der Medizinischen Hochschule Hannover (Direktor Prof. Dr. med. C. Krettek)
Osteochondrale Veränderungen nach Ersatz des vorderen Kreuzbandes bei offenen Wachstumsfugen am Schafmodell
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Sabine Thoben
aus Vechta
Präsident:
Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit:
Prof. Dr. med. Johannes Zeichen
Referentin:
Prof. ‘in Dr. med. Christina Stukenborg-Colsman
Korreferent:
Prof. Dr. med. Klaus Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 03.03.2009
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Henning Windhagen Prof. Dr. Claus Petersen Prof. Dr. Micheal Winkler
1 Einleitung ... 1
1.1 Ruptur des VKB im Kindesalter ... 2
1.2 Post operative osteochondrale Veränderungen ... 3
1.2.1 Studienmodelle ... 3
1.2.2 Osteoarthrose ... 4
1.2.3 Osteoarthrose und die VKB-Ruptur ... 5
1.3 Osteoarthroseforschung ... 6
1.3.1 Methoden ... 6
1.3.1.1 Makroskopie ... 6
1.3.1.2 Biomechanik ... 6
1.3.1.3 Knorpelhistologie ... 7
1.3.1.4 Histomorphometrie (Bone Volume) ... 7
1.3.1.5 Subchondrale Knochendichte ... 7
1.4 Hypothese/Ziel der Studie ... 8
2 Material und Methoden ... 9
2.1 Studienaufbau ... 9
2.2 Tierhaltung ... 9
2.2.1.1 Prä operationem ... 9
2.2.1.2 Post operationem ... 10
2.3 Operation ... 11
2.3.1 Prämedikation und Narkose ... 11
2.3.2 Operationstechnik: Ersatz des vorderen Kreuzbandes ... 12
2.4 Euthanasie ... 17
2.5 Probenentnahme ... 17
2.6 Nomenklatur ... 18
2.7.2.4 Auswertung der biomechanischen Testungen ... 28
2.7.3 Histologische Untersuchungen ... 29
2.7.3.1 Einbettung und Probenanfertigung der histologischen Schnitte ... 29
2.7.3.2 Safranin-O-Färbung ... 30
2.7.3.3 Von-Kossa-Färbung ... 31
2.7.3.4 Digitalisierung der histologischen Schnitte ... 33
2.7.3.5 Histologische Auswertung (Mankin-Score) ... 33
2.7.3.6 Histomorphometrische Auswertung der BV/TV ... 34
2.7.4 Subchondrale Knochendichte ... 36
2.7.5 Statistische Auswertung ... 37
3 Ergebnisse ... 38
3.1 Makroskopische Beurteilung ... 38
3.2 Biomechanische Testungen ... 40
3.2.1 Indentationstestung ... 40
3.2.2 Knorpeldicke ... 42
3.2.3 Elastizitätsmodul ... 43
3.3 Histologie (Mankin-Score) ... 45
3.4 Histomorphometrie (Bone Volume) ... 53
3.5 Subchondrale Knochendichte ... 54
3.6 Korrelationen ... 57
4 Diskussion ... 59
4.1 Grenzen der Studie ... 59
4.2 Makroskopie ... 60
4.3 Biomechanik ... 61
4.4 Histologie (Mankin-Score) ... 62
4.5 Histomorphometrie (Bone Volume) ... 64
4.6 Subchondrale Knochendichte ... 65
4.7 Korrelationen ... 66
5 Zusammenfassung Osteochondrale Veränderungen nach Ersatz des vorderen
Kreuzbandes bei offenen Wachstumsfugen am Schafmodell ... 68
6 Ergebnistabellen ... 70
6.1 Ergebnisse der makroskopischen Beurteilung mittels des ICRS-Scores ... 70
6.2 Ergebnisse der biomechanischen Testungen der intakten Gliedmaße ... 71
6.3 Ergebnisse der biomechanischen Testungen der operierten Gliedmaße ... 72
6.4 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen (Mankin-Score) der intakten Gliedmaße ... 73
6.5 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen (Mankin-Score) der operierten Gliedmaße ... 74
6.6 Ergebnisse der histomorphometrischen Untersuchungen (Bone Volume) ... 75
6.7 Ergebnisse der subchondralen Knochendichte-Messungen ... 76
7 Abbildungsverzeichnis ... 77
8 Diagrammverzeichnis ... 78
9 Tabellenverzeichnis ... 79
10 Literaturverzeichnis ... 81
11 Anhang ... 90
11.1 Erklärung ... 90
11.2 Curriculum vitae ... 90
12 Danksagung ... 94
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
B.Ar Trabecular Bone Area BMD Bone Mineral Density BV/TV Trabecular Bone Volume cm³ Kubikzentimeter
DXA/DEXA Dual-energy X-Ray Absorptiometry et al. et alteri (lat.: und andere)
g Gramm
ICRS International Cartilage Repair Society i.m. intramuskulär
i.v. intravenös
LSD-Test Least Square Difference Test
M. Muskulus
μm Mikrometer
min Minute
mm Millimeter Mpa Megapascal
N Newton
NaCl Natriumchlorid OA Ostearthrose
PECO2 Endtidale Kohlendioxidkonzentration
pH Potenz der Wasserstoffionenkonzentration ROI Region of Interest
s.c. subkutan Tab. Tab.
T.Ar Total Cancellous Tissue Area VE vollentsalztes Wasser
VKB Vorderes Kreuzband
1 Einleitung
Die Ruptur des vorderen Kreuzbandes (VKB) stellt ein häufiges Verletzungsmuster dar. Die Inzidenz dieser Verletzung liegt bei 30 pro 100.000 Einwohner, wobei die meisten Rupturen auf Sportverletzungen zurückzuführen sind (1). Zwar können durch eine Ersatzoperation des vorderen Kreuzbandes die Symptome der Instabilität verbessert werden, jedoch treten trotz einer Operation posttraumatische Arthrosen unvermindert häufig auf (2). Schon innerhalb des ersten Jahres nach einem Trauma können in den betroffenen Gelenken Veränderungen auftreten, die einem frühen Stadium einer Osteoarthrose (OA) entsprechen (3).
Während bei primären Arthrosen die Ursache teilweise genetisch bedingt ist, z.B. infolge einer Minderbelastbarkeit des hyalinen Gelenkknorpels, sind sekundäre Arthrosen Folge von Vorschäden am Gelenk. Hierzu zählt unter anderem die posttraumatische OA. (4). Von besonderer Bedeutung ist das Krankheitsbild der OA deshalb, weil es nach den kardiovaskulären Erkrankungen die zweithäufigste Ursache für Arbeitsunfähigkeit in den Industrieländern darstellt (5;6). Die OA führt zu funktionellen Einschränkungen und zu einer reduzierten Lebensqualität (7). Die Therapie der OA verursacht darüber hinaus enorme Kosten (8;9). Die OA ist somit eine degenerative Gelenkerkrankung mit einer erheblichen sozioökonomischen Bedeutung.
In einer prospektiven Kohortenstudie konnte gezeigt werden, dass ein Knietrauma während der Wachstumsphase das Risiko einer sekundären posttraumatischen OA um ein Vielfaches erhöht (10).
Die Diagnose einer VKB-Ruptur wird auch bei Kindern mit zunehmender Häufigkeit gestellt (11). Etwa 3-4 % aller VKB-Rupturen treten in dieser Altersklasse auf (12;13). Es bestehen keine einheitlichen Richtlinien über die Therapie der Ruptur des VKB im Kindesalter (14).
Einerseits werden bei einer konservativen Behandlung in 90 % der Fälle Meniskusläsionen beobachtet. Andererseits können aber infolge einer Operation Wachstumsstörungen auftreten (15). Weitere, mit dieser Verletzung assoziierte Probleme sind eine im Vergleich zu adulten Patienten höhere Rate an persistierenden Instabilitäten des Kniegelenkes sowie eine erhöhte Rerupturrate, die mit einer deutlich höheren Rate an Revisionseingriffen bei Kindern einhergeht (16-19). Junge Patienten mit einer Kreuzbandverletzung im Kindesalter haben
Eine Ersatzoperation bei einer VKB-Ruptur stellt ein Standardverfahren bei Erwachsenen dar (20). Ein Standardverfahren zur Therapie einer VKB-Ruptur bei Kindern mit offenen Wachstumsfugen existiert im Gegensatz dazu bisher nicht (21). In der Literatur wird diesbezüglich ein breites Spektrum an Meinungen vertreten, die von einer streng konservativen Behandlung bis hin zu einem primären VKB-Ersatz reichen (22-25). Sämtliche Therapiekonzepte werden kontrovers diskutiert. Die rein konservative Behandlung setzt eine konsequente Einhaltung der Entlastungszeiten und eine regelmäßige Durchführung der Physiotherapie zum Muskelaufbau und Propriozeptorentraining voraus. Unter anderem auf Grund der niedrigeren Patientencompliance bei Heranwachsenden für diese Verhaltensregeln sind die langfristigen Ergebnisse einer konservativen Therapie der Ruptur des VKB bei offenen Wachstumsfugen schlecht (26;27). So treten Funktionseinschränkungen, persistierende Gelenkinstabilitäten, Kollateralschäden an Meniskus und Knorpel auf, die potentiell zu einer schwerwiegenden posttraumatischen OA im Kniegelenk führen können (28-30). Außerdem ist das Risiko einer erneuten Verletzung erhöht (27).
