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Untersuchungen zum Prozess der Ligamentisation und der Sehnendefektheilung beim Ersatz des vorderen Kreuzbandes im juvenilen Schafmodell

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Academic year: 2022

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(1)

Untersuchungen zum Prozess der Ligamentisation und der Sehnendefektheilung beim Ersatz des vorderen Kreuzbandes im

juvenilen Schafmodell

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Friederike Fritz aus Müllheim / Baden

Hannover 2006

(2)

Vererbungsforschung, TiHo)

1. Gutachter: Dr. C. Drögemüller 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Niemann

Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2006

(3)

Meinen Eltern

(4)
(5)

2 Literaturübersicht 13

2.1 Das Schafmodell 13

2.1.1 Auswahl des Versuchstieres Schaf zum Kreuzbandersatz beim Menschen 13 2.1.2 Relevanz des Kreuzbandersatzes in der Humanmedizin bei Kindern und

Jugendlichen 14

2.1.3 Ersatz des vorderen Kreuzbandes bei offenen Wachstumsfugen im

Tierversuch 15

2.1.4 Struktur und Biologie in Heilung befindlicher Sehnen und Bänder 16

2.2 Wachstumsfaktoren 19

2.2.1 Bone morphogenetic proteins 20

2.2.2 Fibroblast growth factors 21

2.2.3 Platelet-derived growth factor 23

2.2.4 Transforming growth factor β 25

2.2.5 Vascular endothelial growth factor 27

2.3 Matrixproteine 28

2.3.1 Kollagen I 29

2.3.2 Kollagen III 30

2.4 Zytoskelett 31

2.4.1 Alpha smooth muscle actin 31

2.5 Schlußfolgerung 32

3 Material und Methoden 34

3.1 Studienaufbau 34

3.2 Patientenmaterial 35

3.2.1 Tierhaltung und präoperative Fütterung 35

3.2.2 Prämedikation und Narkose 36

3.2.4 Tierhaltung und Fütterung post operationem 40

3.2.5 Euthanasie 41

3.3 Probenmaterial 41

(6)

3.4.1 Fixierung, Einbettung und Probenvorbereitung für die Lichtmikroskopie 44

3.4.2 Histologische Färbungen 45

3.4.2.1 Hämatoxylin & Eosin Färbung 45

3.4.2.2 Azan Färbung nach Heidenhain 46

3.4.2.3 Auswertung der histologischen Färbungen 47

3.5 Immunhistochemie 49

3.5.1 Probenvorbereitung für die Immunhistochemie 49

3.5.2 Vorversuche 50

3.5.3 Verwendete Primärantikörper 53

3.5.4 Kontrollen 54

3.5.5 Histochemische Chloracetatesterase Azokupplungsmethode 54

3.5.6 Auswertung 54

3.5.7 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Chemikalien für die Histologie und

Immunhistochemie 55

3.6. Elektronenmikroskopie 57

3.7 Genexpressionsanalyse 58

3.7.1 qRT-PCR Assay Etablierung 58

3.7.1.1 Datenbank Recherche 58

3.7.1.2 qRT-PCR Assay Design 59

3.7.1.3 Test PCR auf Schaf cDNA 61

3.7.1.3.1 RNA-Aufreinigung 61

3.7.1.3.2 cDNA Synthese 61

3.7.1.3.3 Amplifikation der gewünschten Sequenzen 62

3.7.1.5 PCR Produkt Klonierung 64

3.7.1.5.1 Vermehrung und Isolierung von Plasmid DNA 64

3.7.1.5.2 Transformation 64

3.7.1.5.3 Bakterienkultur 65

3.7.1.5.4 Flüssigkultur 65

3.7.1.5.5 Protokoll zur Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse 65

(7)

3.7.2 qRT-PCR 67

3.7.2.2 Auswertung der qRT-PCR 69

3.7.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 71

4 Ergebnisse 73

4.1 Histologie 73

4.1.1 Qualitative Beurteilung der H&E-Färbung 73 4.1.1.1 Sehne des M. flexor digitalis superficialis und Ligamentum cruciatum

craniale der intakten Gliedmaße 73

4.1.1.2 Transplantat 74

4.1.1.3 Sehnendefekt 77

4.1.2 Qualitative Beurteilung der Azan-Färbung 81

4.1.2 1 Transplantat 81

4.1.2.2 Sehnendefekt 81

4.1.3 Histomorphometrie 83

4.1.3.1 Volumendichte 83

4.1.3.2 Oberflächen-Volumen-Verhältnis (SVratio) 83

4.2 Immunhistochemie 86

4.2.1 Transforming growth factor β 86

4.2.2 Vascular endothelial growth factor 86

4.2.3 Kollagen 87

4.2.4 Alpha smooth muscle actin 87

4.3 Elektronenmikroskopie des Transplantates 89

4.4 qRT-PCR 91

4.4.1 Assay Design 91

4.4.2 Ergebnisse der Validierungsexperimente 92

4.4.3 mRNA-Expression des Kontrollgens 94

4.4.4 Ergebnisse der relativen Quantifizierung 94

4.4.4.1 BMP2 mRNA-Expression 96

4.4.4.2 FGF2 mRNA-Expression 97

(8)

4.4.4.5 VEGF mRNA-Expression 100

4.4.4.6 COL1A1 mRNA-Expression 101

4.4.4.7 COL3A1 mRNA-Expression 102

4.4.4.8 ACTA2 mRNA-Expression 103

5 Diskussion 104

5.1 Diskussion der Ergebnisse 107

5.2 Diskussion des Einflusses der Wachstumsfaktoren, der Matrixproteine und der zytoskelettalen Proteine auf die Ligamentisation und Sehnendefektheilung 110

5.2.1 Bone morphogenetic proteins 110

5.2.2 Fibroblast growth factor 111

5.2.3 Platelet-derived growth factor 112

5.2.4 Transforming growth factor β 113

5.2.5 Vascular endothelial growth factor 114

5.2.6 Kollagen I 115

5.2.7 Kollagen III 116

5.2.8 Alpha smooth muscle actin 117

6 Zusammenfassung 119

7 Summary 121

8 Literaturverzeichnis 123

9. Anhang 145

9.1 Auflistung der chemikalischen Gebrauchslösungen 145

Danksagung 148

(9)

Verzeichnis der Abkürzungen

ACTA2 alpha smooth muscle actin 2 gene α-SMA alpha smooth muscle actin

AK Antikörper

BMP2 bone morphogenetic protein gene

bp Basenpaare (engl. basepairs)

cDNA komplementäre DNA

COL1A1 Kollagen I Gen

COL3A1 Kollagen III Gen

Ct-Wert threshold cycle

DAB Chromogen 3,3-Diaminobenzidin

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleidtriphosphat

ECM Extrazelluläre Matrix

EGF epidermal growth factor

EM Elektronenmikroskopie

EST expressed sequence tag

FAM 6-Carboxy Fluorescein

FGF2 fibroblast growth factor 2 gene

GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase

GDF growth and differentiation factor

H&E Hämatoxilin und Eosin Färbung

i.m. intramuskulär

i.v. intravenös

IHC Immunhistochemie

kDa kiloDalton

Lcc Ligamentum cruciatum craniale

µm Mikrometer

M. Muskulus

min Minute

mm Millimeter

mRNA messenger RNA

NaCl Natriumchlorid

PCR Polymerasekettenreaktion

PDGF platelet-derived growth factor PDGFB platelet-derived growth factor gene PECO2 Endtidale Kohlendioxidkonzentration

qRT-PCR quantitative Real-Time-PCR

RNA Ribonukleinsäure

ROX Carboxy-X-Rhodamine

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

s.c. subkutan

SDS Natriumdodecylsulfat (engl. sodium dodecylsulfate)

TGF-ß transforming growth factor-ß

(10)

TGFB2 transforming growth factor B2 gene

TNF-α Tumor Nekrose Faktor alpha

TRIS Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan

U Unit

VEGF vascular endothelial growth factor gene

VKB Vorderes Kreuzband

ZP-0 Tier Zeitpunkt Null Tier

2-ddCt 2-∆∆Ct

(11)

1 Einleitung

Als Teil des aktiven und passiven Bewegungsapparates sind Sehnen und Bänder von entscheidender Bedeutung für physiologische Bewegungsabläufe von Tier und Mensch. Im Falle einer Verletzung dieser Strukturen kommt es zu einer Kraftminderung (Sehnen) bzw. Störung der Kinematik (Bänder) des betroffenen Gelenkes. Der Körper reagiert auf eine entsprechende Verletzung mit Heilungsvorgängen, aus denen eine mechanisch und biologisch minderwertige Narbe resultiert.

Bei intraartikulär verlaufenden Bandstrukturen kann eine Heilung sogar ausbleiben, weshalb in diesen Fällen oftmals ein operativer Ersatz zur Wiedererlangung der Stabilität durchgeführt wird. Werden Sehnen als Bandersatz transplantiert, nehmen sie nach einer Umbauphase teilweise die Eigenschaften des ersetzten Bandes an.

Während diesem als Ligamentisation bezeichnetem Prozess finden grundlegende Veränderungen statt, die histologisch in drei Phasen unterteilt werden können:

Nekrose, Revitalisierung und Remodellierung. Die Sehnendefektheilung erfolgt über die Bildung eines Granulationsgewebes, welches schließlich über Matrixproduktion zu einer minderwertigen Narbe führt.

Moduliert werden diese komplexen Umbau- und Heilungsvorgänge durch so genannte Zytokine, Proteine die das Wachstum und die Differenzierung von Zellen regulieren. In der Phase der Nekrose und Revitalisierung der Sehnenheilung spielen vor allem transforming growth factor-ß (TGF-ß) und platelet-derived growth factor (PDGF) eine Rolle. Vascular endothelial growth factor (VEGF) und fibroblast growth factors (FGF) werden in der Phase der Revitalisierung relevant. Von den bone morphogenetic proteins (BMP) wird ein Einfluss auf die Einheilung des Transplantates im Knochentunnel erwartet. In der Phase der Remodellierung ist von Interesse, inwieweit die Matrixproteine Kollagen I und III gebildet werden. Die Expression von alpha smooth muscle actin (SMA) als zytoskelettales Protein spiegelt schließlich den Umbauprozess wider.

