Bindung der Spermien im Ovidukt
3 Material und Methoden
5.2 Ergebnisse der Spermienverteilung durch Spülung und histologische Auszählung
5.2 Ergebnisse der Spermienverteilung durch Spülung und histologische Auszählung
Innerhalb und zwischen den beiden Gruppen waren große Unterschiede zwischen den durch Spülung und histologische Auszählung ermittelten Samenzellzahlen bei den Hündinnen zu verzeichnen.
Bei verschiedenen Tierarten wird über einen individuell unterschiedlichen Spermientransport berichtet (OVERSTREET u. KATZ 1990 zitiert nach RIJSSELAERE et al. 2004), was auch hier in der großen Variation der Spermienverteilung innerhalb der Gruppen zum Ausdruck kommt.
Im Gegensatz dazu erwogen FIALA et al. (2008) bei Stuten, bei denen sie keine Samenzellen nachweisen konnten, die Möglichkeit der Subfertilität aufgrund fehlender Uteruskontraktionen und ausbleibenden Spermientransports. Ein solcher Zusammenhang erscheint bei klinisch und histologisch genitalgesunden Tieren, wie sie in dieser Studie verwendet wurden, eher fraglich.
Aber auch Samenspender und Samendeponierung können den Transport von Samenzellen beeinflussen. So verzeichneten MBURU et al. (1996) unterschiedliche Spermienverteilungen in Abhängigkeit vom eingesetzten Eber und SMITH et al. (1987) fanden im Genitaltrakt weiblicher Hamster mehr Spermien nach natürlichem Deckakt als nach Insemination, was auf eine unterschiedliche Spermienzahl oder erhöhten retrograden Spermienverlust nach Besa-mung zurückzuführen sein kann.
In dieser Studie wurden die Hündinnen mit einer definierten Anzahl von 1 x 109 vorwärtsbe-weglichen Spermien (insgesamt 1,05-1,3 x 109 Spermien) besamt, um einen Einfluss zu ge-ringer inseminierter Spermienzahlen von vornherein auszuschalten. Zur Vermeidung indivi-dueller Einflüsse wurden zudem stets die Ejakulate zweier Rüden gepoolt, wobei für jede Be-samung dieselben Rüden verwendet wurden.
Nachweis der Spermien durch Spülung von Eileiter und Uterushorn Durch Spülung von Eileiter und Gebärmutterhorn konnten insgesamt nur wenige Spermien in 50 µl zentrifugierter und abpipettierter Flüssigkeit gewonnen werden. Dies war nur bei 7 von
71
13 Tieren möglich. Auch RIJSSELAERE et al. (2004) fanden bei Hündinnen nach Spülung des Genitaltrakts der Hündin nur wenige Spermien. Allerdings lag die durchschnittliche An-zahl zurückgewonnener Spermatozoen trotz einer geringeren Besamungsdosis (500 x 106 Spermien) im Bereich von 104 also deutlich höher als in der vorliegenden Studie. Dies kann auf den mit 24 Stunden deutlich kürzeren Zeitraum zwischen Ovariohysterektomie und der Spülung beruhen.
Die Untersuchung der Samenzellen wurde in dieser Studie durch die Agglutination mit E-rythrozyten erschwert. Trotz sorgfältiger Reinigung der äußeren Organoberfläche mittels Tyr-ode-Medium schon direkt nach Entfernung der Organe konnte dies nicht verhindert werden.
Die meisten durch Spülung gewonnenen Samenzellen waren unbeweglich, teilweise auch membrangeschädigt.
RIJSSELAERE et al. (2004) fanden hingegen 24 Stunden nach prä- und periovulatorischer Besamung Spermien mit intakter Membran und Akrosom, nach postovulatorischer Insemina-tion jedoch mehr membran- und akrosomengeschädigte Samenzellen. Der Anteil motiler Spermien war generell gering. Zu beachten ist, das die Autoren den Zeitpunkt der Ovulation über die Bestimmung der Progesteronkonzentration im peripheren Blut „geschätzt“, die Ovu-lation aber nicht direkt nachgewiesen haben.