Auf der anderen Seite steht die chirurgische Versorgung einer Ruptur des VKB. Diese ist aufgrund der nicht akzeptablen Ergebnisse bei konservativer Therapie in den letzten Jahren zunehmend angewendet worden. Nach einer Primärnaht des gerissenen Kreuzbandes traten jedoch persistierende Instabilitäten auf (31;32). Unter Berücksichtigung des verbleibenden Längenwachstums wurden weitere phasenadaptierte Therapiekonzepte entwickelt, die eine anfänglich konservative Therapie bis zum Wachstumsabschluss mit darauffolgender Operation beinhalten. Diese führen zwar im Vergleich zu der rein konservativen Therapie zu besseren Resultaten, bringen aber keine zufriedenstellende Langzeitergebnisse (33). Für einen operativen Ersatz des gerissenen vorderen Kreuzbandes gibt es verschiedene Techniken, wobei eine fugenschonende epiphyseale von einer transphysealen Technik unterschieden wird. Als spezifische Komplikation einer transphysealen Technik muß der frühzeitige Epiphysenschluss mit einer nachfolgenden Wachstumsstörung des Beines berücksichtigt werden (15;23;34). Darüber hinaus ist bei Kindern im Gegensatz zu Erwachsenen eine erhöhte Rerupturrate nach einem Kreuzbandersatz zu verzeichnen (35).
All diese Überlegungen und Probleme führten in der Vergangenheit dazu, dass diverse chirurgische Techniken entwickelt wurden. Jedoch konnte sich keine dieser Techniken durchsetzen, so dass auch heute noch kein einheitliches Therapieschema existiert.
1.2 Post operative osteochondrale Veränderungen
1.2.1 Studienmodelle
Zur Evaluation osteochondraler Veränderungen im Zusammenhang mit einem Knietrauma werden verschiedene Studienmodelle herangezogen. So existieren Modelle, die zur Untersuchung langfristiger Veränderungen einen sehr langen Zeitraum zwischen Trauma und Untersuchung abdecken (2;54), während andere Modelle primär in der zum Verständnis einer Erkrankung und deren Pathomechanismus entscheidenden initialen Phase nach einem Trauma ansetzen.
Zur Untersuchung früher osteochondraler Veränderungen ist die Meniskektomie ein häufig verwendetes Modell. So untersuchten z.B. Pastoureau et al. die Auswirkungen einer Meniskektomie anhand eines Schweinemodells 1 und 3 Monate post operationem (73). Sie beobachteten mit Hilfe histologischer Testungen und Messungen der subchondralen Knochendichte komplexe osteochondrale Veränderungen während der initialen Phase (73;102). Ebenso ist das Schafmodell ein etabliertes Studienmodell zur Untersuchung früher osteochondraler Veränderungen im Rahmen einer Osteoarthrose nach einer Meniskektomie.
Hwa et al. beispielsweise stellten in ihrer Schafstudie histomorphometrische Veränderungen 3 und 9 Monate post operationem dar (68). Appleyard et al. fanden in dieser frühen Phase, sogar bereits 3 Monate post operationem, Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften nach einer Meniskektomie an adulten Schafen heraus (61).
Neben der Meniskektomie ist darüber hinaus eine Ruptur des vorderen Kreuzbandes ein etabliertes Studienmodell zur Untersuchung osteochondraler Veränderungen. Dieses wurde unter anderem an adulten Ratten erprobt. Hierbei zeigten sich nach einer Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes bereits in der zweiten Woche post operationem osteochondrale histologische Veränderungen (56;70). Diese frühen osteochondralen Veränderungen konnten auch in verschiedenen Kaninchenmodellen nachgewiesen werden. Bereits 9 Wochen (95) nach einer isolierten Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes waren in den oben genannten Studien veränderte biomechanische Parameter bei den ausgewachsenen Tieren festzustellen.
Ebenfalls an adulten Kaninchen führten Boyd et al. Studien durch. Hierbei fanden sie mit Hilfe von Knochendichtemessungen sogar zu einem noch früheren Zeitpunkt (3 Wochen post
Ersatzoperation deutliche makroskopische Veränderungen der Knorpeloberfläche bemerkten, die auf eine Chondromalazie hindeuteten (80).
Die Auswertung der vorgenannten Studien ließ den Schluss zu, dass das in dieser Studie angewandte, nachfolgend näher ausgeführte Schafmodell zur Untersuchung früher osteochondraler Veränderungen nach einem Knietrauma grundsätzlich geeignet war. Zudem waren auch bei verhältnismäßig kurzen Untersuchungsintervallen aussagekräftige Daten zu erwarten. Eine im Gegensatz zu den zuvor genannten Studien abweichende Herangehensweise der vorliegenden Studie bestand jedoch darin, dass das Hauptaugenmerk auf den komplexen osteochondrale Veränderungen bei einem juvenilen Schafmodell lag.
1.2.2 Osteoarthrose
Die OA stellt einen der Hauptfaktoren für Funktionseinschränkungen und eine verminderte Lebensqualität älterer Mitmenschen dar (4;36;37). In den USA ist die OA nach den kardiovaskulären Erkrankungen bereits die zweithäufigste Ursache für Arbeitsunfähigkeit (6).
Da im Rahmen des zu erwartenden demographischen Wandels die Bevölkerung immer älter werden wird, steht zu befürchten, dass die Prävalenz der OA während der nächsten 20 Jahre in den westlichen Ländern um bis zu 40% ansteigen wird (38).
Die OA ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die durch fortschreitende Knorpelschädigung und Sklerose der darunter liegenden subchondralen Platte gekennzeichnet ist (39;40). Bei einem physiologischen Gelenkspiel können auf das Gelenk einwirkende Kräfte angemessen abgefedert werden. Voraussetzung für dieses physiologische Zusammenspiel ist ein gesunder Zustand des Gelenkknorpels und der subchondralen Platte (41;42).
Traditionell wurde die Ursache für die OA in einer primären Störung des Knorpels gesucht, die in einer Knorpeldegeneration münden sollte (43). Nachdem Radin 1986 postulierte, dass die Unversehrtheit des Gelenkknorpels auch von den mechanischen Eigenschaften des subchondralen Knochens abhängt (44), wurde wiederholt versucht, die genaue Abfolge des Pathomechanismus der Osteoarthrose zu definieren. So zeigten die Knochendichte (Bone Mineral Density, abgekürzt BMD) und das Knochenvolumen (Trabecular Bone Volume, abgekürzt BV/TV) der subchondralen Platte charakteristische Veränderungen im Zuge einer OA. Die BMD bei Patienten mit Osteoarthrose ist um etwa 5 % höher als die bei Gesunden (45) und das Knochenvolumen ist bei Patienten mit Arthrose um etwa 30 % erhöht (46;47).
Diese Zunahme des Knochenumbaus führt zu einer subchondralen Sklerose, die die Fähigkeit der Pufferung des Knorpels herabsetzt (44). Neben der subchondralen Sklerose kommt es auch zu einer Abnahme der biomechanischen Eigenschaften des Gelenkknorpels an sich. Im Rahmen einer frühen Osteoarthrose nimmt die Steifigkeit (Elastizitätsmodul) des Knorpels ab (48;49). Darüber hinaus konnte eine Korrelation zwischen der Abnahme der Steifigkeit des Gelenkknorpels und der makroskopisch erkennbaren Degeneration (ICRS-Score) nachgewiesen werden (50).
Die funktionellen Eigenschaften des Gelenkknorpels resultieren auch aus seiner einheitlichen Struktur aus Chondrozyten, die in einer Matrix aus Kollagenen, v.a. Kollagen Typ II, und Proteoglykanen eingebettet sind. Der Knorpelmatrixumsatz ist ein Prozess, bestehend aus Synthese und Abbau. Dieser Prozess ist in gesunden Individuen ausbalanciert. Bei Osteoarthrosepatienten finden sich hingegen vermehrt sog. Metalloproteinasen, die unter anderem den Abbau von Kollagenen und Proteoglycanen katalysieren (4) und damit diese Balance stören. Die veränderte Knorpelzusammensetzung bei OA stellte Mankin bereits 1970 dar (51).
Die Integrität beider Strukturen, also die des Gelenkknorpels an sich und die der subchondralen Platte, sind für ein physiologisches Gelenkspiel verantwortlich. Im Rahmen der OA kommt es zu komplexen Veränderungen beider Strukturen, wobei die genaue Reihenfolge bis heute kontrovers diskutiert wird (52). Aktuelle Studien deuten darauf hin, dass zu Beginn der OA die Degeneration des Gelenkknorpels steht und es dann zu Veränderungen in der subchondralen Platte kommt (53).
