Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
___________________________________________________________________
Untersuchungen zum Vorkommen von humanpathogenen Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen
aus verschiedenen Haltungsformen
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kai Caspari aus Hildesheim
Hannover 2005
Wissenschaftliche Bertreuung: PD Dr. Bernhard Nowak
1. Gutachter: PD Dr. Bernhard Nowak
2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Gerhard Gerlach
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2005
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 2
2.1 Yersinia spp.__________________________________________ 2 2.2 Yersinia enterocolitica___________________________________ 4 2.2.1 Historie ______________________________________________ 4 2.2.2 Einteilung von Yersinia enterocolitica-Typen _________________ 5 2.2.2.1 Biovare ______________________________________________ 5 2.2.2.2 Serotypisierung________________________________________ 7 2.2.2.3 Phagentypisierung ____________________________________ 11 2.2.3 Pathogenitätsfaktoren__________________________________ 12 2.2.3.1 Chromosomal kodierte Faktoren _________________________ 12 2.2.3.2 Plasmidiär kodierte Faktoren ____________________________ 15 2.2.4 Epidemiologie ________________________________________ 19 2.2.5 Klinische Erscheinungen beim Tier _______________________ 23 2.2.6 Klinische Erscheinungen beim Menschen __________________ 24 2.2.7 Nachweisverfahren ____________________________________ 27 2.2.7.1 Mikrobiologische Verfahren _____________________________ 27 2.2.7.2 Molekularbiologische Verfahren __________________________ 35 2.2.8 Yersinia enterocolitica in der Fleischerzeugung und
Fleischgewinnung _____________________________________ 39 3. Untersuchungstiere, Material und Methoden 42 3.1 Prüfung verschiedener Methoden zum Nachweis von Yersinia
enterocolitica_________________________________________ 42 3.1.1 Untersuchungstiere____________________________________ 42 3.1.2 Material _____________________________________________ 43
3.1.3 Methoden ___________________________________________ 45 3.1.3.1 Mikrobiologische Verfahrensschritte_______________________ 45 3.1.3.2 Molekularbiologische Verfahrensschritte ___________________ 51 3.2 Humanpathogene Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen
aus verschiedenen Haltungsformen _______________________ 60 3.2.1 Untersuchungstiere____________________________________ 60 3.2.2 Material _____________________________________________ 63 3.2.3 Methoden ___________________________________________ 64 3.2.4 Statistische Auswertung ________________________________ 65
4. Ergebnisse 66
4.1 Vergleich der Untersuchungsmethoden zum Nachweis von Yersinia enterocolitica_________________________________________ 66 4.2 Vorkommen von humanpathogenen Yersinia enterocolitica bei
Schlachtschweinen aus verschiedenen Haltungsformen _______ 76 4.2.1 Tiere aus konventioneller Haltung ________________________ 76 4.2.2 Tiere aus alternativer Haltung____________________________ 81
5. Diskussion 85
6. Zusammenfassung 96
7. Summary 98
8. Literaturverzeichnis 100
9. Anhang 138
9.1 Substanzen und Nährmedien für die mikrobiologischen
Nachweisverfahren ___________________________________ 138 9.2 Substanz für den molekularbiologischen Nachweis __________ 142 9.3 Tabelle der Einzelergebnisse ___________________________ 143
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Absch. Abschnitt
ail Attachment invasion locus BOS Bile oxalate sorbose broth
bp Basenpaare
BS Brommethylblau-Sucrose-Agar
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CIN Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin
cm Zentimeter
cm2 Quadratzentimeter
d.h. das heißt
DNS Desoxyribonukleinsäure
E. Escherichia
ETDA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alii
Fa. Firma
g Gramm
g Erdbeschleunigung G/C Guanin/Cytocingehalt h Stunde
H-Antigen Geißel-Antigen
Ig Immunglobulin
inv Invasin locus
ITC Irgasan-Ticarcillin-Kaliumchlorat
kb Kilobasen
KbE Koloniebildende Einheiten
kD kilo-Dalton
lfd. Nr. laufende Nummer
LPS Lipopolysaccharide
M Molar
MD Mega-Dalton
mg Milligramm
ml Milliliter
mm Millimeter
MPCR Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion MRB modifizierte Rappaportbouillon
Myf mycoid Yersinia factor
n absolute Zahl
O-Antigen Oberflächen-Antigen
PBS Phosphat buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion
pos. positiv
prox. proximal
rRNS ribosomale Ribonukleinsäure
s. siehe
spp. Spezies
SSDC Salmonella-Shigella-Desoxycholat-Citrat-Agar
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-EDTA
Taq Thermes aquaticus
TSB Trypticase-Soja-Bouillon
URE Urease
vgl. vergleiche
Vol. dem Probevolumen entsprechende Menge Yst Hitzestabiles Protein
Y. Yersinia
Y. entero. Yersinia enterocolitica Yad Yersinia adhesin
Yop Yersinia outer membrane protein YVE virulent Yersinia enterocolitica
µl Mikroliter
°C Grad Celsius
1. Einleitung
Die Bedeutung der in den dreißiger Jahren des letzten Jahrhunderts erstmals von SCHLEIFENSTEIN und COLEMAN (1939) aus humanem Untersuchungsmaterial isolierten Yersinia enterocolitica als Krankheitserreger beim Menschen hat in den letzten Jahren stetig zugenommen. Die statistische Erhebung des ROBERT-KOCH- INSTITUTES (2003) zeigt humanpathogene Yersinia enterocolitica auf Rang drei der meldepflichtigen bakteriellen Darminfektionen. Nur Salmonella spp. und Campylobacter spp. sind häufiger anzutreffen. Der Krankheitsverlauf der Yersiniose beim Menschen verursacht durch Yersinia enterocolitica ist in einem Teil der Fälle von mehrtägig anhaltendem Durchfall gekennzeichnet. Schwerwiegendere Krankheitsbilder, die sich als Komplikationen einstellen können, sind Lymphadenitis, Myokarditis oder ein Morbus Crohn ähnliches Geschehen (HOOGKAMP- KONSTANJE u. DE KONING 1990). Die Hauptansteckungsquelle für den Menschen stellt rohes oder ungenügend erhitztes Schweinefleisch dar. Das Schwein als Hauptreservoir trägt verschiedene Yersinia spp. als Kommensale im Magen-Darm- Trakt, darunter auch humanpathogene Yersinia enterocolitica (FUNK et al. 2000).
Untersuchungen über das Vorkommen von Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen, die unter kontrolliert alternativen („naturbelassenes Schweinefleisch“) Bedingungen gemästet wurden, liegen derzeit in der Literatur nicht vor. Die vorliegende Arbeit soll hier mögliche Unterschiede in der Anwesenheit von humanpathogenen Yersinia enterocolitica zwischen Schlachtschweinen in Betrieben mit konventioneller und kontrolliert alternativer Mast in Niedersachsen aufzeigen.
Eine weitere Bestrebung ist, ein praktikables und zuverlässiges Detektionsverfahren für Yersinia enterocolitica zu etablieren. Die in der Literatur beschriebenen Nachweise von Yersinia enterocolitica sind zum Teil sehr aufwändig und ihre Beurteilung in unterschiedlichen Arbeiten widersprüchlich.
2. Literaturübersicht
2.1 Yersinia spp.
Yersinien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Sie stellen sich als gram- negative, kokkoide bis pleomorphe, alkalistabile, psychrophile kurze Stäbchen ohne Sporenbildung dar. Sie wachsen fakultativ anaerob und reduzieren Nitrat zu Nitrit.
Weiter zeigen sie sich als Oxidase-negativ und Katalase-positiv. Ihr Guanin- und Cytosingehalt (G/C) liegt zwischen 46,0 und 48,5 Mol % (BERCOVIER et al. 1984).
Allen Yersinien, außer Yersinia pestis und einigen pathogenen Serovaren von Yersinia enterocolitica (NESBAKKEN et al. 1992), ist eine Beweglichkeit bei 22 – 28 °C, nicht aber bei 35 – 37 °C, eigen (ATLAS 1995).
Im Genus Yersinia befinden sich derzeit zehn verschiedene Spezies (NEUBAUER et al. 2001b): Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia aldovae, Yersinia mollaretii, Yersinia bercovieri und Yersinia rhodei (BRENNER 1979;
ALEKSIĆ et al. 1987a; WAUTERS et al. 1988b). Die Abbildung 1 zeigt die phylogenetische Verwandtschaft von Yersinia spp. mit anderen Enterobacteriaceae.
Abb. 1: Phylogenetische Verwandtschaft von Yersinia spp. und die Position des Genus Yersinia in der Familie Enterobacteriaceae (IBRAIM et al. 1993)
Yersinia ruckeri (EWING et al. 1978) als elfte Spezies des Genus Yersinia ist umstritten, da sie deutliche Abweichungen im G/C-Verhältnis gegenüber den anderen Yersinien zeigt (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1990). Als pathogen für den Menschen werden Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis und einige Serovare von Yersinia enterocolitica angesehen. Yersinia pestis ist für die als Pest bezeichnete Erkrankung des Menschen verantwortlich, wohingegen Krankheiten, die durch Yersinia pseudotuberculosis und Yersinia enterocolitica verursacht werden, mit dem Begriff Yersiniose zu bezeichnen sind (KNAPP 1977, 1980).