Ziel dieser Studie ist es, durch histologische Untersuchungen sowie eine Genexpressionsanalyse den Prozess der Ligamentisation und die Sehnendefektheilung in einem Modell juveniler Schafe nach Ersatz des vorderen

(12)

Kreuzbandes zu analysieren. Damit soll das Fenster zwischen den bereits bestehenden Studien für fetale und adulte Individuen geschlossen werden. Als Hypothese wird vermutet, dass diese Heilungsprozesse im Vergleich zu adulten Individuen schneller ablaufen.

(13)

2 Literaturübersicht

2.1 Das Schafmodell

2.1.1 Auswahl des Versuchstieres Schaf zum Kreuzbandersatz beim Menschen

An ein Tierversuchsmodell werden verschiedene Anforderungen gestellt, die möglichst vollständig erfüllt werden sollten. Je nach Versuch ergeben sich natürlich andere Anforderungen, grundsätzliche Überlegungen beeinflussen die Wahl des Tiermodells (SEIL 2002): Verfügbarkeit grundlegender Daten, allgemeine Übertragbarkeit der Ergebnisse, technische Durchführbarkeit der Eingriffe, Kosten und Verfügbarkeit der Tiere, ethische Vertretbarkeit, vertretbarer Aufwand der Tierhaltung, Tolerierbarkeit von Narkose, Operation und Nachbehandlung, Vergleichbarkeit zum Menschen.

Schafe sind bereits etablierte Versuchstiere für orthopädische Fragestellungen. So wird das Schaf häufig zur Untersuchung von Knochendefektheilungen eingesetzt (AUGAT et al. 1998; PETERS et al. 2005; SCHNEIDER HÄFLIGER 2002; VIATEAU et al. 2004). Ebenso wurden Studien an Schafen zur Heilung der Achillessehne durchgeführt (PETERSEN et al. 2003a). Das Schafmodell hat sich zudem als günstiges Modell für den vorderen Kreuzbandersatz herausgestellt (BOSCH u.

KASPERCZYK 1992; HUNT et al. 2005; KASPERCZYK et al. 1993; LO et al. 2003;

AN u. FRIEDMAN 1999). Speziell für histologische und biomechanische Studien zum Kreuzbandersatz am adulten Tier ist das Schaf ein etabliertes Modell (WEILER et al.

2002a, 2002b).

Das Schaf ist wegen seiner Größe leicht zu handhaben. Es gehört zu einer höheren Spezies als Mäuse, Ratten und Kaninchen, deshalb geht man davon aus, dass die Resultate eher auf den Menschen übertragbar sind. Auch sind die Regenerationsprozesse beim Schaf denen des Menschen sehr ähnlich (AUGAT et al. 1998). Hinzu kommt, dass nach der ersten Heilungsphase diese Tiere relativ artspezifisch und kostengünstig gehalten werden können, so dass die Tiere trotz des Versuches nicht unnötig leiden müssen. Das Schaf belastet seine Gliedmaßen nach

(14)

der Operation meist schnell wieder. Dieser Umstand kann einerseits eine gute Heilung zur Folge haben, andererseits kann es jedoch zu Rupturen oder Ausrissen des Transplantates vor allem beim schnellen Aufspringen und wieder Hinlegen kommen, da Schafe sehr schreckhaft sind (NUNAMAKER 1998). Aus diesem Grund sollten die Schafe auch vor Durchführung der Versuche an menschlichen Umgang, an Manipulationen und an die Fixierung gewöhnt werden.

2.1.2 Relevanz des Kreuzbandersatzes in der Humanmedizin bei Kindern und Jugendlichen

Verletzungen des vorderen Kreuzbandes bei Kindern werden mit zunehmender Häufigkeit diagnostiziert. Die Gründe dafür liegen unter anderem in der vermehrten Teilnahme von Kindern an Wettkampfsportarten. In Deutschland hat die Zahl operationswürdiger Kniebandverletzungen bei Kindern gemäß dem Bundesgesundheitsbericht 2002 um 30% zugenommen. Etwa 3-4% aller vorderen Kreuzband Rupturen (VKB) treten in dieser Altersgruppe auf (CLANTON et al. 1979;

DELEE u. CURTIS 1983). Ohne adäquate Therapie drohen eine Funktionseinschränkung sowie schwerwiegende Folgeschäden am Kniegelenk bis hin zur frühzeitigen Arthrose (DRONGOWSKI et al. 1994; JOHNSON et al. 1992;

KANNUS u. JARVINEN 1987; LOHMANDER 2004). Eine operative Therapie birgt die Gefahr einer iatrogenen Wachstumsstörung. Es ist bisher nicht geklärt, wann und in welcher Form die operative Therapie bei Patienten mit offenen Epiphysenfugen optimalerweise erfolgen sollte. Denn je jünger der Patient ist, desto größer ist die Gefahr konsekutiver iatrogener Schäden durch die operative Therapie (BUCKLEY 1994; KOMAN u. SANDERS 1999; SIMONIAN et al. 1999). Auch ist bisher unklar, warum die Rupturrate nach kindlichem Kreuzbandersatz im Vergleich zu einem erwachsenen Patientenkollektiv höher ist (EDWARDS u. GRANA 2001).

Aufgrund der steigenden Inzidenz der kindlichen Kreuzbandrupturen ist das wissenschaftliche Interesse in den letzten Jahren stark gestiegen. Aus den bisherigen retrospektiven Daten geht hervor, dass die konservative Therapie zu unakzeptablen Ergebnissen führt (AICHROTH et al. 2002; ANGEL u. HALL 1989;

(15)

MCCARROLL et al. 1988). Verfahren zum Ersatz des vorderen Kreuzbandes, wie sie bei Erwachsenen durchgeführt werden, sind für Kinder mit offenen Epiphysenfugen nur dann übertragbar, wenn das Längenwachstum beinahe abgeschlossen ist, dies ist etwa ab dem 14. Lebensjahr der Fall (ARONOWITZ et al. 2000).

2.1.3 Ersatz des vorderen Kreuzbandes bei offenen Wachstumsfugen im Tierversuch

Das für den Ersatz des vorderen Kreuzbandes relevante Ausmaß einer iatrogenen Schädigung der Epiphysenfuge wurde erstmals von Campbell et al. (1959) untersucht. Versuche mit Hunden haben gezeigt, dass Traumatisierungen durch Schrauben oder K-Drähte im Wachstumsfugenbereich regelmäßig zu unerwünschter Knochenbildung führen. Das Ausmaß des Fehlwachstums war erwartungsgemäß vom Durchmesser des durchtretenden Gegenstandes abhängig. Bei Defekten größer als 7-9 % der Wachstumsfuge ist eine Wachstumsstörung zu erwarten (JANARV et al. 1998). Schließlich ergab eine histologische Studie an der distalen Femurepiphysenfuge von Ratten, dass Wachstumsstörungen in Abhängigkeit vom verbleibenden Längenwachstum zunehmen (GARCES et al. 1994).

In Versuchen von Ono et al. (1998) ist es bei 51 von 61 New Zealand White Rabbits nach Ersatz des VKB zu Wachstumsstörungen in Form einer Tibiadeformierung und –verkürzung gekommen.Auch beiübermäßiger Transplantatspannung (> 80 N) sind Wachstumsstörungen zu erwarten, wie Edwards et al. (2001) an 12 Hunden nach viermonatiger Versuchsphase zeigen konnten. Guzzanti et al. (1994) fanden in ihren Versuchen an New Zealand White Rabbits, dass die Bohrung eines 2 mm Tunnels mit Durchziehen der Sehne des M. semitendinosus bei 15% der Tiere zu einem Fehlwachstum führt. Allerdings wurden in einer kleinen Serie an insgesamt vier Hunden nach autologem Kreuzbandersatz keine Wachstumsstörungen gefunden (STADELMAIER et al. 1995). In einer Untersuchung bei unreifen Schafen wurde ein autologes Achillessehnentransplantat als vorderes Kreuzbandtransplantat transphyseal implantiert (SEIL 2002). In der Versuchsgruppe 1 war nach transphysealer Bohrung kein Transplantat eingezogen worden, die Folge war eine

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Varusdeformität bei 3 von 6 Schafen durch vorzeitigen Schluss der lateralen Femurepiphysenfuge. In den Gruppen 2 (Transplantat Achillessehne einfach) und 3 (Transplantat Achillessehne doppelt) resultierten keine Wachstumsstörungen.

Gruppe 4 zeigte bei tibialer Fixierung durch eine Schraube eine Deformität der proximalen Wachstumsfuge der Tibia (SEIL 2002).

Die Untersuchung der Sehnenheilung an den Strukturen des Knies im Schafmodell ist von mehreren Nutzen. Wie bereits zuvor erwähnt, ist das Schaf ein etabliertes Versuchstier für orthopädische Fragestellungen, insbesondere zum Kreuzbandersatz. Beim Kreuzbandersatz wird ein Sehnendefekt zur Transplantatentnahme gesetzt, beide Strukturen können daher parallel untersucht werden. Somit können gleichzeitig Erkenntnisse zu den Themenkomplexen Sehnenheilung, Ligamentisation und Kreuzbandersatz gewonnen werden.

2.1.4 Struktur und Biologie in Heilung befindlicher Sehnen und Bänder

Werden Sehnen im Sinne eines VKB-Ersatzes transplantiert, nehmen sie nach einer Umbauphase zumindest teilweise die Eigenschaften des zu ersetzenden Bandes an.

Dieser Prozess wird als Ligamentisation bezeichnet (AMIEL et al 1986, BOSCH u.