Nach einmaliger Spülung des Eileiters und der Gebärmutterhörner bestanden in den histolo-gischen Präparaten der gespülten und ungespülten Seite dieser Studie keine statistisch abgesi-cherten Unterschiede bezüglich der Spermienzahl. Somit waren histologisch auch im Lumen der gespülten und ungespülten Uterushörner und Eileiter zwei Tage nach Ovulation eine be-trächtliche Menge an Spermien zu finden. Es wurde folglich durch die Spülung nur eine sehr geringe Menge luminaler Spermien gewonnen. Der Nachweis von Oozyten bei fast allen Hündinnen beweist jedoch, dass die Spülung des Eileiterlumens korrekt durchgeführt wurde.
Nach DROBNIS und OVERSTREET (1992) können durch einmaliges Spülen die in den Drü-sen, Falten und Krypten liegenden oder an das Epithel gebundene Samenzellen nicht gewon-nen werden. Die Epithel-gebundegewon-nen Samenzellen repräsentieren jedoch gerade die befruch-tungskompetente Spermienpopulation. Dabei handelt es sich um eine selektierte Population morphologisch normaler, motiler Spermien (THOMAS et al. 1994b).
MBURU et al. (1996) wiesen bei der ersten postovulatorischen Spülung porciner Eileiter mehr Spermien nach als bei einer zweiten Spülung und machen hierfür den Einfluss der
Ovu-72
lation auf die Bindung der Spermien an das Eileiterepithel verantwortlich. SMITH und YANAGIMACHI (1990) gingen davon aus, dass bei der ersten Spülung des Isthmus luminale Spermien, durch eine weitere Spülung an der Mukosa haftende Samenzellen und bei einer dritten in den „Krypten“ befindliche Spermien gewonnen werden können. Da in der vorlie-genden Studie nur einmal gespült wurde, ist diesbezüglich keine Aussage möglich.
Die Ergebnisse von CHATDARONG et al. (2004) bei der Katze sind mit den eigenen Daten insofern vereinbar, als dass sie histologisch eine vergleichbare Anzahl an Samenzellen auf der gespülten und der nicht gespülten Seite nachweisen konnten.
Seitenvergleich
Da bei der Hündin gewöhnlich mehrere Follikel an beiden Ovarien zeitgleich zur Ovulation kommen, ist kein Spermienunterschied bezüglich der Seitenverteilung zu erwarten. Dies konnte durch die vorliegende Studie bestätigt werden.
Bei anderen Spezies berichten verschiedene Autoren über den Einfluss der Ovulation auf die Spermienverteilung im ipsi- und kontralateralen Ovidukt und Uterushorn (HERZ et al. 1985;
WILLIAMS et al. 1993; SULTAN u. BEDFORD 1996). Bei diesen kommt es aber meistens auch nur an einem Ovar zum Follikelsprung.
Spermienverteilung von kaudal nach kranial
Im weiblichen Genitale findet unabhängig von der Tierart eine starke Reduktion der Sper-mienanzahl und Selektion von Samenzellen von kaudal nach kranial statt. Dieser wird unter anderem durch die Barrieren (Zervix, uterotubale Verbindung) zur Verhinderung der Po-lyspermie und der daraus folgenden fehlgeleiteten embryonalen Entwicklung aufgebaut (HUNTER 1996).
So kommt es beim Rind zu einer Reduktion der Samenzellzahl der Größenordnung 1010 im Ejakulat, auf 106 im Uterus, 104 im kaudalen Eileiteristhmus und letztendlich 102 Spermien in der Eileiterampulle (TÖPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001).