2.2 Yersinia enterocolitica
2.2.1 Historie
1933 wurde von GILBERT in New York über eine ungewöhnliche Infektion beim Tier durch ein bisher unbekanntes Bakterium berichtet (KARACHALIOS et al. 2002). Nur ein Jahr später wurde dieser Keim in den USA bei einem Bauern, der an einer Entzündung der Nebenhöhlen und der Lymphknoten im Gesichts- und Halsbereich litt, isoliert (PUTZKER et al. 2001). SCHLEIFENSTEIN und COLEMAN beschrieben den Erreger 1939 als verwandt mit Pasteurella pseudotuberculosis und Bacterium lignerii und nannten ihn Bacterium enterocolyticum. Aber auch mit anderen Namen wie Pasteurella X, Pasteurella Type B oder Keim X, erscheint Bacterium enterocolyticum bzw. Yersinia enterocolitica in der Literatur (PUTZKER et al. 2001).
Klinisch trat der Erreger beim Menschen kaum in Erscheinung. Nur wenige Isolierungen waren bis zum Anfang der 60er Jahre gelungen. MOLLARET (1995) nennt diese Zeit die erste „clinically silent“ Periode, in der der oben erwähnte Keimnachweis nicht mit offenen Krankheitsverläufen beim Menschen assoziiert war.
Hieran schloss sich eine zweite Phase mit klinisch manifesten Infektionen an, die 1960 Westeuropa (Frankreich, Belgien, Niederlande, Deutschland, Schweiz) erreichte. Wenig später traf man sie auch in anderen europäischen Ländern an (Schweden, Ungarn ). Im Verlauf der nächsten Jahre wurde das Bakterium in vielen außereuropäischen Staaten (USA 1965, Kanada und Südafrika 1966, Belgisch- Kongo 1967, Brasilen 1969, Japan 1972 ) nachgewiesen (MOLLARET 1995). 1964 schlug daraufhin FREDERIKSEN die Einführung einer neuen, dritten Yersinia–
Spezies vor und nannte sie Yersinia enterocolyticum. Anschließend erhielt sie 1997 den Namen Yersinia enterocolitica (BOTTONE 1997). Zu diesem Zeitpunkt umfasste die Spezies Yersinia enterocolitica, die bezogen auf ihre Substratverwertung und ihre Pathogenität sehr unterschiedlich war, noch sechs weitere Yersinienarten (NEUBAUER 2001c). Erst im Laufe der Jahre wurde auf Grundlage von Untersuchungen der Desoxyribonukleinsäure (DNS) die Spezies Yersinia enterocolitica in sieben Arten aufgeteilt: Yersinia enterocolitica sensu stricto, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia aldovae, Yersinia mollaretii, Yersinia bercovieri (NEUBAUER et al. 2000b; SULAKVELIDZE 2000).
Eine weitere Unterteilung der Art Yersinia enterocolitica erfolgte, nachdem gezeigt werden konnte, dass amerikanische und europäische Stämme sich in der 16S-rRNS-
Genregion unterschieden (IBRAHIM et al. 1993; NEUBAUER et al. 1999). Dieser Unterschied war aber nicht so gravierend, dass eine neue Art hätte begründet werden können, vielmehr wurde eine Unterteilung von Yersinia enterocolitica in zwei Subspezies vollzogen. Die amerikanischen Stämme wurden unter dem Namen Yersinia enterocolitica sub. enterocolitica und die europäischen unter Yersinia enterocolitica sub. palearctica zusammengefasst (NEUBAUER et al. 2000a). Weitere Aufschlüsselungen der DNS lassen die Einführung neuer Spezies und Subspezies erwarten (FENWICK et al. 1996; IBRAHIM et al. 1997a; NEUBAUER et al. 2000b, 2001c).
2.2.2 Einteilung von Yersinia enterocolitica-Typen 2.2.2.1 Biovare
Da Yersinia enterocolitica biochemisch aus einer heterogenen Gruppe besteht, war dies ein Ansatz zur Unterscheidung der einzelnen Typen. 1969 wurde durch NILEHN (1969a) eine erste Biotypisierung vorgenommen. 1970 erfolgte die erste Modifizierung durch WAUTERS. Es bestanden zu diesem Zeitpunk fünf Biovare. Die Tabelle 1 gibt die Reaktionseigenschaften der einzelnen Biovare nach WAUTERS (1970) wieder. Auf der Grundlage dieser Reaktionseigenschaften teilte WAUTERS (1970) Yersinia enterocolitica in die Biovare 1 – 5 ein.
Tab. 1: Biovare von Yersinia enterocolitica (WAUTERS 1970)
Biovare
Kriterien 1 2 3 4 5
Lecithinase + (+) - - -
Indol + + + - -
D-Xylose + + + - -
Nitratreduktion + + + + -
Trehalose + + + + -
Ornithin-Decarboxylase + + + + -
ß-Galactosidase + + + + +
+ positive Reaktion; (+) schwach positive Reaktion; - negative Reaktion
Im Jahre 1978 wurden von BERCOVIER et al. in Bodenproben Yersinia enterocolitica-Typen nachgewiesen, die nicht eindeutig in das bis dahin bestehende Typisierungsschema passten. Sie führten zusätzlich zum Biovar 3 ein Biovar 3A und 3B ein. WAUTERS veränderte die Aufteilung von BERCOVIER et al. (1987) weiter.
WAUTERS fasste die Gruppen 3A und 3B als Biovar 6 zusammen. Das Biovar 6 wurde auf WAUTERS Vorschlag 1988 in zwei neue Yersinia-Spezies, Yersinia bercovieri und Yersinia mollaretii aufgeteilt (WAUTERS et al. 1988b). Das Biovar 1 unterteilte er in Biovar 1A und 1B. Durch die Differenzierung des ersten Biovars war es ihm gelungen, apathogenen Stämme von den pathogenen zu trennen. Pathogen können diese Yersinia enterocolitica grundsätzlich für alle eukaryotischen Zellen sein; dies belegt eine Untersuchung der Pathogenitätsfaktoren von CARNIEL (1995).
Das Biovar 1A enthält die apathogenen Yersinia enterocolitica. Die sichere Unterscheidung von apathogenen und pathogenen Yersinia enterocolitica gelang ihnen durch den Einsatz von Salicin (Sal), Äskulin (Esc) und Pyrazinamidase (Pyz).
Erscheinungsformen, die Sal/Esc verarbeiten, sind nicht pathogen und sie gehören damit zu Biovar 1A. In den meisten Fällen sind sie ebenfalls Pyz positiv. Pathogene Keime sind immer Sal/Esc und Pyz negativ (KANDOLO u. WAUTERS 1985; RILEY et al. 1989). Ein Teil der krankheitserzeugenden Eigenschaften von Yersinia enterocolitica sind plasmidkodiert, so zum Beispiel Phagozytoseinhibition und Thrombozytenaggregation (s. Kapitel 2.2.3.2). Biochemisch gelingt der Nachweis dieser extrachromosomalen DNS-Einheit mittels folgender phänotypischer Merkmale:
- Autoagglutination (z. B. in Voges-Poskauer-Medium (LAIRD u. CAUNAUGH 1980; ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1987a)),
- Calcium-Abhängigkeit (HIGUCHI u. SMITH 1961; GEMSKI et al. 1980b;
LAZERE u. GEMSKI 1982),
- Kristallviolett-Bindung bei 37 °C (BHADURI et al. 1987),
- Auftrennung in kleine (Plasmid-positive) und große (Plasmid-negative) Kolonien (ALEKSIĆ et al. 1987b) und
- Kongorot-Bindung (PRPIĆ et al. 1983).
In Biovar 1B sind alle humanpathogenen Yersinia enterocolitica, die erstmals in Amerika entdeckt wurden, enthalten. In den Biovaren 2, 3, 4 und 5 befinden sich alle humanpathogenen Yersinia enterocolitica, die in Europa isoliert wurden (NEUBAUER et al. 2001c). In Tabelle 2 ist die Biovareinteilung nach WAUTERS et al. (1987, 1988b) wiedergegeben.
Tab. 2: Überarbeitete Biovareinteilung von Yersinia enterocolitica (WAUTERS et al.
1987, 1988b)
Biovare
Kriterien 1A 1B 2 3 4 5
Lipase (Tween-Esterase) + + - - - -
Äskulin + - - -
Salicin + - - -
Indol + + (+) - - -
Xylose + + + + - w
Trehalose + + + + + -
Pyrazinamidase + - - -
ß-Glucuronidase + - - -
Voges-Proskauer-Reaktion + + + + + (+)
Prolinpeptidase w - - -
+ positive Reaktion (+) schwach positive Reaktion - negative Reaktion w wechselnde Reaktion
2.2.2.2 Serotypisierung
Eine Typisierung auf Grund serologischer Eigenschaften findet bei Yersinia enterocolitica im wesentlichen durch zwei Antigenstrukturen statt:
- Oberflächen(O)-Antigen; hitzestabile Lipopolysaccharide sind mit arabischen Ziffern benannt und
- Geißel(H)-Antigen ist mit kleinen, lateinischen Buchstaben gekennzeichnet.
