Charakterisierung von Legumainen des bovinen Lungenwurmes und deren Evaluierung als
Vakzinekandidaten
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Julia Korrell
Schleswig
Hannover 2014
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Christina Strube, PhD 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ralph Brehm
Tag der mündlichen Prüfung: 26. Mai 2014
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unter dem Förderkennzeichen STR 1171/2-1 sowie das EU-unterstütze FP7-Projekt “Vaccines against helminth infections“ (PARAVAC) gefördert.
Meinen Eltern, meinen Großeltern und meiner Schwester
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Korrell, J., Schnieder, T., Strube, C. (2012)
Transkriptionsmuster von Cysteinproteinasen während der Entwicklung des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus
Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Krankheiten“
Hannover, 02.-04.07.2012
Haake, C., Korrell, J., Strube, C. (2013)
Cysteinproteasen des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus Tagung der DVG-Fachgruppe „Parasitologie und Parasitäre Krankheiten“
Gießen, 08.-10.07.2013
Strube, C., Korrell, J., Haake, C. (2013)
Transcriptional and functional characterization of cysteine proteases of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus
The 24th International conference of the World Association for the Advancement of Veterinary Parasitolology (WAAVP)
Perth, Australien, 25.-29.08.2013
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG ... 11
2. LITERATURÜBERSICHT ... 13
2.1 Dictyocaulus viviparus - Der Lungenwurm des Rindes ... 13
2.1.1 Die Biologie des Erregers ... 13
2.1.2 Klinisches Bild und Pathologie der Dictyokaulose ... 14
2.1.3 Bekämpfung der Dictyokaulose ... 15
2.1.3.1 Behandlung mit Anthelminthika ... 15
2.1.3.2 Vakzinierung zur Prophylaxe parasitärer Infektionen ... 16
2.1.3.2.1 Stand der Forschung zur Vakzineentwicklung gegen mehrzellige Parasiten ... 16
2.1.3.2.2 Stand der Forschung zur Vakzineentwicklung gegen D. viviparus ... 18
2.2 Legumaine ... 21
2.2.1 Vorkommen ... 21
2.2.2 Bedeutung und Forschungsstand bei anderen Organismen ... 22
2.2.2.1 Legumaine der Pflanzen ... 22
2.2.2.2 Legumaine des Menschen ... 22
2.2.2.3 Legumaine der Parasiten ... 22
2.2.2.3.1 Legumaine der Trematoden ... 22
2.2.2.3.2 Legumaine der Nematoden ... 24
3. MATERIAL UND METHODEN ... 25
3.1 Verwendete Puffer und Lösungen... 25
3.2 Verwendete Medien und Platten ... 28
3.3 Verwendete Reagentien, Enzyme, Reaktionskits, Software und Geräte ... 28
3.4 Verwendete Bakterien, Hefen und Vektoren ... 33
3.5 Versuchsplan... 33
3.6 Alignment ... 34
3.6.1 Phylogenetische Abstammung ... 34
3.7 Rekombinante Expression von LEG-1 und LEG-2 in der Hefe Pichia pastoris ... 35
3.7.1 PCR Protokoll zur Inserterstellung für den Vektor PCR™4-TOPO ... 36
3.7.2 Agarosegelelektrophorese, DNA-Aufreinigung und Klonierung in pCR®4-TOPO® .. 37
3.7.3 Restriktionsenzymverdau von LEG-1 und pPinkα-HC ... 38
3.7.4 Ligation von LEG-1-Insert und Expressionsvektor ... 39
3.7.5 Linearisierung ... 40
3.7.6 Vorbereitung der Hefezellen für die Elektroporation ... 40
3.7.7 Elektroporation... 41
3.7.8 Proteinexpression ... 41
3.7.9 Affinitätschromatographie von rekombinantem LEG-1 und LEG-2 ... 42
3.7.10 Entsalzen von LEG-1/LEG-2 ... 43
3.7.11 SDS-PAGE und Western Blot ... 43
3.8 Produktion polyklonaler Anti-LEG-1 bzw. Anti-LEG-2 Antikörper ... 44
3.9 Quantitative real-time PCR (qPCR) ... 44
3.9.1 Generierung von Standardreihen ... 45
3.9.1.1 Linearisierung der Plasmide für die Standardreihen ... 48
3.9.1.2 Dephosphorylierung der Plasmide für die Standardreihen ... 48
3.9.2 Durchführung der qPCR Läufe ... 49
3.10 Überprüfung der qPCR-Ergebnisse auf Expressionsebene ... 52
3.11 LEG-1-Enzymcharakterisierung ... 53
3.11.1 Transaktivierung von LEG-1 durch CPL ... 54
3.11.2 Assay-Bedingungen ... 54
3.11.3 Bestimmung des pH-Optimums ... 55
3.11.4 Bestimmung des Temperatur-Optimums ... 56
3.11.5 Verhalten von LEG-1 nach Zugabe von Inhibitoren ... 56
3.11.6 LEG-1 Enzymkinetik ... 56
3.11.7 Natürliche Substrate ... 59
3.12 LEG-2 Enzymcharakterisierung... 59
3.12.1 Transaktivierung von LEG-2 durch CPB-3 ... 59
3.12.2 Assay-Bedingungen ... 59
3.12.3 Restliche LEG-2 Charakterisierung ... 60
3.13 Immunfluoreszenz ... 60
3.14 Vakzineversuche ... 62
3.14.1 Erster Vakzineversuch ... 62
3.14.1.1 Statistik ... 64
3.14.2 Zweiter Vakzineversuch ... 64
3.14.3 Dritter Vakzineversuch ... 65
3.15 ELISAs ... 65
4. ERGEBNISSE ... 67
4.1 Sequenzhomologie von LEG-1 und LEG-2 ... 67
4.2 Phylogenetische Abstammung von LEG-1 und LEG-2 ... 67
4.3 Klonierung und Expression von rekombinantem LEG-1 und LEG-2 ... 69
4.4 Transkriptionsmuster ausgewählter Cysteinproteasen während der Entwicklung von D. viviparus – Vergleich freilebend und parasitisch ... 70
4.5 Bestätigung der Ergebnisse der qPCR auf Expressionsebene ... 74
4.6 Charakterisierung von LEG-1 in Enzym-Assays ... 79
4.6.1 Transaktivierung von LEG-1 durch CPL ... 79
4.6.2 Artifizielle Substrate ... 80
4.6.3 LEG-1 pH-Optimum ... 82
4.6.4 LEG-1 Temperatur-Optimum ... 82
4.6.5 Natürliche Substrate ... 83
4.7 Charakterisierung von LEG-2 in Enzym-Assays ... 86
4.7.1 Transaktivierung von LEG-2 durch CPB-3 ... 86
4.7.2 Artifizielle Substrate ... 87
4.7.3 LEG-2 pH-Optimum ... 88
4.7.4 LEG-2 Temperatur-Optimum ... 89
4.7.5 Legumain-Inhibitionsassays ... 90
4.8 Natürliche Substrate ... 91
4.9 Immunfluoreszenz ... 93
4.10 Ergebnisse der Vakzineversuche ... 97
4.10.1 Wohlbefinden und Gesundheitszustand der Tiere ... 99
4.10.2 Erster Vakzineversuch ... 99
4.10.2.1 ELISA-Ergebnisse des ersten Vakzineversuches ... 101
4.10.3 Zweiter Vakzineversuch ... 104
4.10.3.1 ELISA-Ergebnisse des zweiten Vakzineversuches ... 106
4.10.4 Dritter Vakzineversuch ... 108
4.10.4.1 ELISA-Ergebnisse des dritten Vakzineversuches ... 111
4.10.4.1.1 LEG-1 ELISA ... 111
4.10.4.1.2 LEG-2 ELISA ... 114
5. DISKUSSION ... 117
5.1 Schlussfolgerungen und Ausblick ... 130
6. ZUSAMMENFASSUNG ... 132
7. SUMMARY ... 134
8. LITERATURVERZEICHNIS ... 136
9. ANHANG ... 147
9.1 VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN ... 147
9.2 TABELLENANHANG - ROHDATEN ... 151
9.3 ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS ... 238
1. Einleitung
Der Lungenwurm des Rindes, Dictyocaulus viviparus, verursacht jährlich erheblichen ökonomischen Schaden in der Rinderhaltung gemäßigter Klimazonen. Als Verur- sacher der Bronchopneumonia verminosa, auch Dictyokaulose oder parasitäre Bron- chitis genannt, kann dieser Parasit zu schwerwiegenden Bronchopneumonien führen, die fast immer mit bakteriellen Sekundärinfektionen einhergehen und nicht selten den Tod der Tiere verursachen. Vorwiegend gefährdet sind Weiderinder, die noch nie in Kontakt mit diesem Parasiten kamen oder solche, die längere Zeit nicht mit dem Parasiten konfrontiert wurden und daher ihre protektive Immunität verloren haben. Daher sind potentiell Weiderinder aller Altersklassen gefährdet. Zur Bekämpfung dieser Parasitose können verschiedene nematizide Anthelminthika eingesetzt werden. Jedoch stellt die Gefahr der Entwicklung von Anthelminthika- resistenzen weltweit ein zunehmendes Problem dar und zugleich gibt es von Seiten der Endverbraucher eine vermehrte Besorgnis gegenüber Medikamentenrück- ständen in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs (NEWTON u. MUNN 1999). Daher ist es eine Zielsetzung parasitologischer Forschung, Alternativen zum Einsatz von Anthelminthika zu schaffen, beispielsweise durch die Entwicklung einer protektiven Vakzine. Bemerkenswert ist, dass eine Infektion mit D. viviparus eine protektive Immunität bei Rindern induziert, die mehrere Monate anhält und in dieser Zeit be- lastbar vor Reinfektionen schützt (JARRETT et al. 1954). Diese Immunität ermöglich- te in der Vergangenheit den erfolgreichen Einsatz röntgenattenuierter dritter Lungen- wurmlarven als oral zu verabreichenden Impfstoff (Handelsname u.a. Bovilis®
Dictol). Diese Lebendvakzine hat allerdings einige Nachteile: Ihre Haltbarkeit ist begrenzt und eine ununterbrochene Kühlung muss gewährleistet werden. Zur Zeit der Impfung dürfen die Tiere keinesfalls mit Anthelminthika behandelt werden, die gegen Lungenwürmer wirksam sind. Infolgedessen sind die Tiere durch Infektionen mit anderen Parasiten gefährdet. Weiterhin ist zur Gewinnung der Larven für die Impfdosen die Haltung von Ausscheidertieren unerlässlich, was ethische Fragen aufwirft. Die Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffes wäre daher nicht nur kostengünstiger, sondern würde auch die Notwendigkeit der Haltung von
Ausscheidertieren vermeiden (MCKEAND 2000). Die Frage, welche dezidierten Proteine des Parasiten vom Immunsystem des Wirtes als Antigen erkannt werden und so eine protektive Immunantwort hervorrufen können, ist in zahlreichen Studien untersucht worden und konnte dennoch bis heute nicht hinreichend geklärt werden.