KASPERCZYK 1992) und verläuft histologisch in drei Phasen: Zunächst kommt es zu einer akuten Entzündungsreaktion mit ischaemischer Nekrose und Zelluntergang.

Mit der Zellrekrutierung und chronischen Entzündung kommt es zur Revaskularisation oder Revitalisierung, Zellproliferation und letztendlich zur Remodellierung der Kollagenfasern (BOSCH u. KASPERCZYK 1992; FRANK et al.

1983a, b; FRANK C. et al. 1985; HUNT 2003; KASPERCZYK et al. 1993;

UNTERHAUSER 2004). Diese Phasen der Transplantateinheilung entsprechen biologisch denen bei Defektheilung, weshalb eine transplantierte Sehne in der Literatur auch als healing tendon bezeichnet wird (BOSCH u. KASPERCZYK 1992;

KASPERCZYK 1993).

Moduliert wird dieser Umbau durch Zytokine. Eine zentrale Rolle im Prozess der Ligamentisation spielt die Angioneogenese in der transplantierten Sehne, welche vor allem durch den vascular endothelial growth factor (VEGF) vermittelt wird

(17)

(PETERSEN et al. 2003c). Die angiogenetische Phase, in der Nährstoffe und Sauerstoff zugeführt werden, wird durch VEGF und fibroblast growth factor-2 (FGF- 2) unterstützt. Durch Hypoxie und hohe lokale Konzentrationen an Stickstoffmonoxid wird dieser Prozess zusätzlich forciert (PETERSEN et al. 2003c). Histologisch konnte nachgewiesen werden, dass die proliferierenden Zellen im Transplantat von extrinsischem Ursprung sind (AMIEL 1986; ARNOCZKY et al. 1982). Diese so genannten extrinsischen Fibroblasten reagieren auf Zytokine und Wachstumsfaktoren mit Proliferation und Synthese von neuer extrazellulärer Matrix, um so das verletzte Gewebe durch eine bindegewebige Narbe zu ersetzen. Diese Synthese dauert mehrere Wochen an (DEEHAN u. CAWSTON 2005). Platelet- derived growth factor BB (PDGFB) übt einen positiven Effekt auf die Fibroblastenproliferation und Kollagensynthese aus (THOMOPOULOS et al. 2005) An adulten Sehnen konnte gezeigt werden, dass transforming growth factor-β (TGF- β) bei der Heilung eine entscheidende Rolle spielt (MENETREY et al. 1999). TGF-β wirkt dabei synergistisch, indem Fibroblasten rekrutiert und in deren Synthese von Kollagen I, III, und V, sowie Proteoglykanen, Fibronectin und anderen extrazellulären Komponenten stimuliert werden (DEEHAN u. CAWSTON 2005). Die Präsenz von Myofibroblasten während der frühen Remodellingphase lässt weiterhin vermuten, dass α–smooth muscle actin (SMA) exprimierende Zellen in der frühsten Phase der Bildung von Kollagenfibrillen mitbeteiligt sind. Myofibroblasten können im Prozess der Geweberestrukturierung während der Remodellierung eines freien Sehnentransplantates, oder der Ligamentisierung nach VKB-Ersatz mitwirken.

Die Eigenschaften von transplantierten Sehnen werden im Laufe der Ligamentisation denen des nativen VKB ähnlich, obwohl diese zwei Gewebe sich durch unterschiedliche Anteile an Kollagen, Glykosaminoglykanen und Kollagen reduzierbaren Querverbindungen deutlich unterscheiden (MARUMO et al. 2005). Auf biochemischer Ebene konnte nachgewiesen werden, dass der Prozess der Ligamentisation etwa 12 Monate bedarf. Zusätzlich wird darauf hingewiesen, dass das Transplantat zwar makroskopisch und histologisch nach diesem Zeitraum wie ein VKB aussieht, jedoch kann man elektronenmikroskopisch noch Unterschiede in der Anordnung der Kollagenfibrillen feststellen (MARUMO et al. 2005). In diesem

(18)

Zusammenhang kommen Bosch und Kasperczyk (1992) nach einem Ersatz des hinteren Kreuzbandes zu der Erkenntnis, dass das Transplantat nicht den Prozess einer Ligamentisation durchläuft, stattdessen entwickelt es sich zu einem in Teilen organisierten Ersatzgewebe, dessen Belastbarkeit niemals der ursprünglichen Struktur entspricht (BOSCH u. KASPERCZYK 1992; GROOD u. NOYES 1976;

HUNT 2003).

Grundsätzlich verläuft die Ausheilung von Sehnendefekten in den gleichen Schritten wie die Ligamentisation mit einer beginnenden Entzündung, anschließend folgen Vaskularisierung und regenerative Phase. Bereits nach einer Wochen ist der Defekt mit provisorischer Matrix und Granulationsgewebe gefüllt (BEREDJIKLIAN et al.

2003). Mikroskopisch entwickelt sich der Defekt schnell zu einem Narbengewebe, welches sich mit Kollagen füllt. Ein bis zwei Wochen nach der Verletzung steigt die Zellzahl an und die Zellmorphologie ändert sich nach 8 bis 24 Wochen von plumpen zu spindelförmigen Tendinozyten. Die Fibrozyten richten sich innerhalb von 24 Wochen entlang der Zugrichtung aus. Im Vergleich zur gesunden Sehnen ist jedoch immer noch eine Hyperzellularität und eine reduzierte Kollagendichte zu beobachten (DAHLGREN et al. 2005b). In der frühen Heilungsphase von Sehnendefekten weisen die Fibrillen einen überwiegend kleinen Durchmesser auf und verändern sich im Prozess der Ausheilung in Richtung eines normalen Durchmessers. Die Bedeutung liegt darin, dass kleine Fibrillen mechanisch weniger stabil sind als Fibrillen mit großem Durchmesser (GOODSHIP et al. 1994; HUNT 2003).

Beredjiklian et al. (2003) führten an trächtigen Schafen einen Versuch zur Sehnenheilung durch. So setzten sie sowohl im Muttertier, als auch im Fetus einen Sehnendefekt. Eine Woche später konnte er in den Feten eine regenerative Heilung beobachten, im Mutterschaf fanden sie eine reparative Heilung mit gebildetem Granulationsgewebe (BEREDJIKLIAN et al. 2003). In der Literatur wird auf die Bedeutung des Verständnisses der Interaktion von Zytokinen bei Wachstum und Heilung von Sehnen und Bändern hingewiesen (BEREDJIKLIAN et al. 2003). Auf dem Gebiet Kreuzbandersatz im Wachstumsalter existieren diesbezüglich keine Daten.

(19)

2.2 Wachstumsfaktoren

Zytokine sind Proteine, die als Signalmoleküle der Zell-Zell-Kommunikation dienen und als solche eine zentrale und sehr vielfältige Funktion für Wachstum und Differenzierung eines Organismus einnehmen. Die Zytokine werden autokrin oder parakrin ausgeschüttet (SPORN et al. 1987). Durch ihre Fähigkeit, sich gegenseitig in ihrer Aktivität zu modulieren, sind sie ausgesprochen geeignet, die komplexen morphogenetischen Ereignisse zu kontrollieren (GOSPODAROWICZ et al. 1986;

1987). Ferner steuern Vertreter der Zytokine die Proliferation, Differenzierung und funktionelle Prägung von Zellen des Immunsystems sowie von Zellen des blutbildenden Systems. Darüber hinaus sind sie an Entzündungsprozessen sowie an der neuronalen, haematopoetischen und embryonalen Entwicklung des Organismus beteiligt. Infolge ihrer essentiellen Funktion für die Steuerung des Immunsystems, für Abwehrreaktionen und für Entzündungsprozesse kommt den Zytokinen eine erhebliche medizinische Bedeutung zu (KRAUSS 1997a). Auch die Heilung von Bindegewebe wird durch Wachstumsfaktoren gefördert. Diese Peptide scheinen in der lokalen Umgebung von Bandverletzungen präsent zu sein. Durch sie kann die Produktion von extrazellulärer Matrix stimuliert werden (DAHLGREN et al. 2005b).

Zytokine können eine elementare Funktion einnehmen, so zeigt sich bei TGFB und VEGF knockout Mäusen, dass ein Fehlen jener Faktoren mit dem Leben nicht vereinbar ist (CROWE et al. 2000; FERRARA et al. 1996). Die Heilung oder Regeneration von Knochen, Knorpel, Bändern, Sehnen und anderen für die Orthopädie interessanten Geweben könnte in Zukunft durch die Applikation relevanter Wachstumsfaktoren gefördert werden (EVANS u. ROSIER 2005).

(20)

2.2.1 Bone morphogenetic proteins

Die Entdeckung der BMPs geht auf 1965 zurück, als in einer Studie demineralisierte Knochenmatrix, eingepflanzt in die Muskulatur von Kaninchen, ektopisch enchondrale Knochenneubildung induzieren konnte (URIST 1965). Die bone morphogenic proteins (BMPs), von denen bis heute 15 Mitglieder identifiziert sind, gehören wie TGF-β und andere Wachstumsfaktoren aufgrund ihrer Struktur zu der TGF-β Superfamilie (DEMERS u. HAMDY 1999; GROENEVELD u. BURGER 2000).

Nur BMP1 gehört nicht zu dieser Familie, sondern ist eine Proteinase, die daran beteiligt ist Prokollagen zu Kollagen umzuwandeln (KESSLER et al. 1996). Die Einteilung der BMPs erfolgt nach Ähnlichkeit in ihrer Aminsäuresequenz (GROENEVELD u. BURGER 2000). So bilden zum Beispiel BMP2 und BMP4 eine Untergruppe mit einer Homologie von 92%, BMP5 und BMP6 bilden mit BMP7 und BMP8, die auch als osteogenic proteins-1 und 2 bezeichnet werden, eine weitere Gruppe. BMP14, 13 und 12, auch als growth and differentiation factor (GDF) 5, 6 und 7 bekannt, bilden eine Gruppe und BMP3 und 3b, besser bekannt als GDF-10 stellen eine weitere Gruppe dar (DEMERS u. HAMDY 1999; WOZNEY 1992). Die BMPs haben, wie alle Mitglieder der TGF-β-Superfamilie auch, ihre spezifischen Rezeptoren. Bis jetzt kennt man zwei Typ-I-Rezeptoren und einen Typ-II-Rezeptor.