In der vorliegenden Studie konnte eine durchschnittliche Abnahme von 109 vorwärtsbewegli-chen Spermien in der Besamungsdosis (insgesamt 1,05-1,3 x 109 Spermien) auf 3,0 x 103 im Uterus und 27,3 Spermien im Eileiter festgestellt werden. Allerdings können diese Ergebnisse
73
nicht mit den Daten beim Rind verglichen werden, da die Spermienzahl im Uterus der Hün-dinnen nicht absolut bestimmt wurde, sondern lediglich je 6.000 Drüsen im kranialen und kaudalen Uterushorn und 3.000 im Uteruskörper ausgewertet und entsprechend der dort nach-gewiesenen Samenzellen semiquantitativ klassifiziert wurden. Diese Vorgehensweise war, wie bereits erwähnt, notwendig, weil die Clusterung der Samenzellen die genaue Quantifizie-rung der Spermien in der Gebärmutter erschwerte.
Spermienreservoir und -barriere
Dem distalen Eileiter als Spermienreservoir werden folgende Aufgaben zugeschrieben: Kon-trolle des Spermientransports, Schutz vor Polyspermie, Schutz vor aus dem Uterus aufstei-genden polymorphkernigen Granulozyten sowie vor metabolischer Stimulation durch das Sekret von Uterus und der Eileiterampulle, Befreiung vom Seminalplasma und Regulation der Spermienkapazitation und -hyperaktivierung (HUNTER u. LÉGLISE 1971; FLÉCHON u.
HUNTER 1981; HUNTER 1995; GUALTIERI u. TALEVI 2000; PETRUNKINA et al. 2001;
SUAREZ 2001; SUAREZ 2002). Die Kontrolle des Spermientransports und der Schutz vor Polyspermie werden auch von einer Spermienbarriere wahrgenommen. Barrieren sind zum Aufbau eines Spermiengradienten notwendig.
Beim Wiederkäuer (QUINLIVAN u. ROBINSON 1969; HUNTER et al. 1980; HUNTER u.
NICHOL 1983; HUNTER u. WILMUT 1984; HYTTEL et al. 1991; LANE et al. 1993;
SUAREZ et al. 1997; COX et al. 2002), Schwein (FLÉCHON u. HUNTER 1981; HUNTER 1981; HUNTER u. NICHOL 1986; SUAREZ et al. 1991; PETRUNKINA et al. 2001) und verschiedenen Heimtieren (YANAGIMACHI u. MAHI 1976; SMITH et al. 1987; SMITH u.
YANAGIMACHI 1990; DEMOTT u. SUAREZ 1992; ORIHUELA et al. 1999) stellen die uterotubale Verbindung und der kaudale Eileiteristhmus das Spermienreservoir dar.
FIALA et al. (2008) vermuten beim Pferd zusätzlich eine Beteiligung der uterinen Drüsen.
Ansonsten ist die Speicherung von Spermatozoen in den Drüsen der Gebärmutter nur bei der Katze präovulatorisch (CHATDARONG et al. 2004) und bei der Kleinen Braunen Fleder-maus (Myotis lucifugus) bekannt, bei der die Spermien sieben bis acht Monate in den uterinen Drüsen und der uterotubalen Verbindung gespeichert werden können (RACEY et al. 1987).
74
Zusätzlich zur uterotubalen Verbindung werden die Uterindrüsen der Hündin von DOAK et al. (1967), RIJSSELAERE et al. (2004) sowie ENGLAND et al. (2006) als funktionelles Spermienreservoir bezeichnet.
Insgesamt wurden in der vorliegenden Studie die meisten Spermien in den Gebärmutterhör-nern und im Gebärmutterkörper und dort hauptsächlich in den Drüsen gefunden. In den Eilei-tern waren deutlich weniger Samenzellen zu finden. Die uterinen Drüsen scheinen bei der Hündin als Spermienreservoir zu fungieren. Anhand der dramatischen Abnahme der Sper-mienzahl im kranial der UTV befindlichen Ovidukt lässt sich deren Funktion als Barriere auch beim Hund ableiten.