Sollte es gelingen, ein Antigen, das zu einer protektiven Immunantwort führt, zu identifizieren und rekombinant zu exprimieren, wäre die Herstellung einer Subunitvakzine möglich. Zur Beurteilung, ob sich ein bestimmtes Parasitenprotein für den Einsatz als Subunitvakzine eignet, ist die Kenntnis seiner biologischen Funktion ein wichtiger Parameter. Weitere Schlüsselparameter sind das Transkriptions- bzw.
Expressionsmuster sowie die Lokalisation des Proteins im Parasiten. Diese beiden Parameter sind entscheidend hinsichtlich der Fragestellung, ob das potentielle Impfprotein für die Immunabwehr des Wirtes überhaupt zugänglich ist und wenn ja, in welchen Stadien der parasitischen Entwicklung dies der Fall ist. STRUBE et al.
(2012) ermittelten, dass die Legumaine des bovinen Lungenwurmes stadien- spezifisch differentiell transkribiert werden. Zudem legen Untersuchungen zu Enzymen anderer Helminthen nahe, dass Legumaine, welche zu den Cystein- proteasen gehören, wahrscheinlich an der Nahrungsaufnahme und Verdauung der Parasiten beteiligt sind (DALTON et al. 1995; OLIVER et al. 2006;
ADISAKWATTANA et al. 2007). Verdauungsenzyme des Parasiten wären gut als Zielproteine für eine rekombinante Vakzine geeignet, da eine Blockierung dieser zu verminderter Entwicklungsfähigkeit und im idealen Fall zum Tod des Parasiten durch Verhungern führen würde.Ziel dieser Arbeit war es daher, Legumain-1 (LEG-1) und Legumain-2 (LEG-2) von D. viviparus bezüglich der zuvor genannten Parameter in vitro zu charakterisieren und ihre Eignung als Subunitvakzinekandidaten in vivo zu evaluieren. Die vorliegende Arbeit setzt sich dementsprechend aus zwei Teilen zusammen: Der erste Teil hatte die rekombinante Expression und in vitro Charakterisierung von LEG-1 und dessen anschließende Evaluation im Vakzinever- such an Kälbern zum Ziel. Der zweite Teil beinhaltete die gleichen experimentellen Arbeiten mit dem Kandidatenprotein LEG-2 sowie zusätzlich einen klinischen Vakzineversuch mit einer Kombination aus beiden Antigenen.
2. Literaturübersicht
2.1 Dictyocaulus viviparus - Der Lungenwurm des Rindes
2.1.1 Die Biologie des Erregers
Dictyocaulus-Arten sind Nematoden, gehören zu den Trichostrongyliden und kommen bei zahlreichen Haus- und Wildwiederkäuern sowie Equiden vor (EPE et al.
1993; GIBBONS u. HOEGLUND 2002; MANGIOLA et al. 2014).
Der Entwicklungszyklus von D. viviparus ist in Abb. 1 schematisch dargestellt. Patent mit D. viviparus infizierte Rinder scheiden erste Larven (L1) mit dem Kot aus (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Diese entwickeln sich über einfach bescheidete zweite Larven (L2) zu den infektiösen dritten Larven (L3), welche bis zu ein Jahr lang infektiös bleiben können (JARRETT et al. 1954). Die L3 gelangen nach peroraler Aufnahme und Durchdringen der Darmwand ins Lymphgefäßsystem und von dort aus in die Mesenteriallymphknoten, wo die Entwicklung zur vierten Larve (L4) stattfindet (JARRETT 1957). Bereits sieben Tage nach Infektion sind ausschließlich L4 in der Lunge zu finden (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Die L1 enthalten Reservestoffe, von denen die Larven während ihrer Entwicklung im Freien und ihrer lymphogenen oder hämatogenen Wanderung zur Lunge bis zur ersten Nahrungs- aufnahme als L4 zehren (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; STRUBE et al. 2012). In der Lunge entwickeln sich die Präadulten oder fünften Stadien (L5), welche sich in den Bronchien und der Trachea ansiedeln und zu geschlechtsreifen adulten Würmern entwickeln. Nach der Paarung legen die Weibchen embryonierte Eier, welche über die Trachea in den Pharynx gelangen und dort abgeschluckt werden.
Während der Darmpassage schlüpfen L1 aus den Eiern und werden wiederum mit der Faeces ausgeschieden (PFEIFFER u. SUPPERER 1980).
Abb. 1: Entwicklungszyklus von D. viviparus.
Meerschweinchen lassen sich experimentell mit Lungenwurmlarven infizieren, wobei die Körperwanderung der Larven durch die Darmwand bis zur Lunge der von Rindern ähnelt. Die Larven entwickeln sich allerdings nicht zu Adulten, sondern bleiben präadult (WADE et al. 1960). In gewissen Grenzen eignet sich das Meer- schweinchen somit als Wirtsmodell für Studien an Lungenwürmern (MCKEAND et al.
1995).
2.1.2 Klinisches Bild und Pathologie der Dictyokaulose
Schon deutlich vor Beginn der Patenz, welche an Tag 21-25 einsetzt (PFEIFFER u.
SUPPERER 1980), können durch wandernde Larvenstadien und damit einher- gehende Schädigungen des Lungengewebes, erste Krankheitssymptome wie Tachy- pnoe, Husten und Fieber auftreten (JARRETT et al. 1954). Besonders die Obstruk- tion von Luft führenden Wegen durch vermehrt gebildetes Bronchialsekret, Immun- zellen und durch die Parasiten selbst führt zu Dyspnoe bis hin zu Emphysemen und Ödemen der Lunge (JARRETT et al. 1954). Kommensalen in der Lunge können sich im Zuge der katarrhalisch-eitrigen Entzündung ungebremst vermehren und bakterielle und virale Sekundärerreger können zu einer Verschlechterung des Krank- heitsbildes führen (REGE et al. 1989; SCHNIEDER et al. 1989). Tiere mit hoch-
gradiger Dyspnoe entwickeln eine abdominal forcierte Atmung und fangen an zu speicheln, da der Speichel nicht mehr abgeschluckt wird. Außerdem kommt es zur Erschöpfung derjenigen Tiere, die sich nicht mehr hinlegen, weil sie im Stehen besser atmen können. Sie zeigen eine Fressunlust und verlieren an Gewicht (PFEIFFER u. SUPPERER 1980).