Beide wurden charakterisiert als membrangebundene Serin-Threonin-Kinasen (DEMERS u. HAMDY 1999).

BMPs werden im Körper von den verschiedensten Geweben produziert;

hauptsächlich von Zellen; die an der Knochenbildung beteiligt sind. Sie können aber auch aus Herz; Niere; Ovarien; Prostata und dem ZNS isoliert werden (BALTZER u.

LIEBAU 1999). BMP2 und BMP4 sind bekannt dafür; dass sie bestimmte Zelllinien in zur Differenzierung zu Osteoblasten beeinflussen können (KATAGIRI et al. 1994). So werden Zelllinien von Myoblasten durch BMP2 in ihrer Entwicklung zu Osteoblasten gefördert (KATAGIRI et al. 1994). In den meisten Studien finden BMP2; BMP4 und BMP7 eine Verwendung; da ihre osteoinduktive Wirkung von allen BMPs am stärksten sein soll (BALTZER u. LIEBAU 1999). Es scheint aber, dass BMP2, trotz großer Homologie zu BMP4, stärker und schneller wirkt (WOZNEY 1992). TGF-β

(21)

wirkt zusätzlich stimulierend auf die durch BMP7 induzierte Knochenneubildung (RIPAMONTI et al. 1997). BMP2 erhöht die IGF-I und –II Expression in Rattenosteoblasten (CANALIS u. GABBITAS 1994) und erhöht die TGF-β und IL-6 Produktion in Zellen (ZHENG et al. 1994). Immunhistochemisch konnte BMP2 in einer Studie zu submandibulären Osteotomien an 12 Schafen nachgewiesen werden (FARHADIEH et al. 2004). Es fand eine Reaktion mit Osteoblasten, Osteozyten, der periostalen Auskleidung und mit Osteoklasten statt. Rekombinate BMPs haben sich als hilfreich in der Heilung von langen Röhrenknochen erwiesen (KHAN u. LANE 2004). In einer Studie zum vorderen Kreuzbandersatz im Tiermodell Hund konnte nach 3 Tagen in der Gruppe, die mit rekombinatem humanem BMP2 (rhBMP2) behandelt wurde, eine deutlich schnellere Integration des Transplantates beobachtet werden, als in der nicht behandelten Kontrollgruppe (RODEO et al. 1999). Nach 8 Wochen konnte eine stärkere Integration des Transplantates über Kollagenfasern am interface zum Knochentunnel festgestellt werden; als in der Kontrollgruppe. rhBMP2 kann den Heilungsprozess zwischen dem autogenen Sehnentransplantat und dem Knochentunnel forcieren (RODEO et al. 1999). Am Sehnen-Knochen-Übergang kann BMP2 somit eine potentielle Rolle spielen (WOZNEY 1993). BMPs gehören zu den Wachstumsfaktoren, die offensichtlich bei der Integration des Transplantates eine bedeutende Rolle spielen.

2.2.2 Fibroblast growth factors

Die ursprüngliche Isolierung der fibroblast growth factors erfolgte 1975 aus bovinen Hypophysen (GOSPODAROWICZ 1975). Die fibroblast growth factors sind eine Familie von Heparin-bindenden Polypeptiden mit mitogener Wirkung; zu der neun Mitglieder gehören. Acid FGF (aFGF entspricht FGF-1); und basic FGF (bFGF entspricht FGF-2) sind am besten beschrieben (CROUCHER u. RUSSELL 1999;

SOLHEIM 1998), aFGF mit einem Molekulargewicht von 16-18 kDa und bFGF mit 18 kDa werden von unterschiedlichen Genen exprimiert und besitzen in ihrer Aminosäuresequenz eine Übereinstimmung von 55%. Der Weg der Sezernierung ist unbekannt. Sie werden nicht über den klassischen Weg über das endoplasmatische

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Retikulum und den Golgikomplex aus den Zellen sezerniert (MIGNATTI et al. 1992), sie werden aber auch nicht ausschließlich beim Tod der Zelle freigesetzt, wie man das vorher annahm (CANALIS et al. 1989). Extrazelluläres FGF kann an Heparin oder Heparansulfat binden und wird so in der extrazellulären Matrix eingelagert.

Dieser Komplex spielt auch bei der Bindung an die spezifischen FGF-Rezeptoren eine wichtige Rolle (CROUCHER u. RUSSELL 1999).

bFGF hat eine stärkere Wirkung als aFGF, ihre Auswirkungen sind aber vergleichbar (CANALIS et al. 1989; 1991). Dies hat sich auch in einer Studie bestätigt, in der sich aFGF und bFGF positiv auf die Proliferation von Fibroblasten auswirken, wobei die Reaktion auf bFGF stärker ausfällt (SCHMIDT et al. 1995).

FGFs sind bekannt für ihre mitogene Wirkung auf verschiedene Zelltypen und für ihre Rolle bei der Neuvaskularisierung von Gewebe (CANALIS et al. 1991; PETERSEN et al. 2003a). In vitro ist eine Steigerung der Syntheseleistung von Fibroblasten beschrieben worden (LEROY et al. 1982). In der Wundheilung spielt bFGF eine entscheidende Rolle. Es ist in Makrophagen nachgewiesen worden, und kann ebenso von Bedeutung sein, wenn es aus zerstörten Zellen freigesetzt wird (BAIRD et al. 1985). Im Gegensatz zu anderen Wachstumsfaktoren wie PDGF oder TGF-β stimuliert bFGF die Proliferation von allen Zelltypen, die im Wundheilungsprozess involviert sind. Dazu gehören Endothelzellen von Kapillaren, glatte Muskelzellen von Gefäßen, Fibroblasten, und andere Zelltypen wie Chondrozyten und Myeloblasten.

bFGF fördert die Ausbildung von Granulationsgewebe, was mit der Stimulation der synthetischen Funktion von Fibroblasten und Myofibroblasten assoziiert ist (BUNTROCK et al. 1982). In vitro konnte gezeigt werden, dass FGF2 zum einen die Zellproliferation von Knochemarkzellen fördert, zum anderen aber auch die mRNA- Expression von Kollagen I und III und α-SMA steigert (HANKEMEIER et al. 2005).

Im Gegensatz zu PDGF und TGF-β kann FGF eine Woche nach dem Kreuzbandersatz nicht nur in peripheren Regionen, sondern auch zentral im Transplantat immunhistochemisch nachgewiesen werden (KURODA et al. 2000).

Drei Wochen post operationem ist die Immunoreaktivität noch vorhanden, 6 Wochen post operationem wurde aber ein Nachlassen der Reaktion beobachtet und 12 Wochen post operationem wurden der Level eines intakten Kreuzbandes erreicht. In

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dieser Studie an 14 Hunden konnte auch eine Immunreaktion von bFGF im intakten VKB und in der intakten Patellarsehne nachgewiesen werden (KURODA et al. 2000).

Im Hundemodell konnte in den Fibroblasten der Sehne des M. flexor digitalis profundus ein positiver Effekt von bFGF sowohl auf die Proliferation von Fibroblasten, als auch deren Kollagensynthese beobachtet werden (THOMOPOULOS et al. 2005). Hingegen war dieser Effekt nicht bei der Applikation von VEGF oder BMP2 erreicht worden (THOMOPOULOS et al. 2005). In diesem Hundemodell zur Sehnendefektheilung konnte im Endo- und Epitenonium, ebenso wie in Entzündungszellen eine schwache immunhistochemische Reaktion beobachtet werden. In den Tendinozyten konnte bFGF nicht nachgewiesen werden (TSUBONE et al. 2004).

2.2.3 Platelet-derived growth factor

Platelet-derived growth factor (PDGF) besteht aus vier nahe verwandten Glykoproteinen mit einem annähernden Molekulargewicht von 30 kDa (DEUEL et al.

1981; RAINES u. ROSS 1982). Zusammengesetzt wird er aus den so genannten A- und B-Ketten, die über Disulfidbrücken in drei Kombinationen verbunden werden. Je nachdem, von welcher Zelle PDGF produziert wird, besteht das Molekül aus den Homodimeren AA und BB, oder aus dem Heterodimer AB (BOWEN-POPE et al.

1989; HAMMACHER et al. 1988). PDGF Dimere binden an zwei unterschiedliche, jedoch nahe verwandte Rezeptoren, die α- und β-Rezeptoren (GRONWALD et al.

1988; MATSUI et al. 1989; YARDEN et al. 1986).

Die dimere Struktur wird für die Mitogenese, jedoch nicht für die Chemotaxis benötigt (WILLIAMS et al. 1983). Beispielsweise scheinen im Bindegewebszellen vor allem PDGF AB und BB die mitogene Aktivität zu vermitteln, wohingegen PDGF AA diesbezüglich weniger potent ist. Diese Unterschiede werden durch die relative Verteilung und Ligandenaffinität zu den α- und β-Rezeptoren erklärt (NISTER et al.

1988).

PDGF spielt bei fundamentalen biologischen Prozessen wie der Embryogenese, Entwicklung des zentralen Nervensystems und Wundheilung eine Rolle

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(HABENICHT et al. 1985). Die vorherrschende biologische Rolle von PDGF besteht darin, die Proliferation mesenchymaler Zellen zu stimulieren, aber auch andere Wirkungen werden beschrieben. So ist PDGF z.B. ein potenter Vasokonstriktor (BERK et al. 1986), er übt eine starke chemotaktische Wirkung auf mesenchymale und haematopoetische Zellen aus (GROTENDORST et al. 1981; WILLIAMS et al.

