Tierärztliche Hochschule Hannover
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken Klinik für Kleintiere
Spermienverteilung und –vitalität im Genitale der
Hündin im Zeitraum der postovulatorischen Oozytenreifung
INAUGURAL - DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
― Doctor medicinae veterinariae ― (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Inga Karre
(Goslar)
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel
1. Gutachter: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Niemann
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2008
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 9
2 Literaturübersicht 11
2.1 Fortpflanzungsdaten – Tierartlich vergleichend 11 2.1.1 Deponierung des Spermas im weiblichen Genitale bei Paarung 12
2.1.2 Oozytenreifung 13
2.2 Sexualzyklus der Hündin (Physiologie inkl. Endokrinologie) 14
2.2.1 Zyklusdauer und Phasen 14
2.2.2 Endokrinologie 15
2.2.3 Sonographische Befunde bei der Hündin um die Ovulation 17
2.3 Spermientransport und -verteilung 17
2.3.1 Weg der Spermien bis zum Befruchtungsort 17
2.3.2 Aktiver und passiver Spermientransport 18
2.3.3 Spermienbarrieren und Reservoire 19
2.3.4 Spermienverteilung im weiblichen Genitale tierartvergleichend 22 2.3.5 Regulation der Spermienkapazitation im Eileiter 26 2.3.6 Umverteilung der Spermien im periovulatorischen Zeitraum 30
3 Material und Methoden 32
3.1 Tiere 32
3.2 Versuchsdurchführung 32
3.2.1 Untersuchungszeitpunkt 32
3.2.2 Klinisch-gynäkologische und vaginalzytologische Untersuchung 34
3.2.3 Progesteronanalyse 34
3.2.4 Sonographie 35
3.2.5 Samengewinnung, Samenuntersuchung 36
3.2.6 Insemination 37
3.2.7 Organgewinnung 37
3.2.8 Präparation, Spülung und Fixierung von Eileiter und Uterushorn 38 3.2.9 Untersuchung der Spülflüssigkeit von Eileiter und Uterushorn 39 3.2.10 Präparation der Organproben für die histologische Untersuchung 41 3.2.11 Erfassung der Spermien in Eileiter und Uterus 44
3.2.12 Statistische Auswertung 45
4 Ergebnisse 47
4.1 Ovulation und Besamung 47
4.2 Spermiengehalt in der Spülflüssigkeit 48
4.3 Oozyten 52
4.4 Spermienverteilung im Eileiter 52
4.4.1 Anzahl und Verteilung der Spermien im Eileiter 53 4.4.2 Vergleich: links-rechts und gespült-ungespült im Eileiter 56
4.5 Spermienverteilung im Uterus 57
4.5.1 Spermienverteilung in den Drüsen: Gruppe 1 versus Gruppe 2 58 4.5.2 Vergleich: links-rechts und gespült-ungespült im Uterus 62
4.6 Spermienverteilung im gesamten Genitaltrakt 64
4.7 Anzahl der Spermien pro Hündin 65
5 Diskussion 66
5.1 Versuchsdurchführung 66
5.2 Ergebnisse der Spermienverteilung durch Spülung und histologische
Auszählung 70
5.3 Schlussfolgerungen 77
6 Zusammenfassung 79
7 Summary 81
8 Literaturverzeichnis 83
9 Anhang 104
Tabellenverzeichnis 113
Abbildungsverzeichnis 114
Danksagung 115
Abkürzungsverzeichnis
ca. circa
bzw. beziehungsweise
d.h. das heißt
et al. (lat. et alii) und andere evtl. eventuell
FSH Follikelstimulierendes Hormon GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon LH Luteinisierendes Hormon
OEC Epithelzellen des Ovidukts
P4 Progesteron
post ov. post ovulationem u. a. unter anderem
UTV uterotubale Verbindung z. B. zum Beispiel
9
1 Einleitung
Die Hündin hat mit durchschnittlich sieben Monaten den längsten Zyklus unter den Haussäu- getieren (HOPPEN 1990). Gleichzeitig ist auch die Dauer des Östrus mit durchschnittlich neun Tagen (individuelle Schwankungen von zwei bis 21 Tagen) am längsten, die Ovulation erfolgt im Allgemeinen zwei Tage nach Einsetzen der Deckbereitschaft (HOLST u.
PHEMISTER 1971; PHEMISTER et al. 1973; BOUCHARD et al. 1991).
Bei der Ovulation werden bei der Hündin Oozyten erster Ordnung freigesetzt, die innerhalb von 60 Stunden die erste Reifeteilung abschließen und damit zu befruchtungsfähigen Oozyten zweiter Ordnung werden (TSUTSUI 1989). REYNAUD et al. (2005) beobachteten zusätzlich, dass die Oozyten nach 54 Stunden das befruchtungsfähige Metaphase-II-Stadium erreicht haben, die Befruchtung selbst jedoch erst nach weiteren 29 Stunden erfolgte, obwohl Oozyten und Spermien zur gleichen Zeit und am gleichen Ort anwesend waren. Bei anderen Autoren wird schon früher von einer Fusion von Eizelle und Samenzelle berichtet (HOLST u.
PHEMISTER 1971).
Aufgrund individueller Eigenarten bezüglich des Beginns und der Dauer des Östrus kann der Deckakt zwischen fünf und neun Tagen vor, bis acht Tage nach der Ovulation erfolgen (CONCANNON et al. 1989; ENGLAND et al. 1989). Damit es zur Befruchtung kommen kann, bedarf es besonderer, tierartspezifischer Strategien für das Überleben der Gameten im Genitaltrakt der Hündin. Es ist schon sehr lange bekannt, dass die Spermien bis zu elf Tage in der Hündin überleben können (DOAK et al. 1967; ENGLAND et al. 1989)
Nach CONCANNON et al. (1983) ist eine potenzielle postkoitale fruchtbare Lebensspanne von Hundespermien von mindestens sechs Tagen anzunehmen. Erfolgt die Bedeckung oder Besamung zum Zeitpunkt der Ovulation, müssen die Spermien zumindest noch ca. 2 Tage
„abwarten“, bis die Oozyten ihre Befruchtungsfähigkeit erreicht haben. Am Ort der Befruch- tung muss ein Verhältnis von männlichen zu weiblichen Gameten von nahezu eins-zu-eins erzielt werden, damit es nicht zur Polyspermie und damit zu einer fehlgerichteten Entwick- lung kommt (HUNTER 1996, 2008).
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RIJSSELAERE et al. (2004) fanden in ihrer Studie heraus, dass der Zeitpunkt der Besamung im Verhältnis zur Ovulation den Spermientransport beeinflusst und dass bei der Hündin die uterotubale Verbindung und die uterinen Drüsen als Spermienreservoir fungieren.
Ziel der vorliegenden Studie ist es nachzuweisen, ob es
1. am Anfang des Befruchtungszeitraums Tag 2 bis 4 post ovulationem zur Umvertei- lung von Spermien im Genitaltrakt der Hündin und
2. zur Befruchtung von Oozyten kommt.
11
2 Literaturübersicht
2.1 Fortpflanzungsdaten – Tierartlich vergleichend
Der weibliche Sexualzyklus und damit auch der Zeitpunkt der Befruchtung ist bei den ver- schiedenen Haustierspezies sehr unterschiedlich ausgeprägt, was auch Unterschiede in der Reproduktionstechnologie nach sich zieht.
Der Besamungszeitpunkt orientiert sich in der Regel an der Ovulation, um optimale Vorraus- setzungen für das Zusammentreffen von befruchtungskompetenten Spermien und befruch- tungsfähigen Eizellen zu schaffen. Bei einigen Spezies wird jedoch auch die Phase der Paa- rungsbereitschaft als Orientierungspunkt heran gezogen (siehe Tabelle 1, Seite 11).
Tabelle 1: Fortpflanzungsdaten - tierartlich vergleichend
Tierart Östrusdauer OV-Zeitpunkt KB-Zeitpunkt KB-Dosis (Anzahl vorwärtsbeweglicher Spermien)
Rind
(LEIDING 2007)
30-36 Stun- den
6-12 Stunden nach Brunstende
12-24 Stunden nach Brunstbe- ginn
2-5 x 106
bei Flüssigkonser- vierung
Kleine Wieder- käuer
20-40 Stun- den
gegen Brunsten- de
12 und 24 Stun- den nach Brunst- beginn
100-130 x 106 bei Flüssigkonser- vierung
Schwein
(WABERSKI u.
WEITZE 2007)
∅ 2 Tage Zu Beginn des letzten Drittels des Östrus
24 Stunden nach Einsetzen der Brunst, erneut 12- 18 Stunden später
1,5-2,5 x 109
Pferd (BADER u.
SIEME 2007)
5-6 Tage 12-24 Stunden vor Brunstende
24 Stunden vor bis 12 Stunden nach OV
250 x 106
Hund s. Kapitel 2.2 Tag der OV
(GÜNZEL-APEL 1994)
150-200 x 106 (LINDE-
FORSBERG 2001)
12
2.1.1 Deponierung des Spermas im weiblichen Genitale bei Paarung
Im Zuge des Coitus wird das Ejakulat bei Rind, Schaf, Ziege und Mensch vaginal abgesetzt, während Pferd und Schwein als Uterusbesamer bezeichnet werden. (HUNTER 1995;
TÖPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001; COX et al. 2002; SUAREZ 2003). Beim Hund wird das Ejakulat in das kraniale Scheidendrittel abgesetzt, aber es gelangt noch während des Hängens in den Uterus (GÜNZEL-APEL 1994).
Die Uterusbesamer Pferd und Schwein setzen mit 20-120 ml bzw. 200-250 ml großvolumige Ejakulate ab. Die Spermienzahl beträgt 5-15 x 109 beim Pferd und mehr als 30 x 109 beim Schwein (WEITZE 2001; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ et al. 2005). Im Vergleich dazu sind die Ejakulate der Scheidenbesamer (Rind, Schaf und Ziege) klein und hochkonzentriert. Das Ejakulat des Rindes umfasst 5 ml und 1,2 x 106/ml (LEIDING 2007).