2.1.3 Bekämpfung der Dictyokaulose
Zur Bekämpfung der bovinen Dictyokaulose stehen im Wesentlichen zwei Möglich- keiten zur Verfügung: Auf der einen Seite besteht die Möglichkeit der strategischen Behandlung mit Anthelminthika. Die zweite Möglichkeit ist die Vakzinierung der Tiere, welche sich aus der Besonderheit dieses Nematoden, nach überstandener Infektion eine mehrere Monate anhaltende, belastbare Immunität gegen Neuinfektionen aus- zubilden, ergibt (MICHEL u. MACKENZIE 1965; URQUHART et al. 1981). Der ent- sprechende Lebendimpfstoff ist jedoch nur in wenigen europäischen Ländern auf dem Markt verfügbar.
2.1.3.1 Behandlung mit Anthelminthika
Heutzutage werden Infektionen mit D. viviparus üblicherweise durch die Gabe von makrozyklischen Laktonen behandelt (STRUBE 2004). Allerdings reduziert die regel- mäßige Gabe von Anthelminthika die Ausbildung einer persistierenden natürlichen Immunität. Diese erlischt nach zwölf Monaten, wenn kein erneuter Kontakt zu infektiösen dritten Larven erfolgt (MICHEL u. MACKENZIE 1965). Außerdem fehlt den Tieren bei regelmäßiger, effektiver Behandlung mit Anthelminthika auch für die kurzzeitige Ausbildung einer ausreichenden Immunität der geeignete antigenetische Stimulus (SCHNIEDER et al. 1996).
Eine Studie von MOLENTO et al. (2006) beschreibt erste Resistenzbildungen von D. viviparus gegen makrozyklische Laktone. Dieser aus Südamerika stammende Bericht ist jedoch bislang weltweit die einzige Beschreibung einer Anthelminthika- resistenz beim bovinen Lungenwurm. Trotz der guten Wirksamkeit ist die Bekämpfung des Rinderlungenwurmes mit Anthelminthika insofern schwierig, als
dass nach Kontaminationseintrag bereits die zweite Lungenwurmgeneration schwer- wiegende Erkrankungen verursachen kann. Die Tiere müssten also hochfrequent behandelt werden. Als Alternative könnten sogenannte „long-acting“-Formulierungen angesehen werden, aber auch diese schützen die Tiere oft nicht ausreichend gegen Ende der Weidesaison.
2.1.3.2 Vakzinierung zur Prophylaxe parasitärer Infektionen
Aufgrund der Komplexität eukaryoter Organismen stellt die Impfstoffentwicklung gegen parasitäre Infektionen seit jeher eine große Herausforderung dar (NEWTON u.
MUNN 1999). Dies gilt insbesondere für mehrzellige Parasiten wie den bovinen Lungenwurm.
2.1.3.2.1 Stand der Forschung zur Vakzineentwicklung gegen mehrzellige Parasiten
Es gibt zahlreiche Beispiele für die Evaluierung von Vakzinekandidaten gegen mehrzellige Parasiten. Zu unterscheiden sind Vakzineversuche, die natives Protein z. B. Parasitenhomogenate oder Ausscheidungsprodukte wie beispielsweise exkretorisch/sekretorische (ES)-Produkte des Parasiten enthalten von solchen, die rekombinant exprimiertes Protein enthalten.
Es gelang, einen Impfstoff basierend auf dem rekombinanten, membranständigen Protein Bm86 von Rhipicephalus (Boophilus) microplus, einer Zecke, die schwer- wiegende Verluste in der Rinderhaltung subtropischer Gebiete verursacht, zu entwickeln (FRAGOSO et al. 1998). Dies ist einer der wenigen bisher erfolgreich kommerzialisierten Impfstoffe gegen Parasiten (TickGARD™). Zudem hat sich der Impfstoff auch als kreuzprotektiv gegenüber Infestationen mit B. annulatus gezeigt.
FRAGOSO et al. (1998) fanden heraus, dass nach Impfstoffapplikation zwischen 55 und 100 % weniger Zecken auf den Tieren saugen. Dies hat einen stark ver- minderten Bedarf an Akariziden zur Folge und schützt die Tiere vor der Infektion mit von Zecken übertragenen Krankheiten wie z. B. der Babesiose (DE LA FUENTE et al. 1999).
Bei Schafen führt die Impfung mit Antigenen der Onkosphäre des Cestoden Taenia ovis zu einer nahezu vollständigen Protektion gegen Neuinfektionen (RICKARD u. WILLIAMS 1982). Basierend auf diesen Proteinen wurde ein rekombinanter Impfstoff entwickelt, der zu zufriedenstellender, wenn auch nicht kompletter Protektion führt (JOHNSON et al. 1989). Allerdings kam es nie zur Markteinführung dieses Impfstoffes (NEWTON u. MUNN 1999). In Bezug auf die prophylaktische Impfung gegen die Zystizerkose beim Schwein gibt es mehrere Studien, sowohl mit nativem, als auch mit rekombinant exprimiertem Antigen von T. solium (SCIUTTO et al. 2013). Dafür wurden Antigene des Erregers der murinen Zystizerkose T. crassiceps, genutzt und in Feldstudien an mit T. solium infizierten Schweinen getestet.
Gegen den humanpathogenen Trematoden Schistosoma mansoni entwickelten CHLICHLIA et al. (2001) eine DNA-Vakzine, welche gegen das Legumain Sm32 des Parasiten gerichtet ist. Diese Vakzine wurde am Mausmodel getestet und führte zu einer verminderten Fruchtbarkeit der weiblichen Parasiten und konnte so die Eiausscheidung um 37 % vermindern. Bei Nematoden gibt es ebenfalls zahlreiche Ansätze, protektive Impfstoffe zu entwickeln. ZHANG et al. (2013) untersuchten die immunogene Wirkung einer rekombinant in Escherichia coli exprimierten Amino- peptidase von Trichinella spiralis in Mäusen. Die Vakzinierung mit diesem rekombinanten Protein resultierte in einer Reduktion der Wurmbürde um 38,1 %.
Haemonchus contortus gehört wie D. viviparus zu den Trichostrongyliden, ernährt sich von Blut und kommt vorwiegend im Labmagen von Schafen und Ziegen vor.
MUNN et al. (1987) konnten zeigen, dass einer Infektion mit H. contortus durch die Impfung mit nativem Darmprotein aus adulten Stadien dieses Parasiten wirkungsvoll entgegen gewirkt werden kann. Das integrale Glycoprotein H11 aus der Darmwand des Parasiten scheint für die gebildete Immunität vorwiegend verantwortlich zu sein.
Es führte in Impfversuchen zu einer Reduktion der Eiausscheidung um 94,6 % und der Wurmbürde der Männchen um 86,5 % bzw. der Weibchen um 93,5 % (SMITH et al. 1993). Es handelt sich bei H11 um ein bei verschiedenen Helminthen konserviertes Protein, was die Autoren JASMER und MCGUIRE (1991) spekulieren lässt, es könnte eine Kreuzimmunität zu anderen Nematoden bewirken. Der Vorteil
von Darmproteinen bei blutsaugenden Parasiten als Vakzinekandidaten ist, dass sie zwar einerseits dem Immunsystem nicht zugänglich sind und daher nur ein geringer Selektionsdruck bezüglich der Immunevasion auf sie einwirkt, aber dass sie andererseits nach Aufnahme einer Blutmahlzeit von spezifischen, durch eine Impfung gebildeten Antikörpern oder auch sensibilisierten Immunzellen erkannt werden können (NEWTON u. MUNN 1999). BOISVENUE et al. (1992) nutzten für die Immunisierung von Schafen eine Fibrinogen-degradierende Cathepsin B-ähnliche Cysteinprotease, die aus dem Darm adulter H. contortus stammte und zu einer Reduktion der Eiausscheidung von über 80 % und der Wurmbürde von über 90 % führte. Auch in Bezug auf den gastrointestinal parasitierenden Nematoden Ostertagia ostertagi wurden mehrere sowohl native als auch rekombinant exprimierte Proteine hinsichtlich ihrer Eignung als Vakzinekandidaten getestet. GELDHOF et al. (2002) impften Kälber mit ES-Produkt, welches für Cysteinproteasen angereichert war und erreichten eine signifikante Reduktion der Eiausscheidung um 60 %, eine Reduktion der Wurmbürde um 18 % und eine signifikante Reduktion der Länge von männlichen und weiblichen Adulten. Im Gegensatz dazu konnten DE MAERE et al. (2005) sowohl nach Impfung mit nativem als auch mit in Baculoviren exprimiertem Aspartyl- proteaseninhibitor (API) keine Protektion gegen eine nachfolgende Infektion mit O. ostertagi erreichen.
2.1.3.2.2 Stand der Forschung zur Vakzineentwicklung gegen D. viviparus Die Impfstoffforschung zur Bekämpfung der bovinen Dictyokaulose begann bereits in den 1950er Jahren. JARRET et al. (1955; 1958; 1960a,1960b) wiesen drei mögliche Wege der Immunisierung bei Rindern nach: Sowohl die intraperitoneale Ver- abreichung von Serum infizierter und darauf folgend genesener Tiere, die intra- muskuläre Injektion von Parasitenmaterial aus adulten Würmern unter Zugabe eines Adjuvans, als auch die orale Applikation von röntgenattenuierten dritten Larven führten zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten Reduktion der Larven- ausscheidung und der Wurmbürde sowie zur Verminderung klinischer Symptome.
