DMEM/Ham´s F12 PAA GmbH, Linz, Österrich
Hank´s Pufferlösung PAA GmbH, Linz, Österreich
RMPI 1640 Medium Biochrom AG, Berlin
Material und Methoden
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Medium I (Anheftungsmedium) DMEM/Ham´s F12
3% FCS Medium II (Proliferationsmedium) DMEM/Ham´s F12
20ng/ml FGF-2 N2
1 mM Natriumpyruvat 0,25% BSA
2 mM Glutamin Medium III (Differenzierungsmedium) DMEM/Ham´s F12
1% FCS B27
100µM Ascorbinsäure 0,25% BSA
2 mM Glutamin
Blocking-Puffer I 3% NGS
0,3% TritonX PBS
Blocking-Puffer II 1% BSA
0,3% TritonX
Material und Methoden
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3.6.1 Versuchsdesign Transplantationsversuche
Abbildung 3: Übersicht Versuchsablauf Transplantationsversuche
3.7 Präparation der E12 Zellen
Zur Gewinnung der mesencephalen Progenitorzellen wurde das ventrale Mesencephalon 12 Tage alter Rattenembryonen (Sprague Dawley, bezogen von Charles River, Sulzfeld, so wie beschrieben von NIKKHAH et al. präpariert (NIKKHAH et al., 1994 (1), NIKKHAH et al., 1994 (2)). Grundlage hierzu ist die Zell-Suspensions-Technik nach BJÖRKLUND et al. (BJÖRKLUND et al., 1983). Die trächtigen weiblichen Ratten wurden mit CO2 getötet und die Embryonen aus den Uteri entnommen. Die abgeschnittenen Köpfe der Embryonen wurden in sterilen Petrischalen gefüllt mit Hank´s Pufferlösung gesammelt. Unter mikroskopischer Kontrolle wurde das Mittelhirn-Neuralrohr präpariert, anschließend die dorsalen und lateralen Anteile am Präparat entfernt und die so erhaltenen ventralen Anteile in DMEM/Ham´sF12 gesammelt. Die ventralen Mesencephalonstücke wurden dann in einer Lösung aus DMEM/Ham´s F12, 0,05% DNAse, 2mmol L-Glutamin, B27 und 1 mmol Natriumpyruvat bei 37°C für 20 Minuten inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von Medium I (Anheftungsmedium) gestoppt und die Suspension für 5
Material und Methoden
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(Anheftungsmedium) resuspendiert und eine Einzel-Zell-Suspension wurde hergestellt durch mechanische Dissoziation mit Eppendorf-Pipetten (1ml, 5-10x, 200µl, 5-10x). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels einer Trypan-Blau-Färbung festgestellt und betrug nahezu 100%.
Pro Embryo konnten - abhängig von der Größe - ca. 60.000 – 80.000 Zellen gewonnen werden.
3.8 Zellkultur
Die Zellkultur wurde wie von Timmer et al. beschrieben durchgeführt (TIMMER et al., 2006). Zunächst wurden die Zellen in einem Hemocytometer gezählt und auf 2.000.000 bis 3.000.000 Zellen/ml eingestellt. Dann wurde je 1 ml der Zellsuspension mit 5 ml des Mediums I (Anheftungsmedium) in 25ml Zellkulturflaschen ausgesät, die vorher mit Polyornithin (100µg/ml) und Laminin (6µg/ml) beschichtet wurden. Die Beschichtung erfolgte in destilliertem Wasser für 24 Stunden bei Raumtemperatur.
Anschließend wurden die Flaschen zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
Nach 24 Stunden wurde das Anheftungsmedium durch Medium II (Proliferationsmedium) ersetzt und die Zellen hierin für 3 Tage kultiviert. Nach der Proliferationsphase wurde das Medium von den Flaschen entfernt, die Oberfläche einmal mit PBS gewaschen und die Zellen mithilfe von Trypsin/EDTA innerhalb von 3-4 Minuten abgelöst. Die Trypsinisierung wurde durch Zugabe von Anheftungsmedium gestoppt. Die Zellen wurden erneut gezählt und auf die benötigten Zellzahlen (2.000.000 Zellen pro Transfektion) eingestellt und transfiziert.
(s. u.).