Das erste Serotypisierungsschema, auf O-Antigen basierend, wurde 1968 von WINBLAD entwickelt. Es folgten mehrere Erweiterungen und Modifizierungen durch WAUTERS et al. (1971, 1972). Zu diesem Zeitpunkt wurden bereits 34 O- und 20 H- Antigene beschrieben. Durch weitere Forschungen zwischen 1981 und 1986 von WAUTERS (1981), BREUER und KNIEWALLNER (1985) und ALEKSIĆ et al. (1986) stieg die Anzahl der O-Antigengruppen auf 60. Die bis jetzt genannten Schemata umfassten neben Yersinia enterocolitica auch die als sogenannte „Yersinia
enterocolitica-like“ bezeichneten Arten, wie Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia und Yersinia kristensenii (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1990). Dabei entfielen nur 28 Serogruppen auf Yersinia enterocolitica. Um das Typisierungsmuster für Yersinia enterocolitica zu vereinfachen, schlugen ALEKSIĆ und BOCKEMÜHL (1984) eine Einteilung vor, die der klinischen Bedeutung für den Menschen entsprechend nur Serovare von Yersinia enterocolitica beinhaltete. O-Antigene sind nicht speziesspezifisch, so dass es zu Kreuzreaktionen mit anderen Keimen kommen kann. Zu nennen sind hier serologische Ähnlichkeiten zwischen dem Serotyp O:9 mit dem Erreger der bovinen Brucellose (CHART et al. 1992; GERBIER et al. 1997) und mit Salmonellen-Antigen O:47. Kreuzreaktionen dieses Salmonellen-Antigens können auch mit O-Antigen von Yersinia enterocolitica O:12 festgestellt werden. Die humanpathogenen Yersinia enterocolitica Serogruppen O:3, O:8 und O:9 zeigen zudem gleiche Reaktionen, wie die oben genannten apathogenen Yersinia enterocolitica-like Arten (AHVONEN u. SIEVERS 1969a; HURVELL 1972; LE MINOR et al. 1972b). Entsprechendes gilt für Gruppe O:5. Aus dieser Serogruppe sind nur Yersinien mit dem zusätzlichen O-Antigen 27 humanpathogen. Die restlichen gelten als ungefährliche Umweltkeime (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1990). In Deutschland stellen O:3, O:9 und O:5,27 die vorkommenden humanpathogenen Serovare dar (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1996). In Tabelle 3 sind zusammenfassend die O- und H-Antigene und ihre Biovarzugehörigkeit sowie ihre Herkunft wiedergegeben.
Tab. 3: O- und H-Antigene, Biovarzugehörigkeit, Herkunft und geographische Verbreitung humanpathogener Yersinia enterocolitica (ZEN-YOJI et al.
1973; MOLLARET et al. 1979; BUTTLER 1983)
O-Antigen H-Antigen Biovar Herkunft Vorkommen 1, 2a, 3
2a, 2b, 3
a, b, c b, c
3 5
Chinchilla Hase, Ziege, Kaninchen, Affe
Europa, USA Europa
3 a, b, c a, b, c, v
a, c c
4
4
Mensch, Schwein, Hund, Katze, Ratte
Mensch, Schwein, Hühnerfleisch
Europa, Südafrika, Kanada, Japan USA, Südamerika, Australien Deutschland, Norwegen
4,32 b, e, f, i 1B Mensch, Lebensmittel USA 5,27 a, b, c
b, c
2 oder 3 2 oder 3
Mensch, Hund, Affe, Wildtier, Milch Milchprodukte, Oberflächenwasser
Deutschland, Niederlande
USA, Kanada, Japan, Australien 8 b, e, f, i 1B Mensch, Schwein USA
b, e, f, i, v Milch, Milchprodukte, Trinkwasser
Kanada,(Italien), (Niederlande) 9 a, b, 2 Mensch, Schwein, Europa
a, b, c selten Hund, Katze, Japan a, b, c, v 3 Ratte
a, c
13a, 13b a, b, i 1B Mensch, Affe, Milch USA 18 b, e, f, i 1B Mensch USA 20 b, e, f, i 1B Mensch, Hund, Ratte USA 21 b, e, f, i 1B Mensch Stamm
„Tacoma“
USA
Die Kreuzreaktionen, die zu falsch-positiven Aussagen führen können, machen es nötig, weitere Eigenschaften bei der serologischen Differenzierung heranzuziehen.
Speziesspezifisch sind die oben erwähnten H-Antigene (SWAMINATHAN et al.
1982). Im Jahr 1990 wurden von ALEKSIĆ und BOCKEMÜHL 18 H-Faktoren bestimmt. Tabelle 4 zeigt das Vorkommen bestimmter H-Antigene bei verschiedenen Yersinia spp. und die Herkunft dieser Yersinia spp.. Die H-Antigenkomplexe a, b; a, b, c; a, b, c, v; a, c; c oder b, c sind bei den humanpathogenen Yersinia enterocolitica Serovaren O:3, O:9 und O:5,27 beschrieben. Bei den humanpathogenen Serovaren O:8, O:4,32, O:18, O:20 und O:21, die fast ausschließlich in den USA vorkommen, ist die eindeutige Kombination mit der H-Antigenstruktur b, e, f, i verbunden (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1987a). Insgesamt sind bis jetzt bei Yersinia enterocolitica und Yersinia enterocolitica-like Keimen 76 Serogruppen mit 293 Serovaren identifiziert worden (ALEKSIĆ 1995).
Tab. 4: Gemeinsames Vorkommen der Antigene O:3, O:9 und O:8 bei verschiedenen Yersinia-Spezies, ihre H-Antigene und ihre Herkunft (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1990)
O-Antigen H-Antigen Spezies Herkunft
3 a, b, c
a, b, c, v a, c
c
Yersinia enterocolitica Mensch Schwein Hund, Katze
Ratte
3 p2
p8
q H- u
Yersinia frederiksenii
Yersinia intermedia Yersinia kristensenii Yersinia mollaretii
Mensch, Seewasser Oberflächenwasser
Trinkwasser Schwein
Mensch
9 a, b
a, b, c a, ,b, c, v
a, c
Yersinia enterocolitica Mensch, Schwein Hund, Katze
Ratte
p4 Yersinia frederiksenii Abwasser 8 b, e, f, i
w y
Yersinia enterocolitica Yersinia bercovieri
Mensch, Schwein, Milch, Milchprodukte
unbekannt unbekannt
2.2.2.3 Phagentypisierung
Drei Phagentypisierungschemata sind bekannt. Für die europäischen Stämme gibt es das sogenannte Französische und das Schwedische Schema. Das Französische Schema basiert auf 12 Phagen und ist am weitesten verbreitet (NICOLLE 1973). Es kann zum Beispiel die jeweiligen humanpathogenen Yersinia enterocolitica mit Biovar 4 Serovar O:3 (4; O:3) nach ihrer Herkunft aufschlüsseln (MOLLARET et al.
1979). Die Tabelle 5 zeigt die geographische Verteilung der Phagentypen von humanpathogenen Yersinia enterocolitica 4; O:3 nach dem französischen Schema.
Tabelle 5: Geographische Verteilung der Phagentypen von Yersinia enterocolitica 4;
O:3 nach dem Französischen Schema (MOLLARET et al. 1979) Herkunft des Isolats Phagentyp
Europa VIII Japan VIII Kanada IVB Südafrika IVA
Das Schwedische Muster umfast 10 Lysotypen (NILEHN 1969a). Alle Phagen aus den beiden europäischen Systemen sind relativ schwach in ihrer Aktivität gegenüber amerikanischen Stämmen (ATLAS 1995). Für die Typisierung dieser Bakterien kann das dritte Schema von BAKER und FARMER (1982) herangezogen werden. Es beinhaltet 24 verschiedene Phagen und ist neben Yersinia enterocolitica, inklusive des amerikanischen Vertreters O:8, auch gegenüber Yersinia intermedia, Yersinia frederikensii und Yersinia kristensenii aktiv; daher kann es gut für epidemiologische Fragestellungen genutzt werden (SCHIEMANN 1989).
2.2.3 Pathogenitätsfaktoren
Yersinia enterocolitica besitzt mehrere Pathogenitätsfaktoren. Die entsprechenden Genstrukturen befinden sich zu einem großen Teil auf dem Chromosom, aber zum Teil auch auf einem Plasmid kodiert (ZINK et al. 1980, 1982; AULISIO et al. 1983;
PORTONOY u. MARTINEZ 1985; BHADURI 2002).
2.2.3.1 Chromosomal kodierte Faktoren
Yersinia enterocolitica kodiert eine Anzahl von Proteinen auf seinem Chromosom, die für die Entfaltung seiner Pathogenität notwendig sind.
Bei 37 °C und der Anwesenheit von Glukose synthetisiert Yersinia enterocolitica Fimbrien (IRIARTE et al. 1993), diese werden mukoid Yersinia Faktor (Myf) genannt.
Der entsprechende Genort, der für sie kodiert, heißt myf. Er zeigt Ähnlichkeit mit dem psa- und dem pap-Genort von Yersinia pestis bzw. Escherichia coli. Die Aufgabe von Myf konnte bis heute noch nicht endgültig geklärt werden; der Nachweis von myf gelang nur in pathogenen Yersinia enterocolitica (CARNIEL 1995).
Bei der für Anheftung und Invasion verantwortlichen Gensequenz ail (attachment invasion locus) ist, wie der Name schon suggeriert, die Aufgabe und Beteiligung an der Virulenz von Yersinia enterocolitica weitestgehend geklärt (MILLER et al. 1989, 1990; BOTTONE 1997). Neben Anheftung und Invasion in die eukaryotische Zelle, vermittelt das durch ihn verschlüsselte Protein (Ail) auch die Resistenz der Bakterien gegenüber dem Komplementsystem (CARNIEL 1995). Das 17 kD große Protein ist Bestandteil der äußeren Membran (NEUBAUER et al. 2001a). An der Oberfläche tritt es in Interaktion mit seinem Liganden auf der Wirtszelle und vermittelt mit anderen Proteinen die Anheftung bzw. Invasion (CARNIEL 1995). MILLER et al. (1989), HARNETT et al. (1996) und LAMBERTZ et al. (1996) zeigten, dass sich ail nur in pathogenen Yersinia enterocolitica nachweisen lässt. Bringt man das ail-Gen in einen apathogenen Yersinia enterocolitica Stamm ein, kommt es nicht zur Invasion (CARNIEL 1995). Dies unterstreicht, dass noch andere Gene bzw. Proteine an dem Mechanismus der Invasion in die eukaryotische Zelle beteiligt sein müssen.