1983), auf die Fibroblastenproliferation wird ein stimulierender Effekt ausgeübt (SCHMIDT et al. 1995) und er fördert die Aktivierung von polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten (TZENG et al. 1985).

PDGF ist an einer Kaskade von Reaktionen beteiligt, deren Ergebnis die Bildung von Prostacyclin und Prostaglandin E2 ist, zwei wichtigen Produkten des Arachidonsäurezyklus, die eine Rolle als Entzündungsmediatoren und in der Immunantwort spielen (HABENICHT et al. 1985). Prostaglandin E2 hat einen stark inhibitorischen Effekt auf Lymphozyten und Makrophagen und könnte somit die PDGF Antwort negativ regulieren (HABENICHT et al. 1985).

PDGF BB konnte in der Heilung eines Defektes an der Sehne des M. flexor digitalis profundus im Hundemodell immunhistochemisch mit einer starken Reaktion im Endotenon, einer etwas geringeren Reaktion im Epitenon und einer geringgradigen Reaktion von Entzündungszellen nachgewiesen werden (TSUBONE et al. 2004). Die Applikation von PDGF konnte in einer Zellkultur von Tendinozyten aus Achillessehnen von Ratten 2-5 Tage postnatal die Expression von VEGF um das Doppelte erhöhen (PETERSEN et al. 2003b). Die Applikation von PDGF BB führte zudem zu einer Proliferation von Fiboblasten, kombiniert mit bFGF wurde dieser Effekt verstärkt. Jedoch konnte dabei kein weiterer Effekt auf die Kollagensynthese verzeichnet werden (THOMOPOULOS et al. 2005). Bei einem Kreuzbandersatz an 14 adulten Hunden konnte in den peripheren Bereichen des Transplantates nach einer Woche ein immunhistologischer Nachweis sowohl von PDGF AA als auch von PDGF BB erfolgen (KURODA et al. 2000). In diesen Randbereichen war eine Einsprossung von Kapillaren zu beobachten. 3 Wochen post operationem war die Reaktion am stärksten, nach 6 Wochen ließ sie merklich nach. Nie konnte PDGF zentral im Transplantat detektiert werden, immer nur peripher. Dabei fiel die Immunreaktion mit PDGF BB etwas stärker aus als die mit PDGF AA (KURODA et al.

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2000). Weiler et al. (2004) führten an adulten Schafen einen Kreuzbandersatz mit PDGF ummanteltem Nahtmaterial durch, da PDGF BB sich zuvor als der effizienteste Wachstumsfaktor in der Heilung des medialen Kollateralbandes herausgestellt hat (HILDEBRAND et al. 1998; LEPISTO et al. 1992; WOO et al.

1998). Die PDGF behandelten Transplantate zeigten nach 6 Wochen eine bessere Vaskularisierung als die Transplantate der Kontrollgruppe, ebenso war zu diesem Zeitpunkt eine bessere biomechanische Stabilität im Transplantat vorhanden (WEILER et al. 2004). Dies deckt sich mit dem Befund, dass nach einem Gentransfer von PDGF in Ratten, in der Patellarsehne eine verstärkte Vaskularisierung festgestellt werden konnte (NAKAMURA et al. 1998).

2.2.4 Transforming growth factor β

Transforming growth factor β (TGF-β) wird der sogenannten TGF-β-supergene family zugeordnet. Diese wird wiederum in Unterfamilien unterteilt, die alle eine gewisse strukturelle Verwandtschaft aufweisen. Insgesamt haben sie primär eine wachstumsregulatorische Funktion (CENTRELLA et al. 1994; CROUCHER u.

RUSSELL 1999; ROSIER et al. 1998; SPORN et al. 1987). Die TGF-β-Familie besteht aus fünf Subtypen. TGF-β 1 bis 3 sind in Säugetieren nachgewiesen worden, TGF-β 4 in Hühnern und TGF-β 5 in Amphibien (Xenopus sp.) (CENTRELLA et al.

1994; COX u. MAURER 1997). Diese untereinander nahe verwandten Isoformen setzen sich aus zwei Untereinheiten zusammen, die durch Disulfidbücken als Homodimer mit einem Molekulargewicht von 25 kD miteinander verbunden sind (CENTRELLA et al. 1994; COX u. MAURER 1997). Es bindet an den TGF-β Rezeptor I und II (KRAUSS 1997b). Die drei Hauptisoformen der Säugetiere TGF-β1, -β2, -β3 werden von verschiedenen Genen codiert (ROBERTS u. SPORN 1990) und stimmen zu 64-85% in ihrer Aminosäuresequenz überein (MASSAGUE 1990).

TGF-β wurde unter anderem aus weißen Blutplättchen (ASSOIAN et al. 1983), aus bovinen Nieren (ROBERTS et al. 1983), Thrombozyten (ASSOIAN et al. 1983), Osteozyten (CROUCHER u. AND RUSSELL 1999), proliferierende Mesenchymzellen, Osteoblasten und Chondroblasten (BOLANDER 1992) isoliert.

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Neben VEGF scheint es auch die Fähigkeit zu besitzen, fördernd auf die Angiogenese wirken zu können (PETERSEN et al. 2003a). Als so genanntes fibrogenetisches Zytokin kann es die Differenzierung der Myofibroblasten in vivo und vitro induzieren (DARBY et al. 1990).

TGF-β2 wird in Zusammenhang mit der embryologischen Entwicklung von Gliedmaßen erwähnt, so soll TGF-β2 in den Sehnen der distalen Gliedmaße exprimiert werden (MERINO et al. 1998). TGFB2 knockout Mäuse zeigen umfassende Defekte insbesondere an Gefäßen, defekte Sehnen konnten dagegen nicht beobachtet werden (DUNKER u. KRIEGLSTEIN 2000).

Ein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Isoformen TGF-β1 und TGF-β2 konnte bisher nicht nachgewiesen werden (CORDEIRO et al. 2000; WOODWARD et al. 1995). TGF-β2 soll jedoch eine stärkere Produktion von Narbengewebe und Kollagen I induzieren können (SPINDLER et al. 2003).

In Zellkulturen von Fibroblasten aus der Lunge ist nachgewiesen worden, dass TGF- β die direkte Expression von α-smooth muscle actin (SMA) auslösen kann (GAULDIE et al. 1999). Dabei wird TGF-β für Fibrose und Akkumulation von Myofibroblasten im Lungengewebe verantwortlich gemacht. TGF-β reguliert die Formation der Matrix (EDOM-VOVARD u. DUPREZ 2004), was sich unter anderem auch daran zeigt, dass nach einer Expression von TGF-β in der Narbe eine verstärkte Ablagerung von Matrix stattfindet (GAULDIE et al. 1999). Conti und Dahner (1993) beschreiben die Auswirkungen von TGF-β auf die biomechanischen Eigenschaften. In ihrer Studie konnte die Applikation von TGF-β die Traglast eines in Heilung befindlichen medialen Kollateralbandes im Vergleich zum nichtbehandelten Kollateralband im Modell der Ratte steigern (CONTI u. DAHNER 1993). In einer weiteren Studie wurde gezeigt, dass TGF-β die Proliferation von Fibroblasten des medialen Kollateralbands von Kaninchen fördert (SCHMIDT et al. 1995). Bereits nach einer Woche konnte TGF-β1 im umgebenden Synovialgewebe des Transplantates nachgewiesen werden (KURODA et al. 2000). Auch 3 Wochen post operationem war noch eine Reaktion vorhanden, die bis 12 Wochen post operationem abnahm und dann nicht mehr nachzuweisen war (KURODA et al. 2000). TGF-β kann immunhistochemisch 10 Tage nach einem Sehnendefekt im Endotenonium nachgewiesen werden, im

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Epitenonium und in Entzündungszellen fiel der Nachweis insgesamt schwächer aus (TSUBONE et al. 2004).

2.2.5 Vascular endothelial growth factor

Vascular endothelial growth factor ist ein Homodimer, es existiert in vier verschiedenen Isoformen und gehört in die Gruppe der cystine knot family (MULLER et al. 1997). Die zwei Untereinheiten werden über Disulfidbrücken miteinander verbunden und haben eine Größe von 46-48 kDa (PETERSEN et al. 2003a) Seine Sequenz ist begrenzt homolog zu PDGF und TGF-β. VEGF bindet an Zelloberflächenrezeptoren der Tyrosin Kinase Familie, den kinase domaine receptor und an fms-like tyrosine kinase Rezeptoren (MULLER et al. 1997).

VEGF ist ein hochspezifisches Mitogen. Unter seinem Einfluss entstehen Blutgefäße während der Embryogenese. Die zentrale Rolle von VEGF in der embryonalen Angiogenese hat sich in einer Studie mit heterozygoten VEGF knockout Mäusen gezeigt, die an fatalen Vaskularisierungdefiziten litten (FERRARA et al. 1996). VEGF spielt in pathologischen Prozessen wie der Pathogenese von Tumoren, proliferativen Retinopathien und rheumatoider Arthritis eine Rolle (AIELLO et al. 1994; FAVA et al.

1994; FEINDT et al. 1995; FERRARA 1999). Es wird in osteoarthritischem Knorpel und in Keratinozyten während der Wundheilung gefunden (BIDDER et al. 2000;

CHEUNG u. BRACE 1998). Des weiteren induziert VEGF eine Erhöhung der Gefäßpermeabilität (PAN et al. 1999).

Immunhistochemisch kann VEGF in Tendinozyten von rupturierten Sehnen gefunden werden, nicht jedoch in gesunden Sehnen (PETERSEN et al. 2003a). Für Sehnen ist beschrieben, dass sie häufig innerhalb einer hypovaskulären Zone reißen (JARVINEN et al. 1997; KANNUS u. JOZSA 1991). Im Prozess der Sehnenheilung und Ligamentisation des Transplantates ist die Angiogenese eine Voraussetzung für die Heilungsvorgänge. Mit der Neovaskularisation werden u.a. Entzündungszellen und Fibroblasten an den Defekt transportiert. Dieser Vorgang ist somit ein entscheidender Faktor in der Phase der Revitalisierung (PETERSEN et al. 2003a).