Nach der Transfektion wurden die Zellen wieder mit in wie oben beschichteten 25ml Zellkulturflaschen ausgesät (1,5 – 2 Millionen Zellen/Flasche) und über Nacht in 5ml Anheftungsmedium inkubiert, das anschließend wieder für 3 Tage durch Proliferationsmedium ersetzt wurde. Abschließend wurde das Proliferationsmedium durch Medium III (Differenzierungsmedium) ersetzt und die Zellen für weitere 4 Tage inkubiert.
Alle Inkubationsphasen fanden bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO2 - 95% Luft Inkubator unter normalen Sauerstoff-Verhältnissen (ca. 20%) statt.
Material und Methoden
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Unmittelbar vor der Transplantation wurden die Zellen wieder wie oben beschrieben mit Trypsin/EDTA abgelöst, die Trypsinisierung mit Anheftungsmedium gestoppt, die Zellen gezählt und die Lebensfähigkeit mit Trypanblau überprüft. Die Suspension wurde nun für 5 Minuten bei 1000rpm zentrifugiert und anschließend in Proliferationsmedium, jedoch ohne FCS, dafür mit 0,05% DNAse, resuspendiert und auf die Endkonzentration von ca. 100.000 Zellen /µl eingestellt.
In der Kontrollgruppe wurden nicht transfizierte Zellen verwendet.
3.9 Transfektion
Die gewählte Art der Transfektion in diesem Versuch ist die Nucleofektion. Hierzu wurde das ´Basic Nucleofector Kit` für primäre Säugetierneuronen der Firma Amaxa, Köln, benutzt.
Der proteinkodierende Bereich vom FGF-2 (23kd Isoform) –Gen der Ratte wurde in das Expressionsplasmid p3xFlag kloniert. Dieses Plasmid wird im folgenden flag23kd genannt. 2.000.000 Zellen wurden je mit flag23kd oder für die Kontrollgruppe mit dem leeren Vektor (im folgenden empty flag genannt) nach dem Protokoll, das von CESNULEVICIUS in unserer Arbeitsgruppe erstellt wurde, transfiziert CESNULEVICIUS et al., 2006). Diese Prozedur überlebten ca. 1.000.000 Zellen.
3.10 Das unilaterale 6-OHDA Läsions-Modell
Weibliche Sprague-Dawley Ratten, ebenfalls bezogen von Charles River, Sulzfeld, wurden im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover in Gruppen von 3-5 Tieren bei einer Raumtemperatur von 22-24°C, einer Luftfeuchtigkeit von 50-60% und einem künstlichen Tag/Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden in Makrolon® Typ IV Käfigen auf Standardeinstreu für Labortiere (Altromin, Altrogge, BRD) gehalten. Die Tiere erhielten Altromin-Haltungsfutter (Altromin, Altrogge, BRD) und Wasser ad libitum.
Es wurden insgesamt 68 Ratten verwendet, die zum Zeitpunkt der Lädierung ein Gewicht von ca. 200g hatten.
Unter intraperitoneal applizierter Injektionsnarkose (Ketaminhydrochlorid 5%
Material und Methoden
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0,1ml/100g KGW und Xylazin 2% 0,02ml/100g KGW, TIMMER et al., 2004) wurden die Tiere in stereotaktische Rahmen eingespannt und erhielten jeweils eine 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) Injektion mit einer 5 ml Hamilton-Spritze in das rechte mediale Vorderhirnbündel an folgenden Koordinaten in Bezug auf Bregma und Dura:
1. 2,5 µl 6-OHDA (3.6 µg /µl in 0,2 mg/ml L-Ascorbinsäure – Saline) bei: AP: -4,4, LAT: 1,2, VERT: 7,8, Zahnbalken: 2,3; 3µl 6OHDA bei AP: 4, LAT: 0,8, VERT: -8, Zahnbalken: +3,4. Die Injektionsrate betrug 1µl/ Minute und die Kanüle wurde nach der Injektion für weitere 3 Minuten an Ort und Stelle belassen und dann langsam entfernt. Nach der Lädierung wurde für mindestens 8 Wochen abgewartet, bevor die Transplantation vorgenommen wurde.
