLAND et al., 2009; BROWN et al., 2011).
Für Tiermodelle gibt es unter anderem zwei Verhaltensversuche, mit denen Angstzustände untersucht und evaluiert werden können. Zum einen das Elevated Plus-Maze (EPM): In diesem ca. einem Meter hohen, kreuzförmig angeordneten Versuchsaufbau (s. Material und Methode) mit 2 offenen und zwei geschlossenen Armen kann anhand des Verhaltens der Versuchstiere deren dann so genanntes Angst-assoziiertes Verhalten bewertet werden (HANDLEY und MITHANI, 1984). Das Prinzip des EPM beruht auf den konkurrierenden Verhaltensweisen von Nagern, einerseits offene und auch hohe Areale zu meiden und andererseits neue Areale erkunden zu wollen. Es kann z.B. eingesetzt werden, um den anxiolytischen oder anxiogenen Effekt von Substanzen zu untersuchen, aber auch um die Beteiligung verschiedener Regionen des ZNS an Angstverhalten zu studieren (WALF und FRYE, 2007).
In der runden, oben offenen Versuchsanordnung des Offenfeldes (OF) (s. Material und Methode) wird vor allem exploratives und lokomotorisches Verhalten untersucht.
Hieraus lässt sich indirekt auf Angstverhalten schließen. Auch hier halten sich Nager natürlicherweise eher am Rand der Arena auf denn im offenen und damit ungeschützten Mittelteil. Eine Verschiebung der Verhältnisse der Aufenthaltszeiten in den verschiedenen Bereichen und anderer Parameter zeigt Veränderungen im Angstverhalten an (PRUT und BELZUNG, 2003). Das OF kann für ähnliche Zwecke
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24 eingesetzt werden wie das EPM.
In anderen als dem von uns gewählten Tiermodellen für M. Parkinson konnte vermehrtes Angst-assoziiertes Verhalten im EPM nachgewiesen werden (TAYLOR et al, 2009). Auch in 6-OHDA Modellen wurde von verschiedenen Gruppen der emotionale Status der Versuchstiere erfasst. In einem bilateralen 6-OHDA Modell konnte von TADAIESKY et al. z.B. ebenfalls vermehrtes Angst-assoziiertes Verhalten im EPM nachgewiesen werden, zudem zeigte sich eine verringerte lokomotorische Aktivität im OF (TADAIESKY et al., 2008). Dahingegen wurde jedoch von BRANCHI et al. ein verringertes Angst-assoziiertes Verhalten nach bilateraler 6- OHDA Injektion in das Striatum beobachtet (BRANCHI et al., 2008). Wiederum von diesen Ergebnissen abweichend konnten Kuan et al. keine Veränderung im Angst- assoziierten Verhalten im EPM nach unilateraler 6-OHDA Injektion feststellen, sie beobachteten lediglich ein verändertes Aufrichtungsverhalten (KUAN et al., 2008).
Der Einfluss neuronaler Transplantationen auf Angst-assoziiertes Verhalten ist am Institut für Neuroanatomie in Folgeversuchen untersucht worden (JUNGNICKEL et al., 2011).
2.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit
Das erste Ziel dieser Studie ist die Optimierung eines möglichen Transplantationsprotokolls für die Zell-basierte Therapie des M. Parkinson.
Es soll die Möglichkeit aufgezeigt werden, das Überleben und die funktionelle Integration transplantierter Zellen durch eine Transfektion mit einem Wachstumsfaktor zu verbessern.
Zu diesem Zweck wurden mesencephale neuronale Progenitorzellen in das (vollständige) unilaterale 6-OHDA Rattenmodell des M. Parkinson transplantiert.
Verglichen wurde die intrastriatale Transplantation naiver Zellen mit der transfizierter Zellen, bei diesen wurde unterschieden zwischen mit FGF-2 23kD und mit einem leeren Vektor transfizierten Zellen.
In einer orientierenden Kurzzeitstudie wurden nach einer bzw. zwei Wochen die 3 Gruppen verglichen: Histologisch wurde die Morphologie und die Integration der transplantierten Zellen untersucht, die durch die Transplantation hervorgerufene
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immunologische Reaktion im Empfängergewebe dargestellt und das Überleben dopaminerger Neurone im Transplantat betrachtet.
Im zweiten Teil der Arbeit soll gezeigt werden, inwieweit Angstverhalten im hier angewandten Rattenmodell des M. Parkinson zu beobachten und in Verhaltensstudien zu evaluieren ist.
Hierzu wurden einseitig mit 6-OHDA lädierte Ratten im Offenfeld und im Elevated Plus-Maze bezüglich ihres Angst-assoziierten Verhaltens untersucht und verglichen.