1.2.3 Osteoarthrose und die VKB-Ruptur
Für die Entwicklung einer sekundären, posttraumatischen OA nach VKB-Ruptur sind einerseits Begleitverletzungen, z.B. am Meniskus, sowie andererseits die Zeit nach dem Trauma als assoziierte Faktoren erkannt worden (2). Die posttraumatische OA, die z.B. nach einer Ruptur des VKB auftreten kann, ist eine in der Häufigkeit oft unterschätzte Diagnose (54). In mehreren Studien wurde der Zusammenhang zwischen der Ruptur des VKB und der Entstehung einer posttraumatischen OA bei Erwachsenen gezeigt (3;55;56). Die langfristigen Ergebnisse nach einer Ruptur des VKB im Hinblick auf die Entstehung einer
kommen Lohmander et al. in einer prospektiv randomisierten Studie (2).
In einer prospektiven Kohortenstudie konnte gezeigt werden, dass ein Knietrauma im Kindes- und Jugendalter das Risiko einer sekundären posttraumatischen OA um ein Vielfaches erhöht (10). Kinder mit einer VKB-Ruptur unterliegen somit im Vergleich zu erwachsenen Patienten mit VKB-Ruptur einem deutlich höheren Risiko, im Laufe ihres Lebens eine Arthrose zu entwickeln.
1.3 Osteoarthroseforschung
1.3.1 Methoden
Es gibt zahlreiche Methoden um das Krankheitsbild der OA zu erforschen bzw. zu beurteilen.
In der vorliegenden Arbeit wurden etablierte Methoden kombiniert, um die Komplexität der osteochondralen Veränderungen möglichst gut abbilden zu können.
1.3.1.1 Makroskopie
Man kann degenerative Veränderungen des Gelenkknorpels makroskopisch, z.B. im Rahmen einer Arthroskopie, erkennen. Diese treten je nach Schweregrad der Degeneration in Form von oberflächlichen oder tiefer greifenden Läsionen auf. Die degenerativen Veränderungen können z.B. mittels des im Rahmen unseres Projektes verwendeten Scores der ICRS bewertet werden (57).
1.3.1.2 Biomechanik
Es ist bekannt, dass die biomechanischen Eigenschaften des Gelenkknorpels im Rahmen einer Osteoarthrose abnehmen (48). Um die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels zu untersuchen, wurden verschiedene Verfahren entwickelt. Hierbei lässt man verschieden starke Kräfte auf einen Knorpel einwirken und misst die daraus resultierenden Verformungen. Zum einen gibt es die confined-compression Testung. Hierbei wird der Knorpel einem wasserundurchlässigen, starren Gefäß angepasst und mit einem porösen Stempel komprimiert.
Der Knorpel wird bei dieser Methode vor der Untersuchung von seiner knöchernen Unterlage gelöst (58). Zum anderen gibt es die unconfined-compression Testung, bei der eine Querdehnung der Knorpelmatrix unter der Kompression zugelassen wird (59). Bei der in unserer Studie verwendeten Indentationsmessung wird der Knorpel mit dem subchondralen
Knochen als funktionelle Einheit getestet. Sie misst die Eindringtiefe der Indentationsnadel bzw. die Widerstandsveränderung bei gegebener Kompression (60;61).
1.3.1.3 Knorpelhistologie
Die histologische Untersuchung der einheitlichen Gewebestruktur eines Knorpels ist eine weitere Methode, Osteoarthrose zu quantifizieren. Sie beruht darauf, dass bei gesunden Individuen ein Gleichgewicht zwischen dem Abbau und der Synthese der Knorpelmatrix besteht. Proteoglykane sind ein Hauptbestandteil des Gelenkknorpels. Die Bestimmung ihres Anteils an der Matrix ist Bestandteil des Mankin-Scores, der die histochemischen Veränderungen des Gelenkknorpels bei Osteoarthrose berücksichtigt (51).
1.3.1.4 Histomorphometrie (Trabecular Bone Volume)
Die histomorphometrische Bestimmung erlaubt eine Aussage über den Mineralisationsstatus der subchondralen Platte. Bei einer Osteoarthrose kommt es zu einem um 30 % höheren BV/TV als bei gesunden Individuen (52). Die Berechnung der BV/TV nach der von Parfitt im Jahre 1987 erstellten Methode wurde unter anderem bereits in einem Rattenmodell angewendet, in dem der Prozess der Osteoarthrose nach einer Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes und einer Meniskektomie untersucht wurde (56;70).
1.3.1.5 Subchondrale Knochendichte
Ein weiteres Kriterium für OA ist die subchondrale Sklerosierung. Die subchondrale Knochendichte kann mittels Messungen der BMD bestimmt werden. Im Rahmen einer Osteoarthrose ist eine um 5 % erhöhte BMD subchondral zu beobachten (45;46;65).
Üblicherweise werden die BMD-Messungen heute mittels der Dual-energy X-Ray Absorptiometry (DXA oder DEXA) oder Computertomographie durchgeführt (66). Die DEXA-Messung ist durch hohe Präzision, Reproduzierbarkeit sowie geringe Strahlenbelastung gekennzeichnet (67). Im Rahmen dieser Studie wurde die BMD mittels der Dual-energy-X-Ray-Absorptiometry (DXA) bestimmt. Diese Methode wurde bereits in vorangegangenen Studien an Schafen angewandt, um osteoarthrotische Veränderungen zu definieren (68).
Hypothese:
Nach einem Ersatz des vorderen Kreuzbandes sind komplexe osteochondrale Veränderungen, bedingt durch Wachstum, Inaktivität oder eine beginnende Arthrose, zu erwarten.
Ziel der Studie:
Da die Ruptur des vorderen Kreuzbandes vor allem bei Kindern zu einer hohen Rate an posttraumatischen Osteoarthrosen führen kann, ist das Ziel dieser Studie, die frühen osteochondralen Veränderungen nach einem Ersatz des vorderen Kreuzbandes im Wachstumsalter an einem juvenilen Schafmodell herauszuarbeiten. Die Beschreibung dieser frühen Veränderungen während des Wachstums soll ein besseres Verständnis jener komplexen Vorgänge ermöglichen, die schließlich in einer Arthrose des betroffenen Gelenkes münden können.
2 Material und Methoden
2.1 Studienaufbau
Der für diese Studie durchgeführte Tierversuch wurde von der zuständigen Behörde, dem Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), unter der Tierversuchsnummer 05/933 genehmigt. Die notwendigen Operationen wurden unter Einhaltung der gesetzlichen Bestimmungen durchgeführt, insbesondere im Zusammenhang mit den lebenden Tieren nahmen nur berechtigte Personen Arbeiten vor. Im Rahmen der Studie wurde an 24 weiblichen Schwarzkopfschafen im Alter von vier Monaten eine Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes durchgeführt. Die Schafe waren in drei Versuchsgruppen mit jeweils acht Tieren eingeteilt und wurden sequentiell nach 6, 12 und 24 Wochen post operationem euthanisiert. Darüber hinaus gab es eine Vergleichsgruppe für den Zeitpunkt Null. Diese bestand lediglich aus den Hintergliedmaßen sechs weiterer Schafe. Im Laufe der postoperativen Phase starben zwei Tiere aus Gründen, die nicht mit der Operation zusammenhingen. Deshalb standen für die 6-Wochen-Gruppe ebenfalls nur sechs Untersuchungstiere zur Verfügung. Alle Eingriffe wurden durch denselben Operateur und mit derselben Operationstechnik durchgeführt. Die nicht operierte, kontralaterale linke Seite diente jeweils als Kontrollgruppe.
An den unmittelbar nach der Euthanasie eröffneten Kniegelenken der Tiere fand eine makroskopische Beurteilung der Knorpelstruktur statt. An einem osteochondralen Plug im Durchmesser von 10 mm wurden zusätzlich histologische, biomechanische, histomorphometrische und radiologische Untersuchungen durchgeführt.
2.2 Tierhaltung
2.2.1.1 Prä operationem
Die 24 weiblichen Schwarzkopfschafe stammten vom Niedersächsischen Schafverwertungsdienst. Sie wurden nach Erhalt der Genehmigung im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover eingestallt. Zuvor waren alle Tiere mit Albendazol (Valbazen, Pfizer, Karlsruhe, Deutschland) oder Moxidectin (Cydectin, Fort Dodge,
operationem zwischen 28,0 und 35,8 kg. 14 Tage vor Versuchsbeginn standen die Tiere in Vierergruppen zwecks Quarantäne und Eingewöhnung auf einer mit Stroh eingestreuten Box von 2,5 m x 3 m Größe.
Die tägliche Futterration betrug pro Tier ca. 1 kg Heu. Zusätzlich bekamen sie 100-200 g pelletiertes Mischfutter (Ergänzungsfuttermittel für Zuchtschafe [Hg 58 S], Raiffeisen).
Darüber hinaus stand den Schafen ein Mineralleckstein (Mineralleckmasse für Schafe, KAWO, Hildesheim, Deutschland) als Zusatzfutter zur Verfügung. Wasser wurde über Selbsttränken ad libitium angeboten. Schließlich wurde auf täglichen Kontakt mit Menschen, Betreuung und medizinische Überwachung geachtet.
Um die Nüchternheit des jeweiligen Tieres, das operiert werden sollte, zu gewährleisten, verbrachte es 24 Stunden vor seiner Operation in einer nicht eingestreuten Box mit freiem Wasserzugang.