3.11 Transplantation der E12 Zellen
Die nach oben beschriebener Art und Weise vorbereiteten Zellen wurden stereotaktisch in das rechte Striatum der lädierten Ratten implantiert. Hierbei wurden folgende Gruppen gebildet: 11 Tiere wurden mit mit flag23kd transfizierten Zellen transplantiert, 11 Tiere wurden mit mit flag empty transfizierten Zellen transplantiert sowie 4 Tiere mit naiven Zellen.
Hierzu wurde eine Glas-Kapillare mit einem äußeren Umfang von 50-70 µm mit Hilfe eines Plastik-Schlauches an einer 2µl Hamilton-Spritze befestigt und jeweils ein Depot von 2 µl an folgenden Stellen im Bezug auf Bregma und Dura injiziert: 1. AP:
+1, LAT: -2,3, VERT: -4; 2. AP: +1, LAT: -2,3, VERT: -5; 3. AP: +1, LAT: -3,3, VERT:
-4, 4. AP: +1, LAT: -3,3, VERT: -5, Zahnbalken: 0 für alle 4 Koordinaten. Die Injektionsrate betrug 1µl/min und die Kanüle wurde kurz nach der Injektion entfernt (NIKKHAH et al, 1994(2)).
3.12 Perfusion und histologische Aufarbeitung
Eine Woche nach der Transplantation (Gruppe empty flag n = 5 ; Gruppe flag23kd n
= 6 ; Gruppe naiv n = 2) bzw. 2 Wochen nach der Transplantation (Gruppe empty flag n = 6 ; Gruppe flag23kd n = 6 ; Gruppe naiv n = 2) wurden die Ratten unter tiefer Narkose zunächst mit 250ml NaCl 0,9% und anschließend mit 250ml
Material und Methoden
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Paraformaldehyd 4% in PBS intracardial perfundiert, und die Gehirne unmittelbar danach präpariert und über Nacht in 4% Paraformaldehyd bei 4°C immersionsfixiert, um danach bis zum Absinken im Gefäß (Dehydratation, maximal 7 Tage) in 30%
Succrose-Lösung zu verbleiben.
Anschließend wurden 6 Serien coronale Gefrierschnitte bei -20°C Objekt- und Kammertemperatur mit einer Dicke von 30 µm (bzw. für die Verhaltensversuche 40 µm) aus den Gehirnen angefertigt. Hierzu werden die Gehirnschnitte je fortlaufend einer von 6 Serien zugeordnet, nach 6 Schnitten beginnt die Zuteilung stets von vorn, so dass alle Serien Schnitte mit 150 µm Abstand aufweisen). Diese wurden bis zur Weiterbearbeitung in Anti-Freeze-Medium (30% Glycerin, 30% Ethylenglycol, 40%
PBS) bei -20°C gelagert.
Es wurden für alle Gehirne soweit möglich folgende immunhistologische Färbungen im Free-Floating-Verfahren durchgeführt: TH-Färbung zum Nachweis dopaminerger Neurone (Präinkubation in 3% H202, 10%Methanol, PBS für 10 Minuten, TH-Antikörper (Sigma Aldrich, Taufkirchen) 1:5000 in Blocking-Puffer II über Nacht;
Visualisierung mittels Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Kit und 3´,3- Diaminobenzidin DAB (NIKKHAH et al., 1994(2)); Dapi-Färbung zur Visualisierung von Zellkernen (1:1500 in PBS für 30 Minuten). Für alle folgenden Färbungen erfolgte die Visualisierung mittels fluoreszierendem Zweitantikörper Cy2 (1:200) bzw. Cy3 (1:500, nur Tubulin 1:1000) im Blocking-Puffer entsprechend dem Erstantikörper; Tubulin-Färbung zum Nachweis von Neuronen (Präinkubation in Blocking-Puffer I für 20 Minuten, Tubulin-Antikörper (Biomol) 1:1000 in Blocking-Puffer V über Nacht );
Nestin-Färbung zum Nachweis von Progenitorzellen (Präinkubation in Blocking-Puffer I für 20 Minuten, Nestin-Antikörper (Chemicon) 1:550 in Blocking-Blocking-Puffer V über Nacht); GFAP- Färbung zum Nachweis von Astrozyten (Präinkubation in Blocking-Puffer I für 60 Minuten, GFAP-Antikörper (monoclonal: SigmaAldrich; polyclonal:
Dako) 1:400 in Blocking-Puffer II über Nacht); flag-Färbung zum Nachweis transfizierter Zellen (Präinkubation in Blocking-Puffer III für 10 Minuten, flagM2-Antikörper (Sigma Aldrich, Taufkirchen) 1:500 in Blocking-Puffer IV über Nacht).
