3. MATERIAL UND METHODEN
3.7 Rekombinante Expression von LEG-1 und LEG-2 in der Hefe Pichia pastoris
Firma Invitrogen genutzt. Die Durchführung erfolgte jeweils auf Grundlage der Herstellerangaben sowie nach den Beschreibungen von KUERPICK et al. (2013).
Die Primer wurden auf Basis der zuvor beschriebenen Sequenzen mit der Lasergene
PrimerSelect Software (DNASTAR, Version 5.06; GATC Biotech) konstruiert. Die Sequenz für die rekombinante Herstellung von LEG-1 bzw. LEG-2 enthielt jeweils sowohl die Expressionssequenz des Legumains inklusive Signalpeptid als auch Restriktionsenzymschnittstellen für die Enzyme Swa1 und Kpn1 für die letztliche Klonierung in den Expressionsvektor für P. pastoris. Außerdem wurde ein aus sechs aneinander gereihten Histidinen bestehender His-Tag angehängt, welcher für die spätere Aufreinigung benötigt wurde. Für die PCR diente D. viviparus cDNA, welche bereits im Institut zur Verfügung stand, als Template. Zu Beginn der Arbeit lag LEG-2 bereits fertig im Expressionsvektor vor. Daher wird im Folgenden lediglich die Klonierung von LEG-1 beschrieben.
3.7.1 PCR Protokoll zur Inserterstellung für den Vektor PCR™4-TOPO Der Reaktionsansatz bestand aus folgenden Komponenten:
40,5 µl Aqua bidest.
5 µl 10x Advantage™ 2 PCR Buffer
1 µl 10 µM Forward Primer (GSP for)
1µl 10 µM Reverse Primer (GSP rev)
0,5 µl Advantage™ Polymerase
1 µl LEG-1 cDNA-template
Das Temperaturprofil der PCR war wie folgt:
Aktivierung der Polymerase bei 95 °C für drei Minuten
Denaturierung bei 95 °C für 45 Sekunden gefolgt von 35 Zyklen Annealing bei 60 °C für eine Minute
Extension bei 72 °C für eine Minute
Die finale Extension erfolgte bei 72 °C für zehn Minuten.
Es wurde ein PeqSTAR PCR Cycler (PEQLAB) für alle PCRs genutzt.
3.7.2 Agarosegelelektrophorese, DNA-Aufreinigung und Klonierung in pCR® 4-TOPO®
Das PCR-Produkt wurde mit sechsfach Probenpuffer versetzt, auf ein 1 %iges Agarosegel, das mit 0,1 % GelRed™ als Farbstoff versetzt war, aufgetragen und nach Auftrennung bei 100 Volt für eine Stunde die entsprechende Bande des LEG-1-PCR-Produkts auf dem Blaulicht Transilluminator Safe Imager™ (INVITROGEN) ausgeschnitten. Darauf folgte die Aufreinigung mit dem Wizard™ PCR Preps DNA Purification System (PROMEGA) und die Bestimmung der Konzentration der gewonnenen DNA mit dem NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (PEQLAB).
Anschließend erfolgte die Klonierung in den pCR®4-TOPO® Vektor (TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing, LIFE TECHNOLOGIES) und die Transformation in One Shot® TOP10 chemisch kompetente E. coli (LIFE TECHNOLOGIES). Die Zellen wurden auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/ml Carbenicillin bei 37 °C für mindestens zwölf Stunden im Wärmeschrank angezüchtet. Da der Vektor eine Carbenicillinresistenz enthält, wachsen auf diesen Platten nur Zellen, in die erfolgreich ein Plasmid transformiert wurde. Das für E. coli letale Gen ccdB, das in der Vektorsequenz enthalten ist, wird durch die Ligation eines PCR-Produktes unterbrochen, was wiederum verhindert, dass Kolonien, die lediglich den Leervektor enthalten, auf dem Agar wachsen.