Eines von den Genen, die an der Invasion in die eukaryotische Zelle beteiligt sind, ist das inv-Gen. Es kodiert das Protein Invasin (Inv) mit einer Masse von 92 kD (ISBERG u. TRAN VAN NHIEU 1994; PEPE et al. 1994). Das Eiweiß interagiert mit seinen Liganden auf der Eukaryontenzelle, den ß1-Integrinen (NEUBAUER et al.
2001a). Dies fördert die Modifikation des Zytoskeletts, die Endozytose der Bakterien und die Akkumulation von Aktin um die endozytotische Vakuole (CARNIEL 1995).
Alle Yersinia enterocolitica Stämme besitzen ein inv-Gen aber nur bei enteropathogenen Isolaten wird auch ein funktionsfähiges Inv-Protein gebildet (RAVAGNAN u. CHIESA 1995).
Enteropathogene Yersinia enterocolitica sezernieren ein hitzestabiles Enterotoxin (Yst) (DELOR et al. 1990). Es entspricht in seiner Struktur und seinen Eigenschaften dem hitzestabilen Enterotoxin (STI) von Eschericha coli (DELOR u. CORNELIS 1992). Welche genauen Aufgaben das Protein als Pathogenitätsfaktor wahrnimmt, ist bis jetzt nicht geklärt (PAI et al. 1978; DELOR et al. 1990; IBRAHIM et al. 1997b;
NEUBAUER et al. 2001a). Tierversuche mit yst-positiven (yst+) und yst-negativen (yst-) Isolaten lassen vermuten (DELOR u. CORNELIS 1992), dass es an Primärschäden des Darmepithels beteiligt ist. Es wird durch das chromosomale yst- Gen kodiert (VISHNUBATLA et al. 2000).
Mit einem sogenannten arthritogenen Antigen von Yersinia enterocolitica konnten experimentell Gelenksentzündungen hervorgerufen werden. Das Protein ist 19 kD groß. Bei seiner Sequenzierung wurde festgestellt, dass es der ß-Untereinheit von Urease (Ure) entspricht (SKURNIK et al. 1993; DE KONING-WARD et al. 1994). Das entsprechende Gen gehört zu einem aus sieben Genen zusammengesetzten Operon: ureA – C kodiert die strukturellen Untereinheiten des Proteins und ureD – G beschreibt die Ureaseaktivität (CARNIEL 1995). Die exakte Rolle der Urease im pathogenen Geschehen konnte bis heute noch nicht demonstriert werden.
Als gramnegativer Keim besitzt Yersinia enterocolitica eine Umhüllung mit Lipopolysacchariden (LPS). Sie spielen bei der Pathogenität eine große Rolle (BENGOCHEA et al. 1996). Die LPS sind mit anderen Lipoproteinen und Lipiden in das Stützskelett der Bakterienzellwand eingelagert. Der Aufbau der LPS variiert in Abhängigkeit von der Temperatur. KAWAOKA et al. (1982) beschreibt, dass bei transienten Bakteriämien durch Yersinia enterocolitica bei einer Körpertemperatur von 37 °C typische Symptome einer gramnegativen Sepsis fehlen. LPS steigern die
Resistenz gegenüber eukaryotischen antimikrobiellen Peptiden und erhöhen die Permeabilität für hydrophobe Stoffe. Dies dient beides dazu, das wirtseigene Abwehrsystem zu überwinden (BUCHER 2001). Sie sind auch mitverantwortlich für arthritisches Geschehen und haben damit Anteil an chronischen Yersiniosen (DI GENARO et al. 2000).
2.2.3.2 Plasmidiär kodierte Faktoren
Das Plasmid ist für zahlreiche Eigenschaften pathogener Yersinia enterocolitica verantwortlich. Eine Übersicht über die plasmidiär verschlüsselten Eigenschaften gibt Tabelle 6 wieder.
Tab. 6: Plasmidiär verschlüsselte Eigenschaften von pathogenen Yersinia enterocolitica
Eigenschaften Autoren
Ca2+-abhängiges Wachstum GEMSKI et al. 1980b;
PERRY u. BRUBAKER 1983;
PORTNOY et al. 1984
Spontane Agglutination LAIRD u. CAVANAUGH 1980;
SKURNIK et al. 1984 Mannose-resistente Hämagglutination KAPPERUD et al. 1987 Serumresistenz PAI u. DE STEPHANO 1982;
PERRY u. BRUBAKER 1983 Anfärbung mit Kongorot im Substrat PRPIĆ et al. 1983
Hydrophobizität LACHICA et al. 1984 Expression von Fibrillen KAPPERUD et al. 1987;
LACHICA et al. 1984 Zahlreiche Oberflächenproteine (s. u.) MICHIELS et al. 1990
Hervorzuheben sind einige Genstrukturen, die von besonderer diagnostischer Bedeutung sind (s. Kapitel 2.2.7). Zu nennen ist hier ein 30,9 kD großes Protein, dass den Virulenzfaktor (VirF) darstellt. Es ist verantwortlich für die Transkriptionsaktivierung der Virulenzregulatoren. Die Eiweißstruktur gehört zur AraC-Familie, des Arabinose-Operonregulators bei Eschericha coli (CORNELIS et al.
1989). Das entsprechende virF-Gen selbst ist stark thermoreguliert, so dass VirF nur bei 37 °C aktiv ist (CORNELIS 1998). Durch das Protein wird die Transkription des yop-Regulons (Yersinia outer protein) veranlasst.
Die Yersinia outer membran proteins (Yop) stellen eine Gruppe von Eiweißen dar, die extrazellulär bei niedriger Kalziumionenkonzentration ausgeschieden werden oder Bestandteile der äußeren Membran sind (MICHIELS et al. 1990, 1991;
CORNELIS 1998). Yop-Strukturen haben auf die eukaryotische Zelle unterschiedlichen Einfluss, wie z. B. Zytotoxizität, Apoptose und Inhibition bzw.
Modifikation der Zytokinfreisetzung und damit der Immunantwort (CORNELIS 1998;
FIELDS et al. 1999). Eine genaue Auflistung über Einteilung und Funktion der einzelnen Yersinia „outer membrane proteins“ zeigt die Tabelle 7.
Tab. 7: Yersinia outer membrane proteins (Yop) von Yersinia enterocolitica (modifiziert nach ASPLUND 1998)
Yop Molekulargewicht in kD
(ca. Angaben)
Funktion Autoren
YopB 44 Translokation der Yop-Einheiten HÅKANSON et al.
1993;
HARTLAND et al.
1996
YopD 37 Translokation der Yop-Einheiten HÅKANSON et al.
1993
YopE 23 Zytotoxidität, F-Aktin Verteilung ROSQVIST et al.
1991;
SORY u. CORNELIS 1994
YopH 51 Phagozytoseinhibition BLISKA et al. 1992 YopM 42 Inhibition der Thrombozyten-
aggregation
LEUNG u.
STRALEY 1989;
BOLAND et al. 1996;
CORNELIS u.
WOLF-WATZ 1997 YopN 33 Regulation der Sekretion und der
Translokation der Yop-Einheiten für den Oberflächenkontakt
FORSBERG et al.
1991;
BOLAND et al. 1996
YopO 82 Beteiligt an der
Zytoskelettregulation
GALYOV et al. 1994
YopP 30 Induktion der Apoptose in Makrophagen
MILLS et al. 1997
YopQ 20 Unbekannt ALLAOUI et al. 1995 YopR 18 Beteiligt an der Translokation von
Yop-Einheiten
ALLAOUI et al. 1995
LcrV 37 – 42 Beteiligt an der Sekretion von YopB und YopD
SARKER et al. 1998
YadA keine Angaben Autoagglutination, Serumresistenz, Adhäsion u. a.
FREDRIKSSON- AHOMAA et al. 1999
Besonders aus den Yersinia „outer membrane proteins“ hervorzuheben sind das YadA- (Yersinia Adhesin A) und das LcrV-Protein (low calcium response V-antigen), da ihre Genloci zur Identifizierung von humanpathogenen Yersinia enterocolitica verwendet werden können. Das YadA-Protein ist ein 44 – 47 kD großes fibrilläres Außenmembranprotein, dass die bakterielle Adhäsion erleichtert, indem es an Fibronektin, Kollagen oder Laminine der Wirtszelle bindet (MANTEL et al. 1989;
PAERREGAARD et al. 1991). Aber auch die Anheftung des Bakteriums an den von Schleimhäuten produzierten Mukus vermittelt es. Der Keim kann durch Änderung seiner Oberflächeneigenschaften von hydrophob zu hydrophil die Adhäsion an die mit Schleim bedeckte Membran des Wirtsorganismus erleichtern (BOTTONE 1997).
Darauf reagiert das betroffene Gewebe mit starker Sekretion von Muzinen (PAERREGAARD et al. 1991). Bei einer Ausschaltung des yadA-Gens kam es, wie BÖLIN et al. (1982) zeigen konnten, zum Verlust der Virulenz. Weitere Eigenschaften des YadA-Proteins sind in Tabelle 8 aufgelistet. LcrV oder nur V-Antigen genannt, hat Anteil an der Einschleusung von Yop-Proteinen in das Zytosol der eukaryotischen Zelle. Es verändert die Zytokinproduktion und auf diesem Wege die Immunantwort (FEILDS et al. 1999).