Dabei erwiesen sich virulenzattenuierte Larven als sehr viel effektivere Stimuli als
somatische Extrakte. Dies deutet auf eine essentielle Bedeutung der vom Parasiten sezernierten Proteine in der Immunitätsentwicklung hin (BRITTON et al. 1993).
Der Impfstoff aus röntgenattenuierten dritten Larven wurde kommerzialisiert (Bovilis®
Dictol, INTERVET) und in Deutschland und anderen Ländern Europas eingesetzt, steht aber aus Gründen, die im Folgenden weiter erläutert werden, in Deutschland nicht mehr zur Verfügung. So ist zur Larvenproduktion eine Passage in Rindern zwingend erforderlich. Das dringend notwendige Einhalten einer adäquaten Kühl- kette und die kurze Haltbarkeit des Impfstoffes erschweren die Anwendung in abgelegeneren Gebieten und erfordern zudem eine ständige Nachproduktion. Eine rekombinante Subunitvakzine wäre stabiler, länger haltbar und würde die Haltung von Ausscheidertieren vermeiden (MCKEAND 2000).
MICHEL (1976) zeigte, dass bei immunen Kälbern nach erneuter D. viviparus Infektion Lungenwurmlarven die Lunge erreichen und erst dort absterben. Dies beweist indirekt, dass die Immunantwort bei der natürlichen Immunität gegen spätere parasitische Stadien gerichtet ist und nicht bereits die L3 nach der Penetration der Darmwand eliminiert. Dies legt wiederum die Vermutung nahe, dass Bestandteile des ES-Produktes der Präadulten und Adulten eine gewichtige Rolle spielen könnten (MCKEAND 2000).
Eine Studie von MCKEAND et al. (1995) an Meerschweinchen zeigte, dass diese nach Impfung mit somatischen Extrakten aus Adulten oder L3 nicht gegen eine In- fektion mit Lungenwürmern geschützt waren. Eine Gruppe, die unter denselben Be- dingungen mit ES-Produkt geimpft worden war, zeigte allerdings im Vergleich zur Kontrollgruppe eine statistisch signifikante Protektion vor einer Reinfektion. Das Serum dieser mit ES-Produkt geimpften Tiere schützte als passive Immunisierung sogar eine Gruppe naiver Tiere vor einer Infektion. MATTHEWS et al. (2001) impften daraufhin Kälber mit ES-Produkt adulter D. viviparus, um die Ergebnisse im Versuch an Rindern zu verifizieren. Aber obwohl die Rinder im Vergleich zur Kontrolle statistisch signifikant erhöhte IgG1- und IgG2-Antikörpertiter hatten, waren sie nicht vor einer Infektion geschützt. Dieser vermeintliche Widerspruch könnte darauf zurückzuführen sein, dass in den beiden Studien unterschiedliche Adjuvantien
eingesetzt wurden, worauf in der Diskussion dieser Arbeit näher eingegangen werden soll.
Die Forschungsergebnisse von JARRETT et al. (1955) zur passiven Immunisierung von Kälbern legen nahe, dass Antikörper an der Immunität maßgeblich beteiligt sind.
Die Frage, welche dezidierten Proteine eine protektive antikörpermediierte Immun- antwort hervorrufen können, ist zwar in zahlreichen Studien untersucht worden, konnte aber bis heute nicht hinreichend geklärt werden. BRITTON et al. (1992) entdeckten, dass D. viviparus in vitro abhängig vom vorliegenden Stadium unter- schiedliche Proteasen sezerniert. Einige dieser Proteasen im ES-Produkt adulter Würmer werden von Antikörpern im Serum rekonvaleszenter Rinder erkannt und gebunden. MCKEAND et al. (1994) analysierten auf der Suche nach einem dezidierten Antigen, das eine protektive Immunantwort hervorrufen kann, die Acetyl- cholinesterase (AChE). Aber obwohl rekombinant exprimierte AChE von D. viviparus von Serumantikörpern immuner Rinder erkannt wird, konnte in einer ersten Vakzine- studie keine signifikante Protektion von geimpften Rindern im Vergleich zur Kontrollgruppe erzielt werden (MCKEAND 2000). Auch die Studie von MATTHEWS et al. (2001) ergab, dass die von ihnen rekombinant in E. coli exprimierte AchE nicht zu einer protektiven Immunität gegen eine Infektion mit D. viviparus bei den Rindern führte.
Die Protein Disulfid Isomerase (PDI) von D. viviparus wurde in einer weiteren Studie rekombinant in E. coli exprimiert und in einem Vakzineversuch an Rindern evaluiert (WOLKEN 2006). Es wird vermutet, dass es sich bei der PDI um ein multi- funktionales Enzym handelt, dessen Hauptaufgabe in der Ausbildung und Mo- difikation von Disulfid-Brücken liegt. Des Weiteren fungiert es als molekulares Chaperon sowie als Untereinheit in zwei Enzymkomplexen. Doch obwohl alle ge- impften Tiere dieser Studie PDI-spezifische Antikörper bildeten, konnte weder eine signifikante Protektion, noch eine signifikante Reduktion der Wurmbürde oder der Larvenausscheidung durch Impfung mit diesem ubiquitär vorkommenden Protein erzielt werden (WOLKEN 2006). Eine weitere Studie untersuchte das Major Sperm Protein (MSP) von D. viviparus hinsichtlich seiner immunogenen und protektiven Eigenschaften (VON HOLTUM 2006). Zwar wurden wiederum Antikörper
verschiedener Immunglobulinklassen gebildet, es ergaben sich jedoch wie bei der PDI keine statistisch signifikanten Unterschiede in Wurmbürde, Larvenausscheidung oder Größe der Würmer im Vergleich zur Kontrollgruppe (VON HOLTUM 2006).
STRUBE et al. (2012) ermittelten durch Suppression Subtractive Hybridisation mehrere Gene, die vorwiegend in parasitischen und weniger in freilebenden Stadien von D. viviparus transkribiert werden. Diese Parasitismus-assoziierten Gene bzw. die resultierenden Proteine könnten geeignete Zielmoleküle für die Vakzineentwicklung darstellen. Unter den identifizierten Genprodukten befinden sich auch die beiden Legumaine LEG-1 und LEG-2, welche in dieser Arbeit untersucht wurden.
2.2 Legumaine
Legumaine sind Clan CD Cysteinproteasen und enthalten eine C13 Domäne, welche sie als Asparaginylpeptidasen klassifiziert (CHEN et al. 1998; CAFFREY et al. 2000).
2.2.1 Vorkommen
Die Erstbeschreibung erfolgte in Pflanzen, genauer in Leguminosen, nach denen sie benannt sind (KEMBHAVI et al. 1993). Es folgten weitere Beschreibungen für Le- gumaine in zahlreichen Vertebraten, darunter Rind (YAMANE et al. 2002), Schwein (DANDO et al. 1999) und Mensch (CHEN et al. 1997; DALL u. BRANDSTETTER 2013). Auch in verschiedenen Parasiten wie Arthropoden (HORN et al. 2009), Tre- matoden wie S. mansoni (DALTON et al. 1995) oder Opisthorchis viverrini (LAHA et al. 2008) und Nematoden wie H. contortus (OLIVER et al. 2006) konnten bereits Legumaine identifiziert werden.
2.2.2 Bedeutung und Forschungsstand bei anderen Organismen
2.2.2.1 Legumaine der Pflanzen
In Pflanzen sind Asparaginylpeptidasen an der Prozessierung von Vorläuferformen von Proteinen der Samen beteiligt (JUNG et al. 1998).
2.2.2.2 Legumaine des Menschen
CHEN et al. (2000) beschreiben, dass humanes Legumain zunächst als Prolegumain vorliegt und im sauren Milieu (idealerweise bei pH 4,5) zur Autoaktivierung fähig ist.
Humanes Legumain ist an der Antigenpräsentation von mikrobiellem Tetanustoxin beteiligt und reguliert die Aktivität von Osteoklasten und dadurch indirekt die Knochenresorption (MANOURY et al. 1998; CHOI et al. 1999; CHEN et al. 2000).
GUO et al. (2013) fanden in Magenkarzinomen beim Menschen eine signifikant stärkere Legumainexpression als in gesundem Magengewebe. Außerdem war die Expressionsrate von Legumain signifikant mit der Ausbildung von Metastasen und Rezidiven bei den Patienten korreliert, weshalb die Autoren Legumain als prognostischen Biomarker vorschlagen.
2.2.2.3 Legumaine der Parasiten
2.2.2.3.1 Legumaine der Trematoden
LAHA et al. (2008) fanden im Darm und in den Eiern des humanpathogenen Leber- egels O. viverrini eine legumainähnliche Asparaginylendopeptidase (Ov-AEP-1).