Alle Schnitte wurden mit Hilfe von Gelatine (7,2 g/l A. dest.) auf mit 100% Alkohol entfettete oder silanisierte Objektträger aufgezogen und nach mindestens einer
Material und Methoden
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Nacht Trocknungszeit eingedeckelt (Fluoreszenzschnitte: Fluoreszent Mounting Medium; DAB-Schnitte: Corbit Balsam).
3.13 Verhaltensstudien zur funktionellen Evaluation
Für die Verhaltensstudien wurden ebensolche Sprague-Dawley Ratten verwendet wie für die Transplantationsversuche. Es erfolgte eine Einteilung in 3 Gruppen:
Gruppe 1: Naive Ratten, Gruppe 2: Sham-lädierte Ratten, Gruppe 3: 6-OHDA-lädierte Ratten. Die Lädierung der Ratten erfolgte wie oben beschrieben, für die Sham-Läsionen wurde anstelle des Toxins lediglich das Lösungsmittel injiziert. Die naiven Ratten wurden lediglich in den Stereotakt eingespannt und für ca. 10 Minuten dort belassen. Zwischen der Lädierung und den Verhaltensexperimenten wurden die Ratten gehandelt um sie an den Umgang mit Menschen zu gewöhnen.
In den Verhaltensstudien wurden zwei Experimente durchgeführt, in denen lokomotorisches, exploratives und angstassoziiertes Verhalten untersucht werden sollte (Abbildung 4).
Die Durchführung der Verhaltensversuche erfolgte in einem Raum, in dem die Apparaturen in einem durch weiße Laken abgehängten Bereich unterhalb der für die Aufzeichnung nötigen Videokamera aufgestellt wurden. Der Raum war klimatisiert (23°C) und durch Leuchtstoffröhren indirekt beleuchtet (50–80 Lux), die Störgeräuschunterdrückung erfolgte mittels eines White Noise Generators bei 60 dB.
Beide Versuchsreihen wurden jeweils zur gleichen Tageszeit und jeweils von den gleichen Experimentatoren durchgeführt und die Tiere 30 Minuten vor Versuchsbeginn in einen dem Versuchsraum angrenzenden Vorbereitungsraum verbracht. Das Verbringen der Tiere in und aus den Arenen erfolgte mittels eines Transportkäfigs, der, ebenso wie die Arenen selbst, zwischen den Versuchsdurchläufen mit Essigsäure gereinigt wurde.
Zum Tracking der Ratten wurde das Computerprogramm EthoVision® (Noldus Information Technology, Wageningen, Niederlande) verwendet, das 1 Sekunde nach dem Einsetzen der Tiere mit dem Aufzeichnen begann. Die Versuchsdauer betrug je 5 Minuten.
Die Versuche fanden randomisiert und für die Experimentatoren verblindet bezüglich der Gruppenzugehörigkeit statt.
Material und Methoden
38 Abbildung 4: Versuchsablauf Verhaltensstudien
3.13.1 Das Offenfeld
Bei der Offenfeld-Arena (im Folgenden OF) handelt es sich um eine nach oben offene, runde Polypropylen-Box mit einem Außendurchmesser von 80 cm und einer 4 mm starken Wand von 25 cm Höhe, die auf einem Tisch in 78,5 cm Höhe platziert wurde (Abbildung 5).
Die Arena wird in 3 Zonen (Zentrum, innen, außen) von je ca. 13–13,5 cm Radius aufgeteilt.
6-OHDA bzw.
Sham-Läsion
Mind.