Diverse in-vitro-Studien konnten zeigen, dass Vitalität und Motilität von Hundespermien durch Bindung der Spermienköpfe an Eileiterexplantate aufrechterhalten werden können (ELLINGTON et al. 1995; PACEY et al. 1999; KAWAKAMI et al. 2001). ENGLAND et al.
(2006) stellten darüber hinaus die zyklusabhängige Bindung von Spermien an bestimmte Bereiche des Uterusepithels und die darauf beruhende Erhaltung ihrer Motilität dar. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigten die Samenzellen eine Anordnung in Clustern mit parallel angeordneten Spermienschwänzen (BURGESS 2000 zitiert nach ENGLAND et al. 2006).
Über eine Bindung der Spermien an das Epithel kann anhand der histologischen Präparate keine Aussage getroffen werden.
An den untersuchten Lokalisationen konnte bezüglich der Spermienzahl kein signifikanter Unterschied zwischen den an Tag 2 und an Tag 4 post ovulationem untersuchten Tieren nachgewiesen werden, jedoch waren an Tag 2 post ovulationem signifikant mehr Uterindrüsen mit > 5 Spermien zu finden als 4 Tage post ovulationem. Dies betraf in Gruppe 1 nahezu 50% der Drüsen der Uterushörner, wobei die genaue Spermienanzahl aufgrund der dicht gedrängten Anordnung der Zellen nicht bestimmt werden konnte (Abbildung 12-Abbildung 13). Dagegen enthielt die überwiegende Anzahl der Drüsen bei den Hündinnen der Gruppe 2 eine bis 5 Samenzellen, im Gebärmutterkörper sogar hauptsächlich ein Spermium.
Daraus ergibt sich die Vermutung, dass während der fertilen Phase der Oozyten Spermien aus den Uterindrüsen freigesetzt und zu anderen Lokalisationen im weiblichen Genitale
75
transportiert oder phagozytiert werden. Die Gesamtzahl der beobachteten Spermien bleibt dabei innerhalb der entsprechenden Genitalabschnitte konstant.
Aufgrund der durch Klassifizierung der Drüsen und entsprechende Berechnung mit 3,5 und 6 Spermien pro Drüse erzielten Ergebnisse kann eine Abnahme der absoluten Spermienanzahl im Uterushorn z.B. durch Phagozytose nicht gänzlich ausgeschlossen werden, zumal mit der Auflösung der Spermiencluster der diesbezügliche Schutz verloren geht. Nach DOAK et al.
(1967) sind mit Einsetzen des Metöstrus, also etwa 7 bis 8 Tage nach der Ovulation (HOLST u. PHEMISTER 1974), keine Spermien mehr im Genitaltrakt der Hündin auffindbar. Dieser Zustand hätte in Gruppe 2 (Ovariohysterektomie Tag 4 post ov.) innerhalb von 3 bis 4 Tagen erreicht werden müssen.
Jeweils 24 Stunden nach Insemination fanden RIJSSELAERE et al. (2004) bei den periovula-torisch besamten Hündinnen in 54,7% der Drüsen mehr als fünf Samenzellen, dagegen nur in 19,9% bzw. 28,2% der Drüsen bei den prä- bzw. postovulatorisch inseminierten Tieren. Bei präovulatorischer Besamung waren in der Mehrzahl der Drüsen ein Spermium, bei postovula-torischer Insemination zwei bis fünf Spermatozoen pro Drüse zu finden.
Eine Verklumpung von Spermien in den uterinen Drüsen wurde schon von DOAK et al.
(1967) beschrieben. Diese Autoren wiesen die meisten spermienhaltigen Drüsen in den Ute-rushörnern, weniger im Uteruskörper nach.