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Eine mRNA-Expression von VEGF ist in Fibroblasten aus Sehnen nachgewiesen worden (JACKSON et al. 1997). Der positive Effekt von VEGF auf die Sehnendefektheilung wird seinem Einfluss als potenter Stimulator der Angiogenese und somit der Versorgung mit Nährstoffen zugeschrieben (THOMOPOULOS et al.

2005). In vivo konnte im Modell am Hund ein fördernder Effekt von VEGF auf Endothelzellen in der Sehne des M. flexor digitalis profundus beobachtet werden (THOMOPOULOS et al. 2005). VEGF wurde zehn Tage nach einem Sehnendefekt immunhistochemisch im Endo- und Epitenonium nachgewiesen (TSUBONE et al.

2004).

2.3 Matrixproteine

Sehnen bestehen aus systematisch organisiertem und dicht gepacktem Bindegewebe, das von Kollagenfasern dominiert wird. Kollagene unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz der Pro-α-Ketten und in der Anzahl der Zuckerreste (LIEBICH 1999). Kollagenmoleküle stellen mit einer Länge von 300 nm und einem Durchmesser von 1,5 nm eines der größten Moleküle im Körper dar (AMIEL u.

KLEINER 1988). Das Tropokollagen als kleinste Einheit besteht aus drei Polypeptidketten, gewunden in einer rechtsdrehenden Tripelhelix (GOODSHIP et al.

1994). Diese Tripelhelix organisiert sich zu Fibrillen, Fasern und Faserbündeln (KJAER 2004). Fibroblasten produzieren diese Kollagenfasern (EDOM-VOVARD u.

DUPREZ 2004). Kollagenfasern können in eine Vielzahl von Kollagentypen unterteilt werden. Eine adulte Sehne besteht zu 95% aus Kollagen Typ I, mit einem geringen Anteil an Kollagen Typ III und V. Die Typen III und V sind mit der intratendinösen Vaskularisierung und den umhüllenden Membranen assoziiert (GOODSHIP et al.

1994; LIEBICH 1999). So werden die Kollagenfasern vom Endotenonium umgeben;

die gesamte Sehne wird vom Peri- und Epitendineum umhüllt (BENJAMIN u.

RALPHS 2000). Die Hauptaufgabe von Sehnen ist die Übertragung der Kraft des Muskels auf den Knochen (EDOM-VOVARD u. DUPREZ 2004). Weitere Bestandteile der Matrix sind neben Kollagen vor allem Elastin, Proteoglykane und Glykoproteine (LIEBICH 1999).

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Eine Störung der Kollagensynthese liegt dem erblichen Ehlers-Danlos-Syndrom (Typ I-VII), in Folge verschiedener Mutationen in Kollagen kodierenden Genen zugrunde (MALFAIT u. DE PAEPE 2005). Dieses Syndrom äußert sich in Überdehnbarkeit und erhöhter Verletzlichkeit der Haut; Überstreckbarkeit der Gelenke und verstärkter Blutungsbereitschaft durch Ruptur großer Gefäße (DAHME et al. 1999). Die Osteogenesis imperfecta ist ebenfalls eine erbliche Erkrankung. Sie kann sowohl autosomal dominant; als auch autosomal rezessiv insbesondere in Folge von COL1A1 und COL1A2 Mutationen auftreten (MULLER et al. 1977; SYKES et al.

1977). Charakteristisch sind die Defekte des Kollagenmetabolismus sowohl in knöchernen als auch in bindegewebigen Strukturen. Der Anteil an Kollagen Typ III nimmt zu; während ein Defizit an alpha2-Ketten besteht. Ebenso sind Abnormalitäten in den Proportionen der Kollagenverbindungen im Knochen und Bindegewebe zu beobachten (MULLER et al. 1977; SYKES et al. 1977).

Entsprechende knockout Mäuse zeigen eine abnormale Kollagenstruktur in sämtlichen Geweben, Sehnen eingeschlossen (EDOM-VOVARD u. DUPREZ 2004).

So konnte erst kürzlich bei Mäusen mit einer Deletion im ersten Intron des Kollagen I kodierenden Col1a1 Gens eine Ruptur der Aorta beobachtet werden (MARJAMAA et al. 2006). Kollagen Typ III knockout Mäuse zeigen ebenso wie Kollagen Typ V knockout Mäuse eine abnormale Fibrillogenese von Kollagen Typ I (ANDRIKOPOULOS et al. 1995; LIU et al. 1997).

2.3.1 Kollagen I

Kollagen Typ I besteht aus zwei gleichartigen Peptidketten (α1) und zusätzlich einer anderen Kettenvariante (α2). Es ist mit ca. 30-35% der häufigste Kollagentyp des Körpers und findet sich in Haut, Sehnen, Faszien, Knochen, Gefäßen, inneren Organen und im Dentin (LIEBICH 1999). Typ I Kollagen bildet Fibrillen mit einem großen Durchmesser (ca. 200 nm), die ungefähr 95% des gesamten Kollagens in normalen Sehnen ausmachen (AMIEL et al. 1984; GOODSHIP et al. 1994; VON DER MARK 1981). Die charakteristische Anordnung von großen, häufig scherengitterartig ineinander greifenden Fibrillen, verleiht den Sehnen ihre

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außergewöhnlich hohe Reißfestigkeit. Zwischen den Kollagenmolekülen bilden sich Querverbindungen aus, die die mechanische Belastbarkeit beeinflussen.

In Sehnen kommt es bereits eine Woche nach einer Verletzung zu einem erhöhten Anstieg der COL1A1 mRNA-Expression von Typ I Kollagen. Diese Werte von Kollagen I können bis zu 6 mal höher liegen als Kollagen III (DAHLGREN et al.

2005a). Durch mechanische Belastung wird die Kollagen I Expression gefördert (KIM et al. 2002). TGF-β1 kann je nach Konzentration die Expression von Kollagen I bis zu 2,2fach steigern (KIM et al. 2002). In vitro konnte die Zugabe von FGF2 in eine Zellkultur von Knochenmarkzellen deren Kollagen I mRNA-Expression signifikant steigern (HANKEMEIER et al. 2005). Bei einem Gentransfer von PDGF in eine Zellkultur aus Tendinozyten von der Ratte konnte ein Steigerung der Genexpression von COL1A1 um 125% erzielt werden (WANG et al. 2004). Durch Förderung der Synthese und der Anordnung von bestimmten Kollagenen im Sehnendefekt, insbesondere Kollagen Typ I, hofft man, das funktionelle Ergebnis optimieren zu können (An u. FRIEDMAN 1999).

2.3.2 Kollagen III

Kollagen Typ III formt Fibrillen mit einem kleinen Durchmesser (ca. 40 nm). Es findet sich im Epi- und Endotenon von gesunden Sehnen und macht weniger als 5% des gesamten Kollagengehaltes in Sehnen aus (AMIEL et al. 1984). Nach Verletzungen wird die Expression von Kollagen Typ III hoch reguliert (WILLIAMS et al. 1980). Die Verteilung des Fibrillendurchmessers in heilenden Sehnen verändert sich von Fibrillen mit ursprünglich großem Durchmesser zu einer Dominanz von Fibrillen mit kleinem Durchmesser. Die Zunahme des Kollagen III Gehaltes in heilenden Sehnen könnte letztendlich die Reißfestigkeit der Sehnen vermindern (DAHLGREN et al.

2005a; HUNT 2003).

Entsprechend konnte in einer Studie an Pferden in gesunden Sehnen nur eine niedrige mRNA-Expression von Typ III Kollagen gemessen werden (DAHLGREN et al. 2005a). Nach einer zugeführten Verletzung war Kollagen Typ III immunhistochemisch innerhalb der ersten zwei Wochen im Endotenonium

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detektierbar. In der vierten bis achten Woche breitete es sich von dort ausgehend immer mehr aus. Dort konnte es auch nach 24 Wochen post operationem noch nachgewiesen werden (DAHLGREN et al. 2005a).

Die Ausbildung von Kollagen III kann ebenso wie bei Kollagen I durch mechanische Belastung von Fibroblasten aus dem humanen Kreuzband in vitro gefördert werden (KIM et al. 2002). Jedoch wird COL3A1 mit einer 2,69fachen Expression im Vergleich zu COL1A1 mit einer 1,63fachen Expression stärker exprimiert (KIM et al. 2002). Die COL3A1 mRNA-Expression kann in vitro durch Zugabe von FGF2 signifikant gesteigert werden (HANKEMEIER et al. 2005).

2.4 Zytoskelett

2.4.1 Alpha smooth muscle actin

Alpha smooth muscle actin (α-SMA) ist ein zytoskelettales Protein, das mit Zellphagozytose, -migration und -kontraktion assoziiert wird (HERMAN 1993). Dieses Protein weist sechs Isoformen auf, die sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden (HERMAN 1993). Zwei dieser Isoformen, β und γ, werden in praktisch allen Zellen gefunden, während die anderen vier α-Isoformen als Differenzierungsmarker von Muskelzellen angesehen werden. Diese α-SMA Isoform wurde in Perizyten ebenso wie in glatten Muskelzellen, welche die Gefäße umgeben, identifiziert (SKALLI et al. 1989). α-SMA wird als die kontraktile Form des Aktins bezeichnet (MASUR et al. 1996). α-SMA hat sich auch als entscheidende Komponente des kontraktilen Apparates von Myofibroblasten herausgestellt (JESTER et al. 1995) und wird als charakteristisch für Myofibroblasten angesehen (MASUR et al. 1996). SMA ist in regenerierendem Bindegewebe wie Haut, Meniskus (AHLUWALIA et al. 2001), Knorpel (WANG et al. 2000), Band (FARYNIARZ et al.

1996), und Sehnen (HARTZEL et al. 2001) gefunden worden.