Das 0,3-1,5 ml große Ejakulat der Ziege enthält nach den Mindestanforderungen von BUSCH und FISCHER (2007) 0,8 x 106 Samenzellen/µl, und beim Schaf wird ein 0,5-2,0 ml großes Ejakulat mit 1x 106/ml erwartet.
Bei den Fleischfressern Hund und Katze liegen andere Verhältnisse vor. Beim Kater beinhaltet das weniger als 0,01-0,77 ml große Ejakulat 3-153 x 106 Spermien (AXNER 1998).
Beim Hund bestehen aufgrund extremer züchtungsbedingter Unterschiede der Körpergröße bzw. des –gewichts (von < 10 kg bis > 60 kg) und der daran gekoppelten signifikant unterschiedlichen Hodengröße entsprechende Abhängigkeiten insbesondere der Spermienzahl vom Körpergewicht der Tiere (< 10 kg mit durchschnittlich 220 x 106 Spermien, > 60 kg mit durchschnittlich 680 x 106 Spermien). Das Ejakulatvolumen kann in Abhängigkeit von der sekretorischen Aktivität der Prostata sehr variabel sein (GÜNZEL-APEL et al. 1994).
Die fertile Phase der Samenzellen in vivo dauert bei Rind, Schaf und Mensch bis zu 48 Stun- den, beim Schwein bis zu 72 Stunden und beim Pferd bis zu 120 (HAFEZ u. HAFEZ 2000).
Beim Hund beträgt die befruchtungsfähige Lebensspanne der Spermien im Uterus duldungs- bereiter Hündinnen vier bis sechs Tage, doch die Samenzellen können über elf Tage motil bleiben (DOAK et al. 1967; CONCANNON et al. 1983; ENGLAND et al. 1989). Im Allge- meinen sind mit Einsetzen des Metöstrus keine Spermien im Genitale der Hündin mehr nachweisbar (DAOK et al. 1967).
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2.1.2 Oozytenreifung
Die primären Oozyten der meisten Haussäugetiere vollenden periovulatorisch die erste meio- tische Teilung, indem ein LH-Peak die Reifung der Oozyten von der Prophase I zur Metapha- se II auslöst. Dadurch werden bei der Ovulation sekundäre Oozyten freigesetzt (LIEBIG 1999; REYNAUD et al. 2006).
Diese sind bei Rind und Schaf bis zu 24 Stunden befruchtungsfähig, beim Schwein nur bis zu 10 Stunden. Die humanen Eizellen können bis zu 24 Stunden, die Oozyten des Pferds bis zu 18 Stunden post ovulationem befruchtet werden (KOSKINEN et al. 1990; HAFEZ u. HAFEZ 2000).
Beim Hund werden bei der Ovulation Oozyten in der Prophase I über einen Zeitraum von zwölf bis 24 Stunden freigesetzt (TSUTSUI 1973; REYNAUD et al. 2006). Die Penetration der Eizellen durch die Spermien erfolgt in der Metaphase der zweiten Reifeteilung. Erst da- nach wird die zweite Meiose abgeschlossen (REYNAUD et al. 2005). Es findet folglich eine extra-follikuläre Ausreifung der Oozyten statt. Der LH-Peak führt nicht zu einer Fortsetzung der meiotische Teilung (REYNAUD et al. 2006).
Nach OLSON et al. (1984) beginnt die erste Teilung der Meiose einen Tag nach der Ovulati- on, wenn die Eizellen schon die Eileitermitte erreicht haben. Sie ist nach drei Tagen abge- schlossen. Drei Tage nach dem Deckakt konnten HOLST und PHEMISTER (1971) Polkörper bei Eizellen im distalen Eileiter finden. CONCANNON et al. (1989) fanden vier Tage nach LH-Peak vollständig ausgereifte Eizellen.
TSUTSUI (1989) beobachtete, dass Eizellen in den ersten 60 Stunden nach der Ovulation nicht befruchtet werden. In diesem Zeitraum gelangen sie in das distale Drittel des Ovidukts.
Die ersten befruchtungsfähigen Eizellen wurden von REYNAUD et al. (2005) nach 54 Stun- den beobachtet. Die ersten befruchteten Eizellen waren hingegen erst nach 83 Stunden sicht- bar, obwohl Eizellen und Spermien im Eileiter zeitgleich für fast 30 Stunden vorhanden wa- ren. Als spätesten Befruchtungszeitraum geben TSUTSUI und SHIMIZU (1975) 120 Stunden nach der Ovulation an. Entsprechend beschreiben ENGLAND et al. (1989) eine erfolgreiche Bedeckung sieben Tage nach dem LH-Peak, so dass von einer fünftägigen Befruchtungsfä- higkeit der Oozyten auszugehen ist. TSUTSUI und SHIMIZU (1975) gehen von 4 ½ Tagen aus.
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Im Zeitraum von drei bis vier Tagen haben die Oozyten der meisten anderen Säugetiere schon den Uterus erreicht und damit die Wanderung durch den Eileiter beendet (HOLST u.
PHEMISTER 1971).
Bei der Hündin findet die frühe Embryonalentwicklung im Eileiter statt. Erst acht bis zwölf Tage post ovulationem erreichen die Embryonen im Morulastadium den Uterus und migrieren mehrere Tage frei im Uterus (HOLST u. PHEMISTER 1971; RENTON et al. 1991). Am Tag 21-23 findet die Implantation statt (CONCANNON et al. 2001).
2.2 Sexualzyklus der Hündin (Physiologie inkl. Endokrinologie)
2.2.1 Zyklusdauer und Phasen
Auffällig ist die Zyklusdauer beim Hund, die die längste bei den Haussäugetieren beobachtete ist (HOPPEN 1990).
Der Zyklus dauert beim Hund sechs bis acht Monate, schwankt jedoch individuell zwischen fünf und zwölf Monaten (CONCANNON et al. 1989). Nach HEAPE (1900) wird er in vier Phasen gegliedert: Proöstrus, Östrus, Metöstrus und Anöstrus (JÖCHLE u. ANDERSEN 1977).
Der Proöstrus beginnt mit dem Austritt von Läufigkeitssekret aus der Vulva und endet mit dem Einsetzen der Paarungsbereitschaft nach durchschnittlich neun Tagen (mit Schwankun- gen von 3-27 Tagen) (TSUTSUI u. SHIMIZU 1973; HOLST u. PHEMISTER 1974; WILDT et al. 1978; CONCANNON 1986; CONCANNON et al. 1989). In dieser Phase findet an den Ovarien die Follikelreifung statt.
Die Paarungsbereitschaft definiert den darauf folgenden Östrus (im Durchschnitt neun Tage, mit Schwankungen von 2-21 Tagen) (TSUTSUI u. SHIMIZU 1973; WILDT et al. 1978;
CONCANNON 1986; CONCANNON et al. 1989), währenddessen am Eierstock die Ovula- tion und Gelbkörperanbildung erfolgen. Üblicherweise erfolgt etwa zwei Tage nach dem Ein- setzen des Östrus, mit individuellen Schwankungen von ein bis fünf Tagen, die Ovulation, die mindestens zwölf bis 24 Stunden dauert (HOLST u. PHEMISTER 1971; PHEMISTER et al.
15
1973; TSUTSUI 1973; CONCANNON et al. 1977; CONCANNON et al. 1989; TSUTSUI 1989; BOUCHARD et al. 1991; RENTON et al. 1992).
Der Metöstrus beginnt mit dem Abklingen der Paarungsbereitschaft. Zytologisch ist er anhand des Auftretens tieferer Epithelzellen im Vaginalabstrich erkennbar (HOLST u. PHEMISTER 1971). Er setzt sich zusammen aus der Phase höchster Gelbkörperaktivität, der Gelbkörper- regression (bis ca. Tag 65 p.OV) und der Reparation des Endometriums (bis ca. Tag 140 post ov. nach JÖCHLE u. ANDRESEN 1977).
Im Anöstrus befinden sich Ovarien und Endometrium in der Ruhe. An den Ovarien laufen Wellen der Follikelan– und –rückbildung mit unterschwelliger Östrogenaktivität ab (JÖCHLE u. ANDERSEN 1977; OLSON et al. 1982).
2.2.2 Endokrinologie
Die Funktion der Gonaden wird zyklusabhängig durch die Hypothalamus-Hypophysen- Gonaden-Achse gesteuert. Die pulsatile Freisetzung von GnRH aus dem Hypothalamus, das von entsprechenden Neuronen in die Eminentia mediana abgegeben wird und über das Portal- gefäßsystem in den Hypophysenvorderlappen gelangt, führt dort zur FSH- und LH-Synthese und -Sekretion und deren Wirkung auf die Ovarien (HOPPEN 1990; CONCANNON 1993).
Im Anöstrus kommt es zur pulsatilen Freisetzung von FSH und LH, so dass sich Follikel an- und rückbilden. Die FSH-Konzentration steigt allmählich an und leitet die Follikulogenese ein (OLSON et al. 1982; CONCANNON 1993; KOOISTRA et al. 1999).
Die Östrogenkonzentrationen sind mit 20-46 pg/ml 45 Tage vor Proöstrusbeginn erhöht, fal- len aber vor Anfang des Proöstrus wieder auf < 20 pg/ml ab, während die Progesteron-Werte im Anöstrus mit <1 ng/ml basal sind (OLSON et al. 1982).
Im Anöstrus steigen die LH-Konzentrationen bei erhöhter Frequenz der LH-Pulse laut CONCANNON (1993) an, steigende FSH-Konzentrationen stimulieren die Follikelreifung und Graaf´sche Follikel werden angebildet (CONCANNON et al. 1977; KOOISTRA et al.
1999; KOOISTRA u. OKKENS 2001).
Im Zuge der Follikelreifung nimmt die Östrogenproduktion zu, so dass die Östradiol-17β- Konzentrationen von ca. 26 pg/ml auf 46-113 pg/ml ansteigen. Sie erreichen ein bis zwei Ta- ge vor dem LH-Peak ein Maximum und fallen anschließend wieder ab (CONCANNON et al.