Der Anteil an spermienhaltigen Drüsen war in der vorliegenden Studie sowohl im Vergleich mit den Befunden von RIJSSELAERE et al. (2004) als auch von DOAK et al. (1967) mit 5,3% im Uteruskörper und 7,1% im Uterushorn von Gruppe 1 und entsprechend 1,3% und 2,0% in Gruppe 2 bedeutend geringer.
Bei RIJSSELAERE et al. (2004) waren in der periovulatorisch besamten und 24 Stunden spä-ter ovariohysspä-terektomierten Gruppe im Gebärmutspä-terkörper 26,5% und in den Hörnern 24,8-27,9% der Drüsen mit Spermien angefüllt. Die Größe der Besamungsdosis kann hierfür je-doch nicht verantwortlich sein: Während die erste Autorengruppe mit einer definierten Sper-mienmenge von 500 x 106, gepoolt aus dem Ejakulat von drei Rüden, tief intravaginal besam-te, ließ die zweite Gruppe die Hündinnen jeweils von einen von fünf verschiedenen Rüden decken. In dieser Studie kam allerdings sogar eine Milliarde vorwärtsbeweglicher
Samenzel-76
len bei der Insemination zum Einsatz. Ein deutlicher Unterschied liegt allerdings in dem Ab-stand zwischen der künstlichen Besamung und der Ovariohysterektomie: RIJSSELAERE et al. (2004) führten die Operation jeweils 24 Stunden nach artifizieller Insemination durch.
Unter Berücksichtigung der Ergebnissen von RIJSSELAERE et al. (2004) und der eigenen Studie lässt sich im Hinblick auf die Ansammlung von Spermien in den uterinen Drüsen eine Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Ovulation, jedoch nicht vom Tag der Besamung ableiten.
Im Genitaltrakt von weiblichen Meerschweinchen fanden MARTAN und SHEPHERD (1973) 15 bis 24 Minuten nach Bedeckung histologisch Spermien in einer „Geldrollen“-artigen An-ordnung, die mit fortschreitender Zeit seltener zu finden waren und weniger Spermien enthiel-ten. Die längsten „Geldrollen“ waren in der uterotubalen Verbindung nachweisbar, die schnellste Dissoziation in einzelne Samenzellen erfolgte im Uterus. Die Anzahl an „Geldrol-len“ nahm über die Zeit zu Gunsten der einzelnen Spermien ab. Die „Geldrollen-artige“ An-ordnung der Spermien wird als Schutzmechanismus vor Phagozytose angesehen, während Dissoziation der Spermien der Vermeidung der Polyspermie dienen dürfte.
FIALA et al. (2008) untersuchten beim Pferd, CHATDARONG et al. (2004) bei der Katze das Vorkommen von Samenzellen im Genitaltrakt des weiblichen Tieres histologisch. Wäh-rend die erstgenannten eine Gruppenbildung von Samenzellen in den Uterindrüsen nicht er-wähnen, konnten die letztgenannten diese zwar beobachten, allerdings quantifizierten sie die Gruppengröße nicht weiter.
Während bei anderen Tierarten die Ovulation sowie deren Produkte periovulatorisch für die Migration der Spermien in kraniale Richtung verantwortlich gemacht werden (HARPER 1973; HUNTER 1996; KAEOKET et al. 2002; BRUSSOW et al. 2006; HUNTER 2008) kommt es beim Hund nur zu einer Umverteilung der Spermien innerhalb der Uterindrüsen, da zahlenmäßig keine Verschiebung innerhalb der einzelnen Abschnitte des Genitaltrakts zu er-kennen war.
Als mögliche Ursache für die Vereinzelung der in den Clustern befindlichen Spermien nach 2 Tagen post OV könnten die Ovulation und die damit einhergehenden endokrinen Verände-rungen, die zwischen Ovulation und Ovariohysterektomie verstreichende Zeit sowie an die Oozyten assoziierten Veränderungen in Frage kommen.
