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104
9 Anhang
Physiologische Kochsalzlösung:
42,5 g NaCl in 5 l Aqua dest. auflösen, autoklavieren.
NaCl-Lösung 10%:
10 g NaCl in 100 ml Auqa dest auflösen Formolzitrat 4 %:
2,9 g Na3-Citrat *2 H2O in 100 ml H2O dest., gut auflösen, dann 4 ml von der Lösung entfer-nen und gleiche Menge Formalin 37% hinzugeben
Formolzitrat 20%:
2,9 g Na3-Citrat *2 H2O in 100 ml H2O dest., gut auflösen, dann 20 ml von der Lösung ent-fernen und gleiche Menge Formalin 37% hinzugeben
4% gepuffertes Formalin: durch Rühren aufgelöst werden, dann das Formalin zugeben, mischen und den pH-Wert über-prüfen (7,0 Stimmt in der Regel).
Tabelle 18: Rezept für Tyrode-basierte Medien
mls in 100 ml (final concn-mM)
Phenolrot + Gentamycin (2mg Phenolrot + 10 mg genta/ml)
1.0
105
Stammlösungen sollen in Präzisionmesszylinder pipettiert werden. Bis auf 80-90 ml auffüllen, pH und Osmolalität kontrollieren.
Am Versuchstag:
20 µl BSA (150mg/ml) und 5 µl Pyruvat (22mg/ml, frisch) per ml zugeben. Ebenso werden Na-Laktat, Phenolrot und Gentamycin am Versuchstag dazugegeben. Ad 100 ml dest. H2O auffüllen. (Laktat und Pyruvat waren vorher nicht eingefroren.)
Äquilibrium pH at 38°C: 7.40 +/- 0.05 Zugabe des Cocadylsäure-Puffers und des Glutaraldehyds.
Stammlösung für die Toluidinblau-Färbung 1 g Toluidinblau
1 g Natriumtetraborat (Borax) 0,2 g Paraformaldehyd
ad 100 ml Aqua dest.
Entwässerung im Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter II, Shandon, Frankfurt) Nachfixierung für 1 Stunde in 10 %igem Formalin, spülen mit Leitungswasser,
dehydrieren in aufsteigender Alkoholreihe (70 %, 85 %, 96 %),entfernen des Alkohols mit Isopropanol und Essigsäure-n-Butylester
Hämalaun-Eosin (HE)-Färbung
Entparaffinisieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe beginnend mit Xylol (3x je) 5 Min., Isopropanol 5 Min., dann 96%iges, 70%iges und 50%iges Ethanol je 2-3 Min., dann Aqua dest.,
15 Min. in Hämalaun nach P. Mayer, 10 Min. Bläuen in Leitungswasser, in Aqua dest. Spülen,
1 Min. in 1%igem Eosin nach Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro Küvette in A. dest. spülen
Entwässern in einer aufsteigenden Alkoholreihe beginnend mit 70%igem, dann 96%
2-3 min., Isopropanol 5 Min., Xylol (3x je) 5 Min.
Eindecken in Roti-Histokitt (Eindeckmittel Rotihisto-Kitt, Fa. Roth C. GmbH )
106
Lösungen für die HE-Färbung Hämalaun nach P. Mayer:
1g Hämatoxylin in 1000ml A. dest lösen, 0,2 g Natriumjodat,
50 g chemisch reines Kalialaun (Kaliumaluminiumsulfat-12-sulfat) dazugeben und erwärmen;
nach dem Erkalten: 50 g Chloralhydrat und 1 g kristalline Zitronensäure dazugeben, kalt lösen; filtrieren;
Eosin:
0,1 % in A. dest lösen;
Nach dem Erkalten filtrieren;
Zum Färben auf 100ml 1% iges Eosin 2 Tropfen Eisessig geben
Tabelle 19: Bezugsquellen der Materialien, Chemikalien und Geräte für die Spermatologie und gynäkologischen Untersuchung
Applichem, Darmstadt: Hepes buffer NaCl (zur Analyse) Carl Zeiss AG, Oberkochen: Phasenkontrastmikroskop
Stereomikroskop Axioskop
Carl Roth, GmbH und CoKG, Karlsruhe: Formalin 37%
NaCl NaOH
Na2HPO4 2 H2O EGTA
Phenolrot
DL-GmbH, Nürnberg: Deckgläser 18 x 18
Objektträger 26 x 76 mm, Kanten geschliffen Heraeus Instruments GmbH, Hanau: Megafuge 2.0 R
Landgraf Laborsysteme GmbH, Langen-hagen:
Eppendorfgefäße
Eppendorf Pipetten (1-10, 10-100, 100-1000) PH-Papier
Pipettenspitze (gelb, blau) Zählkammer Thoma neu Memmert Landgraf Laborsysteme,
Lan-genhagen: Warmwasserbad
107
Sarstedt, Nürmbrecht: Grainer Röhrchen
Röhren 11,5 ml, 100x15,7 mm Serumröhre 10ml, 95x16,8 mm Röhre 3,5 ml, 55 x 12 mm
Serva, Heidelberg: Gentamycin
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkir-chen: Sigma Chemical Co, St. Louis, USA: MgSO4
WDT, Garbsen: OP-Kompressen 7,5 x 7,5 cm
Tabelle 20: Bezugsquellen der Materialien, Chemikalien und Geräte für die Bearbeitung und Untersuchung der Oozyten
DL-GmbH, Nürnberg: Deckgläser 18 x 18
Objektträger 26 x 76 mm, Kanten geschliffen Heraeus Kulzer, Wehrheim: Technovit® 7100
Technovit® 3040 SAV LP, Flinsbach a. Inn: 50% Alkohol
70% Alkohol
Waldeck GmbH Co.KG, Division
Chro-ma, Münster: Kamin-Essigsäure
108
Tabelle 21: Bezugsquellen der Materialien, Chemikalien und Geräte für die Histologie CG-Chemikalien, Laatzen: Ethanol, 99,9%
Engelbrecht, Edermünde: Chromalaun-Gelatine beschichtete Objektträ-ger
Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel: Warmwasserstreckbad für paraffinierte Ge-webeschnitte
GFL 1052 Labor- und Analysen GmbH,
Garbsen-Berenbostel: Warmwasserbad
Heraeus, Hanau: Wärmeschrank 5042
Leica Microsystems GmbH, Wetzlar: Färbeautomat, Leica ST 4040
Medite Medizintechnik, Burgdorf: Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000
Merck, Darmstadt: Eosin, gelblich
Hämatoxylin Microm, Heidelberg: Rotationsmikrotom
Shandon, Frankfurt: Automatensystem Tissue-Tek III ® Einbettsystem
Paraplast Plus®
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe: Chloralhydrat
Eindeckmittel Roti®-Histokitt Essigsäure-n-butylester (EBE) Hämalaunlösung nach Mayer Isopropanol
Natriumjodat p.a.
Sakura¸ AT Zoeterwoude, Niederlande: Tissue Tek Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkir-chen (ehemals Sigma, Fluka, Riedel de
Haën): Citronensäure-1-hydrat p.a., 33114
Waldeck GmbH Co.KG, Division
Chro-ma, Münster: Eiweiß-Glycerin W. Knittel GlasbearbeitungsGmbH,
Braunschweig: Deckgläser (24 x 50 mm)
109
Tabelle 22: Spermienverteilung im Eileiter
Hündin A11 A21 A31 A41 E11 E21 E31 E41
1 0 0 0 12 0 1 0 169
2 0 1 0 1 0 0 0 0
3 1 0 3 14 0 0 0 152
4 2 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0
Gruppe 1 (Ovariohysterektomie
2 Tage post ov.) (n = 6)
6 1 0 9 3 2 0 0 1558
7 0 0 0 23 0 0 0 2
8 0 0 3 2 0 2 0 0
9 0 3 0 0 0 0 0 1
10 0 0 0 0 0 1 0 30
11 0 0 0 0 0 1 0 0
12 0 0 0 3 1 0 1 0
Gruppe 2 (Ovariohysterektomie
4 Tage post ov.) (n = 7)
13 0 0 1 0 0 8 4 51
1Lokalisationen entsprechend Tabelle 2: Kennzeichnung der Gewebeproben des Genitaltrakts
Tabelle 23: Summe der Spermienanzahl über die Gruppe
A11 A21 A31 A41 E11 E21 E31 E41
Gruppe 1 (n = 6) 4 1 12 30 2 1 0 1879
Gruppe 2 (n = 7) 0 3 4 28 1 12 5 84
1Lokalisationen entsprechend Tabelle 2: Kennzeichnung der Gewebeproben des Genitaltrakts
Tabelle 24: Durchschnittliche Spermienanzahl im Eileiter
A1 A2 A3 A4 E1 E2 E3 E4
Gruppe 1 (n = 6) 0,67 0,17 2,00 5,00 0,33 0,17 0,00 313,17 Gruppe 2 (n = 7) 0,00 0,43 0,57 4,00 0,14 1,71 0,71 12,00
1Lokalisationen entsprechend Tabelle 2: Kennzeichnung der Gewebeproben des Genitaltrakts
110
Tabelle 25: Spermienverteilung im Uterus
Gruppe
Gruppe 2
(Ovariohysterektomie 4 Tage post ov.)