2.2.1.2 Post operationem
Während der Aufwachphase und in der ersten Nacht post operationem verweilten die Schafe in einer Einzelbox mit den Maßen 1,2 m x 1,6 m. Dadurch konnte eine Bewegungseinschränkung im frisch operierten Zustand gewährleistet werden. Die Box war mit Stroh eingestreut und Wasser wurde ad libitium mittels Selbsttränken angeboten. Um der möglichen Gefahr einer Schlundverstopfung entgegenzuwirken, stand den Schafen Heu und Kraftfutter erst wieder ab dem ersten Tag post operationem zur Verfügung. Die Schafe konnten ihre operierte Gliedmaße sofort nach der Operation schmerzadaptiert belasten. In den ersten Tagen post operationem bestand dementsprechend eine vorübergehende Lahmheit, ein Limit bei der Belastbarkeit bestand jedoch zu keinem Zeitpunkt der Untersuchung. In den darauf folgenden sieben bis zehn Tagen waren die Schafe in einem 12 m² großem Stall untergebracht, der mit Stroh eingestreut war. Die Gruppengröße betrug nun zwei bis acht Tiere. Während dieser Phase wurden die Wunden der Tiere täglich kontrolliert und das Gangbild bewertet. Die Heuration betrug ca. 1 kg/Schaf/Tag.
Nach sieben bis zehn Tagen wurden die Schafe in eine Außenanlage verbracht. Diese bestand aus einem dreiseitig geschlossenen Offenstall (siehe Abb. 1). Dieser wiederum war auf einer Fläche von 3,5 m x 5 m mit Stroh eingestreut und überdacht. Darüber hinaus besaß der Stall einen betonierten Auslauf, der 10 m x 3,5 m groß war. In der Außenanlage konnten die Schafe tagsüber verweilen. Nachts waren sie im Stall untergebracht.
Während der zuletzt genannten Phase wurden die Futterrationen dem Bedarf der Tiere angepasst und das pelletierte Mischfutter mit Quetschfutter (Raiffeisen) im Verhältnis 1 : 4 gemischt. Die Rationen begannen bei ca. 300 g und wurden im Verlauf des Wachstums auf ca. 700 g pro Tier und Tag gesteigert. Die Heuration erhöhte sich bis zum Ende der 24- wöchigen Standzeit auf ca. 3 kg/Schaf/Tag.
Während der gesamten Standzeit wurde der Gesundheitszustand der Schafe täglich kontrolliert.
2.3 Operation
2.3.1 Prämedikation und Narkose
Die Narkose wurde mittels eines Bolus von 6 mg/kg Körpergewicht Propofol (Propofol Lipuro 1 %, B. Braun Melsungen AG, Deutschland) über eine Venenverweilkanüle (BD Adsyte Pro, 1,3 x 45 mm, Becton Dickinson SA, Madrid, Spanien) in der Vena cephalica antebrachii eingeleitet. Anschließend wurden die Tiere mittels eines Endotrachealtubus (Medos Medizintechnik GmbH, Stolberg, Deutschland) mit einem Innendurchmesser von 8 mm orotracheal intubiert. Auf die Augen wurde Dexpanthenol (Bepanthen Roche; Hoffmann- La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) appliziert. Die Prämedikation bestand zur Sedation aus 0,15 mg/kg Körpergewicht Midazolam intravenös (Midazolam-Curamed-
Abb. 1) Schafe im dreiseitig geschlossenem Offenstall
Wirkung bekamen die Tiere während dieser Vorbereitungsphase zusätzlich Propofol nachdosiert.
Nachdem die Schafe in den Operationssaal gebracht worden waren, wurden sie an ein halbgeschlossenes Narkosesystem (Fabius Beatmungsgerät, Dräger Medical Deutschland GmbH, Lübeck, Deutschland) angeschlossen. Mit Hilfe von intermittierender positiver Druckbeatmung wurden die Schafe zur Aufrechterhaltung der Normokapnie künstlich ventiliert. Zur Narkoseerhaltung wurde Isofluran (Forene, Abbott GmbH & Co. KG, Deutschland) mit Sauerstoff als Trägergas verwendet. Zur Überwachung fand während des Eingriffs neben der Messung der Kapnometrie auch die Messung des Blutdrucks mittels einer Blutdruckmanschette (small adult, Nr. 572472, Datex-Ohmeda GmbH, Freiburg, Deutschland) statt. Die Datensicherung nahm das Überwachungsgerät Cardiocap 3 (Datex- Ohmeda GmbH, Freiburg, Deutschland) automatisch vor.
Zur zusätzlichen Analgesie wurde je 5 min, bevor der Sehnensplitt entnommen und das Kniegelenk eröffnet wurde, 1-2 µg/kg Körpergewicht Fentanyl (Fentanyl-Janssen, Janssen- Cilag GmbH, Deutschland) über den venösen Zugang injiziert. Zusätzlich wurde bei Bedarf zur Narkosevertiefung 4-8 mg Midazolam gegeben.
Während der Operation wurde den Schafen 5-10 ml/kg/h Ringer-Laktat-Lösung durch den venösen Zugang verabreicht, der in der Aufwachphase nach der OP entfernt wurde.
Unmittelbar vor der Operation wurde den Tieren 5 mg/kg Procain-Benzylpenicillin (Langzeitpenicillin und Dihydrostreptomycin, aniMedica, Deutschland) i.m. verabreicht.
Zusätzlich zu dieser perioperativen Antibiose wurde die Gabe mit gleicher Dosierung am Tag zwei und vier post operationem subcutan wiederholt. Entsprechend der oben genannten Dosierung erhielten die Schafe Buprenorphin s.c. 6-8 Stunden nach der ersten Gabe am Tag der Operation und am ersten postoperativen Tag. Außerdem wurden 2 mg/kg Carprofen täglich bis zu drei Tage post OP s.c. injiziert, wobei die Applikation von Carprofen mit der bereits angegebenen Dosis je nach Allgemeinbefinden und Zustand des Gangbildes auch länger oder wiederholt durchgeführt wurde.
2.3.2 Operationstechnik: Ersatz des vorderen Kreuzbandes
Alle Operationen führte derselbe Chirurg in derselben Operationstechnik durch.
Zur Vorbereitung auf die Operation wurde das Operationsgebiet an der rechten hinteren Gliedmaße rasiert und gewaschen. Während der Operation wurde das Schaf in Rückenlage
gelagert und die drei nicht zu operierenden Gliedmaßen wurden fixiert. Nachdem das betroffene Bein abschließend mit Braunoderm (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) desinfiziert worden war, folgte eine sterile Abdeckung, um ein keimfreies Operationsfeld zu garantieren.
Das zur Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes benötigte autologe Transplantat wurde an der ipsilateralen Extremität entnommen. Hierfür wurde eine proximal des Tuber calcanei beginnende, 4 cm lange posterolaterale Inzision gesetzt. Zur Präparation der Sehne des Musculus gastrocnemius und der sich unmittelbar darunter befindlichen Sehne des Musculus flexor digitalis superficialis wurde die gemeinsame Sehnenscheide eröffnet. Es wurde ein 60 mm langer und im Querschnitt 2 mal 3 mm großer Split der Sehnen entnommen, wobei die Bursa calcanei geschont wurde. Zur Lagerung der präparierten Sehnen wurden in NaCl getränkte Kompressen verwendet. Anschließend wurde die Sehnenscheide mit einem 2-0 PDS-Faden vernäht, bevor ein fortlaufender subcutaner Wundverschluss mit einem 3-0 Vicryl Plus-Faden folgte. Die Adaption der Haut wurde in Form von Einzelknopfnähten mit einem 3-0 Monocryl-Faden durchgeführt und danach ein steriler Verband angelegt.
Für die Herstellung des im Querschnitt runden Transplantates mit einem Durchmesser von 4,5 mm wurden die beiden Sehnensplitts längs aneinander gelegt und an ihren Enden über eine Länge von je 20 mm mit einem Ethibond Excel Faden der Stärke 0 über sogenannte „baseball stitches“ vernäht. Die Präparation des Transplantates erfolgte auf einer dafür vorgesehenen Apparatur, dem Graft Master II (Acufex, Smith&Nephew, Norderstedt, Deutschland). Auf ihm wurde das vernähte Transplantat auch schließlich bis zum Einziehen mit einer definierten Kraft von 15 pounds eingespannt. Dieses Vorspannen diente der Konditionierung des Transplantats. Während dieser Phase wurde das Transplantat wieder in feuchte NaCl Kompressen gewickelt, um ein Austrocknen zu verhindern.
Die Arthrotomie erfolgte über einen anteromedialen Zugang. Sie begann 3 cm proximal des oberen Patellapols und endete in der Höhe der medialen Kante der Tuberositas tibiae. Es folgte die Präparation des Retinakulum mediale, welches ca. 5 mm medial von seinem Patellaansatz durchtrennt worden war. Somit war die Möglichkeit zur späteren Refixierung gegeben. Blutungen wurden mit Hilfe einer bipolaren Pinzette gestillt. Im nächsten Schritt wurde die Gelenkkapsel eröffnet, der Hoffa Fettkörper partiell reseziert und im Anschluss die
Aimer“, Smith&Nephew, Norderstedt, Deutschland) verwendet. Es wurde auf einer bis auf das Periost freipräparierten Stelle 1,5 cm medial und 2 cm distal der Tuberositas tibiae und in einem Winkel von 45° angesetzt, wobei die Spitze des Zielgerätes im Ansatzbereich des anteromedialen Bündels des vorderen Kreuzbandes auf der Tibia positionert wurde. In einem ersten Schritt wurde die Bohrung mit einem Bohrdraht der Stärke 2,4 mm durchgeführt.