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1975). Übersteigt der Östradiol-17β-Spiegel für mindestens 36 Stunden einen Schwellenwert, wird durch den positiven Feedback die LH-Freisetzung potenziert (CONCANNON et al.
1975; HOPPEN 1990; DE GIER et al. 2006). Während HOPPEN (1990) die Rückkopplung des Östradiol-17β hauptsächlich auf hypophysärer Ebene sieht, hypothalamische Einflüsse aber nicht ausschließen kann, vermutet DE GIER et al. (2006) dies auf hypothalamischer E- bene.
Der daraus resultierende LH-Wert übersteigt für 18-96 Stunden einen Schwellenwert (CONCANNON et al. 1975; WILDT et al. 1978; CONCANNON 1986; BADINAND et al.
1993; CONCANNON 1993), was im Vergleich zu anderen Haustieren deutlich länger ist (WILDT et al. 1978).
Die frühe LH-Freisetzung ist assoziiert mit der präovulatorischen Luteinisierung der Granulo- sazellen und führt zu einer präovulatorischen Progesteron-Sekretion der follikulären Granulo- sazellen (CONCANNON et al. 1977; WILDT et al. 1978). Zeitgleich setzt im typischen Fall die Duldungsbereitschaft ein (PHEMISTER et al. 1973; CONCANNON et al. 1977; WILDT et al. 1978).
Der präovulatorische Progesteron-Anstieg stellt eine Besonderheit der Hündin dar (RENTON et al. 1991). Bereits zum Zeitpunkt des LH-Peaks werden Progesteron-Werte von 2-4 ng/ml erreicht (WRIGHT 1990). Durchschnittlich zwei Tage später findet die Ovulation statt
(PHEMISTER et al. 1973; CONCANNON et al. 1977; CONCANNON 1986; BOUCHARD et al. 1991). Zum Zeitpunkt der Ovulation erreichen die Progesteronkonzentrationen Werte von 3,4-6,6 ng/ml (BOUCHARD et al. 1991), 5,5 ng/ml (WRIGHT 1990), 1,88-2,34 ng/ml (HASE et al. 2000), > 5ng/ml (ARBEITER et al. 1991), bzw. 6-10 ng/ml (JEFFCOATE 1998).
Progesteronmaxima werden mit 30-90 ng/ml um Tag 30 nach LH-Peak erreicht. Im Zuge der Gelbkörperregression sinken sie dann bis Tag 60 auf 10 ng/ml ab (JEFFCOATE 1998). Bei graviden Tieren werden zum Zeitpunkt der Geburt Werte < 1ng/ml erreicht (CONCANNON et al. 1975). Insgesamt ist das Verlaufsmuster der Progesteronwerte von nicht tragenden und tragenden Hündinnen vergleichbar, lediglich das Ende ist bei tragenden Tieren durch die Ge- burt klarer definiert (HOPPEN 1990).
17
2.2.3 Sonographische Befunde bei der Hündin um die Ovulation
Sonographisch ist die Ovulation am Verschwinden der anechogenen Follikel und Auftreten hypoechogener Strukturen zu erkennen. Letztere repräsentieren mit Fibrin, Follikelflüssigkeit und lutealem Gewebe angefüllte Follikel (ENGLAND u. YEAGER 1993; HAYER et al.
1993).
Follikel werden von RENTON et al. (1992) mindestens drei bis vier Tage vor der Ovulation mit einem Durchmesser von 6 mm identifiziert. ENGLAND und YEAGER (1993) hingegen konnten schon sechs bis acht Tage vor dem LH-Anstieg Follikel als kleine, bis 1-2 mm große, anechogene Gebilde abgrenzen. Die Follikelwand ist nicht vom ovariellen Stroma zu unter- scheiden. Die maximale Follikelgröße von 4-6 mm wurde einen Tag nach dem LH-Anstieg (ENGLAND u. YEAGER 1993) oder am Tag des LH-Peaks mit 6,9 ± 0,7 mm beobachtet (HAYER et al. 1993). Insgesamt ist das sonographische Bild von Follikeln und jungen Corpo- ra lutea sehr ähnlich, da letztere ein flüssigkeitsgefülltes Antrum besitzen (RENTON et al.
1992).
2.3 Spermientransport und -verteilung
2.3.1 Weg der Spermien bis zum Befruchtungsort
Nach der Kopulation und der Absetzung von Spermien im weiblichem Genitale müssen diese ihre Befruchtungsfähigkeit erlangen und zum richtigen Zeitpunkt den Ort der Befruchtung erreichen. Befruchtungskompetente Samenzellen müssen auf befruchtungsfähige Eizellen stoßen, damit eine erfolgreiche Fusion beider Gameten stattfinden kann. Dazu muss ein ent- gegengerichteter Transport der Keimzellen ermöglicht werden. Ziel des Spermientransports ist folglich, dass die Eizellen von befruchtungsfähigen Spermien in ausreichender Anzahl zum richtigen Zeitpunkt erreicht werden.
Hierzu müssen die Spermatozoen die Zervix passieren (bei Scheidenbesamern), um in den Uterus zugelangen bzw. direkt von dort (bei Uterusbesamern) über die Uterushörner in die Eileiter aufsteigen, bis sie schließlich in der Eileiterampulle ankommen. Diese ist bei der Mehrheit der Tierarten der Ort der Befruchtung. Beim Hund jedoch übernimmt der distale
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Eileiter diese Funktion (TSUTSUI 1989). Bei Hund und Pferd ist der Übergang vom Uterus in den Eileiter durch eine Papille gekennzeichnet, die aus der Gebärmutter in den Eileiter auf- steigende Infektionen verhindern kann (TÖNHARDT 2007).
Histologisch betrachtet bestehen nach LIEBIG (1999) Eileiter, Gebärmutter und Gebärmut- terhals aus Tunica mucosa (Epithelium mucosae, Lamina propria mucosae), Tunica muscula- ris (Uterus: Myometrium), Tela subserosa und Tunica serosa oder Adventitia. Die Tunica mucosa des Ovidukts besteht aus einem einschichtigen hochprismatischen Epithel aus Flim- mer- und Drüsenzellen sowie Stiftzellen. Das uterine hochprismatische Epithel ist bei Pferd und Hund einschichtig (Epithelium simplex columnare), bei Wiederkäuer und Schwein teil- weise mehrreihig (Epithelium pseudostratificum columnare). Die Lamina propria (Stroma endometriales) der Gebärmutter besteht aus spinozellulärem Bindegewebe und tubulär ver- zweigten Uterindrüsen. Hier weisen die Wiederkäuer mit den Karunkeln, knopfförmige Vor- wölbungen beim Rind und napfförmige Einziehungen beim Schaf, eine Besonderheit auf. Das Endometrium unterliegt zyklusabhängigen Veränderungen (LIEBIG 1999; STEINHAUER et al. 2004).
2.3.2 Aktiver und passiver Spermientransport
Die Spermienverteilung im weiblichen Genitaltrakt kann allgemein in drei Phasen gegliedert werden:
1. kurzer, schneller Spermientransport, 2. Kolonisation der Spermienreservoire,
3. langsame, verzögerte Freisetzung der Spermien aus den Reservoiren (HAFEZ und HAFEZ 2000).
Der Transport erfolgt dabei sowohl passiv, durch Kontraktion des Myometriums und der My- osalpinx sowie durch Zilienschlag und Flüssigkeitsstrom im Ovidukt, als auch aktiv, durch die Eigenbewegung der Spermien (VANDEMARK u. HAYS 1954; DOBROWOLSKI u.
HAFEZ 1970; BLANDAU u. GADDUM-ROSSE 1974; BATTALIA u. YANAGIMACHI 1979; DROBNIS u. OVERSTREET 1992; HAFEZ u. HAFEZ 2000; SCOTT 2000;
TÖPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001; LANGENDIJK et al. 2002; CAMPBELL u.
ENGLAND 2004).
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Der passive Transport wird beeinflusst durch den Stimulus des männlichen Tieres bei der Ko- pulation bzw. durch Reize bei der Insemination und die Bestandteile des Seminalplasmas un- ter neurohormoneller Vermittlung (DOBROWOLSKI u. HAFEZ 1970; TÖPFER- PETERSEN u. WABERSKI 2001).
Der initiale, schnelle Spermientransport wird in der Literatur unterschiedlich definiert.
Nach DROBNIZ und OVERSTREET (1992) sowie OVERSTREET und COOPER (1978a) beinhaltet er den Transport einer nicht zur befruchtungsfähigen Population gehörenden Spermien vom Ort der Samendeponierung bis zur Ampulle oder Peritonealhöhle. Danach kommen bis zur periovulatorischen Phase keine weiteren Samenzellen mehr in der Eileiterampulle an. Dagegen verstehen HAFEZ und HAFEZ (2000) darunter die Ankunft der ersten, eventuell an der Befruchtung beteiligten Samenzellen.
Während der Transport durch den Uterus hauptsächlich auf Kontraktionen der Gebärmutter beruht, erfolgt die Besiedlung der Spermienreservoire sowie der koordinierte Aufstieg zum Befruchtungsort aktiv (THIBAULT 1973; SCOTT 2000; TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001; SUAREZ 2003; TÖPFER-PETERSEN 2007).
Die Motilität der Spermien ist abhängig vom Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen, dem Milieu des weiblichen Genitale, dem Energiestoffwechsel und der morphologischen In- tegrität der Spermien (HAFEZ u. HAFEZ 2000).
2.3.3 Spermienbarrieren und Reservoire
Obwohl Millionen bis Milliarden von Spermien speziesspezifisch in die Scheide oder in die Gebärmutter abgesetzt werden, erreichen nur wenige den Ort der Befruchtung (HUNTER 1996). Minimiert wird die Anzahl an Spermatozoen durch partiellen retrograden Spermaver- lust, die anatomischen Barrieren (Zervix bzw. uterotubale Verbindung), die Infiltration des Uterus durch polymorphkernige Granulozyten als Reaktion auf die männlichen Gameten und die darauf folgende Phagozytose (HAFEZ u. HAFEZ 2000). Außerdem gehen auch einige Samenzellen in der Peritonealhöhle verloren. Dieses ist insbesondere im Rahmen des schnel- len, passiven Transports möglich, der bei Rind (VANDEMARK u. MÖLLER 1951;
VANDEMARK u. HAYS 1954), Schaf (QUINLIVAN u. ROBINSON 1969), Schwein (BAKER u. DEGEN 1972) und Kaninchen (OVERSTREET u. COOPER 1978a) beschrieben
20
wird. Bei Rind, Schaf, Pferd und Katze ist eine erhebliche Abnahme der Spermienanzahl im weiblichen Genitale bekannt (PARKER et al. 1975; MITCHELL et al. 1985; LANE et al.