Diese konnte in allen Stadien des Parasiten und im ES-Produkt der Adulten nach- gewiesen werden. Die Autoren vermuten eine Beteiligung dieses Enzyms an der Transprozessierung anderer, für die Ernährung des Parasiten entscheidender Enzyme.
Legumain von S. mansoni (auch Sm32 genannt) ist nach SKELLY und SHOEMAKER (2001) im Zäkum und den Protonephridien des Parasiten lokalisiert und wurde vermehrt in Extrakten der löslichen Proteinfraktionen von Adulten nach- gewiesen. Zunächst wurde Legumain bei S. mansoni fälschlicherweise für eine Hämoglobinase gehalten (GOTZ u. KLINKERT 1993). Diese Hypothese wurde revidiert und im Folgenden vermuteten DALTON et al. (1995) sowie DALTON und BRINDLEY (1996), dass Legumain für die Transaktivierung der Hämoglobinase CathepsinB von S. mansoni verantwortlich sei. Die Arbeitsgruppe von SAJID et al.
(2003) konnte diese Transaktivierung in vitro bei in Pichia pastoris exprimiertem Legumain von S. mansoni nachweisen. In vivo ist Legumain jedoch nicht essentiell für die Prozessierung von CathepsinB, was von DELCROIX et al. (2006) und KRAUTZ-PETERSON und SKELLY (2008) durch die vollständige Ausschaltung der Legumainexpression mittels RNA Interferenz (RNAi) - welche nur zu einer gering- gradig verminderten CathepsinB-Aktivität in vivo führte - gezeigt wurde.
Es bleibt fraglich, welche exakte Funktion Legumain in S. mansoni erfüllt. DALTON et al. (2009) suggerieren eine Aktivierung von CathepsinB in zwei Stufen: Für die Autoaktivierung von ProcathepsinB ist demnach eine geringe Menge an bereits aktiviertem CathepsinB unerlässlich. Legumain könnte im ersten Schritt der Kaskade eine geringe Menge von ProcathepsinB prozessieren („Kick-start“). Im zweiten Schritt erfolgt die Autoaktivierung durch aktives CathepsinB.
Verglichen mit S. mansoni scheint der tropische Leberegel Fasciola gigantica eine größere Anzahl unterschiedlicher Legumaine zu besitzen. ADISAKWATTANA et al.
(2007) untersuchten FgLGMN-1 und -2 hinsichtlich ihrer Lokalisation durch In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Sie fanden heraus, dass beide Legumaine in den Epithelzellen des Darmes zu finden sind und sowohl in juvenilen als auch in adulten Entwicklungsstadien exprimiert werden. Entgegen der Annahme, dass beide Legumaine sezerniert werden, konnte keine Legumainaktivität im ES-Produkt von F. gigantica nachgewiesen werden.
2.2.2.3.2 Legumaine der Nematoden
OLIVER et al. (2006) untersuchten das Legumain von H. contortus hinsichtlich seiner Lokalisation, stadienspezifischen Transkription und Enzymaktivität. Dazu wurde aktives Legumain als Fusionsprotein mit der Glutathion-S-Transferase (GST) re- kombinant in E. coli exprimiert. Eine entsprechende Immunfluoreszenzfärbung detektierte Legumain im Mikrovillisaum der Darmzellen in Querschnitten adulter H. contortus. Die qPCR ergab eine vermehrte Transkription in L4 und Adulten und keine Transkription in den Eiern oder L3. Die Legumainaktivität in Extrakten von H. contortus war am höchsten bei pH 7. Das Verhalten nach Zugabe von Inhibitoren entsprach den Untersuchungen von DALTON et al. (1995) zu Legumain von S. mansoni. Durch den allgemeinen Cysteinproteaseninhibitor L-trans-3-Carboxy- oxiran-2-carbonyl-L-leucylagmatine (E-64) erfolgte eine partielle Hemmung des Legumains um 27,1 %. Eine geringe Hemmung der Enzymaktivität um 8,4 % wurde nach Zugabe des Aspartylproteaseninhibitors PepstatinA gemessen.
3. Material und Methoden
In den Kapiteln 3.1 bis 3.4 sind die für diese Arbeit verwendeten Puffer, Lösungen, Medien, Reagentien, Enzyme, Reaktionskits, Software und Geräte aufgeführt.
3.1 Verwendete Puffer und Lösungen
AP-Puffer: 0,1 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) 12,11 g/l Alkalische Phosphatase (AP)
0,1 M Natriumchlorid (NaCl)
0,005 M Magnesiumchlorid (MgCl2) pH 9,5
BCIP: 50 mg/ml 5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat in 100 % Dimethylformamid (DMF)
Blotpuffer (Western Blot): 24 mM TRIS 192 mM Glycin
20 % Methanol in Aqua bidest.
pH 8,3
Cathepsin-Assay-Puffer: 250 mM NaCl
50 mM Natriumacetat 0.16 mM Triton®X-100 1 mM Dithiothreitol (DTT)
2 mM Ethylendiaminetetraacetat (EDTA) pH 4,5
Citratpuffer: 0,1 M C6H8O7
Coomassie-Blue: Stammlösung: 1 % Brilliant blue R 250
Fixier-Färbelösung: 40 % Methanol
10 % Eisessig
0,01 % Coomassie-Blue Entfärbelösung: 10 % Eisessig
Elektrodenpuffer (SDS): 0,025 M TRIS 0,192 M Glycin 0,1 % SDS pH 8,5
Glycerol für Stocks: 100 mM Magnesiumsulfat ( MgSO4 ) 25 mM TRIS-HCl
65 % Glycerol pH 8
Laemmli-SDS-Probenpuffer: 0,7 mM TRIS-HCl 1 % SDS
36 % Glycerin
0,144 M Bromphenolblau 1,42 M β-Mercaptoethanol
Legumain-1-Assay-Puffer: 250 mM NaCl
50 mM Natriumacetat 0.16 mM Triton®X-100 1 mM DTT
2 mM EDTA pH 5,5
Legumain-2-Assay-Puffer: 250 mM NaCl
50 mM Natriumacetat
1 mM DTT (zum Aktivierungsansatz) oder 10 mM DTT (zur Substratlösung)
pH 4,5
NBT: 50 mg/ml Nitro-Blue-Tetrazolium-Chlorid in 70 % DMF
PBS: 150 mM NaCl
16 mM Na2HPO4 x 7 H2O 4 mM Na2HPO4 x 2 H2O
PBS-Tween: PBS mit 0,05 % Tween® 20
Phosphatpuffer: 0,2 M Na2HPO4
6x Probenpuffer: 0,25 % Bromphenolblau 40 % Saccharose
Säulenpuffer A: 20 mM NaH2PO4
500 mM NaCl 20 mM Imidazol pH 7,4
Säulenpuffer B: 20 mM NaH2PO4
500 mM NaCl 500 mM Imidazol pH 7,4
TAE-Puffer: 40 mM TRIS-Acetat 1 mM EDTA
pH 8,0
3.2 Verwendete Medien und Platten
Carbenicillin: in 50 % Ethanol
Endkonzentration im Medium: 50 µg/ml
LB-Medium: 1 % Bacto Trypton
0,5 % Hefeextrakt 1 % NaCl
pH 7,0
LB-Agar: LB-Medium, versetzt mit 15 g Agar/l
PichiaPink™ Media Kit: BMGY (Buffered Glycerol-complex Medium) (INVITROGEN) BMMY (Buffered Methanol-complex Medium)
PAD-Agar (Pichia-Adenine-Dropout-Agar) YPD (Yeast-Peptone-Dextrose-Medium)
YPDS (Yeast-Peptone-Dextrose-Sorbitol-Medium)
3.3 Verwendete Reagentien, Enzyme, Reaktionskits, Software und Geräte
ABCAM, UK
FITC-labelled mouse monoclonal 2A9 anti-rabbit IgG heavy chain antibody
ABD SEROTEK, Deutschland
Konjugate für ELISA: Schaf-Anti-Rind polyklonaler IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgA – Antikörper alle HRP (horseradish peroxidase) konjugiert; monoklonaler Maus-Anti-
Histidin-Tag-IgG1-Antikörper (AP konjugiert); polyklonaler Ziege-Anti-Maus-IgG- Antikörper (AP konjugiert)
BIOGAZELLE, Belgien qBase PLUS software
BIOMETRA, Deutschland Personal Thermocycler
BIORAD, Deutschland
Gene Pulser Xcell™ Elektroporationsgerät
BIOTEK, Deutschland
PowerWave HT Mikroplatten-Spektralphotometer 340
BIOTREND, Deutschland GelRed™
CANDOR, Deutschland