8 Wo
Offenfeld
Elevated Plus Maze
Perfusion und histologische Aufarbeitung
Material und Methoden
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Abbildung 5: Aufbau Offenfeld (nach C. Lindemann)
Die Ratten wurden mit konstanter Blickrichtung in den Zentrumsbereich gesetzt und es wurden für 5 Minuten folgende Parameter erfasst: die insgesamt zurückgelegte Laufstrecke, das Eintreten der Ratten in die jeweiligen Zonen, die Verweildauer in den jeweiligen Zonen sowie (mittels EthoVision); Häufigkeit und Dauer von Aufrichtungs- und Putzverhalten (Rearing und Grooming) in den jeweiligen Zonen (mittels Sondertastatur in Verbindung mit EthoVision) sowie Anzahl der hinterlassenen Kotboli (manuell).
3.13.2 Das Elevated Plus-Maze
Beim Elevated Plus–Maze (EPM) handelt es sich um eine kreuzförmige Versuchsarena, die auf 86,5 cm hohen Säulen befestigt ist. Zwei Arme des Kreuzes sind offen, zwei von 30 cm hohen und 9 mm dicken Wänden begrenzt. Die Maße der Arme betragen 49 cm x 14 cm. Das Zentrum (14 cm x 14 cm) ist ebenfalls offen (Abbildung 6).
Material und Methoden
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Abbildung 6: Aufbau Elevated Plus-Maze (nach C. Lindemann)
Die Ratten wurden konstant mit Blickrichtung in einen offenen Arm in das Zentrum der Arena gesetzt und es wurden für 5 Minuten folgende Parameter erfasst: die insgesamt zurückgelegt Laufstrecke, das Eintreten der Ratten in die jeweiligen Zonen sowie die die Verweildauer in den jeweiligen Zonen (mittels EthoVision);
Häufigkeit und Dauer von Aufrichtungs- und Putzverhalten in den jeweiligen Zonen sowie des Herabschauens der Tiere von den offenen Armen (Head Dips) (mittels Sondertastatur in Verbindung mit EthoVision) sowie Anzahl der hinterlassenen Kotboli (manuell).
3.14 Statistik
Die statistische Auswertung der Verhaltensstudien erfolgte mittels des Computerprogramms GraphPad InStat, Version 3.0. Zunächst wurde mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests ermittelt, ob sich die Daten gemäß einer Gauß`schen Normalverteilung verhalten. Entsprechend des Ergebnisses wurde zum Vergleich der
Material und Methoden
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je 3 Gruppen eine einfaktorielle Varianzananalyse (One-Way-Anova) bzw. bei nicht parametrischen Daten eine Kruskal-Wallice-Varianzanalyse durchgeführt. Als post hoc-Tests wurden anschließend der Bonferroni Multiple Comparison Test bzw. bei nicht parametrischen Daten der Dunn Multiple Comparison Test verwendet. Das Signifikansniveau wurde auf p < 0,05 festgesetzt.
Zur genauen Bestimmung der p-Werte wurden die im post-hoc Test als signifikant erkannten Gruppen mittels eines t-Tests verglichen.
Ergebnisse
43 4 Ergebnisse
4.1 Transplantationsversuche
Die hier erzielten Ergebnisse sind als Grundlage für nachfolgende Studien hinsichtlich der Entwicklung eines effizienten Transplantationsprotokolls für transfizierte neuronale Progenitorzellen im Rattenmodell des Morbus Parkinson zu sehen. Zu diesem Zweck wurden hier in einer Kurzzeitstudie Zellen aus dem Mesencephalon 12 Tage alter Rattenembryonen verwendet um ihr Verhalten nach Transfektion und Transplantation zu beurteilen.
Hierzu wurden drei experimentelle Gruppen gewählt: in der ersten wurden naive Progenitorzellen, die in vitro insgesamt 6 Tage proliferiert und 4 Tage differenziert wurden, transplantiert. Für die zweite Gruppe wurden die Zellen bei ansonsten gleicher Behandlung nach 3 Tagen Proliferation mit flag23kD transfiziert, in der dritten Gruppe erfolgte zu diesem Zeitpunkt eine Transfektion mit einem leeren flag-Vektor.
Die Evaluation der Morphologie und Integration der transplantierten Zellen erfolgte je nach einer bzw. nach zwei Wochen.