1993; CHATDARONG et al. 2004).
Nach KAEOKET et al. (2002) ist das Befruchtungsergebnis insgesamt abhängig von der fruchtbaren Lebensspanne der Spermien und der Oozyten, der Spermienverteilung, der Sper- mienbindung an den Oozyten und der Spermienverluste.
Art und Anzahl der anatomischen Hürden, welche von den Spermien überwunden werden müssen, sind abhängig vom Ort der Samendeponierung (SCOTT 2000) und beeinträchtigen den Weg der Samenzellen zum Ort der Befruchtung. Es kommt zur Etablierung eines Sper- miengradienten im weiblichen Genitale (DOBROWOLSKI u. HAFEZ 1970; DROBNIZ u.
OVERSTREET 1992), um die Gefahr der Polyspermie zu verringern (HUNTER u. LEGLISE 1971; HARPER 1994; HUNTER 1996).
Bis zum Eintreffen befruchtungsfähiger Oozyten am Ort der Befruchtung verbleiben die männlichen Keimzellen je nach Spezies Stunden bis Tage im weiblichen Genitaltrakt, wo sie sich in sogenannten Spermienreservoiren aufhalten. Dabei handelt es sich um funktionelle Reservoire mit vielfältigen Aufgaben:
• Kontrolle des Spermientransports,
• Aufrechterhaltung der Befruchtungsfähigkeit bis zum Eintreffen der Oozyten durch Epi- thelkontakt,
• Schutz vor Polyspermie (nur wenige Spermien erreichen den Ort der Befruchtung),
• Schutz vor aus dem Uterus aufsteigenden polymorphkernigen Leukozyten,
• Schutz vor metabolischer Stimulation durch das Sekret des Uterus und der Ampulle,
• Befreiung vom Seminalplasma,
• Regulation der Kapazitation und Hyperaktivierung
(HUNTER u. LÉGLISE 1971; FLÉCHON u. HUNTER 1981; HUNTER 1995; GUALTIERI u. TALEVI 2000; PETRUNKINA et al. 2001; SUAREZ 2001; SUAREZ 2002).
Bei den Scheidenbesamern (Rind, Schaf, Ziege) (HUNTER 1995; COX et al. 2002;
SUAREZ 2003), Katze (CHATDARONG et al. 2004), Kaninchen und dem Menschen (SUAREZ 2003), stellt die Zervix die erste zu überwindende Barriere (= Barriere I) dar (SCOTT 2000). Sie leitet die Spermatozoen mit ihren Primär-, Sekundär- und Tertiärfalten und dem zervikalen Mukus, tief in die Krypten und trägt damit zur Etablierung des ersten
21
Spermienreservoirs bei (= Spermienreservoir I) (MATTNER 1968; TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001). In den Krypten herrscht ein solartiges, spermienfreundliches Milieu, das die zur Gebärmutter gerichtete Bewegung der Spermien unterstützt (TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001). Weiterhin werden die Samenzellen vom Seminalplasma befreit. Sper- mien mit morphologischen und eventuell auch funktionellen Abnormalitäten werden elimi- niert (KATZ et al. 1989; TÖPFER-PETERSEN 2007).
Nach QUINLIVAN und ROBINSON (1969), DOBROWOLSKI und HAFEZ (1970), HAWK (1983), CROXATTO (1996) und HAFEZ und HAFEZ (2000) erhält der Zervixhals bei Rind, Schaf, Ziege und Mensch eine Population befruchtungsfähiger Spermien und dient somit als Reservoir, um Spermien in die höheren Genitalabschnitte zu entlassen. So können zum Bei- spiel bei der Frau Spermien periovulatorisch 58 Stunden im zervikalen Mukus überleben (COHEN u. STEIN 1951). Im Gegensatz dazu existieren Hinweise darauf, dass der Gebär- mutterhals bei der Frau kein funktionelles Reservoir darstellt (HUNTER 1987). Bei der intra- uterinen Besamung wird die Zervix mit dem Besamungsinstrument überwunden und fällt so- mit als Spermienspeicher aus (MITCHELL et al. 1985).
Bei den Uterusbesamern (Pferd und Schwein) wird das Ejakulat direkt in die Gebärmutter abgesetzt, so dass die männlichen Keimzellen den Gebärmutterhals nicht mehr überwinden müssen. Von dieser Situation ist auch beim Hund auszugehen (TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001).
Bei den Scheidenbesamern ist die uterotubale Verbindung die zweite Barriere (= Barriere II) (SCOTT 2000). Bei den Uterusbesamern reguliert hingegen nur die UTV den Spermie- naufstieg in den Eileiter (= Barriere I) (SCOTT 2000).
Mit Erreichen des Uterus gelangen die Spermien demnach in ein verhältnismäßig unfreundli- ches Milieu, das sie innerhalb kurzer Zeit durch Eintritt in die uterotubale Verbindung und den kaudalen Isthmus verlassen.
Als Spermienreservoire wurden folgende Lokalisationen identifiziert:
• Rind Isthmus (HUNTER u. WILMUT 1984);
UTV und Isthmus (HYTTEL et al. 1991; SUAREZ et al. 1997);
Kaudale Ovidukt (SUAREZ et al. 1997),
• Schaf Isthmus (QUINLIVAN u. ROBINSON 1969; HUNTER et al. 1980;
HUNTER u. NICHOL 1983; LANE et al. 1993),
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• Ziege Ovidukt (COX et al. 2002),
• Pferd UTV (THOMAS et al. 1994a; SCOTT et al. 2002),
• Schwein Isthmus (FLÉCHON u. HUNTER 1981; HUNTER 1981; HUNTER u.
NICHOL 1986; PETRUNKINA et al. 2001),
• Maus Isthmus (DEMOTT u. SUAREZ 1992),
• Ratte Isthmus (ORIHUELA et al. 1999),
• Goldhamster Isthmus (SMITH et al. 1987; SMITH u. YANAGIMACHI 1990),
• Meerschweinchen distaler Ovidukt, inklusive UTV (YANAGIMACHI u. MAHI 1976),
• Kaninchen Isthmus (OVERSTREET u. COOPER 1978b).
Bei der Katze dienen die uterinen Krypten und die UTV als Speicher für die Samenzellen (CHATDARONG et al. 2004). Neuere Studien beim Pferd zeigen, dass auch bei dieser Tierart die uterinen Drüsen neben der uterotubalen Verbindung an der Bildung des Spermienreser- voirs beteiligt sind (FIALA et al. 2008). Beim Menschen hingegen ist das Vorkommen eines Reservoirs am Übergang vom Uterus zum Eileiter umstritten (siehe Kapitel 2.3.4).
Beim Hund gehen DOAK et al. (1967) davon aus, dass sich Spermien bis zur Befruchtung im Uterus und in den uterinen Drüsen ansammeln. Nach RIJSSELAERE et al. (2004) ist zusätz- lich die UTV an der Speicherung beteiligt.
2.3.4 Spermienverteilung im weiblichen Genitale tierartvergleichend
a. Wiederkäuer: Rind, Schaf, Ziege
Im Rahmen des im Angelsächsischen als „rapid sperm transport“ bezeichneten Vorgangs er- reichen die Samenzellen beim Rind innerhalb von ein bis zwei Minuten nach Deckakt oder künstlicher Besamung das Eileiterinfundibulum (VANDEMARK u. HAYS 1954). Innerhalb von 4,3 Minuten oder weniger kommen auch immotile Spermien im proximalen Eileiter an (VANDEMARK u. MOELLER 1951).
Innerhalb von sechs bis acht Stunden gelangen die befruchtungsfähigen Spermien bei Rind und Schaf in den kaudalen Isthmus (HUNTER et al. 1980; HUNTER et al. 1982; HUNTER u.
WILMUT 1984; HUNTER 1985), wo beim Rind über weitere sechs Stunden das Spermienre-
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servoir aufgebaut wird (WILMUT u. HUNTER 1984). DOBROWOLSKI und HAFEZ (1970) fanden hingegen die maximale Spermienanzahl im Eileiter schon acht Stunden nach Besa- mung.
HYTTEL et al. (1991) wiesen fünf Stunden nach intra uterinen Insemination ein Spermienre- servoir in der uterotubalen Verbindung und im Isthmus nach. Dort werden die Samenzellen für 17-20 Stunden bis kurz vor der Ovulation gespeichert (HUNTER et al. 1982; HUNTER u.
NICHOL 1983; HUNTER u. WILMUT 1984; HUNTER 1985). LANE et al. (1993) zeigten, dass der Isthmus 65 mal mehr Spermien enthält als die Ampulle. Somit reguliert der distale Eileiter die Anzahl der die Ampulle erreichenden Spermien (CHIAN u. SIRARD 1995).
Periovulatorisch bewegen sich die Spermien dann, beim kleinen Wiederkäuer innerhalb von zwei bis drei Stunden, vom Spermienreservoir zur Ampulla-Isthmus-Verbindung fort, dem Ort der Befruchtung (HUNTER et al. 1982; HUNTER u. WILMUT 1984; HUNTER u.
NICHOL 1986).
Nach postovulatorischer Insemination von Rindern sind mehr Spermien in den proximalen Abschnitten des Eileiters zugegen als nach präovulatorischer Besamung (SUAREZ et al.
