Bindung der Spermien im Ovidukt
3 Material und Methoden
4.7 Anzahl der Spermien pro Hündin
Auffällig sind die großen Unterschiede in der Spermienverteilung bei den einzelnen Hündin-nen, unabhängig von der Gruppenzugehörigkeit (s. auch Anhang Tabelle 22, Tabelle 25). Die Spanne lag in den uterinen Drüsen zwischen 0 und 12773,5, im Uteruslumen zwischen 0 und 4751 und im Eileiter zwischen 0 und 1573 ( Tabelle 17).
Tabelle 17: Anzahl der Spermien pro Hündin Uterus
Tier Drüsen1 Lumen Eileiter
1 9438,5 4751 182
2 55,5 0 2
3 2462,5 25 170
4 0 0 2
5 22 0 0
Gruppe 1 (2 Tage post ov.)
n = 6
6 12773,5 3394 1573
7 324,5 9 25
8 7 0 7
9 336,5 1 4
10 2833 62 31
11 3 2 1
12 791,5 53 5
Gruppe 2 (4 Tage post ov.)
n = 7
13 1571,5 32 64
1Die Dezimalstellen entstehen durch die Art der Kategorisierung und anschließender Berech-nung der Drüsen mit zwei bis fünf Spermien, die als 3,5 Samenzellen gerechnet wurden.
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5 Diskussion
5.1 Versuchsdurchführung
Bestimmung von Ovulation und Besamungszeitpunkt
Ziel dieser Studie war es, die Spermienverteilung und -Vitalität im Genitaltrakt der Hündin am Tag 2 und 4 nach ovulationsnaher Insemination festzustellen.
Die Untersuchungszeitpunkte orientierten sich an dem frühen Zeitraum, in welchem befruch-tungskompetente Oozyten im Ovidukt zu erwarten sind.
Die Anzahl verfügbarer Hündinnen von n = 6 (Gruppe 1) und n = 7 (Gruppe 2) erlaubte die statistische Analyse der erhobenen Daten.
Durch gynäkologische und endokrinologische Untersuchung in Kombination mit der Ultraso-nographie konnten der Zeitpunkt der Ovulation präzise bestimmt und die Insemination genau terminiert werden. Die bei der Ovulation vorliegenden Progesteronwerte entsprachen den in der Literatur angegebenen Werten (BOUCHARD et al. 1991; WRIGHT 1990; ARBEITER et al. 1991; JEFFCOATE 1998).
Die sonographischen Ovulationsbefunde wiesen neben den in der Literatur beschriebenen Merkmalen (Verschwinden der anechogenen Follikel, Auftreten hypoechogener aus Fibrin, Follikelflüssigkeit und lutealem Gewebe bestehender Strukturen; BOYD et al. 1993;
ENGLAND u. YEAGER 1993; HAYER et al. 1993) bei 10 Hündinnen einen anechogenen Bereich um das Ovar auf. TSUTSUI (1989) wies 2-3 ml einer transparenten Flüssigkeit in der Bursa ovarica zwölf Stunden vor der Ovulation nach, welche zum Zeitpunkt der Ovulation rosa oder rot war, die wahrscheinlich in dieser Studie sonographisch nachgewiesen werden konnte.
Im gesamten weiblichen Genitaltrakt, insbesondere den Ovarien im Rahmen der Follikelan-bildung, Ovulation und Gelbkörperkörperfunktion, läuft zyklusabhängig eine Neovaskularisa-tion ab (REYNOLDS et al. 1992). Zugleich kommt es zu einer kurzzeitigen Hyperämie am Follikel an der Austrittsstelle der Eizelle (LIEBIG 1999), wodurch es erst zur Transsudation
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von Serum (transparente Flüssigkeit) kommen könnte, welches durch die Ovulation und die damit einhergehende Ruptur der Follikelwand mit Erythrozyten (rötliche Färbung der Flüs-sigkeit) vermengt wird.