Danach wurde der Bohrkanal mit dem 4,5 mm starken Endobutton-Bohrer erweitert. Durch die Bohrung wurde die tibiale Epiphysenfuge perforiert und die Apophyse der Tuberositas tibiae geschont. Der femorale Bohrkanal wurde in einer transtibialen Technik angelegt. Die Bohrung erfolgte vom Ursprungsbereich des vorderen Kreuzbandes in Richtung laterale Femurcorticalis.
Die Länge der Tunnel sowie auch die intraartikuläre Länge wurden mittels einer Messlehre bestimmt. Die Gesamtlänge lag dabei in einem Bereich von 65-80 mm. Nun konnte das Transplantat mit einem Endobutton (Smith&Nephew, Norderstedt, Deutschland) derart verknüpft werden, dass jeweils proximal und distal 15-20 mm des Sehnengewebes sicher im Knochentunnel zu liegen kamen. Die Fadenlänge zwischen Transplantat und Endobutton betrug somit etwa 10 mm bei einer femoralen Tunnelänge von 30 mm. Dabei wurde der Knoten der Fadenschlinge transplantatnah gelegt. Ein Ethibond Excel-Faden der Stärke 5 wurde als Zugfaden und ein Ethibon Excel-Faden der Stärke 2 als sogenannter Flipfaden in den Endobutton eingezogen.
Zum Einziehen und Fixieren des Transplantats wurde der Bohrdraht mit der Öse retrograd durch die beiden Bohrkanäle geführt und am lateralen distalen Oberschenkel ausgeleitet. Das Ende des Bohrdrahtes wurde zuvor mit einer Fadenschlinge armiert. Mit Hilfe dieser Fadenschlinge wurde der Zug-, wie auch der Flipfaden, durch vollständiges Durchziehen des Bohrdrahtes durch die Bohrkanäle gezogen, um am distalen Oberschenkel lateral aus der Haut auszutreten. Um die korrekte Position des Transplantats zu erreichen, wurde es nun mittels des Zugfadens so weit eingezogen, bis der Endobutton die laterale Kortikalis des Femurs sicher überschritten hatte. Stabilisiert wurde diese Position durch das Querstellen des Endobuttons. Dies wurde durch Ziehen an den Flipfaden erreicht. Das Transplantat wurde nun durch 20 Extensions-/Flexionsbewegungen konditioniert. Schließlich wurde es mit einer Kraft von 20 Newton vorgespannt und über seine Fäden an der tibialen Kortikalis mit dem Suture Washer (Smith&Nephew, Norderstedt, Deutschland) fixiert. Abschließend erfolgte ein
Patellahalteband mit einem 3-0 Vicryl Plus-Faden vernäht. Daraufhin folgte die Adaption der Muskulatur in Einzelnähten mit einem 2-0 Mersilene-Faden. Die Oberschenkelfaszie wurde fortlaufend mit einem 2-0 PDS-Faden und die Unterhaut mit einem 3-0 Vicryl Plus-Faden vernäht. Die Cutis wurde wiederum mittels einer Einzelknopfnaht mit einem resorbierbaren 3-0 Monocryl-Fadens adaptiert (vergleiche Abb. 2). Abschließend wurde ein transparenter Sprühverband angelegt.
A B
C D E
F G
Abb. 2) Arbeitsschritte der Operation:
A: Aufsicht auf das geöffnete Gebiet der Transplantatentnahme. B: Demonstration des Transplantats. C-E: Darstellung des Bohrkanals, des Verlaufes und der Fixierung des eingezogenen Transplantats. F/G: Naht.
2.4 Euthanasie
Am Ende der jeweiligen Beobachtungszeit wurden die Tiere mittels einer i.v. Injektion von 6 mg/kg Körpergewicht Propofol und 50-60 mg/kg Pentobarbital (Eutha 77; Essex Pharma GmbH, München, Deutschland) euthanasiert.
2.5 Probenentnahme
Die Entnahme der Proben für die verschiedenen Untersuchungen erfolgte nach der Euthanasie. Nach Durchführung einer Mini-Arthrotomie wurde mit einer Stanze (OATS Osteochondral Autograft Transfer System, Arthrex, München, Deutschland) ein osteochondraler Plug aus der Hauptbelastungszone der medialen Femurcondylen beider Seiten entnommen (siehe Abb. 3). Dieser Plug hatte einen Durchmesser von 10 mm und beinhaltete neben der Knorpeloberfläche zusätzlich 10 mm subchondralen Knochen. Der osteochondrale Plug wurde nach der Entnahme umgehend in mit Ringer Lösung (MACO Pharma, Langen, Deutschland) getränkte Gazekompressen gewickelt und in einem Plastikbecher mit Schraubverschluss bei –70°C tiefgefroren.
A B
Abb. 3) Darstellung der Plug-Entnahme (A/B)
2.6 Nomenklatur
Die 24 Tiere wurden zu Beginn der Studie in drei Gruppen mit jeweils acht Tieren (bzw. mit sechs Tieren in der 6-Wochen-Gruppe) eingeteilt. Je nach Zugehörigkeit zu einer Gruppe stand an erster Stelle der Nomenklatur der Schafe die Zahl 6, 12 oder 24. Außerdem erhielt jedes Tier innerhalb seiner Gruppe eine weitere Kennzahl von 1-8 (bzw. 1-6 in der 6-Wochen- Gruppe). Die sechs Tiere aus der Gruppe „Zeitpunkt Null“ wurden ebenfalls innerhalb ihrer Gruppe von 1-6 durchnummeriert. Die dritte Nomenklaturstelle kennzeichnete die Zugehörigkeit der Probe zu einer intakten oder operierten Gliedmaße. Dabei stand ein „i“ für die Zugehörigkeit zur intakten und ein „o“ für die Zugehörigkeit für die operierte Seite. Die Extremitäten der 0-Wochen-Gruppe stellten für die makroskopischen und biomechanischen Untersuchungen ebenso wie für die Messungen der Knochendichte einen einheitlichen Ausgangswert für beide Seiten dar.
Makroskopie Histologie Biomechanik Histomorphometrie Knochendichte
0/1 0/1 0/1
0/2 0/2 0/2
0/3 0/3 0/3
0/4 0/4 0/4
0/5 0/5 0/5
0/6 0/6 0/6
6/1/i und o 6/1/i und o 6/1/i und o 6/1/i und o 6/1/i und o 6/2/i und o 6/2/i und o 6/2/i und o 6/2/i und o 6/2/i und o 6/3/i und o 6/3/i und o 6/3/i und o 6/3/i und o 6/3/i und o 6/4/i und o 6/4/i und o 6/4/i und o 6/4/i und o 6/4/i und o 6/5/i und o 6/5/i und o 6/5/i und o 6/5/i und o 6/5/i und o 6/6/i und o 6/6/i und o 6/6/i und o 6/6/i und o 6/6/i und o 12/1/i und o 12/1/i und o 12/1/i und o 12/1/i und o 12/1/i und o 12/2/i und o 12/2/i und o 12/2/i und o 12/2/i und o 12/2/i und o 12/3/i und o 12/3/i und o 12/3/i und o 12/3/i und o 12/3/i und o 12/4/i und o 12/4/i und o 12/4/i und o 12/4/i und o 12/4/i und o 12/5/i und o 12/5/i und o 12/5/i und o 12/5/i und o 12/5/i und o 12/6/i und o 12/6/i und o 12/6/i und o 12/6/i und o 12/6/i und o 12/7/i und o 12/7/i und o 12/7/i und o 12/7/i und o 12/7/i und o 12/8/i und o 12/8/i und o 12/8/i und o 12/8/i und o 12/8/i und o 24/1/i und o 24/1/i und o 24/1/i und o 24/1/i und o 24/1/i und o 24/2/i und o 24/2/i und o 24/2/i und o 24/2/i und o 24/2/i und o 24/3/i und o 24/3/i und o 24/3/i und o 24/3/i und o 24/3/i und o 24/4/i und o 24/4/i und o 24/4/i und o 24/4/i und o 24/4/i und o 24/5/i und o 24/5/i und o 24/5/i und o 24/5/i und o 24/5/i und o 24/6/i und o 24/6/i und o 24/6/i und o 24/6/i und o 24/6/i und o 24/7/i und o 24/7/i und o 24/7/i und o 24/7/i und o 24/7/i und o 24/8/i und o 24/8/i und o 24/8/i und o 24/8/i und o 24/8/i und o
Tab. 1) Probenkennzeichnung
2.7.1 Makroskopische Beurteilung
Im Rahmen dieser Studie wurden die untersuchten Knorpel makroskopisch mit Hilfe des Scores der International Cartilage Repair society (ICRS) (81) durch drei voneinander unabhängige Untersucher beurteilt. Der Score wurde bereits im Rahmen einer früheren Studie auf eine Schafstudie übertragen (57). Er entstammt aus dem ICRS Cartilage Injury Evaluation Package, das fünf verschiedene Schweregrade von Knorpelschäden voneinander abgrenzt. Die Zugehörigkeit zu den unterschiedlichen Graden war abhängig von der Tiefe des Knorpelschadens, wobei eine normale Knorpelbeschaffenheit mit Grad 0 und eine rein oberflächliche Läsion mit Grad 1 beurteilt wurde. Tiefergehende Verletzungen wurden mit Grad 2 (Verletzungstiefe unterhalb der Hälfte der Knorpeltiefe), Grad 3 (Läsionen über 50%
der Knorpeltiefe, jedoch nicht bis zum subchondralen Knochen reichend) oder aber Grad 4, bei welchem die Knorpelbeschaffenheit schwer vom physiologisch gesunden Zustand abwich, beurteilt (vergleiche Abb. 5). Makroskopisch wurde jeweils das gesamte geöffnete Kniegelenk inklusive der Patella begutachtet. Vorhandene Schäden wurden gemäß der Abb. 4 eingeteilt. Die Untersucher beurteilten jedes Präparat einmal und der Durchschnittswert für die Bewertung jeder einzelnen Probe wurde als Wert für das jeweilige Präparat ermittelt.