1997). Demnach scheint der Aufstieg in die Ampulle schneller oder ehr zu erfolgen.
b. Schwein
Beim Schwein erreichen die Samenzellen innerhalb von ein bis zwei Stunden nach natürli- chem Deckakt den kaudalen Eileiter (FLÉCHON u. HUNTER 1981 bzw. HUNTER 1981;
MBURU et al. 1996; KAEOKET et al. 2002). Im gleichen Zeitraum gelangen auch tote Spermien nach Besamung in den Ovidukt (VIRING 1980). Intrauterin deponierte radioaktive Moleküle benötigen fünf Minuten, bis sie in den proximalen Oviduktbereich gelangen (VIRING et al. 1980). Die Anzahl der Spermien im Eileiter wird durch die uterotubale Ver- bindung reguliert (FLÉCHON u. HUNTER 1981). Die präovulatorische Speicherung im Eileiter kann länger als 36 Stunden dauern, bis es zur Umverteilung der Spermien in Richtung Ovar kommt (HUNTER 1984; HUNTER 1985; HUNTER et al. 1987).
Peri- und postovulatorisch sind im Folgenden die Spermien mehr im mittleren und oberen Isthmus zu finden (MBURU et al. 1996). Die Besiedlung des Spermienreservoirs im Eileiter erfolgt postovulatorisch schneller (HUNTER 1981), so dass schon zwei Stunden nach künstli-
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cher Besamung die Zona pellucida von Eizellen penetriert werden kann (HUNTER u. DZIUK 1968). Diese Zeit ist zur Kapazitation notwendig (SCHNURRBUSCH 2007).
Insgesamt ist die Spermienanzahl und –verteilung beim Schwein zyklus- und auch eberab- hängig (MBURU et al. 1996; KAEOKET et al. 2002). Wurde die Besamung mehr als 18 Stunden nach der Ovulation durchgeführt, war der Spermientransport quantitativ verringert.
Bei mehr als 30 Stunden konnten KAEOKET et al. (2003) keine Trächtigkeit mehr erzielen.
Zusätzlich war die Anzahl an Abwehrzellen ausschließlich vom Zyklusstadium abhängig und nicht vom Besamungszeitpunkt.
c. Pferd
Beim Pferd ist die genaue Lokalisation des Spermienspeichers im Eileiter lange unbekannt gewesen. Zwar waren Deckakte drei bis vier Tage vor der Ovulation erfolgreich (BURKHARDT 1949), aber erst SCOTT et al. (2002) fanden eine Anreicherung von Sper- mien in der UTV vier Stunden nach präovulatorischer Insemination, die auch 18-26 Stunden später noch bestand. Aufgrunddessen wird die UTV als präovulatorisches Spermienreservoir der Stute angesehen.
Hingegen konnten BOYLE et al. (1987) 24 Stunden nach Deckakt bzw. Insemination nur sehr wenige Spermien in der uterotubalen Verbindung und im Isthmus finden. Dass nach erfolgter Ovulation mehr Spermien im Isthmus vorlagen, wird von den Autoren als Indiz für einen ursächlichen Zusammenhang zwischen der Bewegung der Spermien von der UTV zum Ort der Befruchtung und der Ovulation interpretiert. Zwei Stunden nach postovulatorischer Besamung bzw. Bedeckung sind die ersten Spermien im Eileiter nachweisbar (BADER 1982).
FIALA et al. (2008) fanden 30 Minuten nach Besamung Spermien im Eileiter und nach einer Stunde auch in den uterinen Drüsen, welche von diesen Autoren als weiteres Spermienreser- voir in Betracht gezogen werden. Die Spermienverteilung ist in beiden Eileitern ausgeglichen und somit offensichtlich unabhängig vom ovulierten Follikel (PARKER et al. 1971; FIALA et al. 2008). Der Einfluss des Hengstes wird unterschiedlich beschrieben (PARKER et al. 1971;
PARKER et al. 1975).
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d. Mensch
Beim Menschen erreichen die Spermien unabhängig von Zyklusstand nach 30 Minuten den Eileiter. Sie verbleiben im weiblichen Genitale 50 Stunden motil (RUBENSTEIN et al. 1951).
ZINAMAN et al. (1989) sprechen dem Gebärmutterhals die Funktion eines Spermienreser- voirs zu, da in vivo die Spermienakrosome dort lange intakt bleiben, während der Eileiter- isthmus nicht als Spermienreservoir dargestellt wird (WILLIAMS et al. 1993). CROXATTO (1996) berichtet von einem kontinuierlichen Spermienfluss von der Zervix durch den Eileiter in die Peritonealhöhle ohne Aufenthalt in einem weiteren Reservoir.
WILLIAMS et al. (1993) wiesen in der Ampulle am ovulierenden Ovar einen größeren Pro- zentsatz an Spermien als auf der anderen Seite nach. Die Spermienanzahl in den Eileitern zeigte jedoch keine signifikanten Unterschiede.
Dagegen fanden SETTLAGE et al. (1973) die ersten Spermien jeweils fünf Minuten nach Besamung im Ovidukt. Ihre Anzahl bleibt im Zeitraum von 15- 45 Minuten nach Besamung konstant. Über den gesamten Untersuchungszeitraum waren die meisten Spermien im
Eileiterinfundibulum vorhanden, während jedoch im Uterus keine Samenzellen nachgewiesen wurden.
e. Hund
DOAK et al. (1967) entdeckten in der ersten Studie zur Spermienverteilung beim Hund unabhängig vom Untersuchungszeitpunkt die meisten Spermien im Uterus und in den uterinen Drüsen. Motile Spermien waren über vier bis sechs Tage im Uterus zu finden. Noch 268 Stunden (ungefähr elf Tage) post coitum waren einige Samenzellen im Uterus anzutreffen. Im Eileiter und in der Bursa ovarica wurden hingegen niemals große Mengen an Spermien gefunden. Im Allgemeinen waren mit Einsetzen des Metöstrus keine Spermien mehr nachweisbar.
Durch Fistulierung einer Uterushornspitze wiesen TSUTSUI et al. (1989) die Ankunft der ersten Spermien 30 bis 60 Sekunden nach natürlichem Deckakt und Besamung nach. Ebenso berichtete EVANS (1933) schon nach 25 Sekunden von eintreffenden Spermien.
RIJSSELAERE et al. (2004) besamten Hündinnen mit einer definierten Spermienanzahl vor, während und nach der Ovulation und führten jeweils 24 Stunden später eine Ovariohysterek-
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tomie durch, um die Verteilung der Spermien zu untersuchen. Die meisten Samenzellen wa- ren in den uterinen Drüsen und der UTV zu finden, nur wenige im Ovidukt. Durch die Spü- lung von Uterushorn und Ovidukt konnten nur geringe Spermienanzahlen gewonnen werden.
Die Qualität der Spermien war in allen Abschnitten des Genitaltrakts identisch. Die Autoren schließen daraus, dass die UTV und die uterinen Drüsen das Spermienreservoir der Hündin bilden und dass der Spermientransport durch die Ovulation beeinflusst wird. Die Spermien- zahl in den uterinen Drüsen war nach Besamung während der Ovulation größer als nach prä- oder postovulatorischer Insemination.
2.3.5 Regulation der Spermienkapazitation im Eileiter
Bindung der Spermien im Ovidukt
Den verschiedenen in-vivo-Studien zur Spermien-Epithelzell-Interaktion folgten diverse in- vitro-Studien. Dabei kamen einerseits Frisch- und Tiefgefriersperma, andererseits ganze Eilei- ter oder Präparate aus den Oviduktepithelzellen zum Einsatz.
In erster Linie gehen unkapazitierte Spermien eine Verbindung mit dem Epithel ein, während kapazitierte Spermien diese Fähigkeit verloren haben (SMITH u. YANAGIMACHI 1991;
LEFEBVRE u. SUAREZ 1996; FAZELI et al. 1999).
Die Bindung der Samenzellen erfolgt zwischen der Akrosomregion des Spermienkopfes und der apikalen Plasmamembran des Eileiterepithels. Sie wird beim Schwein innerhalb von Mi- nuten eingegangen (ELLINGTON et al. 1991; POLARD et al. 1991; SUAREZ et al. 1991;
THOMAS et al. 1994a; KAWAKAMI et al. 2001; BOILARD et al. 2002). Vermittelt wird sie über Kohlenhydrat-Proteinbindungen (SUAREZ 1998; GREEN et al. 2001; TÖPFER- PETERSEN u. WABERSKI 2001), wobei der Kohlenhydratanteil bei den verschiedenen Tierarten unterschiedlich ist.
Beim Schwein verhindern die Disaccharide Laktose und Maltose die Bindung von Samenzel- len an Oviduktepithelzellen (=OEC), sowie das Monosaccharid Mannose (GREEN et al.
2001), aber auch Oligomannose, Mannose und Galaktose sind an der Bindung beteiligt (WAGNER et al. 2002). Bei Epithelzellmonolayern des Eileiters von Hamster und Pferd inhi- bieren Fetuin und Galaktose die Bindung mit Spermien (DOBRINSKI et al. 1996a; DeMOTT et al. 1995), bei Explantaten vom Rind hingegen Fukose und dem Oligosaccharid Lewis-a (LEFEBVRE et al. 1997, SUAREZ et al. 1998). REVAH et al. (2000) vermuten, dass es beim
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Rind nach Entfernung des Seminalplasmas zur Freilegung der Fukose-Bindungsstellen kommt, welche während der Kapazitation verloren gehen oder modifiziert werden, wodurch es zur Loslösung vom Epithel kommt. Anschließend sollen Mannose-Bindungsstellen freige- legt oder aktiviert werden, über welche die Bindung an der Zona pellucida erfolgt.
PETRUNKINA et al. (2003) konnten beim Hund zusätzlich darlegen, dass die Bindung von Spermien an porcine OEC hauptsächlich Spermien mit unphosphorylierten Tyrosin an den Spermienköpfen betrifft.
Beim Pferd geht die Bindung an OEC mit einer verminderten intrazellulären Kalzium- Konzentration der Samenzellen einher, wodurch die vorzeitige Kapazitation und Akrosom- reaktion verhindert und dadurch die Lebensspanne der Spermien verlängert wird (DOBRINSKI et al. 1996b, 1997).