Material und Methoden
27 3 Material und Methoden
3.1 Chemikalien
Ammoniumnickel(II)sulfat Sigma-Aldrich, Steinheim
Ascorbinsäure Sigma-Aldrich, Steinheim
Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Steinheim
B 27 – Supplement Gibco, Invitrogen, Karlsruhe
Corbit-Balsam I. Hecht, Kiel-Hasseer
DAB Sigma-Aldrich, Steinheim
Dapi (4´,6Diamdino-2-pheyindol) Sigma-Aldrich, Steinheim
D (+)-Sacharrose Roth, Karlsruhe
DMEM/Ham´s F12 PAA GmbH, Linz, Österreich
DNAse Roche, Mannheim
Essigsäure 0,1% Riedel-de Haën, Seelze
Ethylenglycol Riedel-de Haën, Seelze
Fetales Kälberserum (FCS) PAA GmbH, Linz, Österreich
Gelatine Merck, Darmstadt
Glutamin PAA GmbH, Linz, Österreich
Glycerin Merck, Darmstadt
H2O2 Sigma Aldrich, Taufkirchen
Laminin BD Bioscience, Heidelberg
Methanol J. T. Baker, Deventer, Holland
Natriumchlorid J. T. Baker, Deventer, Holland
Natrium-Chlorid (NaCl) 0,9 % Braun, Melsungen
Natriumpyruvat PAA GmbH, Linz, Österreich
Normal Goat Serum (NGS) Gibco, Invitrogen, Karlsruhe
N2-Supplement Gibco, Invitrogen, Karlsruhe
Phosphate Buffered Saline (PBS) Dulbecco Biochrom AG, Berlin
Paraformaldehyd (PFA) Fluka, Sigma Aldrich, Steinheim
Polyornithin Sigma Aldrich, Steinheim
TritonX Fluka, Sigma Aldrich, Steinheim
Material und Methoden
28
Trypanblau Sigma Aldrich, Steinheim
Trypsin/EDTA PAA GmbH, Linz, Österreich
Xylol J.T. Baker, Deventer, Holland
FGF -2 23 kDa Tebu Bio, Frankfurt
3.2 Geräte
Brutschrank Sanyo, Bad Nenndorf
CCTV Camera (VW-BP330/GE) Panasonic,
ColorView Kamera, Soft Imaging Olympus, Hamburg Elevated Plus-Maze
Licht- und Fluoreszenzmikroskop BX-60 Olympus, Hamburg
Kryostat, Leica CM 3050 TechnoMed, Bielefeld
Magnetrührer Ika-Labortechnik, Staufen
Neubauer Zählkammer Superior, Marienfeld
Offenfeld Zimmermann & Collegen,
Hannover
Pipettierhilfe Integra Bioscience, Fernwald
Schüttler Ika-Labortechnik, Staufen
Stereotakt Stölting, Illinois, USA
Sterilbank Microflow Nunc, Roskilde, Dänemark
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments,
Tujunga, Californien, USA
Viedeokassetten VHS E-240 Kodak
Videorekorder (FX 7500) Aiwa
Waage Sartorius universal Sartorius, Göttingen
Wasserbad GFL®, Burgwedel
Zentrifuge Varifuge3.0R Hereaus, Langenseebold
3.3 Antikörper
βIII-Tubulin-Antikörper, monoclonal Biomol, Hamburg
Biotinylierter Kaninchen-Anti-Maus Antikörper Dako, Glostrup, Dänemark
Material und Methoden
29
cy2-Anti-Kaninchen-Antikörper Jackson/Dianova, Hamburg cy3-Anti-Ziege-Antikörper Sigma Aldrich, Taufkirchen flagM2-Antikörper, monoclonal Sigma Aldrich, Taufkirchen GFAP-Antikörper, monoclonal Sigma-Aldrich, Taufkirchen GFAP-Antikörper, polyclonal Dako, Glostrup, Dänemark Nestin-Antikörper, monoclonal Chemicon, Hofheim
TH-Antikörper, monoclonal Sigma-Aldrich, Taufkirchen Vectastain ABC Kit, Maus IgG Linaris, Wertheim
3.4 Sonstiges
6er Well-Platten Nunc, Roskilde, Dänemark
Bohrer Minimot 40/E Proxxon, Niersbach
Deckgläser (24x60mm) Menzel-Gläser®, Braunschweig
Einmalspritzen Luer 1 ml, 5 ml Braun, Melsungen Einmalkanülen Luer 0,8 mm x 40 mm Braun, Melsungen
0,5 mm x 16 mm
Falcon® Röhrchen 15 ml Becton Dickinson, Heidelberg Fluoreszent Mounting Medium Dako, Glostrup, Dänemark
Glaswaren Schott, Braunschweig
Glasstangen Leica, Nussloch
Hamilton-Spritzen 2µl, 5µl Hamilton, Bonaduz, Schweiz
Intrafix® Infusionssystem Braun, Melsungen
Ketaminhydrochlorid 5% Albrecht GmbH, Aulendorf
Kimwipes® Lite 2000 KimberlyClark, Zaventem,
Belgien
Latexhandschuhe Digitil PF Hartmann, Heidenheim
Mikroliter-Kapillaren Drummond, Broomall, USA
Nitrilhandschuhe Purple Nitrile Kimberly-Clark, Zaventem, Belgien
Objektträger Menzel-Gläser®, Braunschweig