Ein Kollabieren der Follikel war, wie bereits beim Hund beschrieben, in Koinzidenz mit der Ovulation nicht zu beobachten (ENGLAND u. ALLEN 1989; ENGLAND u. YEAGER 1993;
HAYER et al. 1993; SILVA et al. 1996b).
Besamungsmethodik
Beim Schwein ist eine Abhängigkeit zwischen der Verteilung von Spermien im Eileiter und dem Eber bekannt (MBURU et al. 1996). Deswegen sollte durch das Poolen der Besamungs-portion aus dem Ejakulat zweier fertiler Rüden der Einfluss eines Rüden auf die Spermienver-teilung verringert werden. Daneben sollte gewährleistet werden, dass die vor Versuchsbeginn definierte Besamungsdosis an vorwärtsbeweglichen Samenzellen bei der artifiziellen Insemi-nation jeder Hündin gegeben war.
Die Merkmale der von den Rüden gewonnenen Ejakulate wiesen hinsichtlich des Volumens, der Spermiengesamtzahl, der Bewegungsaktivität, der Membranintegrität und der Morpholo-gie Normwerte auf (GÜNZEL-APEL et al. 1994).
Die Besamung erfolgte mittels Osiris-Katheter nach der modifizierten Methode von THERET et al. (1987) und NIŻAǸSKI (2006). NIŻAǸSKI (2006) konnte durch vaginale Besamung mit Frischsperma mit diesem Katheter ähnlich gute Ergebnisse erzielen wie bei Verwendung einer Rinder-Besamungspipette. Als Vorteil wird der Ballon des Katheters angesehen, der den Bulbus carvernosus des Rüden nachahmt und somit bei der besamten Hündin vaginale und uterine Kontraktionen induziert, welche den Transport der Spermien stimulieren (SILVA et al. 1996a, NIŻAǸSKI 2006). SILVA et al. (1996a) erzielten bei der vaginalen Besamung mit dem Osiris-Katheter auch mit laparoskopischer, uteriner Besamung vergleichbare Ergebnisse.
Ferner wurde der spermienreichen Phase ein geringes Volumen an Prostatasekret zugefügt.
So bestehen laut SMITH et al. (1987) Unterschiede im Spermientransport nach Bedeckung und Insemination, weil durch den Kopulationsvorgang und die Bestandteile des Seminalplas-mas Uteruskontraktionen ausgelöst werden. Ferner sollte durch den Ballon des Besamungska-theters ein retrograder Verlust des Inseminats verhindert werden.
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Die Ovariohysterektomie wurde am Tag 2 bzw. 4 nach der Ovulation bzw. der Besamung vorgenommen, so dass Tag 2 die Phase vor der Befruchtung der ersten Oozyten repräsentiert, Tag 4 die Phase, in welcher befruchtungskompetente Oozyten im Ovidukt zu erwarten sind.
Da der Vorgang der Eizellfreisetzung aus den Follikeln über 12-24 Stunden erfolgt (RENTON et al. 1992; TSUTSUI 1973), ist eine nicht näher zu bestimmende, geringe Diffe-renz bezüglich Ovulation – Besamung – Ovariohysterektomie zwischen den einzelnen Tieren möglich.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Penetration der Oozyten durch die Spermien circa drei bis vier Tage post ovulationem beginnt (CONCANNON et al. 1989; TSUTSUI 1989;
REYNAURD et al. 2005). Der späteste Befruchtungszeitpunkt wird mit 5 Tagen post ovulati-onem angegeben (TSUTSUI 1989).
Methodik der Organgewinnung und –Präparation sowie der Ermittlung der Spermienverteilung
Die Ovariohysterektomie sowie die anschließende Präparation erfolgten unter größtmöglicher Sorgfalt, um Manipulationsartefakte der Spermienverteilung zu vermeiden. Aus diesem Grunde wurden außerdem die Gebärmutterhörner bereits intra operationem mittels Naht-material ligiert. Eine Kontamination der Spülflüssigkeit mit Erythrozyten konnte trotz Säube-rung der Organe unmittelbar nach der Entnahme sowie während der Präparation nicht immer in ausreichendem Maße verhindert werden.