Hinsichtlich der Bindung bestehen tierartliche Unterschiede in Bezug auf den Zyklusstand des weiblichen Tieres, der Bindung an Isthmus oder Ampulle sowie das männliche Tier. Auch der Effekt der Zellen des weiblichen Genitaltrakts auf die männlichen Gameten ist bezüglich der Erhaltung der Lebensfähigkeit, der Motilität und der Beeinflussung der Kapazitation unter- schiedlich.
Isthmus- und Ampullenepithelzellen von Rind, Schaf, Schwein und Hund binden homologe Spermien in gleicher Weise, während bei Pferd und Mensch der kaudale Eileiterabschnitt mehr Samenzellen bindet als andere Lokalisationen (Rind: LEFEBVRE et al. 1995;
LEFEBVRE u. SUAREZ 1996; Schaf: GILLAN et al. 2000; Schwein: SUAREZ et al. 1991;
PETRUNKINA et al. 2001; Pferd: THOMAS et al. 1994a; Mensch: YEUNG et al. 1994;
Hund: PACEY et al. 2000).
CHIAN und SIRARD (1995) entdeckten Unterschiede in der Dauer der Bindung von bovinen Samenzellen: in Ampulle und im gesamten Ovidukt lösten sich Spermien bereits nach drei Stunden, während die Bindung am Isthmus über zwölf Stunden bestehen blieb.
Epithelien anderer Organe, wie z.B. porcine Nierenepithelzellen sind nicht in der Lage homo- loge Samenzellen zu binden ebenso wie Zellpräparate der apikalen Plasmamembran von Lun- ge und Duodenum die Vitalität nicht aufrechterhalten können (FAZELI et al. 1999, 2003).
Auch die Motilität und Befruchtungskapazität von Spermien werden durch Kontakt mit Epi- thelien gewebespezifisch beeinflusst (POLLARD et al. 1991; CHIAN u. SIRARD 1995;
ELLINGTON et al. 1998; BOILARD et al. 2002).
28
Der Zyklusstand hat bei Pferd und Hund einen Einfluss auf die Interaktion von Samen- und Epithelzellen: Beim Pferd binden vermehrt Spermien an Oviduktexplantate, die in der Folli- kelphase oder der postovulatorischen Phase gewonnen wurden, während die Spermienmotili- tät bei der Inkubation mit Präparaten aus der Follikelphase die von Explanten aus der posto- vulatorischen oder diöstrischen Phase übersteigt (THOMAS et al. 1994a).
PACEY et al. (2000) beobachteten eine stärkere flagellare Aktivität bei caninen Spermien, die an das Eileiterepithel östrischer Hündinnen gebunden hatten, im Vergleich zu Spermien, die mit Gewebe aus der Lutealphase oder aus dem Anöstrus interagierten. Nach Inkubation von Spermien mit OEC aus der Follikelphase waren bei KAWAKAMI et al. (2001) mehr Hun- despermien hyperaktiv und akrosomreagiert nach der Loslösung als bei der Inkubation mit OEC aus der Lutealphase.
In Abhängigkeit vom Zyklusstadium des caninen Eileiterspendertieres werden die Motilität aufrechterhalten und die Akrosomreaktion eingeleitet (PACEY et al. 2000; KAWAKAMI et al. 2001).
Bei Rind, Schwein und Mensch konnte diese Abhängigkeit vom Zyklus des weiblichen Do- nors nicht verzeichnet werden, allerdings werden Samenzellen von Eileitern von Frauen aus der Menopause deutlich schlechter gebunden (Rind: LEFEBVRE et al. 1995; Schwein:
SUAREZ et al. 1991; PETRUNKINA et al. 2001; FAZELI et al. 2003; Mensch: PACEY et al. 1995; BAILLIE et al. 1997).
Beim Schwein zeigte sich trotz der Zyklusunabhängigkeit unter β-Östradiol-Zusatz eine Zu- nahme der Anzahl gebundener Spermien an porcinen Explantaten (SUAREZ et al. 1991), während dieser Effekt bei Inkubation mit OEC nicht zu beobachten war. In diesem System nahm die Bindung nach Zusatz von Progesteron ab (BUREAU et al. 2002). Beim Pferd war kein entsprechender Einfluss von Steroiden auf Motilität oder Bindung von Spermien auf OEC nachweisbar (THOMAS et al. 1994a).
Bei Schwein und Pferd wurden individuelle Einflüsse der Samenspender auf die Spermien- Explantat-Interaktion festgestellt (DOBRINSKI et al. 1995; PETRUNKINA et al. 2001;
WABERSKI et al. 2006).
Beim Hund läuft die Spermien-Eileiter-Interaktion in vivo demjenigen in vitro ähnlicher Wei- se ab (ELLINGTON et al. 1995): Homologe OEC binden Spermien innerhalb von 30 Minu- ten. Die Verbindung wird innerhalb von 5 ½ bis sechs Tage gelöst, wobei 10% der Samenzel-
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len gebunden und ihre Motilität erhalten bleibt. Nach PETRUNKINA et al. (2003) ist anzu- nehmen, dass die Loslösung vom Epithel nach der Phosphorylierung des Spermienschwanzes einsetzt. Danach erfolgen die Ablösung des Spermienkopfes und Hyperaktivierung der Sa- menzellen. Durch die Sekrete des Ovidukts wird schließlich die Kapazitation eingeleitet (KAWAKAMI et al. 1998).
Bei gebundenen equinen Spermien bleibt eine flagellare Bewegung über vier Tage bestehen (ELLINGTON et al. 1993). In diesem Zeitraum löst sich der enge Kontakt zwischen den Epi- thelzellen und den Spermien.
Die Kapazitation der Spermien schreitet nach Inkubation mit OEC von Isthmus oder Ampulle voran, an ihrer Vollendung ist beim Rind die Ampulle beteiligt (CHIAN u. SIRARD 1995;
FAZELI et al. 1999).
Kapazitation
Nach der Loslösung der Spermien vom Eileiterepithel durchlaufen sie eine Aktivierungspha- se, um ihre Befruchtungsfähigkeit zu erlangen. Dieser als Kapazitation bezeichnete Prozess ist durch Hyperaktivierung der Spermien gekennzeichnet. Es kommt zu Veränderungen des Bewegungsapparats und des Akrosombereichs der Spermien. Oberflächenassoziierte Proteine werden entfernt, Cholesterin strömt aus der Plasmamembran und die Membranfluidität nimmt zu. Die Proteine in der Membran werden neuorganisiert. Durch die Erhöhung der Membran- durchlässigkeit für Kalziumionen kommt es zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration in den Samenzellen. Anschließend werden Spermienproteine phosphoryliert (TÖPFER- PETERSEN u. WABERSKI 2001; TÖPFER-PETERSEN 2007), wodurch die Lebensspanne der Spermien aufgrund der Destabilisierung der Membran und Erschöpfung des Zellmetabo- lismus verkürzt wird (TÖPFER-PETERSEN 2007).
Bei Kontakt der Spermien mit der Oozyte wird die Befruchtungskaskade aktiviert:
I. Primäre Bindung der Spermatozoen an die Eizelle,
II. Akrosomreaktion (Exozytose des Akrosoms) und sekundäre, temporäre Bindung zur Penetration der Zona pellucida,
III. Fusion der Gameten mit Aktivierung der Eizelle und Polyspermieblock, sowie Vor- kernbildung
(TÖPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001; TÖPFER-PETERSEN 2007).
30
Während die Akrosome gebundener Spermien lange intakt bleiben, geht die Loslösung der Spermien von Epithelzellen mit Veränderungen der Spermienoberfläche einher und wird durch die Hyperaktivität unterstützt (SMITH u. YANAGIMACHI 1991; PACEY et al. 1995;
GUALTIERI u. TALEVI 2000; SUAREZ 2001).
Im humanen in-vitro-System üben Oviduktzellen eine fördernde Wirkung auf die Kapazitati- on, Stabilisierung der Akrosommembran und Inhibition der Zona-Bindung aus (YAO et al.
1999).
2.3.6 Umverteilung der Spermien im periovulatorischen Zeitraum
Da die Befruchtung bei den meisten Tierarten in der Ampulle erfolgt, müssen Eizellen und Spermien zeitgleich an dieser Lokalisation eintreffen. Zusätzlich muss eine Polyspermie ver- hindert werden, ein bei den Säugetieren pathologisches Geschehen, das in einer fehlerhaften embryonalen Entwicklung mündet. Am Übergang von der Ampulle zum Isthmus bzw. in der Ampulle beträgt das Verhältnis von Eizellen zu Samenzellen nahezu 1:1 (MORICARD u.
BOSSU 1951; HUNTER 1996). Erst mit dem Aufbau eines Polyspermie-Blocks wird die Kontrolle des Aufstiegs weiterer Spermien durch den Isthmus vermindert (HUNTER 1996, 1998, 2008).
In unmittelbaren Zusammenhang mit der Befruchtung bewegen sich die Samenzellen aktiv auf die befruchtungsfähigen Oozyten zu (allgemein: THIBAULT 1973; Kaninchen:
OVERSTREET u. COOPER 1978b; OVERSTREET u. COOPER 1979; OVERSTREET et al. 1980). Zudem besteht im Allgemeinen ein passiver Transport in Form entgegengesetzt gerichteter Peristaltik der Eileitermuskulatur, Mukosakontraktionen des Eileiters, Zilienaktivität sowie Sekretströme (Hamster: BATTALIA u. YANAGIMACHI 1979;
Schwein: BLANDAU u. GADDUM-ROSSE 1974; FLÉCHON u. HUNTER 1981; allgemein:
THIBAULT 1973; TÖPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001). Während allerdings beim Schwein und beim Kaninchen die Eileiterzilien zum Ovar gerichtete Strömungen erzeugen, ist der Fluss bei Rind, Schaf und Mann zum Uterus gerichtet. Bei Meerschweinchen und Ratte konnten GADDUM-ROSSE und BLANDAU (1976) keine Strömungen beobachten.