Abb. 4) Lokalisation der beurteilten Knorpelflächen
ICRS Grade 0 – Normal ICRS Grade 1 –Nearly Normal Superficial lesions. Soft indentation (A)
And/or superficial fissures and cracks (B)
ICRS Grade 2 – Abnormal Lesions extending down to <50%
of
cartilage depth
A B
ICRS Grade 3 – Severely Abnormal
Cartilage defects extending down >50% of cartilage depth (A) as well as down to calcified layer (B) and down to
but not through the subchondral bone (C). Blisters are included in this Grade (D)
A B C D
ICRS Grade 4 – Severely Abnormal
Abb. 5) Einteilung der Knorpelschäden gemäß der ICRS-Einteilung
2.7.2.1 Aufbau der Testapparatur
Die Bestimmung der biomechanischen Eigenschaften des Knorpels erfolgte mit einer Messapparatur, die von den Zentralen Forschungswerkstätten der Medizinischen Hochschule Hannover für die Versuche gebaut worden ist (siehe Abb. 6 und Abb. 7). Der Aufbau des Geräts lehnte sich an bereits von Mow et al. 1989 und Athesian et al. 1997 beschriebene Indentatoren an (82;83). Der Indentor bestand aus zwei Einheiten. Auf der einen Seite war die Apparatur in der Lage, die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels mittels einer Kompressionsmessung zu bestimmen. Auf der anderen Seite bestand die Möglichkeit der Dickenmessung des Knorpels.
Das Basiselement des Indentors war ein Kraftaufnehmer, in dem ein Messverstärker integriert war. Die Knorpelknochenprobe wurde in einem mit NaCl gefüllten Kunststoffbehälter auf einer Kunststoffplatte auf dem Kraftaufnehmer mittels Feststellschrauben positioniert. Dieser Kraftaufnehmer konnte die Kraft, die von einem Messstempel auf die Probe ausgeübt wurde, über einen Biegebalken mit aufgeklebten Dehnmessstreifen erfassen. Damit die Oberfläche der Probe, die unmittelbar auf dem Kraftaufnehmer positioniert worden war, horizontal ausgerichtet werden konnte, war der Kraftaufnehmer auf einem Kipptisch befestigt worden.
Dieser Kipptisch war so konstruiert, dass er zwar um 90° gedreht werden konnte, zugleich war er aber auch auf einem XY-Verstelltisch befestigt. Auf diese Weise konnte eine optimale Positionierung der Proben sichergestellt werden.
Um die Temperatur des Probenmilieus konstant bei 37°C zu halten, fanden bei den Kompressionsmessungen eine Heizspirale und ein Temperaturfühler Verwendung. Diese konnten manuell positioniert werden. Oberhalb des Indentorstempels gab es eine Vorrichtung für eine Messplatte, die den zurückgelegten Weg des Messstempels aufzeichnete. Der Indentorstempel wurde mittels Druckluft innerhalb eines Zylinders reibungsfrei in Position gehalten. Er endete oberhalb der Probe in einer soliden, planen Spitze mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Während der Messungen lag der Indentorstempel mit seinem Gewicht von 10,4 g auf der Probe auf.
Die Einheit Kraftaufnehmer, Kipptisch und Verstelltisch war auf einer Schlittenplatte montiert, mit deren Hilfe die Proben in die einzelnen Messpositionen gebracht werden konnten. Die Messpositionen waren diejenige für die Kompressionsmessung und diejenige für die Dickenmessung. Durch einen genau festgelegten Verschiebeweg wurde gesichert, dass die
beiden Messungen an exakt derselben Stelle vorgenommen wurden. Fixiert wurden die beiden Positionen der Kraftaufnehmer-Kipptisch-Verstelltisch-Einheit durch Arretierbolzen.
Den gleichmäßigen Vorschub einer Kanülenspitze in die Probe im Rahmen der Dickenmessung gewährleistete ein Motor. Oberhalb des Motors war die gleiche Vorrichtung für einen Wegsensor vorhanden, wie bei der Einheit für den Kompressionstest. Dieser Wegsensor konnte, je nach Bedarf, an die Einheit des Kompressionstests oder der Dickenmessung angebracht werden.
An jedem Knorpelknochenplug wurde zunächst die Kompressionsmessung durchgeführt.
Nach einer Regenerationsphase von 20 min folgte die Dickenmessung an exakt derselben Stelle des Knorpels.
Abb. 6) Schematische Darstellung der Messeinheit für die Kompressionsmessung (Mit freundlicher Genehmigung von J. Reifenrath, LBB, Hannover).
Abb. 7) Schematische Darstellung der Messeinheit für die Dickenmessung (Mit freundlicher Genehmigung von J. Reifenrath, LBB, Hannover).
Das Prinzip der Indentationsmessung beruht darauf, dass der Knorpel durch einen Stempel mit einem definierten Gewicht komprimiert wird. Dadurch findet eine Wegveränderung des Messstempels statt, die durch einen axial oberhalb des Stempels eingebauten, berührungslosen Wegsensor erfasst wird.
Die Knorpelknochenproben wurden unmittelbar nach der Entnahme in mit Ringer Lösung (MACO Pharma, Langen) getränkte Gazekompressen gewickelt und bei –70°C in einem Schraubdeckelbehälter aus Plastik eingefroren. 12 Stunden vor der Testung wurden die Proben langsam bei Zimmertemperatur aufgetaut.
Für die Testdauer wurden die Proben mittig in ein Plastikschälchen mit Epoxy-Kleber (Zwei- Komponenten Kleber, Conrad Electronics, Hannover) befestigt. Dabei wurde besonderer Wert auf die horizontale Lage der Oberfläche der Knorpelknochenproben gelegt.
Anschließend wurde das Plastikschälchen mit 0,9 % iger NaCl-Lösung aufgefüllt, mittels der Feststellschrauben eingespannt und durch die Heizspirale auf 37°C angewärmt. Die exakte Testposition wurde mittels der Kraftaufnehmer-Kipptisch-Verstelltisch-Einheit eruiert. Dafür wurde zu Beginn ein Nullabgleich der Kraft durchgeführt, dem sodann das Absenken des Stempels bis zu einem geringfügigen Ausschlag des Kraftsensors folgte. Dies war die Position, in welcher der Stempel die Knorpeloberflächen minimal berührte. Damit auch ein senkrechter Sitz des Stempels auf den Knorpeloberflächen gewährleistet war, wurde der Tisch um 90° gedreht und der Ausschlag des Kraftsensors erneut beobachtet. Änderte sich die Kraft deutlich, so wurde die Probenausrichtung korrigiert. Ziel war, die Knorpelknochenproben so zu positionieren, dass nur minimale Kraftunterschiede in den verschiedenen Positionen auftraten. Am Anfang der Kompressionsversuche wurde der Weg auf den Punkt Null gesetzt bevor die eigentlichen Messungen initiiert wurden. Die Testdauer betrug jeweils sechs Stunden. Die Dauer der einzelnen Tests war durch Vorversuche im Rahmen einer Pilotstudie bestimmt worden. Nach sechs Stunden Testdauer war das Equilibrium bei allen Knorpelknochenproben erreicht und damit auch der Punkt der maximalen Deformation des Knorpels bestimmt (vergleiche Diagramm 1). Um das Austrocknen der Knorpeloberflächen zu verhindern, wurde während der Versuchsdauer stündlich 0,9 %ige NaCl-Lösung in das Plastikschälchen nachgefüllt.
2.7.2.3 Dickenmessung
Der Dickenmessung eines Knorpels liegt das Prinzip zugrunde, dass das Eindringen einer Metallnadel in einen Knorpel einerseits und anschließend in die subchondrale Knochenplatte andererseits zu einer Änderung des zu beobachtenden Widerstandes führt (64).