Low Cross Buffer® (wurde für alle Anwendungen 1:2 mit Aqua bidest. verdünnt)
CLONTECH, Deutschland
Advantage™ 2 PCR Buffer; Advantage™ Polymerase; SMART RACE cDNA Synthesis Kit
CP-PHARMA, Deutschland
0,1 % Medetomidinhydrochlorid (Cepetor™); 10 % Ketamin
DAKO, Deutschland Dako Pen
EPPENDORF, Deutschland
Microzentrifuge 5415R; Thermomixer comfort
FERMENTAS/ THERMO FISHER SCIENTIFIC, Deutschland
Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder; GeneJet™ PCR Purification Kit;
FastAP™; FastAP™ Buffer; EcoN1 (Xag1); Buffer R; FastDigest® Kpn1;
FastDigest® Green Buffer; FastDigest® Swa1; FastDigest® Stu1; FastDigest® Pst1;
Mass Ruler™ Express DNA Ladder Forward Mix; 96-well non-skirted qPCR plates, Ultra clear qPCR capstrips; SuperfrostTM plus slides; Absolute Blue qPCR Low ROX™ Mix
GE HEALTHCARE, Deutschland
ÄKTA FPLC (Fast protein liquid chromatography), ÄKTA-Säule: HisTrapTM HP; Quick Prep™ Micro mRNA Purification Kit
GERBU BIOTECHNIK GmbH, Deutschland QuilA™
INVITROGEN/ LIFE TECHNOLOGIES/ APPLIED BIOSYSTEMS, Deutschland TaqMan™-Minor Groove Binder-Sonden (FAM™, VIC®) und Primer; SeeBlue® Pre- stained Protein Standard; TOPO TA Cloning™ Kit for Sequencing; T4 DNA Ligase;
Safe Imager™ (Blaulicht Transilluminator); PichiaPink™ Expression System;
TaqMan™-Minor Groove Binder Sonden und Primer
ISCONOVA AB, Schweden Adjuvans Matrix Q™ (ISCOM)
LEICA, Deutschland
Leica Jung Tissue freezing Medium; Cryotome Leica Jung Frigocut 2800 E
MACHEREY & NAGEL, Deutschland Plasmid DNA Purification NucleoBond
NDR BIO-IMAGING SYSTEMS, Deutschland Bioimager MF-ChemiBIS 3.2
NIKON, Deutschland
Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse Ti; NIS-elements AR 2.3 64 bit Software
OLYMPUS, Deutschland Olympus Software 5050
PAA LABORATORIES, Deutschland
Fetales Kälberserum (fetal calve serum, FCS)
PEQLAB, Deutschland
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer; PeqSTAR PCR Cycler
5 PRIME, Deutschland
Perfect Taq DNA Polymerase
PREMIER Biosoft International, USA Allele®ID Software
PROMEGA, USA
Wizard™ PCR Preps DNA Purification System
ROTH, Deutschland
Roti®garose NEEO Ultra-Qualität (Agarose); 5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat (BCIP); Nitro-Blue-Tetrazolium-Chlorid (NBT), Bovines Serumalbumin (BSA)
SCI ED CENTRAL SOFTWARE
Align Plus 5 Sequence Alignment Program Version 5.0
SARTORIUS, Deutschland
Elektronische Präzisionswaage IsoCal
SIGMA ALDRICH, Deutschland
Goat-Anti-Rabbit-IgG-Antikörper; L-trans-3-Carboxyoxiran-2-carbonyl-L-leucylagma- tine (E-64); Cystatin from egg white; Iodessigsäure; Pepstatin A; (L-3-trans- (Propylcarbamyl)oxirane-2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-proline (Ca-074); N-Benzyloxy- carbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethylketone (Z-VAD-FMK), Hemoglobin from bovine blood; Fibrinogen from human plasma; Kollagen Typ I from calf skin; Kollagen Typ II from bovine tracheal cartilage; IgG from bovine serum
STRATAGENE, Deutschland
Mx 3005P™ Multiplex Quantitative PCR System
SYSTAT SOFTWARE GMBH, Deutschland Sigma Stat 3.1
VWR, Deutschland
Nunc® Immobilizer™ Amino Plates
Die 0,5 ml, 1,5 ml und 2 ml Savelock Reaktionsgefäße sowie die 11 ml, 50 ml und 120 ml Falcons sowie die genutzten Pipettenspitzen stammten von den Firmen EPPENDORF, BIOZYM, ROTH und SARSTEDT. Alle genutzten Pipetten stammten von den Firmen EPPENDORF und BIOHIT/ SARTORIUS und wurden regelmäßig (mindestens einmal pro Jahr) geeicht.
3.4 Verwendete Bakterien, Hefen und Vektoren
INVITROGEN
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli;
PichiaPink™ Expression Strain Kit Vektoren:
PCR™ 4-TOPO;
PichiaPink™ Secreted Protein Vector (pPinkα-HC)
3.5 Versuchsplan
Um die beiden Legumaine LEG-1 und LEG-2 des bovinen Lungenwurmes näher zu charakterisieren, wurden diese zunächst hinsichtlich ihrer Ähnlichkeit zueinander und ihrer Verwandtschaft zu Legumainen anderer Spezies molekulargenetisch untersucht. Anschließend wurden die Transkriptionsmuster verschiedener Cystein- proteasen von Dictyocaulus viviparus mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) bestimmt und die Ergebnisse für LEG-1 und LEG-2 auf Expressionsebene durch Western Blot von Parasitenmaterial verifiziert. Die rekombinante Expression in der Hefe Pichia pastoris ermöglichte sowohl die Herstellung polyklonaler Antikörper im Kaninchen, als auch die Enzymcharakterisierung von LEG-1 und LEG-2 in ver- schiedenen in vitro Tests. Diese Tests beinhalteten sowohl die Evaluierung hinsichtlich der Abhängigkeit der Enzyme von verschiedenen Faktoren, wie z. B. pH- Wert, Temperatur und Verhalten nach Zugabe von Inhibitoren, als auch die Untersuchung der Enzymaktivität und -kinetik. Darauf folgend wurden die beiden Enzyme hinsichtlich verschiedener artifizieller und möglicher natürlicher Substrate untersucht, um Rückschlüsse auf die in vivo Funktion zu ermöglichen. Des Weiteren wurden die rekombinant exprimierten Proteine in drei Vakzineversuchen an Rindern hinsichtlich ihrer Eignung, eine protektive Immunität hervorzurufen, untersucht.
Bei allen experimentellen Arbeiten wurden, sofern im Text nicht ausdrücklich anders beschrieben, die Protokolle der jeweiligen Hersteller aller Reaktionskits detailliert befolgt.
3.6 Alignment
Die Nukleotid- und Proteinsequenzen für LEG-1 und LEG-2 mit den Accession Nummern JQ828985.1 und JQ828986.1 bzw. AFM37368.1 und AFM37369.1 lagen zu Beginn dieser Arbeit bereits im Institut vor. Zum Vergleich der beiden Sequenzen wurde das Protein-Alignment mit dem Programm Align Plus 5 (SCI ED CENTRAL SOFTWARE) durchgeführt.
3.6.1 Phylogenetische Abstammung
Die Proteinsequenzen von LEG-1 und LEG-2 wurden mittels BLASTP (“Basic Local Alignment Search Tool“ NCBI, USA) mit anderen öffentlich zugänglichen Sequenzen der GenBank (NCBI, USA) verglichen. Dazu wurden 28 Sequenzen von Legumainen anderer Spezies, darunter Vertebraten, Arthropoden, Trematoden und Nematoden ausgewählt (siehe
Tab. 1) und mittels ClustalW Alignment (MEGA) bezüglich ihrer Ähnlichkeit zueinander untersucht. Um die Verwandtschaftsverhältnisse zu berechnen, wurde die Maximum Parsimony Methode mit 1000 Bootstrap-Replikaten gewählt und ein phylogenetischer Stammbaum erstellt (ZHARKIKH u. LI 1995). Diejenigen Positionen, die Lücken oder fehlende Daten enthielten, wurden gelöscht, sodass letztendlich 343 Aminosäuren untersucht wurden. Die Analyse bezüglich der evolutionären Entwicklung der Legumaine erfolgte mit dem Programm MEGA5 (TAMURA et al. 2011).