An der Regulation des feinabgestimmten entgegengesetzten Transports sind mutmaßlich verschiedene Faktoren beteiligt. Nach HARPER (1973) und KAEOKET et al. (2002) steht die Umverteilung innerhalb des Ovidukts unter dem Einfluss der Ovulation bzw. der Produkte der
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Ovulation, während HUNTER et al. (1999) eine Beteiligung der Follikelflüssigkeit an der Ablösung der Spermien vom Epithel ausschließen. Eine primäre Kontrollfunktion wird dem Progesteron zugeordnet, welches durch das bei einigen Tieren vorhandene Gegenstromprinzip der Ovarvene und –Arterie in den Eileiter gelangt (HUNTER 1996, 2008). Außerdem wirkt der Cumulus-Oophorus-Komplex, beim Schwein unter Beteiligung von Hyaluronsäure, stimulierend auf die Spermienumverteilung (BRUSSOW et al. 2006). Bei der Ratte wurde eine Regulation des Spermientransport durch das ipsilaterale Ovar nachgewiesen (SULTAN u. BEDFORD 1996).
Innerhalb des porcinen Eileiters besteht präovulatorisch ein Temperaturgradient mit steigen- der Temperatur vom Isthmus zur Ampulle. Dieser geht nach der Ovulation verloren (HUNTER u. NICHOL 1986). Beim Kaninchen wurde zum Zeitpunkt der Ovulation ein Temperaturunterschied von bis zu 1,6 ± 0,1°C zwischen Isthmus und dem Übergang zur Am- pulle beobachtet. Dabei nimmt die Temperatur am Ort der Spermienspeicherung die Tempe- ratur ab, woraufhin die Spermien in den wärmeren Bereich abwandern (BAHAT et al. 2005).
32
3 Material und Methoden
Der Tierversuch wurde am 13.12.2005 mit dem Aktenzeichen 05-10.05 genehmigt.
3.1 Tiere
Für die Untersuchung standen 12 nullipaare Beagle-Hündinnen und eine unipaare Beagle- Hündin im Alter von 14 bzw. 47 Monaten (Durchschnitt zwei Jahre und 9 Monate) und einem Körpergewicht von 10,2 bis 13,4 kg (Durchschnitt 12,0 kg) zur Verfügung. Die Hündinnen wurden in Außenboxen mit Stroh und Auslauf bzw. im Stall mit Auslauf in Gruppen von zwei bis vier Tieren gehalten und mit einem herkömmlichen Fertigfutter gefüttert. Wasser wurde ihnen ad libitum angeboten.
Als Samenspender dienten zwei Beagle-Rüden im Alter von 28 Monaten und einem Gewicht von 17,5 bzw. 19,4 kg. Die Rüden wurden getrennt von den Hündinnen gehalten und wie die- se mit Futter und Wasser versorgt.
3.2 Versuchsdurchführung
3.2.1 Untersuchungszeitpunkt
Alle Tiere wurden zweimal wöchentlich auf Läufigkeitssymptome kontrolliert. Mit dem ers- ten Austritt von blutigem Sekret aus der Vulva erfolgte die erste gynäkologische Untersu- chung. Diese beinhaltete die Vaginoskopie, eine Tupferentnahme zum Nachweis des bakteri- ellen Keimgehalts, die Vaginalzytologie sowie die quantitative Bestimmung der Serumpro- gesteronkonzentration. Die weiteren Befunderhebungen erfolgten entsprechend des bei der ersten Untersuchung festgestellten Zyklusstandes in zwei- bis dreitägigen Abständen. Sobald die Progesteronkonzentration auf 2-4 ng/ml (Indiz für den präovulatorischen LH-Peak) ange- stiegen war, wurden zusätzlich die Ovarien zweimal pro Tag im Abstand von zwölf Stunden ultrasonographisch untersucht (Abbildung 1).
33
Bestimmung des Läufigkeitsstadiums :
:
Gruppe 1 : Gruppe 2 n = 6 : n = 7
Sonographische Ovulationsdiagnose (alle 12 Stunden)
Tag 2 ---
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Abbildung 1: Versuchsablauf, schematisch
Progesteron 2-4ng/ml LH-Peak
Artifizielle Insemination am Tag der Ovulation
Ovariohysterektomie Tag 2 post ovulationem
Ovariohysterektomie Tag 4 post ovulationem
Einseitige Spülung des Genitaltrakts
Histologische Untersuchung des gesamten Genitaltrakts Untersuchung der
Spülflüssigkeit auf Eizellen und Spermien
(Anzahl, Motilität, Morphologie, Membranintegrität)
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3.2.2 Klinisch-gynäkologische und vaginalzytologische Untersuchung
Die klinisch-gynäkologische Untersuchung umfasste die Adspektion der Vulva, die Beurtei- lung des Duldungsreflexes und des Vaginalsekrets und die Bewertung der Scheidenschleim- haut hinsichtlich Quellung, Farbe und Feuchtigkeit mittels Röhrenspekulum und Lichtquelle (WABERSKI u. GÜNZEL-APEL 1990; GÜNZEL-APEL 1994).
Das zytologische Material wurde durch einen mit steriler Kochsalzlösung befeuchteten Watte- tupfer im kranialen Scheidendrittel gewonnen und nach der von GÜNZEL und KOIVISTO (1984) beschriebenen Methode auf einem vorgefärbten Objektträger (Testsimplet, Boehrin- ger Mannheim, Mannheim) in ca. drei bis fünf Bahnen ausgerollt und mittels Merckofix (Merck, Darmstadt) nach Trocknung fixiert. Nach erneuter Trocknung wurde der Ausstrich unter kaltem Wasser vorsichtig abgespült. Danach erfolgte die Eindeckung mit Eukitt (O.
Kindler, Breisgau) und zugehörigen Deckgläschen. Der Ausstrich wurde hinsichtlich der Epi- thelzellart, -häufigkeit und des Objektträgerhintergrundes sowie des Vorkommens von E- rythrozyten oder Leukozyten unter Zuhilfenahme eines Binokular-Lichtmikroskops beurteilt (Okular x 10, Objektiv x 16 bzw. Objektiv x 40).
Bei kulturellem Nachweis eines bedingt pathogenen Keimgehaltes wurden die Tiere mit ei- nem Antibiotikum behandelt.
3.2.3 Progesteronanalyse
Zur Eingrenzung der Ovulation wurde die Progesteronkonzentration im peripheren Blut ge- messen und Proben aus der Vena cephalica antebrachii oder der Vena saphena lateralis in zur Serumgewinnung präparierten Röhrchen (Sarstedt, Nürmbrecht) gewonnen und bei 3.000 Umdrehungen zehn Minuten mittels Heraeus Labofuge 200 (Thermo Scientific, Karlsruhe) zentrifugiert. Das durch Abpipettieren gewonnene Serum wurde in ein Röhrchen ohne Zusatz (Sarstedt, Nürmbrecht) überführt. Die Progesteronbestimmung erfolgte im Labor der Abtei- lung für Endokrinologie des Chemischen Instituts der Stiftung Tierärztliche Hochschule Han- nover mit Hilfe eines kompetitiven Immunoassays (Immulite, Siemens Diagnostics, Bad Nauheim) (untere Nachweisgrenze: 0,05 ng/ml; Intraassayvariationskoeffizient: 4,6; Interas- sayvariationskoeffizient: 12%). In wenigen Ausnahmen (Wochenende) kam stattdessen ein
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semiquantitativer Progesterontest (Hormonost, biolab, München) zum Einsatz. Die Ergeb- nisse wurden später durch qualitative Analyse überprüft.
3.2.4 Sonographie
In Vorbereitung für die Ultraschalluntersuchung wurden die Hündinnen vom Bereich der Bla- se bis nach vorne zu den Rippen und seitlich beidseitig bis in den Nierenbereich unterhalb der Lendenmuskulatur geschoren.
Für die Untersuchungen stand das Ultraschallsystem Logic 5 Pro (General Electric Medical Systems, Solingen) zur Verfügung. In einem abgedunkelten, ruhigen Raum wurden die unse- dierten Tiere in Abhängigkeit ihrer Kooperationsbereitschaft in Seitenlage auf einer gepolster- ten Kunststoffunterlage oder im Stehen untersucht. Handelsübliches Ultraschallgel wurde unterhalb der Lendenmuskulatur kaudal des Rippenbogens im Nierenbereich aufgetragen.
Zum Aufsuchen der Ovarien wurde die von HAYER et al. (1993) und GÜNZEL-APEL et al.
(2001) beschriebene Methode angewendet: Der Schallkopf wurde nach kurzer Einwirkzeit des Ultraschallgels unterhalb der Lendenmuskulatur im Bereich der ipsilateralen Niere auf die seitliche Bauchwand aufgelegt. Die Ovarien wurden im kaudalen Bereich der jeweiligen Nie- re aufgesucht. In einzelnen Fällen lag der Eierstock auch weiter medial, lateral und seltener auch kranial der Niere.
Die Ovarien wurden zunächst mit einem 6,0-MHZ-Schallkopf aufgesucht, und dann mit einer 10,0-MHZ-Sonde genauer betrachtet. Beurteilt wurden nach HAYER et al. (1993) und GÜNZEL-APEL und DIETERICH (2001) die Abgrenzbarkeit und Größe der Organe (im größten Querschnitt) und Anzeichen der Ovulation. Der jeweils größte Funktionskörper wur- de ausgemessen und die Ergebnisse entsprechend dokumentiert.
Indizien für das Stattfinden der Ovulation waren insbesondere das Verschwinden der anecho- genen Follikel und das Auftreten hypoechogener Strukturen, bestehend aus Fibrin, Follikel- flüssigkeit und lutealem Gewebe in den ovulierten Follikeln (BOYD et al. 1993; ENGLAND u. YEAGER 1993; HAYER et al. 1993).
Traten Symptome der Ovulation am Morgen auf, erfolgte die Insemination noch am selben Tag. Waren erst am Abend entsprechende Hinweise feststellbar, wurde am folgenden Morgen besamt.
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3.2.5 Samengewinnung, Samenuntersuchung
Für die Besamung der Hündinnen wurde von jeweils zwei Rüden ein Ejakulat fraktioniert gewonnen. Dies erfolgte auf die von GÜNZEL-APEL (1994) beschriebene Weise durch ma- nuelle Stimulation der Glans penis im Präputium unter Anwesenheit der läufigen, zu besa- menden Hündin.