α-SMA positive Zellen sind im gesunden humanen Kreuzband nachgewiesen worden (MURRAY et al. 2004), ebenso wie im intakten Kreuzband des Schafes (UNTERHAUSER 2004). Im VKB des Schafes ist die Nukleusmorphologie

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homogener im Vergleich zu der des Menschen, dementsprechend sind α-SMA positiv gefärbte Zellen nicht von der Lokalisation, sowie der Blutgefäßdichte beeinflusst (MURRAY et al. 2004). Ebenso wurde gezeigt, dass TGF-β1 den α-SMA Gehalt steigert (GAULDIE et al. 1999). Diese Expression von ACTA2 ermöglicht eventuell die Kontraktion der Enden eines rupturierten Kreuzbandes (MURRAY et al. 2004).

Dieser Umstand könnte die Ursache dafür sein, dass es bei einer kompletten Ruptur des vorderen Kreuzbandes zu keiner Heilung kommt (MURRAY et al. 2004;

PREMDAS et al. 2001).

2.5 Schlußfolgerung

Diese Arbeit ist Teil einer interdisziplinären Studie zum Ersatz des vorderen Kreuzbandes bei offenen Wachstumsfugen im Schafmodell. Als bereits etabliertes Tiermodell für den Kreuzbandersatz beim Menschen, wurde das Schaf ausgewählt.

Aufgrund der steigenden Inzidenz der kindlichen Kreuzbandruptur wird in der Literatur zunehmend auf das mangelnde Basiswissen und die Notwendigkeit weiterer experimenteller und klinischer Studien hingewiesen (SEIL et al. 2003; SPONSELLER u. STANITSKI 2001). Ziel dieser Studie ist es, durch histologische Untersuchungen sowie eine Genexpressionsanalyse den Prozess der Ligamentisation und die Sehnendefektheilung in einem Modell juveniler Schafe zu analysieren. Damit soll das Fenster zwischen den bereits bestehenden Studien für fetale Individuen einerseits und adulte Individuen andereseits geschlossen werden. Als Hypothese wird vermutet, dass diese Heilungsprozesse im Vergleich zu adulten Individuen schneller ablaufen.

In ihrem Entwicklungsstand sollen die im Versuch eingesetzten Schafe zum Zeitpunkt der Operation dem eines Menschen im Alter von 8 Jahren entsprechen.

Dementsprechend sollten sie sich vor der Operation in einem präpubertären Alter befinden und im Laufe der Beobachtungen die Geschlechtsreife erlangen. Zum Zeitpunkt der Operation sind die Schafe vier Monate alt. In diesem Alter ist bei Schafen mit einem geschätztem Restwachstum von 15% zu rechnen (SEIL 2002)

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Schafe erlangen im Alter von 6-7 Monaten die Geschlechtsreife (ZETTL u. BRÖMEL 1994).

Die Vielfalt der eingesetzten Methoden wie der quantitativen reverse transcriptase (qRT)-PCR, Histologie mit Histomorphometrie, Immunhistochemie (IHC) und Elektronenmikroskopie (EM) soll einen umfassenden Einblick in die Prozesse nach autologem Ersatz des Kreuzbandes und der Sehnendefektheilung ermöglichen. Auf der Basis einer gründlichen histologischen Verlaufsstudie sollen die Resultate der qRT-PCR, IHC und EM den einzelnen Heilungsphasen zugeordnet werden. Durch die Genexpressionsanalyse der untersuchten Wachstumsfaktoren, Kollagene und zytoskelettalen Bestandteile die eine Sehnenheilung initiieren und die Zellen und Moleküle während der Ligamentisation im Transplantat kontrollieren, soll ein wesentlicher Beitrag zum Verständnis der Vorgänge geleistet werden. Parallel sollen die gewonnenen Erkenntnisse einer Prognose über die Leistungsfähigkeit und Belastbarkeit von Sehnenverletzungen bei verletzten juvenilen Tieren in der Veterinärmedizin dienen.

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3 Material und Methoden

3.1 Studienaufbau

Bei 32 weiblichen Schwarzköpfigen Fleischschafen im Alter von 4 Monaten wurde ein operativer Ersatz des kranialen Kreuzbandes vorgenommen. Nach einem Zeitraum von 3, 6, 12 und 24 Wochen post operationem wurden jeweils 8 Tiere je Gruppe euthanasiert (Abb. 3.1).

A B

Knorpelbiomechanik destruierende biomechanische

Testung Knie Kinematik Genexpressionsanalyse (qRT-PCR)

Immunhistochemie Histologie

Elektronenmikroskopie

32 Schwarzköpfige Fleischschafe

Je Gruppe n=8

3Wochen 6Wochen 12 Wochen 24Wochen

Abb. 3.1 Aufbau der Gesamtstudie. Je zwei Schafe werden im Rahmen dieser Arbeit mit den Methoden aus Kreis A analysiert. Die anderen sechs Schafe aus jeder Gruppe werden mit den Methoden B untersucht.

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Von je zwei Tieren wurden eine Genexpressionsanalyse, histologische, immunhistologische und elektronenmikroskopische Analysen von ausgewählten Proben beteiligter Strukturen des Knies durchgeführt (Abb. 3.1. A). Proben von sechs Tieren aus jeder Gruppe wurden biomechanisch in einer weiteren Studie des Gesamtprojektes aufgearbeitet (Abb. 3.1. B). Die linke, nicht operierte Gliedmaße lieferte die jeweiligen Vergleichsproben. Aus einem anderen genehmigten Versuch konnten die Hintergliedmassen von 2 Schwarzköpfigen Fleischschafen im Alter von 4 Monaten als sogenannte Zeitpunkt Null (ZP-0) Tiere oder Referenztiere verwendet werden. Der Tierversuch wurde von der zuständigen Behörde Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) unter der Tierversuchsnummer 05/933 genehmigt.

3.2 Patientenmaterial

3.2.1 Tierhaltung und präoperative Fütterung

Nach Erhalt der Genehmigung wurden die Tiere im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover eingestallt.

Es wurden 32 juvenile weibliche Schwarzköpfige Fleischschafe im Alter von vier Monaten in vier Gruppen zu je acht Tieren aufgeteilt. Die Schafe stammten vom Niedersächsischen Schafverwertungsdienst und wurden zum Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover geliefert.

Vor Anlieferung und Einstallung sind alle Schafe mit Albendazol (Valbazen©, Pfizer, Karlsruhe) oder Moxidectin (Cydectin©, Fort Dodge, Würselen) gegen Endoparasiten behandelt worden. Auch wurde eine Klauenpflege vom jeweiligen Züchter durchgeführt.

Bei Einstallung ins Tierlabor wurden alle Schafe einer klinischen Allgemeinuntersuchung unterzogen und gewogen. Nur Schafe in einwandfreiem Gesundheitszustand wurden eingestallt. Das Körpergewicht betrug vor der Operation zwischen 28,0 und 35,8 kg. Vor Beginn des Versuchs standen die Tiere zur

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Eingewöhnung und Quarantäne 14 Tage in Vierergruppen auf einer mit Stroh eingestreuten Box von 2,5x3 m.

Die Schafe bekamen eine tägliche Fütterungsration von ca. 1 kg Heu und zusätzlich 100-200 g pelletiertes Mischfutter (Ergänzungsfuttermittel für Zuchtschafe (Hg 58 S;

Raiffeisen) pro Tier. Wasser stand über Selbsttränken ad libitum zur Verfügung.

Außerdem wurde den Schafen ein Mineralleckstein (Mineralleckmasse für Schafe, KAWO, Hildesheim, Deutschland) als Zusatzfutter angeboten. Sie wurden täglich an menschlichen Kontakt gewöhnt, betreut und medizinisch überwacht.

24 Stunden vor der OP wurde das jeweilige Tier in eine nicht eingestreute Box mit freiem Zugang zu Wasser nüchtern gestellt.

3.2.2 Prämedikation und Narkose

Eingeleitet wurde die Narkose mit einer Bolusinjektion des Injektionsnarkotikums Propofol (Propofol-®Lipuro 1%; B. Braun Melsungen AG, Deutschland) in einer Dosierung von ca. 6 mg/kg über eine Venenverweilkanüle (BD Adsyte Pro®, 1,3 x 45 mm, Becton Dickinson SA, Madrid) in der Vena cephalica antebrachii. Anschließend wurden die Tiere mit einem Endotrachealtubus (Innendurchmesser 8 mm)(Medos Medizintechnik GmbH, Stolberg) orotracheal intubiert, ebenso wurde eine Pansensonde geschoben. Dexpanthenol (Bepanthen Roche; Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) wurde auf die Augen appliziert. Als Prämedikation erhielten die Tiere Midazolam (Midazolam-Curamed®- Injektionslösung; CuraMED Pharma GmbH, Deutschland), zur Gruppe der Ataraktika/Sedativa gehörend, in einer Dosierung von 0,15 mg/kg i.v. zur Sedation.

Zur intra- und postoperativen Analgesie wurden 0,01 mg/kg Buprenorphin (Temgesic® Essex Pharma GmbH) i.m. und das nichtsteroidale Antiphlogistikum Carprofen (Rimadyl®, Pfizer GmbH, Karlsruhe), in der Initialdosis von 4 mg/kg, je zur Hälfte s.c. und i.v. eingesetzt. Während dieser Vorbereitungsphase wurde Propofol nach Wirkung nachdosiert.