Tab. 8: Virulenzeigenschaften des YadA-Proteins von pathogenen Yersinia enterocolitica (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 1999)
Eigenschaften Autoren
Oberflächenhydrophobizität LACHICA et al. 1984 Autoagglutination SKURNIK et al. 1984 Serumresistenz BALLIGAND et al. 1985
Adhäsion an Epithelzellen HEESEMANN u. GRÜTER 1987 Expression von Fibrillen KAPPERUD et al. 1987
Bindung an den Bürstensaum PAERREGAARD 1991 Resistenz gegenüber
polymorphkernigen Lymphozyten
RUCKDESCHEL et al. 1996
2.2.4 Epidemiologie
Yersinia enterocolitica ist weltweit verbreitet. MOLLARET et al. sammelten 1979 über den Nachweis von Yersinia enterocolitica Berichte aus 35 Ländern von sechs Kontinenten. In gemäßigten Klimazonen tritt das Bakterium besonders häufig auf.
Dies umfasst Gegenden Nord- und Südamerikas, Nord-, Zentral- und Ostasiens, Europas, Australiens und Südafrikas (MOLLARET 1971; TOMA et al. 1979;
MARUYAMA 1987). Der Nachweis in tropischen und subtropischen Regionen der Erde ist nur vereinzelt oder gar nicht möglich (MOLLARET et al. 1979; LOMBIN et al.
1985; ADESIYUN et al. 1992). Ursprünglich konnte den jeweiligen Regionen, vor allem in den USA und Europa, bestimmte Bio-/Serogruppen zugeordnet werden. Wie oben bereits erwähnt (s. Kapitel 2.2.2.2), wurden in den Vereinigten Staaten die Bio- /Serovar-Kombinationen 1B/O:4, 1B/O:8, 1B/O:13, 1B/O:20 und 1B/O:21 besonders häufig als humanpathogene Yersinia enterocolitica erkannt; für Europa waren dies 4/O:3, 2 oder 3/O:5,27 und 2/O:9 oder seltener 3/O:9 (MOLLARET et al. 1979;
BAKER u. FARMER 1982; BOCKEMÜHL 1982; BREWER u. CORBEL 1985; WORD HEALTH ORGANISATION 1987). Seit Anfang der 80er Jahre ist diese lokale Zuordnung immer mehr aufgeweicht. Erkrankungen in den USA, für die Yersinia enterocolitica 0:8 verantwortlich gemacht werden konnten, nahmen zu Gunsten von Yersinia enterocolitica 4/O:3 ab (OSTROFF 1995). Die Gründe sind bisher unklar.
Dieser Wechsel der Serogruppen konnte aber auch in anderen Teilen der Erde beobachtet werden. In Großbritannien kam es zu einer Verschiebung in Richtung Serovar O:9, dass zuvor ganz besonders in Skandinavien dominierte (CHRISTENSEN 1980; BREWER u. CORBEL 1985; PRENTICE et al. 1991). Das Serovar O:8 tauchte in Japan auf (CHIESA et al. 1991a, 1991b; ICHINOHE et al.
1991). Bisher ist ein Nachweis von Yersinia enterocolitica O:8 in Deutschland in der Literatur nicht beschrieben.
Yersinia enterocolitica ist sowohl in unbelebter als auch in belebter Umwelt nachgewiesen worden. Als unbelebte Umgebungen können Oberflächenwasser und das Erdreich genannt werden (MOLLARET et al. 1979; KAPPERUD 1981). Auch in Gemüse, Milchprodukten und Trinkwasser ist das Bakterium entdeckt worden (HARTUNG u. GERIGK 1991; KAPPERUD et al. 1993; ACKERS et al. 2000). Bei belebten Habitaten ist das Wirtsspektrum von Yersinia enterocolitica groß. Es umfasst nachweislich kaltblütige Tiere wie Reptilien, Fische und Schalentiere sowie warmblütige Wild- und Haustiere (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1990).
WINBALD erwähnt 1982 Infektionen bei Wildtieren. In einer Studie von NIKOLOVA et al. (2001) wird berichtet, dass Yersinia enterocolitica O:3 der vorherrschende Serotyp u.a. bei untersuchten Wildschweinen (Sus scrofa scrofa), Rotfüchsen (Vulpes vulpes), Mufflons (Ovis musimon) und europäischen Flussottern (Lutra lutra) ist. Bei Haustieren, die den Heimtieren zugeordnet werden, wie Chinchillas, Meerschweinchen, Hasen und Kaninchen, entdeckten LIAN et al. (1987), WUTHE et al. (1995), ZHENG und XIE (1996) sowie WUTHE und ALEKSIĆ (1997) das Bakterium. Bei Chinchillas sind erwiesenermaßen neben klinisch apparenten auch subklinische Krankheitsverläufe anzutreffen (WUTHE u. ALEKIĆ 1992). Haustiere, wie Hund und Katze können genauso von einer Infektion mit Yersinia enterocolitica betroffen sein (WEBER u. LEMBKE 1981; PAGAGEORGES et al. 1983; FENWICK et al. 1994). Zu beiden Tierarten ist ein asymptomatischer Verlauf bekannt (WEBER u. LEMBKE 1981; FANTASIA et al. 1993; HAYASHIDANI et al. 1995). In vielen Ländern wurden vermehrt pathogene Stämme beim Hund nachgewiesen, vor allem solche mit humanpathogener Bedeutung wie Bio-/Serovar 4/O:3 (FANTASIA et al.
1985; CHIESA et al. 1987; CHRISTENSEN 1987). NEUBAUER et al. (2001b) schreiben Hunden das Potenzial zu, als Vektor für den Menschen zu dienen. Zu den Nutztieren liegen zahlreiche Veröffentlichungen vor. Beim Rind sind viele Untersuchungen auf Antikörper im Blut gemacht worden. Als die vorherrschenden Bio-/Serovare konnten 2/O:9 und 3/O:9 identifiziert werden (ALEKSIĆ u.
BOCKEMÜHL 1996; GOURDON et al. 1999). In Neuseeland und Australien fanden KITTELBERGER et al. (1995) über 50 % der Bestände serologisch positiv. In Europa schwanken die Angaben zwischen 10 % in Belgien und Frankreich und 50 % in den fünf neuen deutschen Bundesländern (NATTERMANN et al. 1986; WEYNANTS et al. 1996a). Je nach individueller Empfänglichkeit konnten unterschiedlich schwere Krankheitserscheinungen diagnostiziert werden. GARIN-BASTUJI et al. (1999) konnten bei besonders empfänglichen Tieren eine Ausscheidung des Keims über längere Zeitspannen beobachten. Es ist zu vermuten, dass solche Tiere für die Durchseuchung eines Bestandes verantwortlich sind. Die Tendenz der Nachweishäufigkeit von Yersinia enterocolitica in Rinderbeständen ist steigend (GOURDON et al. 1999). Bei kleinen Wiederkäuern dürfte sich das Bakterium auf alle Zuchtländer ausgebreitet haben. Bei diesen Tieren kommen in Europa Yersinia enterocolitica der Serovare O:2a, 2b, 3b, c mit dem Biovar 5 überwiegend vor (NEUBAUER et al. 2001b). In Deutschland kommt es selten zu klinisch apparenten Ausbrüchen (WUTHE u. ALEKSIĆ 1997). Dennoch fanden LUDES und WEISS (1984) in Fäzes von Schlachtschafen in 3,1 % der Tiere Yersinia enterocolitica. Als
begünstigende Faktoren einer Infektion werden Wurmbefall und Kokzidien genannt (PHILBEY et al. 1991; SLEE u. SKILBECK 1992). Dem Schwein kommt in diesem Zusammenhang eine exponierte Stellung zu. Es ist seit langem als Reservoir von humanpathogenen Yersinia enterocolitica der Serovare O:3, O:9 und O:5,27 bekannt (WAUTERS et al. 1976; BOCKEMÜHL et al. 1979; ROBINSON-BROWNE 1997;
FUNK et al. 2000; JOHANNESSEN et al. 2000). Beim Schwein selbst tritt die Yersiniose überwiegend bei Jungtieren klinisch apparent auf. Ältere Tiere gelten als asymptomatische Träger des Keims (NEUBAUER et al. 2001b). Wie weit humanpathogene Yersinia enterocolitica Stämme in Schlachtschweinen verbreitet sind, zeigen eine Vielzahl von Studien, die zum größten Teil bei Tieren in der Endmast durchgeführt wurden. FUNK et al. (1997) untersuchten Schweine in der Aufstallung eines Schlachtbetriebes in den USA und fanden etwa 24 % aller Tiere mit Yersinia enterocolitica behaftet. Von diesen 24 % waren die Hälfte humanpathogene Arten. Bei einer Untersuchung in Kanada beobachteten LETELLIER et al. (1999) ähnlich hohe Zahlen. Sie ermittelten 21 % positive Tiere. In Europa ist das Bild vergleichbar. ASPLUND et al. (1990) fanden bei einer Studie in Finnland bis zu 36 % der Schweine mit dem Keim behaftet. Jüngere Forschungen, die als Gegenstand Schweinefleisch hatten, wiesen auch hier bei über 10 % der genommenen Proben Yersinia enterocolitica nach (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 2001d; HANK et al.
2001).
Seit Mitte der 70er Jahre kann eine Zunahme des Nachweises von Yersinia enterocolitica beim Menschen in weiten Teilen der Erde beobachtet werden. In Italien stieg die Zahl der Yersinia enterocolitica Nachweise beim Menschen innerhalb von sechs Jahren von einem, im Jahr 1978, auf 130 Fälle an (CHIESA et al. 1987). In Belgien kam es bis 1990 zu einer Vervierfachung von 305 (1975), auf 1314 positive Befunde (VERHAEGEN et al. 1991) und in Großbritannien verdoppelte sich die Zahl von 212 (1983), auf 489 (1988) (PRENTICE et al. 1991). In der ganzen EU betrug die Summe statistisch erfasster Nachweise von Yersinia enterocolitica beim Menschen im Jahre 1999 8309 Fälle (EUROPÄISCHE KOMMISSION 1999). In den USA kommen jährlich fast 20000 neue Fällen hinzu (BUCHREISER et al. 1994).