Die Spermienuntersuchung umfasste die Bestimmung von Volumen (ml), Aussehen (Konsis- tenz/Farbe), pH-Wert, Dichte (106/ml), Gesamtspermienzahl (106), Bewegungsaktivität sowie Morphologie (GÜNZEL-APEL 1994).
Die Dichte wurde durch das Auszählen einer vorgefertigten Verdünnungsstufe des Ejakulats mit 10%iger Natriumchloridlösung in einer Zählkammer (Thoma neu, Landgraf Laborsyste- me GmbH, Langenhangen) mit definierter Fläche unter einem binokularen Phasenkontrast- mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen; Okular x10, Objektiv x40) bestimmt und mit entspre- chender Formel ausgerechnet.
Die Spermiengesamtzahl errechnet sich durch Multiplikation des Volumens mit der Dichte der spermienreichen Ejakulatfraktion.
Die Bewegungsaktivität der Spermien wurde durch Schätzung der Anteile vorwärts-, orts- und unbeweglicher Spermien (in %) unter einem Phasenkontrastmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen; Okular x10, Objektiv x16) bei Verwendung eines Heiztisches festgestellt.
Der prozentuale Anteil formabweichender Spermien wurde nach Fixierung in 4 % Formalcitrat hinsichtlich Qualität und Quantität mittels Phasenkontrastmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen; Okular x10, Objektiv x100) mit Ölimmersion durch Auswertung von 200 Samenzellen ermittelt.
Unter einem Fluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen; Okular x10, Objektiv x40) wurden nach Propidiumiodid-(PI)-Färbung (485µl spermienreiche Phase mit 100 Mio.
Samenzellen/ml + 10 µl 4% Formolzitrat + 5 µl PI) bei 200 Samenzellen die Integrität der Plasmamembran ermittelt und der Anteil an membranintakten Spermien bestimmt.
Aus den spermienreichen Fraktionen der beiden Samenspender wurde die Besamungsdosis von einer Milliarde vorwärtsbeweglicher Spermien errechnet. Das entsprechende Spermavolumen wurde in einer Spritze (Injekt Einmalspritze 5 ml mit Luer-Ansatz, B.Braun Melsungen AG, Melsungen) aufgezogen und auf insgesamt 3 ml mit Prostatasekret aufgefüllt.
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3.2.6 Insemination
Die Insemination erfolgte mit Hilfe eines Osiris-Katheters (imv Technologies, L'Aigle, Frank- reich) am Tag der Ovulation. Die Besamungsmethode von THERET et al. (1987) und NIŻAǸSKI (2006) wurde leicht modifiziert, indem der innere Mandrin des Osiris-Katheter entfernt wurde, um Rückfluss von Sperma zwischen den beiden Röhren und damit einen par- tiellen Verlust der Besamungsdosis zu verhindern.
Nach Reinigung und Desinfektion (Kodan® Tücher, Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt) des äußeren Genitale wurde unter Spreizen der Vulva der Katheter in das kraniale Drittel der Vagina vorgeführt. Der in den Katheter integrierte Ballon wurde mit 20 ml Luft gefüllt.
Die Hündin wurde zum Absetzen der Besamungsdosis durch Senken des vorderen Ende des Untersuchungstisches in leichte Beckenhochlage gebracht. Dann wurde der Samen unter Zu- hilfenahme einer Spritze (Injekt Einmalspritze 5 ml mit Luer-Ansatz, B.Braun Melsungen AG, Melsungen) langsam in die kraniale Vagina abgesetzt. Zur vollständigen Entleerung des Katheters wurden 3 ml Luft zügig nachgegeben. Die Hündin verblieb unter manueller Stimu- lation des Duldungsreflexes eine halbe Stunde in dieser Position.
Danach wurde die Luft aus dem Ballon abgelassen und die Hündin unter Vermeidung einer Komprimierung des Abdomens vom Behandlungstisch gehoben.
3.2.7 Organgewinnung
Die Gewinnung der Organe erfolgte bei Gruppe 1 (n = 6) zwei und bei Gruppe 2 (n = 7) vier Tage nach der mittels Ultrasonographie bestimmten Ovulation durch Ovariohysterektomie.
Die Ovulation wurde dabei als Tag 0 festgelegt.
Der chirurgische Eingriff wurde unter Allgemeinanästhesie in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover vorgenommen.
Während der Operation wurde beidseits jeweils eine Ligatur 1 cm unterhalb der Bursa ovarica auf dem Uterushorn sowie auf den Übergangsbereich vom Uterushorn zum Uteruskörper ge- setzt, um durch Manipulation verursachte Spermienumverteilungen zu verhindern. Aus dem- selben Grund musste die Operation zügig und unter Vermeidung unnötigen Druckes auf das Organ durchgeführt werden. Daher erfolgte die Fixation der Gebärmutter über das Fettgewebe des Ligamentum latum.
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Intra operationem wurde das linke und rechte Uterushorn durch lange Ligaturen gekennzeich- net, um eine spätere Seitenzuordnung zu erleichtern. Zur Vermeidung einer unnötigen Kon- tamination der Organe mit Blut wurde der Genitaltrakt sofort nach Exenteration von außen vorsichtig mit körperwarmer Tyrode-Lösung abgespült. Anschließend wurden die Organe bis zur weiteren Präparation in verschließbare handelsübliche Gefrierbeutel verbracht, die in ca. 1 l steriler, isotonischer Kochsalzlösung bei 38°C in einer Styroporbox während des Transports in die ca. 4 km entfernte Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken warmgehalten wur- den.
3.2.8 Präparation, Spülung und Fixierung von Eileiter und Uterushorn Während der gesamten Handhabung wurden die Organe auf einer Wärmeplatte (Störk-Tronik GmbH & Co.KG, Stuttgart) bei 38°C warm und mittels Tyrode-Medium sowie sterilen Tup- fern/OP-Kompressen (WDT, Garbsen) feucht gehalten.
Die gesamte Präparation erfolgte mit einer feinen Schere (Aesculap-Schere, BC 060 gerade, 10,5 cm, spitz-spitz, B.Braun Melsungen, Melsungen) und einer Adson-Pinzette (12 cm, 1x2 Zähne).
Die Organe wurden zuerst von überschüssigem Fettgewebe befreit. Danach wurde zunächst der zu spülende Eileiter sowie das zu spülende Uterushorn freipräpariert und gespült.
Gespült wurde innerhalb der Gruppen abwechselnd links und rechts, so dass in Gruppe 1 je dreimal auf jeder Seite und bei Gruppe 2 drei- bzw. viermal auf jeder Seite die Spülflüssigkeit untersucht werden konnte.
Der Eileiter war nach Eröffnung der Bursa ovarica als zarter Strang darstellbar. Die Präparati- on erfolgte parallel zum Eileiter vom Infundibulum aus in beide Richtungen entlang zu den fettärmeren Stellen der Bursa ovarica am Ovar vorbei.
Das Infundibulum wurde mit einer Braunüle (Vasocan Braunüle 20G, B. Braun Melsungen AG, Melsungen) sondiert und mit chirurgischem Nahtmaterial (Ethicon Vicryl Polyglactin 910, Johnson & Johnson, Norderstedt) circa 0,5-1 cm kaudal des Infundibulums abgebunden.
Anschließend erfolgte die retrograde Spülung des Ovidukts mit 5 ml Tyrode-Medium (in In- jekt-Einmalspritzen 5 ml mit Luer-Ansatz, B.Braun Melsungen AG, Melsungen). Die Spül-
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flüssigkeit wurde in einer Petri-Schale (mit Nunclon Oberfläche, Delta, Nunc, Dänemark) aufgefangen.
Unmittelbar nach der Spülung wurde der Eileiter mit Hilfe handelsüblicher, rostfreier Steck- nadeln auf 0,75 cm dickem Styropor fixiert und in ein Gefäß mit 4%igem Formalin überführt.
Das zugehörige Gebärmutterhorn wurde lediglich in seiner Gesamtheit bei jedem Tier gespült (links B1 bis C3 oder rechts F1 bis G3).
Dafür wurde das entsprechende Uterushorn separiert und dreimal mit je 5 ml Tyrode-Medium über eine Braunüle (Vasocan Braunüle 20G, B. Braun Melsungen AG, Melsungen) von kra- nial nach kaudal gespült. Das Auffangen der Spülflüssigkeit erfolgte in einem Grainer- Röhrchen (Sarstedt, Nürmbrecht).
Anschließend wurde das Uterushorn durch Halbierung in einen kranialen und kaudalen Be- reich unterteilt, auf Styropor fixiert und ebenso wie das Ovar der entsprechenden Seite in 4%iges Formalin verbracht.
Der Uteruskörper wurde nicht gespült.
Uteruskörper, Uterushorn und Eileiter sowie Eierstock der kontralateralen Seite wurden ohne vorherige Spülung bei gleicher Vorgehensweise präpariert, gestreckt auf Styropor fixiert und in 4%iges Formalin überführt. Die zur Fixation verwendeten Styroporblöcke waren jeweils mit „kranial“ und „kaudal“ gekennzeichnet, um eine zweifelsfreie Zuordnung der Organloka- lisationen bei der Anfertigung der histologischen Präparate zu gewährleisten.
3.2.9 Untersuchung der Spülflüssigkeit von Eileiter und Uterushorn
Unmittelbar nach der Spülung des Eileiters wurde die Spülflüssigkeit mittels Stereomikroskop (Carl Zeiss AG, Oberkochen; 70fache Vergrößerung) auf das Vorhandensein von Oozyten untersucht. Die gefundenen Oozyten wurden dann durch Zuhilfenahme von Eppendorf- Pipetten (Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen) in mit Karnowsky-Lösung gefüllte Eppendorf-Gefäße (Landgraf Laborsysteme GmbH, Langenhagen) überführt und bis zur wei- teren Bearbeitung im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Spülflüssigkeit des Eileiters wurde mittels Eppendorf-Pipetten (Landgraf Laborsysteme, Langenhagen) separat in ein Grainer-Röhrchen (Sarstedt, Nürmbrecht) verbracht.