Gruppe 1
(Ovariohysterektomie 2 Tage post ov.)
Tier 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
111
Fortsetzung Tabelle 23: Spermienverteilung im Uterus
Gruppe
Gruppe 2
(Ovariohysterektomie 4 Tage post ov.)
Gruppe 1
(Ovariohysterektomie 2 Tage post ov.)
Tier 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
1Lokalisation, s. Tabelle 2: Kennzeichnung der Gewebeproben des Genitaltrakts
2Anzahl der Spermien in den Drüsen
112
Tabelle 26: Allgemeine Angaben zu den Studienhündinnen
♀
1Tag der Ovariohysterektomie p. ov.
2Differenz zwischen geschätzten LH-Peak (P4 2-4 ng/ml, nach WRIGHT et al. 1990) und Ovulation
3Zeit zwischen Auftreten der ersten Läufigkeitssymptome und der Ovulation
113
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Fortpflanzungsdaten - tierartlich vergleichend 11 Tabelle 2: Kennzeichnung der Gewebeproben des Genitaltrakts 41 Tabelle 3: Anzahl, Motilität und Plasmamembranintegrität von in der Spülflüssigkeit
von Eileiter und Uterus nachgewiesenen Spermien 50 Tabelle 4: Morphologie von in der Spülflüssigkeit von Eileiter und Uterus
nachgewiesenen Spermien 51
Tabelle 5: Verteilung der Spermien im Eileiter 53
Tabelle 6: Durchschnittliche Spermienanzahl im linken und rechten Eileiter 56 Tabelle 7: Durchschnittliche Spermienanzahl im gespülten und ungespülten Eileiter 57 Tabelle 8: Durchschnittliche Spermienanzahl in den uterinen Drüsen 57 Tabelle 9: Durchschnittliche Spermienanzahl im Gebärmutterlumen 58 Tabelle 10: Mittlerer Anteil der spermienhaltigen Uterindrüsen 59 Tabelle 11: Verteilung der Spermien in den Uterindrüsen 59 Tabelle 12: Durchschnittliche Spermienanzahl in den Drüsen des linken und rechten
Uterushorns 62
Tabelle 13: Durchschnittliche Spermienanzahl im Gebärmutterlumen des linken und
rechten Uterushorns 63
Tabelle 14: Durchschnittliche Spermienanzahl in den Drüsen des gespülten und
ungespülten Uterushorns 63
Tabelle 15: Durchschnittliche Spermienanzahl im Gebärmutterlumen des gespülten
und ungespülten Uterushorns 63
Tabelle 16: Durchschnittliche Spermienzahl im weiblichen Genitale 64
Tabelle 17: Anzahl der Spermien pro Hündin 65
Tabelle 18: Rezept für Tyrode-basierte Medien 104
Tabelle 19: Bezugsquellen der Materialien, Chemikalien und Geräte für die Spermatologie und gynäkologischen Untersuchung 106 Tabelle 20: Bezugsquellen der Materialien, Chemikalien und Geräte für die
Bearbeitung und Untersuchung der Oozyten 107
Tabelle 21: Bezugsquellen der Materialien, Chemikalien und Geräte für die Histologie 108
Tabelle 22: Spermienverteilung im Eileiter 109
Tabelle 23: Summe der Spermienanzahl über die Gruppe 109
Tabelle 24: Durchschnittliche Spermienanzahl im Eileiter 109
Tabelle 25: Spermienverteilung im Uterus 110
Tabelle 26: Allgemeine Angaben zu den Studienhündinnen 112
114
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Versuchsablauf, schematisch ... 33
Abbildung 2: Kennzeichnung der Eileiterabschnitte entsprechend Tabelle 2... 42
Abbildung 3: Untersuchte Gebärmutterabschnitte entsprechend Tabelle 2 ... 42
Abbildung 4: Sonographie... 48
Abbildung 5: Oozyten in der Spülflüssigkeit des Eileiters von Tier 14... 52
Abbildung 6: Mukosafalten des Eileterinfundibulums, bestehend aus einschichtigem hochprismatischen Epithel, kein Spermium sichtbar (H.E.-gefärbter Schnitt) ... 54