Bei anderen Tierarten (Rind, Schaf, Pferd, Schwein) wurde die Spermienverteilung durch Spülung definierter Genitalabschnitte, durch elektronenmikroskopische Untersuchungen oder durch Rückschlüsse von der Befruchtung der Eizellen oder der Anzahl von akzessorischen Spermien auf der Oozyte ermittelt (zum Beispiel HUNTER et al. 1980; FLÉCHON u.
HUNTER 1981; HUNTER 1984; BOYLE et al. 1987). Dagegen lieferte in der vorliegenden Studie die histologische Untersuchung umfassendere Ergebnisse als die Spülung von Uterus und Ovidukt. Entsprechendes wird von RIJSSELAERE et al. (2004) berichtet.
Da die Spülung des Ovidukts in einigen Fällen zu einer Schädigung des Organs führte, wurde aufgrund des knappen Organmaterials eine Integrität von mindestens 75% als Bedingung für die Auswertung zu Grunde gelegt.
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In zwei Fällen musste ein größerer Organdefekt, wahrscheinlich durch schiefes Einbetten, in Kauf genommen werden, was die Anfertigung neuer Schnitte ausschloss.
Die Einteilung in Ovidukt 1 (Infundibulum), Ovidukt 2, Ovidukt 3, Ovidukt 4 (kraniale UTV), kraniales und kaudales Uterushorn und Uteruskörper war bei der Präparation in der Mehrzahl der Fälle möglich. Der Bereich der Ampulle konnte aufgrund des Fehlens einer deutlichen Verengung zum Isthmus hin nicht eindeutig identifiziert werden. Deshalb wurde der Ovidukt zwischen Infundibulum und UTV halbiert und aus der Mitte jeder Hälfte eine Probe gewonnen.
Von allen Oviduktabschnitten wurden Querschnitte beginnend am Infundibulum in kaudaler Richtung angefertigt.
Nur an der uterotubalen Verbindung war das nicht sicher möglich, da der kraniale Bereich aufgrund der Windungen nicht in die für die Herstellung von Querschnitten erforderliche Po-sition eingebettet werden konnte.
Die Spermienverteilung wurde in erster Linie histologisch bestimmt: Nach Aufteilung des Genitaltrakts wurde die Spermienanzahl im Eileiter bzw. in den uterinen Drüsen absolut bzw.
prozentual ermittelt. Die Aufteilung der Drüsen in Quadranten war zur Erlangung eines reprä-sentativen Überblicks über den Genitalabschnitt geeignet und hilfreich. Dasselbe gilt für die Vorgehensweise bei der Auswertung durch Einbeziehung jeden Bereichs zwischen Myo-metrium und Gebärmutterlumen. Der doppelten Erfassung einzelner Samenzellen wurde bei der Anfertigung der histologischen Schnitte durch Verwerfen eines mindestens 10 µm großen Bereichs zwischen den einzelnen Schnitten in Anlehnung an die Länge eines Spermienkopfes von 5 bis 7 µm vorgebeugt. Die Clusterung von Spermien insbesondere in den kaudalen Ute-rusbschnitten (Gebärmutterhorn und -körper) verhinderte eine Auswertung der absoluten Spermienzahl in allen histologischen Schnitten. Aus diesem Grund erfolgte die Auswertung an 100 Drüsen durch Klassifizierung nach der Anzahl der Spermien pro Drüse Klasse 1: keine Spermien, Klasse 2: ein Spermium, Klasse 3: 2 bis 5 Spermien, Klasse 4: > 5Spermien.
Da die statistische Auswertung der Ergebnisse nur mit Hilfe absoluter Zahlen möglich war, wurden Drüsen mit 2 bis 5 Spermien als Drüsen mit 3,5 und Drüsen > 5 Spermien als Drüsen mit 6,0 Spermien gewertet. Diese Vorgehensweise erlaubte zwangsläufig nur eine tendenziel-le Bewertung, da die Spermienanzahl in zahlreichen Uterusdrüsen 6 deutlich überstieg.
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