Als Metallnadel wurde eine auswechselbare Kanülenspitze (Sterican® 0,40 x 12 mm, Braun, Melsungen, Deutschland) verwendet. Diese wurde im Rahmen der Messungen mit einer gleichbleibenden Geschwindigkeit in die Proben vorgeschoben, bis eine maximale Kraft von 1,2 Newton erreicht war. Mit der Änderung des Widerstandes, der der Nadel entgegenwirkte, änderte sich auch die Kraftaufbringung auf den Kraftaufnehmer. Mit Hilfe eines Computers wurde die Kraft in Abhängigkeit vom zurückgelegten Weg ermittelt. Um die absolute Knorpeldicke bestimmen zu können, wurde aus den gewonnenen Daten ein Kraft/Weg- Diagramm erstellt und hieraus die Knorpeldicke abgelesen. Dies war möglich, da es bei einem gleichmäßigen Vorschub der Nadel zu zwei deutlichen Kraftänderungen kam. Sowohl beim Auftreffen der Nadel auf die Knorpeloberfläche als auch beim Auftreffen der Nadel auf Diagramm 1) Darstellung einer Beispielkurve der Indentationsmessung
2.7.2.4 Auswertung der biomechanischen Testungen
Mit Hilfe der Werte der Indentationsmessung und der Dickenmessung war eine biomechanische Beurteilung des Knorpels durch eine Berechnung von Elastizitätsmodulen möglich (84). Dafür flossen die ermittelten Werte in die Formel
(Formel 1)
nach Räsänen u. Messner (85), so dass der Elastizitätsmodul (Young-Modul) berechnet werden konnte. P entsprach dabei der Kraft [N], die während der Versuchsdauer des Kompressionsversuches auf den Knorpel eingewirkt hatte. V stand für die Poisson`s ratio.
Hierbei handelt es sich um eine Materialkonstante, die auch als Querdehnungszahl bezeichnet wird und für die im Rahmen dieser Auswertung der Wert 0,45 verwendet wurde (85;86). A stand für den Indentorradius in [mm] und betrug 0,5 mm. ω stellte die jeweilige Deformation des Knorpels in [mm] dar, die mittels der Kompressionsmessung ermittelt worden war.
Hierfür wurde aus der durch den Kompressionsversuch ermittelten Kurve das Equilibrium abgelesen und als Wert für die maximale Deformation eingesetzt. κ stellte einen Faktor dar, der von der Höhe des Knorpels und dem Radius des Indentors abhängig war. Er wurde aus Diagramm 2) Darstellung einer Beispielkurve der Dickenmessung
der Tabelle von Hayes et al. entnommen und besaß im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen einen Wert von 1,252 (84).
2.7.3 Histologische Untersuchungen
Für die histologischen Untersuchungen wurden von den bei Raumtemperatur für die Dauer von fünf Tagen in neutral gepuffertem 3,5 %haltigen Formaldehyd fixierten und anschließend in Technovit 9100 eingebetteten halbierten Knorpelknochenplugs Kunststoffschnitte mit einem Hartschnittmikrotom angefertigt.
2.7.3.1 Einbettung und Probenanfertigung der histologischen Schnitte
Die zuvor halbierten, in neutral gepuffertem 3,5 %igem Formaldehyd fixierten Knorpelknochenplugs der medialen Femurkondylen wurden mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 96 %, Iso-Alkohol) innerhalb von 8 Tagen dehydriert. Zur Erlangung der jeweilig benötigten Konzentrationen wurde 2-Propanol (Fa. Roth) mit destilliertem Wasser verdünnt. Zum Abschluss der Dehydrierung wurden die Proben in Xylol (Fa. Roth) überführt.
Das für die nun folgende Einbettung verwendete Polymerisationssystem (Technovit 9100 Neu) war ein auf der Basis von Methylmethacrylat aufgebautes, speziell zur Einbettung von mineralisierten Geweben in der Lichtmikroskopie geeignetes System. Dem Einbettungsschema für Technovit 9100 Neu der Fa. Heraeus Kulzer folgend, lagen die Proben nach der Dehydrierung 3 Tage bei 4°C in der Präinfiltrationslösung und anschließend bei gleicher Temperatur 7 Tage in der Infiltrationslösung. Nach jedem Umsetzen der Proben, mindestens einmal täglich, wurde von den Proben mit einem Exsikkator (Duran, Fa. Omnilab) ein Vakuum gezogen. Die Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen lassen sich aus der Tabelle 2 entnehmen.
Lösung Reagenzien
Präinfiltration 200 ml Technovit 9100 Neu Basislösung (entstabilisiert) + 1 g Härter 1 Infiltration 250 ml Technovit 9100 Neu Basislösung (entstabilisiert) + 20 g PMMA
Pulver + 1 g Härter 1
Stammlösung A 80 g PMMA Pulver + 3 g Härter 1 ad 500 ml entstabilisierte Basislösung Stammlösung B 4 ml Härter 2 + 2 ml Polymerisationsregler ad 50 ml entstabilisierte
Anschluss mit einem Hartschnittmikrotom (RM 2155, Fa. Leica) geschnitten. Während des Schneidens der Schnitte mit einer Dicke von 5 μm wurde der Block mit 30 %igem Ethanol (Fa. J.T. Baker) befeuchtet. Um ein späteres Abschwimmen der Schnitte von den Objektträgern (SuperFrost, Fa. Menzel GmbH+CoKG) bei weiteren Schritten zu vermeiden, wurden sie auf zuvor mit Ponal beschichtete Objektträger aufgezogen. Für die Ponal/Poly-L- Lysine-Beschichtung wurde 3 g Ponal Express (Fa. Henkel) in 150 ml vollentsalztem Wasser gelöst. 7,5 ml Poly-L-Lysine Stammlösung (Fa. Sigma) wurde mit 75 ml Aqua dest. verdünnt und im Verhältnis 1 : 2 zu der Ponal-Lösung gegeben. Die sauberen Objektträger lagerten 10 min in der Lösung ein. Anschließend trockneten sie 24 Stunden bei 37°C. Die Schnitte wurden nach dem Aufziehen auf den Objektträgern mit 96 %igem Ethanol (Fa. J.T.Baker) gestreckt, mit Kisolfolie (Fa. Kettenbach) abgedeckt, und zum Trocknen in einer Objektträgerpresse (Fa. Heraeus Kulzer) für 2 Tage bei 37°C gelagert.
Damit das mit Technovit 9100 Neu eingebettete Gewebe mit den unterschiedlichen Färbungen bearbeitet werden konnte, mussten die Schnitte vor den Färbedurchgängen entplastet werden. Dafür wurden die Schnitte ohne Kisolfolie für 2 x 20 min in Xylol und danach für 1 x 20 Minuten in Methoxyethylacetat getaucht.
2.7.3.2 Safranin-O-Färbung
Die Safranin-O-Färbung ist eine Übersichtsfärbung, durch die eine semiquantitative Aussage über den Glycosaminoglycangehalt des Knorpels gemacht werden kann. Safranin-O ist ein basischer Azofarbstoff, der unterschiedliche Strukturen kontrastreich rot anfärbt. Knorpel wird pink-orange und Knochen rot dargestellt. Die Intensität der Anfärbbarkeit der Strukturen ist proportional zu dem Glycosaminoglycangehalt (87) und lässt auf diesem Wege eine Auswertung zu.
Um eine vergleichende Aussage über den Glycosaminoglycangehalt der einzelnen Schnitte machen zu können, wurden sämtliche Schnitte in einem Färbedurchgang bearbeitet. Pro Knorpelknochenprobe wurde ein Schnitt bearbeitet und somit eine Ebene ausgewertet. Die zuvor entplasteten Schnitte wurden mittels einer absteigenden Alkoholreihe (2 x Iso-Alkohol, 96 %, 70 %, Aqua dest. für je 2 min) rehydriert. Danach folgte eine Färbung mit 0,1 %igem Safranin-O für die Dauer von 4 min. Anschließend wurden die Schnitte 2 Minuten lang mit destilliertem Wasser gespült und per aufsteigender Alkoholreihe (70 %, 96 %, 2 x Iso-
Alkohol) wieder dehydriert. Schließlich wurden die Schnitte mit Eukitt-Eindeckmedium (Fa.
Labonord) eingedeckelt (siehe Tab. 3).
Durchführung Inkubationszeit Reagenzien Rehydrieren Je 2 min 2 x Iso-Alkohol, 96 %, 70 %, Aqua
dest.
Färbung 4 min Safranin-O (Mikroskopische Kontrolle)
Spülen 2 min VE Wasser
Dehydrieren Je 2 min 70 %, 96 %, 2 x Iso-Alkohol
Eindecken Eukitt
Tab. 3) Färbeprotokoll Safranin-O-Färbung
2.7.3.3 Von-Kossa-Färbung
Die Von-Kossa-Färbung dient zur Untersuchung von Knochengewebe, wobei Kalzium in den Karbonaten und Phosphaten gegen Silberionen ausgetauscht wird, die anschließend z.B.
durch Tageslicht zu metallischem Silber reduziert werden. Kalzium färbt sich in dieser Färbung braun-schwarz an und Zellkerne stellen sich rot dar. Pro Knorpelknochenprobe wurden nun drei Ebenen untersucht, wobei die Abstände der Schnitte jeweils mindestens 100 μm betrugen. Die zuvor entplasteten Schnitte wurden bei dieser Färbung wie bereits bei der Safranin-O-Färbung beschrieben mittels einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Um den Ionenaustausch zu gewährleisten, wurden die Schnitte 30 Minuten lang in einer 5 %igen Silbernitratlösung (Fa. Merck) eingelagert, wobei sie dem starken Lichteinfall einer Lampe ausgesetzt waren. Nach Ablauf der vorgesehenen Zeit folgte eine mikroskopische Kontrolle.