Einzelne auf den Platten gewachsene und demnach das Plasmid mit der Antibiotikaresistenz enthaltende Kolonien wurden in LB-Medium mit 50 µg/ml Carbenicillin gepickt und bei 37 °C für mindestens zwölf Stunden angezüchtet. Es folgte eine Kontroll-PCR nach dem unter 3.7.1 beschriebenen Protokoll und anschließend eine Minipräparation mit dem Plasmid DNA Purification NucleoBond Kit (MACHEREY & NAGEL), um das Plasmid aus den Zellen zu isolieren.
Zudem wurden Glycerolstocks angelegt, um eine dauerhafte Lagerung der Zellen und somit die Möglichkeit der ständigen Nachproduktion zu gewährleisten. Hierfür wurden LB-Kultur und Glycerolstock-Lösung zu gleichen Teilen gemischt und bei -80 °C eingefroren.
Die darauf folgende Kontroll-PCR der Plasmid-DNA (siehe 3.7.1) bestätigte den Erfolg der Klonierung durch Banden auf der erwarteten Höhe im Agarosegel. Mittels Minipräparation isolierte Plasmide mehrerer Klone wurden zur Sequenzierung zu der Firma SEQUENCE LABORATORIES (SeqLab, Göttingen) geschickt.
Da die Sequenzierung korrekte Insertsequenzen bestätigte, folgte eine Midi-präparation mit dem Plasmid DNA Purification NucleoBond Kit (MACHEREY &
NAGEL), um größere Mengen an Plasmid DNA zu isolieren. Die Subklonierung der Leg-1-Expressionssequenz in den Expressionsvektor pPinkα-HC (PichiaPink™
Expression System, INVITROGEN) wurde wie im Folgenden beschrieben durchgeführt.
3.7.3 Restriktionsenzymverdau von LEG-1 und pPinkα-HC
Verdau des P. pastoris Expressionsvektors (2 separate Ansätze):
1 µl pPinkα-HC (1,3 µg)
2 µl Buffer green 37 °C
1 µl Kpn1 16 Stunden
1 µl Stu1 im Wärmeschrank
15 µl Aqua bidest.
Verdau von LEG-1 im PCR™-4TOPO-Vektor (4 separate Ansätze):
1 µl LEG-1 (1027,2 ng)
2 µl Buffer green 37 °C
1 µl Kpn1 45 Minuten
1 µl Swa1 im Heizblock
15 µl Aqua bidest.
Nach Inkubation erfolgte eine Hitzeinaktivierung, um eine eventuelle Star-Aktivität der Enzyme zu verhindern. Dafür wurden der pPinkα-HC-Restriktionsenzym-verdauansatz für zehn Minuten und der LEG-1-RestriktionsenzympPinkα-HC-Restriktionsenzym-verdauansatz für fünf Minuten auf 80 °C im Heizblock erhitzt.
Um die erwarteten Banden im Agarosegel sichtbar zu machen, wurden die beiden Restriktionsenzymverdauansätze mit sechsfach Probenpuffer versetzt und auf ein 0,5 %iges Agarosegel mit 0,1 % GelRed™ als Farbstoff aufgetragen. Um eine sehr saubere Auftrennung der Banden zu gewährleisten, erfolgte die Gelelektrophorese bei nur 65 Volt für einen Zeitraum von zwei Stunden.
Die Banden des pPinkα-HC-Vektors und LEG-1 wurden auf dem Safe Imager™
(Blaulicht Transilluminator, INVITROGEN) ausgeschnitten, jeweils gepoolt und mit dem Wizard™ PCR Preps DNA Purification System (PROMEGA) aufgereinigt. Es folgte die photometrische Ermittlung der DNA Konzentration mit dem NanoDrop (PEQLAB) und anschließend die Ligation von LEG-1 in den pPinkα-HC-Vektor.