Die Analyse der angefertigten Gefrierschnitte beinhaltet die Erfassung der in den Transplantaten vorhandenen Zelltypen mithilfe immunhistochemischer Marker, die vorhanden Zelltypen wurden auf Ihre Verteilung, ihre Morphologie und Integration hin untersucht. Zur Darstellung der Zelltypen wurden Antikörper für folgende Marker gewählt:
1. GFAP: zur Darstellung von Astrozyten, also der astroglialen Reaktion
2. Nestin: zur Darstellung von neuronalen Progenitorzellen sowie reaktiver Astrozyten
3. Tubulin: zur Darstellung von Neuronen 4. TH: zur Darstellung dopaminerger Neurone
Zudem wurden die Präparate mit Dapi zur Markierung der Zellkerne angefärbt, um damit einen Hinweis auf die Zelldichte im Präparat zu erhalten.
Vor allem bei den Darstellungen von Neuronen und TH-positiven Neuronen kam es zu teils sehr unterschiedlicher Anfärbbarkeit der verschiedenen Präparate mit zum
Ergebnisse
44 Teil erheblicher Hintergrundfärbung.
Zudem wurden alle Transplantate auf die Ausprägung des flag-tags untersucht. Es zeigte sich jedoch in keinem der Schnitte eine Immunreaktivität für das Fusions-Tag, wohingegen in vitro das flag-tag (vgl. Abb. 7) darzustellen ist.
4.1.1 Überleben transfizierte Zellen die Transplantation?
Anhand der Dapi-Färbung lässt sich erkennen, dass die transfizierten Zellen die Transplantation überlebt haben: In den Bereichen, wo die Transplantate zu erwarten sind, zeigen sich deutlich abgrenzbare Bereiche erhöhter Zelldichte, und das in allen drei experimentellen Gruppen, sowohl eine (Abb. 8, 10, 12 D) als auch zwei Wochen (Abb. 9, 11, 13 D) nach der Transplantation. Besonders interessant wird diese Beobachtung, wenn man die Anfärbbarkeit der Zellkerne mit der für die anderen Marker vergleicht (s. u.).
4.1.2 Ist eine verstärkte Astrozytose auf die Transplantate zu beobachten?
Zur Darstellung der astrozytären Reaktion wurden die angefertigten Gefrierschnitte mit einem Antikörper für GFAP, einem Bestandteil des Zytoskeletts von Astrozyten, immunhistochemisch untersucht. Die Astrozyten stellen sich aufgrund des gewählten sekundären Antikörpers grün dar.
Es kann für alle Gruppen gezeigt werden, dass die Gehirnhälfte, in der die Transplantation erfolgt ist, insgesamt eine stärkere astrozytäre Reaktion zeigt als die nicht transplantierte Seite: Die angefärbten Astrozyten sind hier insgesamt dicker und weisen mehr Zellausläufer auf, dadurch erscheint die gesamte Gehirnhälfte stärker leuchtend.
In allen experimentellen Gruppen stellt sich zudem eine vermehrte Reaktivität der Astrozyten direkt um die Transplantate dar: Alle Transplantate sind von einem Bereich umgeben, in dem besonders viele reaktive Astrozyten zu finden sind: Diese kennzeichnen sich dadurch, dass sie noch einmal größer und dicker sind und dass sie mehr Ausläufer aufweisen als die Astrozyten, die innerhalb der Transplantate und in den übrigen Bereichen der Gehirnhälfte zu sehen sind (vgl. z. B. Abb. 13 G1 und
Ergebnisse
45 G2).
Die Astrozyten, die sich im Inneren der Transplantate anfärben lassen, weisen eine feinere Struktur auf, sind kleiner und scheinen so weniger zu leuchten. Sie füllen die Transplantate in unterschiedlicher Dichte aus.