Abbildung 7: Isthmus, kein Spermium sichtbar (H.E.-gefärbter Schnitt )... 54
Abbildung 8: Kranialer Bereich der uterotubale Verbindung, kein Spermium sichtbar (H.E.-gefärbter Schnitt)... 55
Abbildung 9: Kranialer Bereich der uterotubalen Verbindung mit einem Spermium (H.E.-gefärbter Schnitt)... 55
Abbildung 10: Endometrium des Uteruskörpers, Region mit unterschiedlich vielen Spermien in den einzelnen Drüsen (H.E.-gefärbter Schnitt)... 60
Abbildung 11: Endometrium des Uterushorns, Drüsen mit 2 Spermienköpfen (H.E.-gefärbter Schnitt)... 60
Abbildung 12: Endometrium des Uterushorns, Drüse mit mehr als fünf Spermien, einzelne Spermien können nicht genau differenziert werden (H.E.-gefärbter Schnitt )... 61
Abbildung 13: Endometrium des Uterushorns, Drüse mit mehr als fünf Spermien, die einzelnen Spermien sind weitestgehend differenzierbar (H.E.-gefärbter Schnitt) ... 61
Abbildung 14: Endometrium des Uteruskörpers, Drüse mit einem Spermium, dicht an der Muskularis gelegen (H.E.-gefärbter Schnitt) ... 62
115
Danksagung
Frau Prof. Günzel-Apel danke ich für die Überlassung des sehr interessanten Themas und die Möglichkeit, wertvolle Kenntnisse im Bereich der Reproduktionsmedizin bei Hund und Katze zu sammeln.
Mein weiterer Dank gilt Frau Prof. Meyer-Lindenberg, Frau Dr. Kramer und Mitarbeitern aus der Kleintierklinik für die sorgfältige Durchführung der Ovariohysterektomie.
Ein herzliches Dankeschön an Prof. Beinecke und Bettina Bunk aus dem Institut für Patholo-gie für die Hilfe und Beratung bei der Anfertigung und die Tips zur Auswertung der histolo-gischen Präparate.
Meinen ganz besonderen Dank an Franziska Eschricht, für die Unterstützung bei den Besa-mungen und der Untersuchung der Spülflüssigkeit, meistens am Wochenende, ebenso Carola Urhausen, Marta Gosk und Anja Seefeldt.
Ohne die Hilfe aus dem Labor von Petra Hasenleder, Erika Schröder und Yvonne wäre die ganze Arbeit sicherlich nicht möglich gewesen- vielen Dank.
Edita Podhajski, Monika Gummer und Prof. Meinecke aus der Reproduktionsbiologie ein großes Dankeschön für die Bearbeitung der Oozyten und so manch einen hilfreichen Tipp.
Ebenso Prof. Meyer und Marion Gähle aus dem anatomischen Institut.
Prof. Hoppen und Frau Niederstrucke aus der Abteilung Endokrinologische Chemie des Insti-tuts für Chemie danke ich für die Untersuchung der Progesteronproben – und Frau Dr. Marion Piechotta für die Suche nach den Estrogenproben.
Vielen Dank auch Dr. Beyerbach aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informa-tionsverarbeitung für die Beratung bei der statistischen Auswertung.
Meinen Freundinnen Lena und Annika danke ich für die ständige Aufmunterung, das Ver-ständnis für die wenige Zeit und das Korrekturlesen der Arbeit.
Den Beaglen aus der Studie danke ich für ihre Kooperationsbereitschaft, den liebevollen Er-fahrungen, die ich durch sie habe sammeln dürfen und die tolle Zeit – insbesondere Danke ich Curly für ihre ständig gute Laune, mit der sie mich immer zum Lachen bringt.
Meinem Freund Marcos danke ich herzlich für seine Liebe, Verständnis, Ausdauer und Hilfe, den Rechner zu bezwingen.
Meinen Eltern danke ich herzlich für die schöne Kindheit und die Ausbildung, die sie mir ermöglicht haben und ihre stetige Liebe.