3.7.4 Ligation von LEG-1-Insert und Expressionsvektor
Der PichiaPink Expressionsvektor pPinkα-HC wurde mit dem LEG-1-Insert nach dem im Folgenden beschriebenen Ansatz ligiert: kompetente TOP 10 Zellen transformiert. Da auch der pPinkα-HC-Vektor eine Carbenicillinresistenz enthält, wurden erneut carbenicillinhaltige LB-Agar-Platten zur Anzucht genutzt. Zehn Kolonien wurden in Flüssig-LB-Medium gepickt und über Nacht angezüchtet. Es folgte eine Kontroll-PCR der Kulturen mit 1 µl Kulturansatz als Template nach dem PCR-Protokoll von 3.7.1 Die PCR-Produkte wurden auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen und bei 65 Volt ca. eineinhalb Stunden lang aufgetrennt. Nach dem Anlegen von Glycerolstocks aus den LB-Kulturen für die dauerhafte Lagerung wurde eine Minipräparation (MACHEREY & NAGEL) durch-geführt und das Produkt zur Sequenzierung geschickt (SEQUENCE
LABORATORIES). Nach erfolgreicher Sequenzierung wurden die Plasmide eines fehlerfreien Klons mit der Midipräparation (MACHEREY & NAGEL) isoliert.
3.7.5 Linearisierung
Um der Hefe die Aufnahme des Expressionsvektors zu ermöglichen, wurde dieser vor der geplanten Elektroporation linearisiert. Dazu wurde das Plasmid mit dem Restriktionsenzym EcoN1 inkubiert, welches lediglich an einer einzigen Stelle schneidet. Der Restriktionsenzymverdauansatz wurde wie folgt durchgeführt:
8,7 µl LEG-1 bzw. LEG-2 in pPinkα-HC 37 °C
30 µl 10x Buffer R zwei Stunden
30 µl EcoN1 im Wärmeschrank
231,3 µl Aqua bidest.
Nachfolgend wurde eine Natriumacetat-Ethanol-Fällung und die Elektroporation in den P. pastoris PichiaPink Stamm 4 durchgeführt.
3.7.6 Vorbereitung der Hefezellen für die Elektroporation
Zur Vorbereitung für die Elektroporation wurde ein Aliquot des bei -80 °C gelagerten P. pastoris Stamm 4 auf Eis aufgetaut und der Inhalt auf YPD-Agar-Platten (PichiaPink Media Kit) ausgestrichen und bei 28 °C für 3-5 Tage bebrütet, bis sich Kolonien gebildet hatten. Einzelkolonien wurden in 10 ml YPD-Medium (PichiaPink Media Kit) gepickt und in einem weitlumigen Schikanekolben (mind. 125 ml) bei 300 rpm und 25 °C für ein bis zwei Tage inkubiert. Das Verhältnis von Volumen der Pichia-Kultur zu Volumen des Schikanekolbens betrug mindestens 1:5, um eine aus-reichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.
Nach dem Anwachsen wurden mit dieser Starterkultur 100 ml YPD-Medium auf eine OD600 von 0,2 eingestellt und wiederum inkubiert, bis die OD600 zwischen 1,3 und 1,5 lag, was zwischen 12 und 24 Stunden dauerte. War die gewünschte OD600
erreicht, wurden die Zellen bei 1500 g für fünf Minuten abzentrifugiert und mit 250 ml eisgekühltem, autoklaviertem Aqua bidest. resuspendiert. Es folgten eine weitere
Zentrifugation, die Resuspension in 50 ml Aqua bidest. und nach einer erneuten Zentrifugation die Resuspension in 10 ml eisgekühltem 1 M Sorbitol (PichiaPink Media Kit). Im letzten Schritt wurden die Zellen wieder abzentrifugiert, in 300 µl eisgekühltem Sorbitol resuspendiert und auf Eis gelagert.