Nach der Vorbereitung wurden die Schafe in der OP Saal gebracht. Dort wurden die Schafe an ein halbgeschlossenes Narkosekreissystem (Fabius Beatmungsgerät,

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Dräger Medical Deutschland GmbH, Lübeck) angeschlossen und zur Aufrechterhaltung der Normokapnie mittels intermittierender positiver Druckbeatmung (IPPV) künstlich ventiliert. Zur Narkoseerhaltung während des Eingriffs wurde Isofluran (Forene®, Abbott GmbH & Co. KG, Deutschland) verwendet, als Trägergas diente Sauerstoff. Ausreichend zur Narkoseerhaltung waren Isofluran- Werte von durchschnittlich 2,4 vol.-% in der endtidalen Exspirationsluft. Neben der Kontrolle der Normokapnie (PECO2: 40mm Hg) erfolgte eine Überwachung des Blutdruckes mittels einer Blutdruckmanschette (small adult, Nr. 572472, Datex- Ohmeda GmbH, Freiburg, Deutschland). Die Messung und Aufzeichnung wurden über das Überwachungsgerät Cardiocap 3 (Datex-Ohmeda GmbH, Freiburg, Deutschland) gesichert.

Je 5 Minuten vor der Entnahme des Sehnensplits und Eröffnung des Kniegelenkes wurden 1-2 µg/kg des Opioidanalgetikums Fentanyl (Fentanyl-Janssen®, Janssen- Cilag GmbH, Deutschland), zur zusätzlichen Analgesie über den venösen Zugang injiziert. Bei Bedarf wurden 4-8 mg Midazolam (Midazolam-Curamed®- Injektionslösung; CuraMED Pharma GmbH, Deutschland) zur Narkosevertiefung nachdosiert.

Während der OP erhielten die Tiere 5-10 ml/kg/h Ringer-Laktat-Lösung. Der venöse Zugang wurde in der Aufwachphase nach der Operation wieder entfernt.

Eine perioperative Antibiose erfolgte direkt vor dem Eingriff mit einem Langzeitpenicillin i.m in einer Dosierung von 5 mg/kg Procain-Benzylpenicillin (Langzeitpenicillin und Dihydrostreptomycin, aniMedica, Senden-Bösensell). Am Tag zwei und vier post OP wurde die Applikation in gleicher Dosierung subkutan wiederholt. Buprenorphin wurde entsprechend der oben genannten Dosierung 6-8 Stunden nach der ersten Applikation am Tag des Eingriffs und am ersten postoperativen Tag s.c. injiziert, 2 mg/kg Carprofen täglich bis zu drei Tage post OP s.c. Je nach Ausprägung der Lahmheit und Stand des Allgemeinbefindens erhielten die Schafe länger oder wiederholt Carprofen (2 mg/kg).

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3.2.3 Operationstechnik

Alle Operationen wurden von demselben Chirurgen mit derselben Methode durchgeführt. Das Schaf wurde in Rückenlage gelagert. Die rechte Hinterextremität wurde nicht ausgebunden, die anderen Extremitäten wurden fixiert. Das betroffene Bein war bereits rasiert und gewaschen, nach abschließender Desinfektion des Beines mit Braunoderm© wurde das Schaf steril abgedeckt.

Die Transplantatentnahme erfolgte an der ipsilateralen Extremität über eine 4 cm lange posterolaterale Inzision unmittelbar proximal des Tuber calcanei beginnend.

Nach Eröffnung der gemeinsamen Sehnenscheide wurde zunächst die zweibäuchige Sehne des M. gastrocnemius, darunter die Sehne des M. flexor digitalis superficialis präpariert. Die entnommenen Sehnen wurden in NaCl getränkten Kompressen gelagert. Unter Schonung der Bursa calcanei wurde von beiden Sehnen ein 60mm langer und etwa 2 mal 3 mm im Querschnitt haltender Split entnommen. Mit einem 2- 0 PDS©`-Faden wurde die Sehnenscheide wieder adaptiert. Der subcutane Wundverschluss erfolgte fortlaufend mit einem 3-0 Vicryl Plus©-Faden, die Haut wurde mit einem 3-0 Monocryl©-Faden in Form von Einzelheften adaptiert. Es wurde ein steriler Verband angelegt.

Die Präparation des Transplantates erfolgte auf einer dafür vorgesehenen Vorrichtung („Graft Master II“). Die beiden Sehnenteile wurden längs aneinandergelegt und an ihren Enden über eine Länge von je 20mm mit einem Ethibond Excel Faden der Stärke 0 über sog. „baseball stitches“ zu einem im Querschnitt runden Transplantat mit einem Durchmesser von 4,5 mm vernäht. Bis zum Einziehen des Transplantates erfolgte die Konditionierung über ein sogenanntes pre-tensioning auf dem Graft Master II mit einer definierten Kraft von 15 pounds. Um eine Austrocknen zu verhindern wurde das Transplantat nun erneut in feuchten NaCl Kompressen verwahrt.

Die Schnittführung zur Arthrotomie und Resektion des kranialen Kreuzbandes erfolgte im Sinne eines anteromedialen Zuganges, beginnend 3 cm proximal des oberen Patellapoles bis an den medialen Aspekt der Tuberositas tibiae distal. Es folgte die Präparation auf das Retinakulum mediale und sorgfältige Durchtrennung

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etwa 5mm medial des Ansatzes an der Patella zur späteren Refixierung. Blutungen wurden durch den Einsatz einer bipolaren Pinzette gestillt. Nach Eröffnung der Gelenkkapsel wurde der Hoffa Fettkörper partiell reseziert. Es erfolgte nun die Luxation der Patella nach lateral.

Das vordere Kreuzband mit seinem anteromedialen und posterolateralen Bündel wurde dargestellt. Nach vollständigem Freipräparieren wurde es mit dem Skalpell ansatznahe reseziert. Es erfolgte dann unter Sicht die Ablösung aus dem Ursprungsbereich am lateralen Femurkondylus.

Medial der Tuberositas tibiae wurde nun bis auf das Periost freipräpariert. Für ein zielgenaues Bohren wurde ein Zielgerät („ACL Tip Aimer©“)in einem Winkel von 45°

angesetzt und in Richtung des laterocaudalen Ansatzbereiches des anteromedialen Bündels gebohrt. Die Bohrung erfolgte zunächst mit einem 2,4 mm starken Bohrdraht, anschließend zur Erweiterung des Bohrkanals mit dem 4,5 mm Endobutton-Bohrer©. In einer transtibialen Technik wurde nun unter Schonung des hinteren Kreuzbandes mit dem 2,4mm Bohrdraht der femorale Tunnel im Ursprungsbereich des resezierten Kreuzbandes vorgelegt. Auch hier erfolgte ein Überbohren mit dem 4,5 mm Endobutton Bohrer©. Durch diese Methode wurde sowohl die femorale als auch die tibiale Epiphysenfuge durchbohrt. Mit einer Messlehre wurden der femorale und tibiale Tunnel in seiner Länge vermessen, ebenso die Gesamtlänge bestimmt. Diese lag in einem Bereich von 65 bis 80 mm.

Entsprechend der Tunnel- und Gesamtlänge konnte nun das Transplantat mit dem Endobutton© derart verknüpft werden, dass jeweils proximal und distal 15-20 mm des Sehnengewebes sicher im Knochentunnel zu liegen kamen. Die Fadenschlinge zwischen Transplantat und Endobutton© war also bei einer femoralen Tunnellänge von 30 mm ca. 10 mm lang. Der Knoten der Fadenschlinge kam transplantatnah zu liegen. In den Endobutton© wurde ein Ethibond Excel©-Faden der Stärke 5 als Zugfaden und ein Ethibond Excel© Faden der Stärke 2 als sogenannter Flipfaden eingezogen.

Zum Einziehen und Fixieren des Transplantates wurde der Bohrdraht mit Öse retrograd durch die Bohrkanäle geführt und am lateralen distalen Oberschenkel perkutan ausgeleitet. Das Ende des Bohrdrahtes wurde mit einer Fadenschlinge

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armiert. Durch diese Fadenschlinge wurden sowohl Zug- als auch Flipfaden gelegt.

Beim vollständigen Durchziehen des Bohrdrahtes wurde nun mit der Fadenschlinge der Zug- und Flipfaden durch die Bohrkanäle gezogen, um lateral auf dem Oberschenkel aus der Haut zu treten. Mit Hilfe des Zugfadens konnte nun das Transplantat eingezogen werden, bis der Endobutton© die laterale Kortikalis des Femurs sicher zur Gänze überschritten hat. Mit dem Flipfaden wurde der Endobutton© umgekippt, also quergestellt und somit auf der lateralen Femurkortikalis positioniert. Durch 20 Bewegungszyklen und Zug nach distal wurde nun das Transplantat weiter präkonditioniert. Nach Aufbau einer Spannung von 20 pounds mit Hilfe des Tensiometers© wurde das Transplantat über seine Fäden an dem Fixationsknopf Suture Washer© fixiert.

Schliesslich erfolgte ein schichtweiser Wundverschluß. Vernäht wurde zunächst die Muskulatur in Einzelheften mit einem 2-0 Mersilene©-Faden, das mediale Patellahalteband und die Gelenkkapsel mit einem 3-0 Vicryl Plus©-Faden. Die Oberschenkelfaszie wurde fortlaufend mit einem 2-0 PDS©-Faden und die Unterhaut mit einem 3-0 Vicryl Plus©-Faden vernäht. Die Haut wurde wiederum in Einzelheften mit einem 3-0 Monocryl©-Faden adaptiert.

Es wurden keine Verbände oder Bandagen angebracht, dafür wurde abschließend ein transparenter Sprühverband angelegt.

3.2.4 Tierhaltung und Fütterung post operationem

Post-operativ wurden die Schafe in der Aufwachphase und in der folgenden Nacht in einer Einzelbox mit den Maßen 1,2 m x 1,6 m aufgestallt, um eine Bewegungseinschränkung im frisch operierten Zustand zu gewährleisten. Auch diese Box war mit Stroh eingestreut und Wasser stand ad libitum zur Verfügung; Heu und Kraftfutter erhielten die Tiere wegen der Gefahr einer Schlundverstopfung ab dem ersten Tag post operationem.

In den folgenden 7-10 Tagen standen die Tiere in einer Gruppe von 2-8 Tieren in einem Stall mit der Grundfläche von 12m2 mit Stroh als Einstreu. Es wurde täglich eine Wundkontrolle und Schmerzbewertung durchgeführt.

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