Auch Deutschland ist von dieser Entwicklung betroffen. So sind im Jahre 2002 7451 Darmerkrankungen mit der Beteiligung von Yersinien beim Menschen gemeldet worden. Dies ist ein Anstieg gegenüber dem Vergleichszeitraum des Vorjahres von etwa 3,3 % (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2003). Eine noch höhere Dunkelziffer darf angenommen werden. Als möglicher Grund ist der bei Erwachsenen relativ kurze
Krankheitsverlauf mit Durchfall für zwei bis drei Tage zu nennen, bei dem nicht selten auf die Konsultation eines Arztes verzichtet wird. Aber auch beim Aufsuchen eines Mediziners wird nicht immer eine Stuhlprobe genommen, die dann weiter diagnostisch geprüft werden könnte. Da für den kulturellen Nachweis von Yersinia enterocolitica ein verhältnismäßig hoher Aufwand erforderlich ist und auch bei der Molekularbiologie (PCR) das zielgerichtete Vorgehen entscheidet (s. Kapitel 2.2.7.2), ist es von imminenter Bedeutung, dass ein Anfangsverdacht auf Yersiniose besteht, um labordiagnostische Bemühungen in diese Richtung zu lenken. Schon 1979 stellte BEYER in einer Studie fest, dass dieser pathogene Keim als mögliche Krankheitsursache für den Menschen bei Ärzten nicht sehr bekannt ist.
Ein Grund für den Anstieg der Prävalenz von Yersinia enterocolitica konnte mit letzter Sicherheit noch nicht gefunden werden. Es wurden aber einige Zusammenhänge aufgedeckt, die hiermit in Verbindung gebracht werden können.
Zum einen bestehen Verhaltensweisen in bestimmten Bevölkerungen, die eine Erkrankung mit Yersinia enterocolitica begünstigen. In Belgien zum Beispiel konnte TAUXE et al. (1987) feststellen, dass 18 % aller Kinder Lebensmittel zu sich nehmen, die rohes Fleisch enthalten. Diese Gruppe verzeichnet eine besondere Häufung von Infektionen mit Yersinien. Kinder gehören darüber hinaus mit älteren und immungeschwächten Menschen zu den besonders prädisponierten Personen für eine Yersiniose (RABSON et al. 1975; BOUZA et al. 1980). Des weiteren haben auch demographische Veränderungen einen gewissen Einfluss auf die Inzidenz von Yersinia enterocolitica Erkrankungen beim Menschen. In Bevölkerungsgruppen, in denen die Betreuung der Kleinkinder zum Beispiel durch Großmütter und nicht durch die Mutter wahrgenommen wurde, war das Aufkommen von Infektionen mit humanpathogenen Yersinia enterocolitica deutlich höher als bei Kindern aus anderen Verhältnissen. Als Ursache nennt LEE et al. (1990), dass die Enkel des Öfteren während der Zubereitung von Innereien an der Küchenarbeitsfläche zwischendurch ernährt werden. Hier kam es dann durch verunreinigte Eingeweide zu einer Schmierinfektion der Säuglingsnahrung. Weiterhin war die Technologie und Organisation sowie der Handel in Bezug auf Fleisch und Fleischerzeugnisse in den letzten Jahrzehnten starken Veränderungen unterworfen (s. Kapitel 2.2.4). Vor allem hervorzuheben sind die längeren Transportwege, die das Fleisch vom Schlachtbetrieb bis zum Endverbraucher hat. Bei diesen Transporten herrschen Kühltemperaturen, so dass sich Yersinia enterocolitica als psychrophiler Keim auch unter diesen Bedingungen gut vermehren kann (ICHINONE et al. 1991).
2.2.5 Klinische Erscheinungen beim Tier
Wie oben bereits erwähnt tritt Yersinia enterocolitica bei vielen Tieren in Erscheinung. Manifeste klinische Erkrankungen sind bei zahlreichen Säugetieren beschrieben worden. Bei unseren Heim- und Haustieren sind Untersuchungen bei Chinchillas, Hasen, Kaninchen sowie Hunden und Katzen gemacht worden (JENTZEN u. HELLMANN 1980; WEBER u. LEMBKE 1981). Bei den Nagetieren und den Hasenartigen tritt eine hämorrhagische bis fibrinöse Enterokolitis in Erscheinung.
Typisch bei beiden Ordnungen ist die Entstehung von Granulomen in der Milz, der Leber, der Lunge sowie in der Darmmukosa (NEUBAUER et al. 2001b). Das Krankheitsbild kann zu Verwechselungen mit der Rhodentiose führen, die durch Yersinia pseudotuberculosis verursacht wird (WUTHE u. ALEKSIĆ 1992, 1997). Bei akut erkrankten Tieren kommt es auch zu einer septischen Verlaufsform, die mit dem Tode endet (WINBALD 1982). Bei Hund und Katze ist das klinische Bild durch blutigen Durchfall gekennzeichnet (WEBER u. LEMBKE 1981; FANTASIA et al.
1985). Beim Hund wurde darüber hinaus noch eine mesenteriale Adenitis und eine Affektion der Analdrüsen beobachtet. Es kann abdominal zur Zystenbildung kommen (MOLLARET et al. 1979). Welpen sind anfälliger für den Ausbruch einer Infektion mit Yersinia enterocolitica. HAYASHIDANI et al. (1995) ermittelten als infektiöse Dosis für vier Monate alte Welpen 106 Keime und bei erwachsenen Hunden eine um drei Zehnerpotenzen höhere Menge. Eine Ausscheidung des Bakteriums über den Kot in einer Konzentration von 102 bis 106 Kolonie bildender Einheiten (KbE) /100g über drei Wochen konnte bei betroffenen Tieren festgestellt werden (FENWICK et al.
1994). Große und kleine Wiederkäuer zeigen klinisch mesenteriale Lymphadenitiden, Enterokolitiden mit Mikroabszessbildung, Mastitiden, Aborte und Endokarditiden (MOLLARET et al. 1979; NATTEMANN 1986). Am infektionsanfälligsten sind auch hier junge Tiere. Generell kann aber gesagt werden, dass eine Erkrankung dieser Tiergruppen selten mit Yersinia enterocolitica in Verbindung gebracht werden kann (WUTHE u. ALEKSIĆ 1997). Bei kleinen Wiederkäuern konnten Infektionen in zeitliche Verbindung mit äußeren Umständen gebracht werden. Dabei handelt es sich um Futterumstellungen, Absetzen, Scheren und um die Aufzucht in feuchtem Klima (NEUBAUER et al. 2001b). Obwohl das Schwein als Hauptträger von pathogenen Yersinien gilt, ist die klinische Erkrankung bei diesen Tieren wenig untersucht. Bei Feldinfektionen mit pathogenen Yersinia enterocolitica zeigten die Bestände als Folge von katarrhalischen Enteritiden, Serositiden und Arthritiden sowie Pneumonien Minderleistung und erhöhte Jungtierverluste. Sauen bildeten nach
durchstandener Infektion eine stabile Immunität aus, nachdem es zuvor zu einer Abnahme der Fruchtbarkeit und einer Häufung von Aborten kam (NATTERMANN et al. 1986). Eine Ausscheidung des Keims mit dem Kot konnte über fünf bis neun Wochen nach einer Infektion in Keimmengen von 103 KbE/100g bis 104 KbE/100g beobachtet werden (FUKUSHIMA et al. 1983). Experimentell infizierte Ferkel zeigten Enteritiden und Enterokolitiden in Verbindung mit Anorexie und Diarrhoe sogar mit Todesfällen (TZIPORI et al. 1987). Bei hohen Dosen mit Yersinia enterocolitica konnten purulente Menigoenzephalitiden und nekrotisierende Entzündungen der Tonsillen ausgelöst werden (NAJDENSKI et al. 1998). Die Erkrankung kann in einen komplizierten Verlauf übergehen; dann kommt es zu Arthritiden und Arthrosen und es entstehen schwere Lahmheiten. Einbeziehungen der Haut sind ebenfalls beschrieben worden (NATTERMANN et al. 1990).
2.2.6 Klinische Erscheinungen beim Menschen
Nach den unterschiedlichen Infektionswegen äußert sich das jeweilige Krankheitsgeschehen beim Menschen mit variierenden Bildern. Grundsätzlich ist eine orale und eine parenterale Infektion bekannt. Bei der oral-alimentären Infektion erscheint die Erkrankung als enteritische Form. Ihr Verlauf ist vom Alter des Betroffenen abhängig (HOOGKAMP-KONSTANJE u. DE KONING 1990; PUTZKER et al. 2001). Bei einer Keimaufnahme per os kommt es nach einer Inkubationszeit von vier bis sieben Tagen zu einem akuten Krankheitsgeschehen. Es kann einige Tage bis Wochen anhalten (NEUBAUER et al. 2001c). Bei Kindern und Jugendlichen manifestieren sich die Beschwerden besonders als fiebrige Enteritis mit mesenterialer Lymphadenitis, Bauchschmerzen, Pharyngitis, Nausea, Erbrechen und Durchfall (KIHLSTROM et al. 1993; AL MOHSEN et al. 1997). Die Diarrhoe ist wässrig aber nicht blutig und kann bei Kindern und Jugendlichen zwei bis vier Wochen dauern. Bei Erwachsenen sind es normalerweise zwei bis drei Tage. Es kann aber auch zu Rezidiven kommen mit Tendenz zur Chronizität. Eine pseudo- appendizitische Symptomatik, die durch eine Entzündung der lokalen Lymphknoten ausgelöst wird, tritt vornehmlich bei Jugendlichen und Erwachsenen auf (ARBEITSKREIS BLUT 2000). Sie äußert sich mit Druckempfindlichkeit im rechten unteren Quadranten des Abdomens und durch Fieber (STOLK-ENGELAAR u.