3.7.7 Elektroporation
80 µl der Zellsuspension wurden mit 5 bis 10 µg LEG-1 bzw. LEG-2 im pPinkα-HC-Vektor in einer eisgekühlten 2 mm Elektroporationsküvette (INVITROGEN) für fünf Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte die Elektroporation mittels der vom Hersteller für P. pastoris vorgeschlagenen Voreinstellungen von 2000 Volt Spannung, 200 Ω Widerstand und 25 µF Kapazität mit dem Gene Pulser Xcell™
Elektroporationsgerät (BIORAD). Direkt nach dem elektrischen Impuls wurde 1 ml YPDS-Medium (PichiaPink Media Kit) hinzugegeben und nach kurzem Vermischen je 200 µl der Suspension auf PAD-Agar-Platten (PichiaPink Media Kit) ausgestrichen.
Die Inkubation erfolgte bei 28 °C, bis sich nach zwei bis vier Tagen Kolonien gebildet hatten. Die PichiaPink-Stämme wachsen nur dann auf den Adenin freien PAD-Agar-Platten, wenn DNA aufgenommen wurde, welche das Gen ade2 enthält und so den Zellen die Adeninbiosythese ermöglicht. Dieses Gen befindet sich auf dem Vektor pPinkα-HC und ermöglicht so eine Vorselektion derjenigen Klone, die bei der Elektroporation die gewünschte DNA aufgenommen haben. Die Farbe der Kolonien ist von der Anzahl der in das Genom integrierten DNA-Abschnitte abhängig.
Rosafarbene Kolonien enthalten einige wenige DNA-Abschnitte, während weiße Kolonien zahlreichere DNA-Abschnitte enthalten.
3.7.8 Proteinexpression
Eine PCR von den Kolonien und mit den pPinkα-HC vektorspezifischen Primern 5′AOX1 und 3′CYC1 (INVITROGEN) nach dem unter 3.7.1 beschriebenen Protokoll bestätigte die Insertion von LEG-1 bzw. LEG-2 ins Hefegenom.
Die Expression erfolgte zunächst in kleinerem Volumen („small scale“), um die Be-dingungen für die Expression zu optimieren. Sobald die ideale
Bebrütungs-temperatur, -dauer und Methanolkonzentration bestimmt waren, wurde in größerem Volumen gearbeitet, um die Ausbeute zu erhöhen.
25 ml BMGY-Medium (PichiaPink Media Kit) in einem 250 ml Schikanekolben wurden mit einer Einzelkolonie beimpft und bei 28 °C und 300 rpm 24 Stunden lang inkubiert. Mit dieser Starterkultur wurde ein Liter BMGY-Medium beimpft und dieser auf vier je einen Liter fassende Schikanekolben aufgeteilt. Diese Ansätze von ca.
250 ml wurden wiederum bis zu einer OD600 von 2 bis 6 bei 300 rpm und 28 °C inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann bei 1500 g für fünf Minuten abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Zur Induktion der Expression wurde das Zellpellet aus 1 l Pichia-Kultur in 200 ml BMMY (PichiaPink Media Kit) mit 1 % Methanol resuspendiert und über Nacht bei 28 °C und 300 rpm inkubiert. Die Methanol-konzentration wurde durch eine Supplementierung von 500 µl 100 % Methanol nach 24 Stunden erneuert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Analyse und Verarbeitung bei -80 °C eingefroren.
3.7.9 Affinitätschromatographie von rekombinantem LEG-1 und LEG-2
Die Affinitätschromatographie erfolgte mit dem Gerät ÄKTA FPLC (AMERSHAM BIOSCIENCES). Der Überstand aus der Expression in P. pastoris wurde steril filtriert (0,2 µm Filter, SARSTEDT) und auf zwei mit Säulenpuffer A äquilibrierte Säulen (HISTrap™ GE HEALTHCARE) mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute aufgetragen. Anschließend wurden die Säulen mit dem 12,5 fachen des Säulen-volumens an Säulenpuffer A gewaschen und im Folgenden das jeweils gebundene Protein mit Säulenpuffer B eluiert. Die eluierten Proteine wurden mit Hilfe eines Kollektors in je 500 µl Fraktionen aufgefangen. Die LEG-1 bzw. LEG-2 enthaltenen Fraktionen wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt, auf 10 %ige SDS-PAGE-Gele aufgetragen, bei 150 Volt aufgetrennt und anschließend in Coomassielösung gefärbt.