Spezies Protein GenBank Acc.Nummer
Anas platyrhynchos Legumain, partial EOA99906.1
Angiostrongylus cantonensis Hemoglobinase-type cysteine proteinase
mRNA, complete cds HQ110101.1
Angiostrongylus cantonensis Asparaginyl endopeptidase AGM20566.1
Ascaris suum Legumain ERG87786.1
Bos grunniens mutus Legumain ELR47687.1
Bos taurus Legumain precursor NP_776526.1
Caenorhabditis elegans Protein T28H10.3 NP_506137.1 Caenorhabditis remanei Hypothetical protein CRE_27126 XP_003113975.1
Camelus ferus Legumain precursor EPY81547.1
Danio rerio Legumain precursor NP_999924.1
Dictyocaulus viviparus Legumain 1 (leg-1) mRNA, complete cds JQ828985.1 Dictyocaulus viviparus Legumain 2 (leg-2) mRNA, complete cds JQ828986.1 Fasciola hepatica Legumain like precursor CAC85636.1
Haemaphysalis longicornis Tick legumain BAF51711.1
Haemonchus contortus mRNA for legumain (leg-1 gene) AM177177.1
Homo sapiens Cysteine protease BAA09530.1
Homo sapiens Legumain AAH03061.1
Ictalurus furcatus Legumain ADO28000.1
Ixodes ricinus Legumain-like protease precursor AAS94231.1
Macaca fascicularis
RecName: Full=Legumain; AltName:
Full=Asparaginyl endopeptidase;
AltName: Full=Protease, cysteine 1; Flags:
Precursor
Q4R4T8.1
Mus musculus Legumain precursor NP_035305.1
Myotis brandtii Legumain EPQ14910.1
Myotis davidii Legumain ELK34139.1
Pongo abelii Legumain precursor NP_001126789.1
Rattus norvegicus Legumain AAH87708.1
Salmo salar Legumain precursor NP_001158867.1
Schistosoma mansoni Hemoglobinase AAA29895.1
Trichinella spiralis Legumain XP_003376561.1
Xenopus (Silurana) tropicalis Legumain precursor NP_001005720.1
Xenopus laevis Legumain precursor NP_001079911.1
Tab. 1: GenBank Accession-Nummern der für die phylogenetische Analyse genutzten Proteinsequenzen
3.7 Rekombinante Expression von LEG-1 und LEG-2 in der Hefe Pichia pastoris Für die rekombinante Expression wurde das PichiaPink Expressionssystem der Firma Invitrogen genutzt. Die Durchführung erfolgte jeweils auf Grundlage der Herstellerangaben sowie nach den Beschreibungen von KUERPICK et al. (2013).
Die Primer wurden auf Basis der zuvor beschriebenen Sequenzen mit der Lasergene
PrimerSelect Software (DNASTAR, Version 5.06; GATC Biotech) konstruiert. Die Sequenz für die rekombinante Herstellung von LEG-1 bzw. LEG-2 enthielt jeweils sowohl die Expressionssequenz des Legumains inklusive Signalpeptid als auch Restriktionsenzymschnittstellen für die Enzyme Swa1 und Kpn1 für die letztliche Klonierung in den Expressionsvektor für P. pastoris. Außerdem wurde ein aus sechs aneinander gereihten Histidinen bestehender His-Tag angehängt, welcher für die spätere Aufreinigung benötigt wurde. Für die PCR diente D. viviparus cDNA, welche bereits im Institut zur Verfügung stand, als Template. Zu Beginn der Arbeit lag LEG-2 bereits fertig im Expressionsvektor vor. Daher wird im Folgenden lediglich die Klonierung von LEG-1 beschrieben.
3.7.1 PCR Protokoll zur Inserterstellung für den Vektor PCR™4-TOPO Der Reaktionsansatz bestand aus folgenden Komponenten:
40,5 µl Aqua bidest.
5 µl 10x Advantage™ 2 PCR Buffer
1 µl 10 µM Forward Primer (GSP for)
1µl 10 µM Reverse Primer (GSP rev)
0,5 µl Advantage™ Polymerase
1 µl LEG-1 cDNA-template
Das Temperaturprofil der PCR war wie folgt:
Aktivierung der Polymerase bei 95 °C für drei Minuten
Denaturierung bei 95 °C für 45 Sekunden gefolgt von 35 Zyklen Annealing bei 60 °C für eine Minute
Extension bei 72 °C für eine Minute
Die finale Extension erfolgte bei 72 °C für zehn Minuten.
Es wurde ein PeqSTAR PCR Cycler (PEQLAB) für alle PCRs genutzt.
3.7.2 Agarosegelelektrophorese, DNA-Aufreinigung und Klonierung in pCR®4- TOPO®
Das PCR-Produkt wurde mit sechsfach Probenpuffer versetzt, auf ein 1 %iges Agarosegel, das mit 0,1 % GelRed™ als Farbstoff versetzt war, aufgetragen und nach Auftrennung bei 100 Volt für eine Stunde die entsprechende Bande des LEG-1- PCR-Produkts auf dem Blaulicht Transilluminator Safe Imager™ (INVITROGEN) ausgeschnitten. Darauf folgte die Aufreinigung mit dem Wizard™ PCR Preps DNA Purification System (PROMEGA) und die Bestimmung der Konzentration der gewonnenen DNA mit dem NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (PEQLAB).
Anschließend erfolgte die Klonierung in den pCR®4-TOPO® Vektor (TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing, LIFE TECHNOLOGIES) und die Transformation in One Shot® TOP10 chemisch kompetente E. coli (LIFE TECHNOLOGIES). Die Zellen wurden auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/ml Carbenicillin bei 37 °C für mindestens zwölf Stunden im Wärmeschrank angezüchtet. Da der Vektor eine Carbenicillinresistenz enthält, wachsen auf diesen Platten nur Zellen, in die erfolgreich ein Plasmid transformiert wurde. Das für E. coli letale Gen ccdB, das in der Vektorsequenz enthalten ist, wird durch die Ligation eines PCR-Produktes unterbrochen, was wiederum verhindert, dass Kolonien, die lediglich den Leervektor enthalten, auf dem Agar wachsen.
Einzelne auf den Platten gewachsene und demnach das Plasmid mit der Antibiotikaresistenz enthaltende Kolonien wurden in LB-Medium mit 50 µg/ml Carbenicillin gepickt und bei 37 °C für mindestens zwölf Stunden angezüchtet. Es folgte eine Kontroll-PCR nach dem unter 3.7.1 beschriebenen Protokoll und anschließend eine Minipräparation mit dem Plasmid DNA Purification NucleoBond Kit (MACHEREY & NAGEL), um das Plasmid aus den Zellen zu isolieren.
Zudem wurden Glycerolstocks angelegt, um eine dauerhafte Lagerung der Zellen und somit die Möglichkeit der ständigen Nachproduktion zu gewährleisten. Hierfür wurden LB-Kultur und Glycerolstock-Lösung zu gleichen Teilen gemischt und bei -80 °C eingefroren.
Die darauf folgende Kontroll-PCR der Plasmid-DNA (siehe 3.7.1) bestätigte den Erfolg der Klonierung durch Banden auf der erwarteten Höhe im Agarosegel. Mittels Minipräparation isolierte Plasmide mehrerer Klone wurden zur Sequenzierung zu der Firma SEQUENCE LABORATORIES (SeqLab, Göttingen) geschickt.
Da die Sequenzierung korrekte Insertsequenzen bestätigte, folgte eine Midi- präparation mit dem Plasmid DNA Purification NucleoBond Kit (MACHEREY &
NAGEL), um größere Mengen an Plasmid DNA zu isolieren. Die Subklonierung der Leg-1-Expressionssequenz in den Expressionsvektor pPinkα-HC (PichiaPink™
Expression System, INVITROGEN) wurde wie im Folgenden beschrieben durchgeführt.
3.7.3 Restriktionsenzymverdau von LEG-1 und pPinkα-HC
Verdau des P. pastoris Expressionsvektors (2 separate Ansätze):
1 µl pPinkα-HC (1,3 µg)
2 µl Buffer green 37 °C
1 µl Kpn1 16 Stunden
1 µl Stu1 im Wärmeschrank
15 µl Aqua bidest.
Verdau von LEG-1 im PCR™-4TOPO-Vektor (4 separate Ansätze):
1 µl LEG-1 (1027,2 ng)
2 µl Buffer green 37 °C
1 µl Kpn1 45 Minuten
1 µl Swa1 im Heizblock
15 µl Aqua bidest.
Nach Inkubation erfolgte eine Hitzeinaktivierung, um eine eventuelle Star-Aktivität der Enzyme zu verhindern. Dafür wurden der pPinkα-HC-Restriktionsenzym- verdauansatz für zehn Minuten und der LEG-1-Restriktionsenzymverdauansatz für fünf Minuten auf 80 °C im Heizblock erhitzt.
Um die erwarteten Banden im Agarosegel sichtbar zu machen, wurden die beiden Restriktionsenzymverdauansätze mit sechsfach Probenpuffer versetzt und auf ein 0,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % GelRed™ als Farbstoff aufgetragen. Um eine sehr saubere Auftrennung der Banden zu gewährleisten, erfolgte die Gelelektrophorese bei nur 65 Volt für einen Zeitraum von zwei Stunden.
Die Banden des pPinkα-HC-Vektors und LEG-1 wurden auf dem Safe Imager™
(Blaulicht Transilluminator, INVITROGEN) ausgeschnitten, jeweils gepoolt und mit dem Wizard™ PCR Preps DNA Purification System (PROMEGA) aufgereinigt. Es folgte die photometrische Ermittlung der DNA Konzentration mit dem NanoDrop (PEQLAB) und anschließend die Ligation von LEG-1 in den pPinkα-HC-Vektor.