Objektträger, silanisiert Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Material und Methoden
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Petrischalen (ø 10 cm) Becton Dickinson, Heidelberg
Pipetten Eppendorf, Wessling-Berzdorf
Pipettenspitzen: gelb (0,2ml), blau (1ml) Sarstedt, Nümbrecht
Polyethylenschlauch ø 0,38mm, 0,58mm Becton Dickinson, Heidelberg
Präparategläser 4ml, 20ml Roth, Karlsruhe
Probenröhrchen 50ml Sarstedt, Nümbrecht
Reaktionsgefäße:
Eppendorf® 0,5ml, 1,5ml, 2ml Sarstedt, Nümbrecht
Rompun® 2% (Xylazin) Bayer Vital GmbH, Leverkusen
Stabpipetten 5ml, 10ml, 25ml, 50ml Sarstedt, Nümbrecht
Zellkulturflaschen 25mm Nunc, Roskilde, Dänemark
3.5 OP-Besteck
Chirurgische Pinzette No. 08-231-130 Allgaier Instrumente GmbH Frittlingen Chirurgische Schere No. 04-124-145 Allgaier Instrumente GmbH, Frittlingen Feine Schere , Iris scissor straight WPI, USA
Fixierungsklemme, J.H. Bulldog Clamp World Precision Instruments, USA
Knopfkanüle Fine Science Tools GmbH, Heidelberg
Metzenbaum-Schere Fine Science Tools GmbH, Heidelberg
Michelklemmen Aesculap, Tuttlingen
Raspiratorium Aesculap, Tuttlingen
Skalpellhalter Aesculap, Tuttlingen
Skalpellklinge Aesculap, Tuttlingen
Uhrmacher-Pinzette Dumont, No. 5 Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Vannas-Mikroschere, No. 15003-08 Fine Science Tools GmbH, Heidelberg
3.6 Puffer und Lösungen
DMEM/Ham´s F12 PAA GmbH, Linz, Österrich
Hank´s Pufferlösung PAA GmbH, Linz, Österreich
RMPI 1640 Medium Biochrom AG, Berlin
Material und Methoden
31
Medium I (Anheftungsmedium) DMEM/Ham´s F12
3% FCS
20ng/ml FGF-2 B27
N2
1 mM Natriumpyruvat 0,25% BSA
2 mM Glutamin Medium II (Proliferationsmedium) DMEM/Ham´s F12
20ng/ml FGF-2 N2
1 mM Natriumpyruvat 0,25% BSA
2 mM Glutamin Medium III (Differenzierungsmedium) DMEM/Ham´s F12
1% FCS B27
100µM Ascorbinsäure 0,25% BSA
2 mM Glutamin
Blocking-Puffer I 3% NGS
0,3% TritonX PBS
Blocking-Puffer II 1% BSA
0,3% TritonX PBS
Blocking-Puffer III 10% BSA
0,3% TritonX PBS
Blocking-Puffer IV 3% BSA
0,3% TritonX PBS
Blocking-Puffer V 1% NGS
0,3% TritonX PBS
Material und Methoden
32
3.6.1 Versuchsdesign Transplantationsversuche
Abbildung 3: Übersicht Versuchsablauf Transplantationsversuche
3.7 Präparation der E12 Zellen
Zur Gewinnung der mesencephalen Progenitorzellen wurde das ventrale Mesencephalon 12 Tage alter Rattenembryonen (Sprague Dawley, bezogen von Charles River, Sulzfeld, so wie beschrieben von NIKKHAH et al. präpariert (NIKKHAH et al., 1994 (1), NIKKHAH et al., 1994 (2)). Grundlage hierzu ist die Zell- Suspensions-Technik nach BJÖRKLUND et al. (BJÖRKLUND et al., 1983). Die trächtigen weiblichen Ratten wurden mit CO2 getötet und die Embryonen aus den Uteri entnommen. Die abgeschnittenen Köpfe der Embryonen wurden in sterilen Petrischalen gefüllt mit Hank´s Pufferlösung gesammelt. Unter mikroskopischer Kontrolle wurde das Mittelhirn-Neuralrohr präpariert, anschließend die dorsalen und lateralen Anteile am Präparat entfernt und die so erhaltenen ventralen Anteile in DMEM/Ham´sF12 gesammelt. Die ventralen Mesencephalonstücke wurden dann in einer Lösung aus DMEM/Ham´s F12, 0,05% DNAse, 2mmol L-Glutamin, B27 und 1 mmol Natriumpyruvat bei 37°C für 20 Minuten inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von Medium I (Anheftungsmedium) gestoppt und die Suspension für 5 Minuten bei 100 rpm zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 1ml Medium I
6-OHDA Injektion
Präparation E12 Zellen
3 Tg Proliferation
mind 8 Wochen
Trans fektion
3 Tg Proliferation,
4Tg Differenzierung
Transplantation
Perfusion 1 Wo
Perfusion 2 Wo