Diejenigen Fraktionen, die Banden auf der erwarteten Höhe von etwa 50 kDa ergaben, wurden bis zum Entsalzen bei -80 °C gelagert.
3.7.10 Entsalzen von LEG-1/LEG-2
Diejenigen Fraktionen, die deutliche Banden auf der Höhe von 50 kDa im coomassiegefärbten SDS-PAGE-Gel zeigten, wurden auf eine mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) äquilibrierte Desalting-Säule (HiPrepTM 26/10 Desalting GE HEALTHCARE) aufgetragen. Dabei wurde darauf geachtet, dass das Volumen 15 ml nicht überschritt. Mit einer Fließgeschwindigkeit von 12 ml/Minute wurden die Proteine wieder von der Säule eluiert und alle eluierten Fraktionen mit Hilfe eines Kollektors aufgefangen. Diejenigen Fraktionen, die LEG-1 bzw. LEG-2 in einer zufriedenstellenden Konzentration enthielten, wurden wiederum anhand der Intensität der Banden im SDS-PAGE-Gel ermittelt, anschließend gepoolt und die Endkonzentration an Protein mit dem Bradford-Assay bestimmt. Gelbanden der Legumaine wurden ausgeschnitten und mittels MALDI-TOF-Analyse im Functional Genomics Center Zurich (FGCZ) verifiziert.
3.7.11 SDS-PAGE und Western Blot
Zur Überprüfung der Proteinexpression wurden nach jedem erfolgten Expressions-ansatz SDS-PAGE-Gele und Western Blots durchgeführt. Das mit Hilfe des Align Plus 5 (SCI ED CENTRAL SOFTWARE) auf Grundlage der Sequenzen errechnete Molekulargewicht beträgt für LEG-1 50,1 kDa und für LEG-2 50,9 kDa. Da daher das Molekulargewicht der rekombinanten Proteine bekannt ist und sowohl LEG-1 als auch LEG-2 mit einem His-Tag versehen wurden, kann im Western Blot mit einem His-spezifischen Antikörper überprüft werden, ob Banden auf der richtigen Höhe zu sehen sind. Diese Qualitätskontrolle folgte auf jede neue Expression. Dazu wurde das rekombinante Protein mit sechsfach Laemmli SDS-Probenpuffer vermischt und bei 99 °C für fünf Minuten denaturiert. 10 %ige SDS-PAGE-Gele dienten der Auf-trennung der Proteine und wurden bei 80 Volt (Taschengel) bzw. 150 Volt (Trenngel) laufen gelassen. Nach vollständiger Auftrennung wurden die Proteine bei 100 mA für ca. 75 Minuten auf Nitrozellulosemembranen, die mit Blotpuffer getränkt waren, transferiert (MACHEREY & NAGEL). Im Anschluss wurde die Membran einmal mit TBS-Tween® für fünf Minuten gewaschen und eine Stunde in
BSA-Roti-Block-Lösung (ROTH) geschwenkt, um unspezifische Bindungsstellen auf der Membran abzusättigen. Nach dreimaligem Waschen in TBS-Tween® wurde die Membran eine Stunde lang in 1:500 verdünntem polyklonalen Maus-Anti-His-Antikörper (ABD SEROTEC) geschwenkt. Es folgte ein erneutes dreimaliges Waschen in TBS-Tween und anschließend eine Stunde Inkubation mit dem 1:5000 in TBS-Tween®
verdünnten, mit Alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Anti-körper (ABD SEROTEC). Gebundene SekundärantiZiege-Anti-Maus-IgG-Anti-körper wurden nach erneutem fünfminütigem Waschen in TBS-Tween® und zweimal fünfminütigem Waschen in TBS mit Hilfe von 5-Bromo-4-Chloro-3'-Indoxylphosphat (BCIP, ROTH) und Nitro-blue-Tetrazolium (NBT, ROTH) sichtbar gemacht.