3.7.4 Ligation von LEG-1-Insert und Expressionsvektor
Der PichiaPink Expressionsvektor pPinkα-HC wurde mit dem LEG-1-Insert nach dem im Folgenden beschriebenen Ansatz ligiert:
1,3 µl pPinkα-HC (20,44 ng)
6 µl LEG-1 (17,7 ng) 25 °C
1 µl T4 Ligase zwei Stunden
2 µl Ligasepuffer im Heizblock
9,7 µl Aqua bidest.
Danach wurden 5 µl Ligationsprodukt wie unter 3.7.2 beschrieben, in chemisch kompetente TOP 10 Zellen transformiert. Da auch der pPinkα-HC-Vektor eine Carbenicillinresistenz enthält, wurden erneut carbenicillinhaltige LB-Agar-Platten zur Anzucht genutzt. Zehn Kolonien wurden in Flüssig-LB-Medium gepickt und über Nacht angezüchtet. Es folgte eine Kontroll-PCR der Kulturen mit 1 µl Kulturansatz als Template nach dem PCR-Protokoll von 3.7.1 Die PCR-Produkte wurden auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen und bei 65 Volt ca. eineinhalb Stunden lang aufgetrennt. Nach dem Anlegen von Glycerolstocks aus den LB-Kulturen für die dauerhafte Lagerung wurde eine Minipräparation (MACHEREY & NAGEL) durch- geführt und das Produkt zur Sequenzierung geschickt (SEQUENCE
LABORATORIES). Nach erfolgreicher Sequenzierung wurden die Plasmide eines fehlerfreien Klons mit der Midipräparation (MACHEREY & NAGEL) isoliert.
3.7.5 Linearisierung
Um der Hefe die Aufnahme des Expressionsvektors zu ermöglichen, wurde dieser vor der geplanten Elektroporation linearisiert. Dazu wurde das Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoN1 inkubiert, welches lediglich an einer einzigen Stelle schneidet. Der Restriktionsenzymverdauansatz wurde wie folgt durchgeführt:
8,7 µl LEG-1 bzw. LEG-2 in pPinkα-HC 37 °C
30 µl 10x Buffer R zwei Stunden
30 µl EcoN1 im Wärmeschrank
231,3 µl Aqua bidest.
Nachfolgend wurde eine Natriumacetat-Ethanol-Fällung und die Elektroporation in den P. pastoris PichiaPink Stamm 4 durchgeführt.
3.7.6 Vorbereitung der Hefezellen für die Elektroporation
Zur Vorbereitung für die Elektroporation wurde ein Aliquot des bei -80 °C gelagerten P. pastoris Stamm 4 auf Eis aufgetaut und der Inhalt auf YPD-Agar-Platten (PichiaPink Media Kit) ausgestrichen und bei 28 °C für 3-5 Tage bebrütet, bis sich Kolonien gebildet hatten. Einzelkolonien wurden in 10 ml YPD-Medium (PichiaPink Media Kit) gepickt und in einem weitlumigen Schikanekolben (mind. 125 ml) bei 300 rpm und 25 °C für ein bis zwei Tage inkubiert. Das Verhältnis von Volumen der Pichia-Kultur zu Volumen des Schikanekolbens betrug mindestens 1:5, um eine aus- reichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.
Nach dem Anwachsen wurden mit dieser Starterkultur 100 ml YPD-Medium auf eine OD600 von 0,2 eingestellt und wiederum inkubiert, bis die OD600 zwischen 1,3 und 1,5 lag, was zwischen 12 und 24 Stunden dauerte. War die gewünschte OD600
erreicht, wurden die Zellen bei 1500 g für fünf Minuten abzentrifugiert und mit 250 ml eisgekühltem, autoklaviertem Aqua bidest. resuspendiert. Es folgten eine weitere
Zentrifugation, die Resuspension in 50 ml Aqua bidest. und nach einer erneuten Zentrifugation die Resuspension in 10 ml eisgekühltem 1 M Sorbitol (PichiaPink Media Kit). Im letzten Schritt wurden die Zellen wieder abzentrifugiert, in 300 µl eisgekühltem Sorbitol resuspendiert und auf Eis gelagert.
3.7.7 Elektroporation
80 µl der Zellsuspension wurden mit 5 bis 10 µg LEG-1 bzw. LEG-2 im pPinkα-HC- Vektor in einer eisgekühlten 2 mm Elektroporationsküvette (INVITROGEN) für fünf Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte die Elektroporation mittels der vom Hersteller für P. pastoris vorgeschlagenen Voreinstellungen von 2000 Volt Spannung, 200 Ω Widerstand und 25 µF Kapazität mit dem Gene Pulser Xcell™
Elektroporationsgerät (BIORAD). Direkt nach dem elektrischen Impuls wurde 1 ml YPDS-Medium (PichiaPink Media Kit) hinzugegeben und nach kurzem Vermischen je 200 µl der Suspension auf PAD-Agar-Platten (PichiaPink Media Kit) ausgestrichen.
Die Inkubation erfolgte bei 28 °C, bis sich nach zwei bis vier Tagen Kolonien gebildet hatten. Die PichiaPink-Stämme wachsen nur dann auf den Adenin freien PAD-Agar- Platten, wenn DNA aufgenommen wurde, welche das Gen ade2 enthält und so den Zellen die Adeninbiosythese ermöglicht. Dieses Gen befindet sich auf dem Vektor pPinkα-HC und ermöglicht so eine Vorselektion derjenigen Klone, die bei der Elektroporation die gewünschte DNA aufgenommen haben. Die Farbe der Kolonien ist von der Anzahl der in das Genom integrierten DNA-Abschnitte abhängig.
Rosafarbene Kolonien enthalten einige wenige DNA-Abschnitte, während weiße Kolonien zahlreichere DNA-Abschnitte enthalten.
3.7.8 Proteinexpression
Eine PCR von den Kolonien und mit den pPinkα-HC vektorspezifischen Primern 5′AOX1 und 3′CYC1 (INVITROGEN) nach dem unter 3.7.1 beschriebenen Protokoll bestätigte die Insertion von LEG-1 bzw. LEG-2 ins Hefegenom.
Die Expression erfolgte zunächst in kleinerem Volumen („small scale“), um die Be- dingungen für die Expression zu optimieren. Sobald die ideale Bebrütungs-
temperatur, -dauer und Methanolkonzentration bestimmt waren, wurde in größerem Volumen gearbeitet, um die Ausbeute zu erhöhen.
25 ml BMGY-Medium (PichiaPink Media Kit) in einem 250 ml Schikanekolben wurden mit einer Einzelkolonie beimpft und bei 28 °C und 300 rpm 24 Stunden lang inkubiert. Mit dieser Starterkultur wurde ein Liter BMGY-Medium beimpft und dieser auf vier je einen Liter fassende Schikanekolben aufgeteilt. Diese Ansätze von ca.
250 ml wurden wiederum bis zu einer OD600 von 2 bis 6 bei 300 rpm und 28 °C inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann bei 1500 g für fünf Minuten abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Zur Induktion der Expression wurde das Zellpellet aus 1 l Pichia-Kultur in 200 ml BMMY (PichiaPink Media Kit) mit 1 % Methanol resuspendiert und über Nacht bei 28 °C und 300 rpm inkubiert. Die Methanol- konzentration wurde durch eine Supplementierung von 500 µl 100 % Methanol nach 24 Stunden erneuert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Analyse und Verarbeitung bei -80 °C eingefroren.
3.7.9 Affinitätschromatographie von rekombinantem LEG-1 und LEG-2
Die Affinitätschromatographie erfolgte mit dem Gerät ÄKTA FPLC (AMERSHAM BIOSCIENCES). Der Überstand aus der Expression in P. pastoris wurde steril filtriert (0,2 µm Filter, SARSTEDT) und auf zwei mit Säulenpuffer A äquilibrierte Säulen (HISTrap™ GE HEALTHCARE) mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute aufgetragen. Anschließend wurden die Säulen mit dem 12,5 fachen des Säulen- volumens an Säulenpuffer A gewaschen und im Folgenden das jeweils gebundene Protein mit Säulenpuffer B eluiert. Die eluierten Proteine wurden mit Hilfe eines Kollektors in je 500 µl Fraktionen aufgefangen. Die LEG-1 bzw. LEG-2 enthaltenen Fraktionen wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt, auf 10 %ige SDS-PAGE-Gele aufgetragen, bei 150 Volt aufgetrennt und anschließend in Coomassielösung gefärbt.
Diejenigen Fraktionen, die Banden auf der erwarteten Höhe von etwa 50 kDa ergaben, wurden bis zum Entsalzen bei -80 °C gelagert.