HOOGKAMP-KORSTANJE 1996). Bei der Laparotomie zeigt sich eine unspezifische Lymphadenitis und terminale Ileitis bei unverändertem Appendix (GLEASON u.
PATTERSON 1982; HOOGKAMP-KONSTANJE et al. 1986a). Bei Erwachsenen kommt es bei etwa 5 % der an terminaler Ileitis erkrankten Menschen zu einem Morbus Crohn-ähnlichen Geschehen. Klinisch sind beide nicht eindeutig voneinander zu unterscheiden. Ihr Verlauf ist chronisch, und es kommt immer wieder zu Bauchschmerzen und wiederkehrenden Durchfällen (HOOGKAMP-KONSTANJE u.
DE KONING 1990). Die Erkrankung der Yersinien-induzierten Kolitis betrifft ebenfalls vornehmlich Erwachsene. Sie ist eine schwerwiegende Entzündung des Dickdarms.
Es entstehen dort diffuse Ulzerationen, die zur Perforation des Darmes führen können. Als Folge einer Durchlässigkeit der Darmwand, kommt es zu einer Peritonitis. Häufig zeigen sich anschließend an die Ileitis bzw. Kolitis auch extraintestinale Manifestationen, wie z. B. reaktive Arthritis, periphere Lymphadenitis und besonders bei Frauen Erythema nodosum (NAKTIN u. BEAVIS 1999; PUTZKER et al. 2001). Auch belastete Blutkonserven können zu Krankheitsbildern außerhalb des Magen-Darmkanals führen (ARBEITSGRUPPE BLUT 2000). Betroffen sind besonders Erwachsene (HOOGKAMP-KONSTANJE u. DE KONING 1990). Die septische Form führt zu multiplen Organabszessen, Vaskulitis mit hohem Fieber und Gewichtsverlust sowie zu Hepatitis und Splenomegalie (HOOGKAMP-KONSTANJE 1987; MERCIE et al. 1996). Als prädisponierende Faktoren sind Immundefiziens, hämatologische Erkrankung, Eisenüberladung (Desferal®-Behandlung), Alkoholismus, Unterernährung u. a. zu nennen (BOELAERT et al. 1987; BOTTONE 1997). Die Letalität ist bei der septischen Yersiniose hoch. Steht die Lymphadenopathie im Vordergrund, die unabhängig von einer Enteritis entstanden sein kann, ähnelt das Bild einem malignen Lymphom oder einer anderen hämatologischen Erkrankung. Es zeigen sich generalisierte Lymphadenopathien mit Splenomegalie, hohem Fieber und Gewichtsverlust (HOOGKAMP-KONSTANJE u.
DE KONING 1990). Histologisch sind unspezifische granulomatöse Entzündungen und vaskuläre Schädigungen mit Thrombenbildung zu diagnostizieren (HOOGKAMP- KONSTANJE et al. 1986b). Findet darüber hinaus eine Erregeraussaat im Körper statt, (beschrieben ist der hämatogene und der lymphogene Weg) sind Entzündungsgeschehen in den unterschiedlichsten Organen zu beobachten. Dabei kann es sich um Pleuritis, Thyreoiditis, Endokarditis, Perikarditis, Osteomyelitis, septische Arthritis, Myositis, Pankreatitis, Cholezystitis und lokale Abszessbildung handeln (COVER u. ABER 1989; KARACHALIOS et al. 2002). Die Persistenz von Yersinia enterocolitica im menschlichen Organismus über viele Jahre konnten HOOGKAMP-KONSTANJE et al. bereits 1988 beweisen. Der Keim konnte in Lymphknoten und darmassoziiertem lymphatischen Gewebe isoliert werden. Dies
betrifft vor allem Menschen, die an chronischen oder rezidivierenden Infektionen erkrankt sind. Bei den oben erwähnten Krankheitsgeschehen können sekundär noch die Gelenke und die Haut betroffen sein. Dies kann als Anschluss an eine intestinale Erkrankung mit Yersinia enterocolitica der Fall sein, ist aber auch ohne eine Symptomatik seitens des Verdauungstraktes beobachtet worden (BORG et al. 1992).
Eine reaktive Arthritis bildet sich etwa ein bis vier Wochen nach dem sich, wenn vorhanden, Darmsymptome geäußert haben. Die Arthritis ist schmerzvoll und betrifft besonders die Gelenke der unteren Extremitäten (STOLK-ENGELAAR u.
HOOGKAMP-KONSTANJE 1996). In 75 % der Fälle ist mehr als ein Gelenk betroffen (DE KONING et al. 1989). Vornehmlich dauert die Arthritis vier bis zwölf Wochen, sie kann aber auch Jahre persistieren (PUTZKER et al. 2001). Die Hauterscheinungen zeigen sich meist vier bis sechs Wochen nach einer Infektion.
Sie haben das Bild eines Erythema nodosums und werden, wie oben bereits genannt, vermehrt bei Frauen angetroffen (HOOGKAMP-KONSTANJE et al. 1990).
2.2.7 Nachweisverfahren
Grundsätzlich stehen für den Nachweis von Yersinia enterocolitica zwei Untersuchungsarten zur Verfügung:
1. Mikrobiologische Verfahren und 2. Molekularbiologische Verfahren.
Beide beinhalten eine Vielzahl unterschiedlicher Vorgehensweisen.
2.2.7.1 Mikrobiologische Verfahren
Ein für Deutschland verbindliches Untersuchungsverfahren nach dem Beispiel der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsmethoden des Lebensmittel- und Bedarfgegenständegesetzes (§ 35 LMBG) gibt es nicht. Es sind aber zwei normierte Standards in Europa vorhanden:
a) Methode NMKL Nr. 117 (1987) vom Nordic Commitee of Food Analysis (NCFA)
b) Internationaler Standard ISO 10273 (DRAFT INTERNATIONAL STANDARD 1993)
zu a) Methode NMKL Nr. 117
Wie die meisten kulturellen Nachweisverfahren, die bei Yersinia enterocolitica zur Anwendung kommen, ist auch Methode NMKL Nr. 117 des NCFA in eine Voranreicherungs- und eine Selektivanreicherungsstufe gegliedert. Diese Mehrstufigkeit resultiert aus der geringen Keimzahl mit der Yersinia enterocolitica normalerweise in der Umwelt angetroffen wird (STENGEL 1983).
Voranreicherung durch Kälte
Die Kälteanreicherung findet in einer Lösung PBS (phosphat-buffered saline) supplementiert mit 1 % Sorbitol und 0,15 % Gallensalze bei einem pH-Wert von 7,6 statt. Die ersten drei Stunden wird bei 25 °C inkubiert und dann die Bouillon mit einer Öse auf Yersinia-Selektivagar nach SCHIEMANN (Cefsulodin-Irgasa-Novobiocin-
Agar, CIN-Agar) ausgestrichen. Die nächsten 21 Tage wird die in PBS verbrachte Probe bei 4 °C gehalten. Am Tag 8, 12, 14 und 21 werden jeweils CIN-Platten durch einen Ösenausstrich beimpft.
Selektivanreicherung
Am Tag 8 wird 0,1 ml des Proben-PBS-Ansatzes in 10 ml modifiziertes Rappaportmedium (modified Rappaport broth; MRB) gemischt. Die Anreicherung findet bei 25 °C für vier Tage statt. Das MRB enthält zusätzlich 80 g MgCl2 pro Liter.
Das Carbenicillin wird nicht eingesetzt. Nach vier Tagen wird bebrütetes Medium auf CIN-Nährböden ausgebracht.
Alle CIN-Platten werden bei 29 °C für 18 – 20 h bebrütet. Fünf Kolonien, die das typische Kuhauge (rotes Zentrum umgeben von einer opaken Randzone) zeigen, werden abgenommen und auf Bromthymolblau-Sucrose-Agar (BS-Agar) ausgestrichen. Alle Sucrose-positiven Kolonien werden weiteren biochemischen und plasmidnachweisenden Verfahren unterzogen. In Tabelle 9 sind die diagnostischen Reaktionen von präsumptiv humanpathogenen Yersinia enterocolitica wiedergegeben. Die Abbildung 2 zeigt die Untersuchungsvorschrift NMKL Nr. 117 im Schema.
Inkubation
PBS 3 h bei 25 °C
CIN 1 Tag bei 30 °C Vordifferenzierung
PBS bei 4 °C
8. Tag 12. Tag 14. Tag 21. Tag Selektivanreicherung
MRB 4 Tage bei 25 °C
BS-Agar (Sucrose-positive) Identifizierung
Biochemische Identifizierung
Pathogenitätstest
Abb. 2: Schematische Darstellung zum mikrobiologischen Nachweis von Yersinia enterocolitica nach NMKL Nr. 117 (Nordic Commitee of Food Analysis 1987)
zu b) Methode nach ISO 10273
Beim internationalen Standardverfahren nach ISO 10273 werden ähnlich Schritte gewählt wie beim NMKL Nr. 117. In Abbildung 3 ist das Vorgehen nach ISO 10273 als Schema dargestellt.