Zudem wurden die Objektträger dreimal in VE-Wasser gespült. Danach wurde die Färbung mit 1 %igen Pyrogallol (Fa. Merck) durchgeführt Nach der anschließenden erneuten mikroskopischen Kontrolle wurden die Schnitte ein weiteres Mal in drei Durchgängen mit VE-Wasser gespült. Zur Fixierung wurden die Schnitte nun mit 5 %igen Na-Thiosulfat (Fa.
Merck) 5 min lang gefärbt. Um eine möglichst geringe Hintergrundfärbung zu erreichen, wurden die Schnitte im Folgenden mit Leitungswasser gespült, wobei binnen 5 min das Wasser 3 x gewechselt wurde. Abschließend folgten wiederum drei Spüldurchgänge mit VE- Wasser, dann wurden die Objektträger bei Raumtemperatur mit dem Eindeckmedium
Durchführung Inkubationseit Reagenzien Rehydrieren Je 2 min 2 x Iso-Alkohol, 96 %, 70 %, Aqua
dest.
Färbung 1 x 30 min 5 % Silbernitrat (Mikroskopische Kontrolle bei starker Beleuchtung) Spülen 3 x wechseln VE Wasser
Färbung 1 min 1 % Propanol Spülen 3 x wechseln VE Wasser
Färbung 5 min Na-Thiosulfat
(Mikroskopische Kontrolle) Spülen 3 x wechseln/5 min H2O
Spülen 3 x wechseln VE Wasser
Eindecken Aquatex
Tab. 4) Färbeprotokoll Von-Kossa-Färbung
Geräte und Verbrauchsmaterialien Herkunft
Exsikkator Duran, Fa. Omnilab GmbH & Co. KG, Bremen Rüttler Typ 3005, Gesellschaft für Labortechnik mbH,
Burgwedel
Einbettförmchen Fa. Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG, Wehrheim Hartschnittmikrotom Leica RM 2155, Leica Instruments GmbH, Nussloch Mikrotommesser Leica Instruments GmbH, Nussloch
Deckgläschen Menzel GmbH & Co KG, Braunschweig Kisol-Folie Kettenbach GmbH & Co. KG, Eschenburg Objektträger SuperFrost® Menzel GmbH + Co KG, Braunschweig
Objektträgerpresse Fa. Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG, Wehrheim Trockenschrank Typ T5042 E, Fa. Heraus
Tab. 5) Verwendete Geräte und Verbrauchsmaterialien
Chemikalien Herkunft Safranin O Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Xylol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe (2Methoxyethyl)-acetat Fa. Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn 2-Propanol ≥ 99,5% Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Silbernitratlösung Fa. Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn Pyrogallol Fa. Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn Natriumthiosulfat Fa. Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Ponal Express Fa. Henke KGaA, Düsseldorfl
Technovit® 9100 NEW Fa. Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG, Wehrheim Eukitt O. Kindler GmbH & Co, Freiburg
Aquatex Fa. Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn
Tab. 6) Verwendete Chemikalien
2.7.3.4 Digitalisierung der histologischen Schnitte Safranin-O:
Die Schnitte wurden mit Hilfe eines Mikroskops (Axioskop 40, Fa. Zeiss) in der 10er Vergrößerung unter Verwendung einer Farbkamera (Axio Cam MRc, Fa. Zeiss) fotografiert.
Die Digitalisierung der Bilder fand mit einer speziellen Software (Axiovision 4.5, Fa. Zeiss) statt.
Von-Kossa-Färbung:
Die Schnitte wurden an einem Mosaiktischmikroskop (Imager.Z1, Fa. Zeiss) in der 5er Vergrößerung mittels einer Farbkamera (Axio Cam MRc, Fa. Zeiss) fotografiert. Die Bilder wurden ebenfalls mit der vorbezeichneten Software (Axiovision 4.5, Fa. Zeiss) gespeichert.
2.7.3.5 Histologische Auswertung (Mankin-Score)
Die Auswertung der mit Safranin-O gefärbten Präparate erfolgte mit Hilfe des Mankin-Scores (88). Dieser Score dient der histologischen und histochemischen Bewertung von Knorpeldegenerationen. Er beinhaltet die Bewertung der Knorpelstruktur und der Knorpelzellen. Außerdem findet durch ihn eine Auswertung der Safranin-O-Anfärbung und
einfach verblindet durch. Dafür stand jedem Untersucher eine Aufstellung repräsentativer Bilder für die einzelnen Kategorien des Mankin-Scores zur Verfügung. Eine detaillierte Darstellung der Untersuchungskriterien ergibt sich aus der Tabelle 7.
Mankin’s histological and histochemical grading system for evaluation of articular cartilage degeneration
Category Grade Category Grade I. Structure III. Safranin-O staining
Normal
Surface irregularity
Pannus and surface irregularity Clefts to transitional zone Clefts to radial zone Clefts to calcified zone Complete disorganization
0 1 2 3 4 5 6
Normal Slight reduction Moderate reduction Severe reduction No dye noted
0 1 2 3 4
II. Cells IV. Tidemark integrity Normal
Diffuse hypercellularity Cloning
Hypocelluarity
0 1 2 3
Intact
Crossed by blood vessels
0 1
Tab. 7) Untersuchungskriterien des Mankin-Scores (88)
Die vergebenen Werte für einzeln untersuchte Kategorien wurden am Ende der Auswertung zusammengerechnet. In Anlehnung an das von Mankin entwickelte Auswertungsschema konnten maximal 14 Punkte erreicht werden. Je mehr Punkte einem Knorpel zugeordnet worden waren, desto schwerer wurden die degenerativen Veränderungen des Knorpels eingeschätzt. Eine Enteilung der Degeneration des Knorpels erfolgte in drei Klassen (51) (siehe Tab. 8).
Stage I 0-6 points mild degeneration Stage II 7-9 points moderate degeneration Stage III 10-14 points severe degeneration, cartilage
disorganisation
Tab. 8) Klasseneinteilung des Degenerationsstatus (88)
2.7.3.6 Histomorphometrische Auswertung der BV/TV
Die histomorphometrische Auswertung der Von-Kossa gefärbten Präparate beinhaltete die
AxioVision Rel. 4,5 Software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Germany). Um die subchondrale Fläche unterhalb des Knorpels zu analysieren, wurde mittels der Freihandfunktion ein bestimmter Bereich markiert. Dieser Messbereich lag unmittelbar unterhalb der Tidemark des Knorpels und wurde über die gesamte Schnittbreite ausgeweitet.
Die Tiefe des auszuwertenden Areals betrug 600 µm und wurde automatisch von der Software mit einer parallel gezeichneten Kurve festgelegt (vergleiche Abb. 8). In Anlehnung an die American Society of Bone and Mineral Research wurde die Trabecular Bone Volume mit ihrem Anteil an der gesamten spongiösen Fläche berechnet (89). Von jeweils drei Schnitten, die zueinander einen Abstand von ca. 100 µm aufwiesen, wurde mit Hilfe der Computersoftware einerseits die „Trabecular Bone Area“ (B.Ar in mm²) und andererseits die
„Total Cancellous Tissue Area“ (T.Ar in mm²) berechnet. Mittels der Formel nach Parfitt (89),
(Formel 2),
wurde die Trabecular Bone Volume der drei Schnitte berechnet. Die Ergebnisse wurden sodann addiert. Der Durchschnittswert ergab den dreidimensionalen Wert.
Abb. 8) Beispielbild einer markierten Fläche, deren Trabecular Bone Area“ und die „Total Cancellous Tissue
Degenerative Veränderungen gehen mit einer reaktiven Vermehrung und Mineralisation des subchondralen Knochens einher. Um eventuelle subchondrale Sklerosierungen oder andere Veränderungen in diesem Bereich zu erkennen, wurde daher die subchondrale Knochendichte gemessen. Dieses Vorgehen war bereits von Hwa et al. an einem Schafmodell angewendet worden (68).
Die Bone Mineral Density der Hauptbelastungszone der medialen Femurkondyle wurde mittels eines Hologic QDR Discovery A 4500 X-ray Knochen-Densitometers (Fa. Hologic, USA) gemessen (siehe Abb. 9). Mit Hilfe der „Small-Animal-Einstellung“ der zugehörigen Software „QDR for Windows“ (Fa. Hologic, USA) wurden die Scans anschließend ausgewertet.
Um die Kalibrierung gemäß den Angaben des Herstellers zu erfüllen, wurde vor den einzelnen Messdurchgängen ein humanes lumbales Wirbelsäulenphantom (Model DPA/QDR- 1 Anthropomorphic Spine Phantom, Fa. Hologic) als Standardmodell benutzt. Damit konnte sichergestellt werden, dass die Korrelationsvarianz und das Konfidenzintervall für das Gerät innerhalb der Normwerte lag.
A B
Abb. 9) Abbildung des Hologic QDR Discovery A 4500 X-ray-Knochen-Densitometers (Fa. Hologic, USA) (A) mit Darstellung der Untersuchungsdurchführung (B).