Die Differenzierung, ob die reaktiven Astrozyten um die Transplantate herum liegen oder Teil von Ihnen sind, ist deshalb möglich, weil in der Doppelmarkierung mit Dapi zu sehen ist, dass der Bereich der besonders hohen Dichte an Zellen (also der Bereich, in dem die transplantierten Zellen sich befinden) umgeben ist von einem Bereich der vermehrten glialen Reaktion (also vermehrt GFAP-positiven Zellen) und dass sich diese beiden unterschiedlichen Zellanordnungen nicht überschneiden. Es lässt sich also folgern, dass die äußere Grenze der Transplantate mit dem Beginn der vermehrten glialen Reaktion zusammenfällt. Die Bereiche der transplantierten Zellen scheint also durch die reaktiven Astrozyten eingegrenzt zu werden (Abb. 8, T/G2)
Zwischen den experimentellen Gruppen lassen sich keine deutlichen Unterschiede in Maß und Ausbreitung der glialen Reaktion erkennen. Jedoch ist zu bemerken, dass die gliale Reaktion nach einer Woche jeweils deutlicher ausgeprägt ist und die Astrozyten eher unregelmäßig angeordnet erscheinen, wohingegen nach zwei Wochen die gliale Reaktion weniger stark, die saumartige Abgrenzung der Transplantate durch reaktive Astrozyten weniger deutlich ist. Außerdem erscheinen die Zellen insgesamt etwas regelmäßiger angeordnet, sie orientieren sich teilweise in Richtung der Mitte der Transplantate, teilweise liegen sie konzentrisch um die Transplantate angeordnet.
Ebenso wie um die Transplantate herum ist im Bereich des Einstichs der Transplantationsnadel eine vermehrte Reaktivität von Astrozyten zu sehen, die sich trichterförmig in die Tiefe verjüngt. Sie steht nicht in räumlichem Kontakt mit den Bereichen, in denen die transplantierten Zellen zu finden sind.
4.1.3 Sind neuronale Progenitorzellen in den Transplantaten zu finden?
Die Darstellung von neuronalen Progenitorzellen erfolgt mithilfe des Markers Nestin.
Nestin ist ebenfalls ein Bestandteil des Zytoskeletts und kommt in Progenitorzellen
Ergebnisse
46
vor, aber auch in reaktiven Astrozyten. Nestin-immunreaktive Zellen stellen sich aufgrund des gewählten zweiten Antikörpers rot dar (Beachte: Aufgrund der besseren Darstellbarkeit ist die Farbe in einigen Schnitten digital nach gelb verändert).
Nestin-positive Zellen finden sich in fast allen Schnitten. Sie sind überwiegend in und um die Transplantate zu sehen (Die Differenzierung erfolgt auch hier durch die Doppelfärbung mit Dapi).
Die Gestalt der Nestin-immunreaktiven Zellen erinnert an die von Astrozyten. Jedoch sind sie insgesamt filigraner: Ihre Zellkörper ebenso wie ihre Ausläufer sind schlanker und erscheinen dadurch länger (z.B. Abb. 12 Nes2 und G2).
In den Gruppen mit transfiziert transplantierten Zellen liegen die Nestin-positiven Zellen ähnlich den reaktiven Astrozyten vornehmlich um die Transplantate herum und die in den Transplantaten zu sehenden Nestin-positiven Zellen sind noch einmal kleiner und feiner als die übrigen. Nach einer Woche sind in diesen beiden Gruppen fast keine Nestin-positiven Zellen innerhalb der Transplantate zu sehen. Nach zwei Wochen sind innerhalb der Transplantate mehr Nestin-positive Zellen zu sehen als nach einer Woche, insgesamt ist die Dichte an Nestin-positiven Zellen aber geringer.
In den Transplantaten mit nicht transfizierten, naiv transplantierten Zellen sind insgesamt deutlich weniger Zellen Nestin-positiv. Die immunreaktiven Zellen liegen fleckenartig um und in den Transplantaten verteilt, es zeigt sich nicht ein so deutlich abgrenzbarer Bereich immunreaktiver Zellen um die Transplantate. Auch hier sind nach 2 Wochen weniger immunreaktive Zellen zu sehen.
Reaktive Astrozyten können ebenfalls Nestin-positiv sein (KRUM und ROSENSTEIN, 1999). Daher wurden GFAP- und Nestin-Immunreaktivität verglichen. Aus methodischen Gründen konnte keine direkte Doppelfärbung für beide Marker angefertigt werden, somit werden benachbarte histologische Schnitte verglichen: in den Fällen, wo GFAP- und Nestin-positive Zellen wie als Ring um die Transplantate herum zu liegen kommen, kommen die beiden Zelltypen nebeneinander vor.
Vermutlich sind hier einige Zellen für beide Marker positiv. Auch in den Transplantaten, wo Nestin- und GFAP-positive Zellen innerhalb der Transplantate zu finden sind, liegen sie in den gleichen Bereichen (z.B. Abb. 9 N/G).