10 g des zu untersuchenden Materials werden in 100 ml Pepton-Sorbit-Gallensalz- Bouillon (PSB) gegeben und für zwei bis drei Tage in Bewegung bei etwa 25 °C inkubiert. Ist das Bewegen während dieses Vorgangs nicht möglich, so verlängert sich die Bebrütungszeit um zwei weitere Tage. Nun wird ein Teil direkt auf CIN-Agar ausgebracht und bei 30 °C für 24 h im Brutschrank belassen. Ein anderer Teil wird erst nach einer Behandlung mit 0,25 %iger Kalilauge für 20 Sekunden auf CIN-Agar gegeben und wie oben weiter behandelt. Parallel zur PSB-Anreicherung findet noch eine Anreicherung des nativen Probenmaterials mit Irgasan-Ticarcillin-Kaliumchlorat- Bouillon (ITC) statt. Das Untersuchungsmaterial wird 1:100 mit ITC-Bouillon verdünnt und für zwei Tage bei 25 °C aufbewahrt. Nach zwei Tagen wird aus dieser Verdünnung Material auf Salmonella-Shigella-Desoxycholat-Citrat-Agar (SSDC) überführt und für 1 – 2 Tage bei 30 °C bebrütet. Nach der Anzüchtung auf CIN- bzw.
SSDC-Agar werden fünf typische Kolonien auf Standard-II-Agar gegeben und hier für einen Tag bei 30 °C belassen. Hieran schließt sich wie bei der Methode NMKL Nr.
117 eine biochemische Identifizierung und Prüfung auf Pathogenität an.
Inkubation
ITC 2 Tage bei 25 °C
PSB in Bewegung 2 Tage bei 25 °C
Selektivanreicherung
SSDC 2 Tage bei 30 °C
CIN 1 Tag bei 30 °C
Standard-II-Agar 1 Tag bei 30 °C Reinigung
Biochemische Identifizierung Identifizierung
KOH
Pathogenitätstest
Abb. 3: Schematische Darstellung zum mikrobiologischen Nachweis von Yersinia enterocolitica nach ISO 10273 (DRAFT INTERNATIONAL STANDARD 1993)
Für Laboratorien, die ein hohes Probeaufkommen zu bewältigen haben, scheinen die oben genannten normierten Verfahren zu arbeitsaufwendig und damit zu kosten- und zeitintensiv zu sein. SAUER (1996) stellt dies für das ISO 10273-Verfahren fest. Es kann aber auch auf die Methode NMKL Nr. 117 übertragen werden. Neben diesen beiden definierten Vorgehensweisen, gibt es noch eine Anzahl bekannter Anreicherungsverfahren und Selektivanreicherungen für pathogene Yersinia enterocolitica, die aber nicht für alle Probenmaterialen gleichermaßen geeignet sind.
Zu nennen sind, soweit sie oben noch keine Erwähnung fanden:
Zweischritt-Anreicherung nach SCHIEMANN (1982) (WALKER und GILMOUR 1986):
Schritt 1: 25 g Probe werden in 225 ml Trypticase Soja Bouillon (TSB) für 30 Sekunden homogenisiert und einen Tag bei 22 °C inkubiert.
Schritt 2: 1 ml aus Schritt 1 wird in 100 ml Bile Oxalate Sorbose Boillon (BOS) gegeben und fünf Tage bei 22 °C belassen.
Mit diesem Zweitschrittverfahren lassen sich nach SCHIEMANN (1982) besonders gut Lebensmittelproben auf die Anwesenheit von Yersinia spp. untersuchen.
Anreicherung nach OSSMER (WAUTERS 1973; SCHIEMANN 1979):
Es werden 10 g Probe in 90 ml OSSMER-Anreicherungs-Bouillon gegeben. Sie enthält Irgasan und Bacitracin zur Hemmung der Begleitflora. Die Probe bleibt einen Tag bei 30 °C in der Bouillon.
Anreicherung im Kälteverfahren mit PBS (EISS 1975; VAN NOYEN et al. 1980):
Hierbei werden 25 g Probe in 225 ml PBS (0,15 mol; pH 7,6) homogenisiert und für 7 – 21 Tage bei 4 °C verwahrt.
Diese Kälteanreicherung eignet sich nach verschiedenen Autoren für eine Vielzahl von Probenarten wie Kot, Untersuchungsmaterial von Schlachtschweinen und
Lebensmitteln (FUKUSHIMA et al. 1984; MAIR u. FOX 1986; MILCZEWSKI 1993;
KOTULA u. SHARAR 1993).
Anreicherung im Kälteverfahren mit Tryptose-Soja-Bouillon (TSB) nach VAN PEE u. STRAIGER (1979):
Es werden 25 g Probe in 225 ml TSB homogenisiert und für 7 – 21 Tage bei 4 °C inkubiert.
Nach DELMAS u. VIDON (1985) sowie WALKER u. GILMOUR (1986) eignet sich dieses Verfahren für den Nachweis von Yersinia spp. aus unterschiedlichsten Lebensmitteln.
Anreicherung nach WEAGANT et al. (1995):
Eine Probe von 25 g wird in 225 ml Peptone Sorbitol Bile Bouillon (PSBB) für 30 Sekunden homogenisiert und zehn Tage bei 10 °C bebrütet.
Die Selektivanreicherung erfolgt weitestgehend auf festen Nährböden. Ihr geht stets eine Voranreicherung mit einem flüssigen Medium voraus.
Sie stellt eine Modifizierung der Kälteanreicherung dar und umfasst ein ähnliches Probenspektrum.
Selektion auf MacConkey-Agar (NILEHN 1969b; EISS 1975):
Die Selektion findet bei 30 °C für einen Tag statt. Yersinia enterocolitica Kolonien sind etwa 1 mm im Durchmesser, flach und farblos.
Selektion auf Virulent-Yersinia enterocolitica-Agarmedium (VYE) nach FUKUSHIMA (1987):
Hier erfolgt die Isolierung von pathogenen Yersinia enterocolitica durch mehrere Zusätze. Zur Unterdrückung anderer Keime werden die Antibiotika Cefsulidom- Irgasan, Josamycin und Oleandomycin zugesetzt. Der Pathogenitätsnachweis gelingt mittels der Zugabe von Äskulin. Wie bereits weiter oben genannt, sind pathogene Yersinia enterocolitica stets Äskulin-negativ. Sie bilden rote Kolonien. Nur apathogene Yersinien können das Äskulin hydrolysieren. So entstehen auf diese Weise aus den nichtkrankheitserzeugenden Keimen dunkle Anhäufungen von Bakterien. Diese Reaktionen laufen bei 30 °C innerhalb von zwei Tagen ab.
Unabhängig von der Selektivanreicherung werden die verdächtigen Kolonien weiter auf ihre biochemischen und pathogenitätshinweisenden Eigenschaften untersucht.
Üblicherweise wird mit einer Überimpfung auf Kligler-Agarmedium (Eisen-III-Zucker- Schrägagar) begonnen. Es enthält Laktose, dass von Yersinia enterocolitica nicht fermentiert wird. So gelingt eine weitere Einschränkung, da es bei der Selektivanreicherung zu Verwechselungen mit anderen Enterobacteriaceaen, die Laktose positiv sind, kommen kann. Das Kligler-Medium wird ein bis zwei Tage bei 30 °C bebrütet. Zur weiteren Eingrenzung kommt noch ein Test auf Harnstoff- und Mannitolverwertung in Betracht. Yersinia enterocolitica ist Urease-positiv und zeigt keine oder eine nur sehr geringe Gasbildung mit Mannitol (ATLAS 1995). Bei der weiteren Differenzierung sind verdächtige Kolonien solche, die Glucose-positv, H2S- negativ, keine Gasbildung und eine positive Harnstoffmetabolisierung zeigen. Eine Identifizierung mittels kommerziell erhältlicher Testsysteme ist möglich. Als geeignetes, auf biochemischen Reaktionskaskaden beruhendes Testsystem kann das API 10 S von bioMérieux (bioMérieux sa., Marcy-l´Etoile, Frankreich) genannt werden (NEUBAUER et al. 1998). Die Tabelle 9 zeigt zusammenfassend diagnostisch verwertbare biochemische Reaktionen von präsumptiv pathogenen Yersinia enterocolitica nach ISO 10273 (DRAFT INTERNATIONAL STANDARD 1993)
Tab. 9 : Diagnostische Reaktionsereignisse von präsumptiv pathogenen Yersinia enterocolitica nach ISO 10273
Testsystem Reaktion Ergebnis
Biochemische Verdachtstests Urease +
Tryptophandesaminase -
Glukose +
Gasbildung aus Glukose -
Laktose -
Hydrogensulfit -
Oxidase -
Biochemische Bestätigungstests Lysindecarboxylase -
Ornithindecarboxylase +
Saccharose - Rhamnose -
Citrat -
Pathogenitätstests Salizin -
Äskulin -
Pyrazinamidase -
Kalziumabhängiges Wachstum bei 37
°C
+
2.2.7.2 Molekularbiologische Verfahren
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und ihre unterschiedlichen Vorgehensweisen stellen ein sehr effizientes Werkzeug zum Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica dar (NEUBAUER et al. 2000c; VISHNUBHATLA et al. 2000; BHADURI 2002). Trotz notwendiger Voranreicherungen, die aus denen im Kapitel 2.2.7.1.
genannten bestehen können, ist die PCR eine deutliche Arbeitserleichterung beim Nachweis von Yersinia enterocolitica, wie Vergleichsstudien zwischen PCR und mikrobiologischen Vorgehensweisen belegen (NESBAKKEN et al. 1991a;
LAMBERTZ et al. 1996; JOHANNESSEN et al. 2000; BOYAPALLE et al. 2001).