77
Bei verschiedenen Tieren ist in die Kontrolle des Spermientransports der präovulatorischen Graff`schen Follikel bzw. Progesteron involviert (HUNTER 1996, 2008).
Es ist auch bekannt, dass Progesteron in kapazitierten Spermien den Kalzium-Influx und die Akrosomenreaktion initiieren kann. Folglich kann die Follikelluteinisierung und der damit verbundene präovulatorische Progesteronanstieg als Stimulus für die Loslösung der Spermien vom Eileiterepizhel angesehen werden (ENGLAND u. BURGESS 2003).
In-vitro-Studien zur Oozyten-Reifung zeigen, dass diese durch Supplementierung von Pro-gesteron oder in Kombination mit Östrogenen gefördert wird (VANNUCCHI et al. 2006).
Im Gegensatz zu anderen Tierarten, bei welchen die Befruchtung in der Ampulle bzw. im Übergang von Ampulle zum Isthmus geschieht, findet diese beim Hund zwischen 54 und 120 Stunden post ovulationem im distalen Eileiter statt (TSUTSUI 1975; TSUTSUI 1989;
REYNAUD et al. 2005), wobei der „distale Eileiter“ nicht genauer definiert wird.
Obwohl andere Autoren von der Befruchtung von Oozyten im Rahmen von 3 bis 4 Tagen nach der Ovulation sprechen (REYNAUD et al. 2005), konnten in der vorliegenden Studie keine befruchteten Eizellen nachgewiesen werden. Die Befruchtung der Oozyten scheint nicht vor 4 Tagen post ovulationem zu erfolgen. Dabei ist aber zu beachten, dass der Prozess der Ovulation selbst beim Hund 12 bis 24 Stunden dauern kann (TSUTSUI 1973; RENTON et al 1992).
5.3 Schlussfolgerungen
Zusammenfassend lassen sich aus dieser Studie folgende Schlüsse ziehen:
1. Während des Befruchtungszeitraums findet bei Anwesenheit von Oozyten im Eileiter keine signifikante Umverteilung von Spermien statt.
2. Zwei Tage post ovulationem dominieren im Uterus Drüsen mit mehr als fünf Samen-zellen, während vier Tage post ovulationem Drüsen mit zwei bis fünf Spermien im Uterushorn und mit einer Samenzelle im Uteruskörper überwiegen. Die Auflösung der
78
Spermiencluster und die damit einhergehende Vereinzelung von Spermien erfolgen im zeitlichen Bezug zur zurückliegenden Ovulation.
3. Die uterinen Drüsen und die uterotubale Verbindung beim Hund scheinen sowohl als Spermienreservoir als auch als –barriere zu fungieren.
4. Die Befruchtung der Oozyten scheint nicht vor 4 Tagen post ovulationem zu erfolgen.
5. Die Spermienverteilung im Genitaltrakt der Hündin lässt sich besser mittels histologi-scher Untersuchungen als durch Spülung des weiblichen Genitaltrakts bestimmen.
In in-vitro-Studien werden Monolayer, Präparate der apikalen Plasmamembran oder Explan-tate von Eileitern verwendet. Untersuchungen zur Interaktion zwischen Spermien und dem Uterusepithel, z.B. im Hinblick auf die Erhaltung der Vitalität, Beeinflussung der Motilität sowie das Bindungsvermögen wurden bisher kaum unternommen.
Derartige Studien dürften in Anbetracht der Tatsache, dass die uterinen Drüsen bei Pferd, Katze und Hund im Zeitraum zwischen Bedeckung oder Besamung an der Spermenspeiche-rung beteiligt sind, aufschlussreiche Ergebnisse liefern. Interessant wäre auch die genaue Un-tersuchung der Clusterung von Samenzellen im zeitlichen Verlauf der Spermienmigration und –speicherung in-vitro, ebenso wie der Effekt von Progesteron auf die Bindung bzw. Loslö-sung der Spermien vom Epithel der Genitalmukosa des weiblichen Hundes.
79