der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Wachstumsverhalten von Yersinia enterocolitica DSM 11502 in künstlich kontaminiertem
Schweinehackfleisch unter verschiedenen modifizierten Atmosphären
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Christian Strotmann
aus Coesfeld
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. B. Nowak Univ.-Prof. Dr. G. Klein
1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. B. Nowak Univ.-Prof. Dr. G. Klein
2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. F. Feldhusen
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2006
Meinen Eltern gewidmet
45. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Vete- rinärmedizinischen Gesellschaft
27. bis 30. September 2004 in Garmisch-Partenkirchen (Poster mit erweitertem Abstract)
47. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der Deutschen Vete- rinärmedizinischen Gesellschaft
26. bis 29. September 2006 in Garmisch-Partenkirchen (Vortrag mit erweitertem Abstract)
1. Einleitung 13
2. Schrifttum 15
2.1. Yersinia enterocolitica 15
2.1.1. Geschichte 15
2.1.2. Systematik 15
2.1.3. Biotyp 17
2.1.4. Serotyp 18
2.1.5. Pathogenität 20
2.1.5.1 Plasmid-kodierte Pathogenität 21
2.1.5.2 Chromosomal-kodierte Pathogenität 22
2.2. Lebensmittelhygienische Bedeutung von Yersinia enterocolitica 24 2.2.1. Vorkommen bei Schlachtkörpern vom Schwein 24 2.2.2. Vorkommen in Fleisch und Fleischerzeugnissen vom Schwein 25 2.3. Epidemiologie und Krankheitsbild der humanen Yersiniose 28 2.4. Zusammenhang zwischen humaner und porciner Infektion 30 2.5. Epidemiologie und Krankheitsbild der porzinen Yersiniose 32 2.6. Nachweismethoden für Yersinia enterocolitica 33
2.6.1. Mikrobiologische Verfahren 33
2.6.1.1. Voranreicherung 34
2.6.1.2. Isolierung auf festen Nährmedien 35
2.6.1.3. Biochemische und serologische Identifizierung 36
2.6.1.4. Pathogenitätstests 37
2.6.2. Molekularbiologische Nachweismethoden 38
2.7. Hackfleisch als Risikolebensmittel für Yersinia enterocolitica 40
2.7.1. Rechtliche Grundlagen 40
2.7.2. Mikrobiologie von Hackfleisch 41
2.7.3. Farbe 43
2.8.1.2. Sauerstoff (O2) 50
2.8.1.3. Kohlendioxid (CO2) 50
2.9. Einfluss verschiedener Schutzatmosphären auf das Wachstum
von Yersinia enterocolitica 53
3. Eigene Untersuchungen 57
3.1. Material 57
3.1.1. Probenmaterial 57
3.1.2. Eingesetzter Yersinia enterocolitica Stamm 57
3.2. Methoden 58
3.2.1. Ermittlung der für die Dotierung erforderlichen Keimzahl 58 3.2.2. Erstellen einer Dotierungslösung und Dotierung des Hackfleisches 59
3.2.3. Verpackung und Lagerung der Proben 62
3.2.4. Mikrobiologische Untersuchungen 66
3.2.4.1. Oberflächenspatelverfahren 66
3.2.4.2. MPN Verfahren (Most Propable Number) 67 3.2.4.3. Vordifferenzierung verdächtiger Kolonien 70 3.2.4.4. Bestätigung verdächtiger Kolonien 71 3.2.4.5. Ermittlung der mesophilen aeroben Gesamtkeimzahl 75
3.2.5. Physikalische Untersuchungen 75
3.2.5.1. pH-Wert 75
3.2.5.2. L*a*b*Farbmessung 76
3.2.6. Chemische Untersuchungen 77
3.2.6.1. Trockensubstanz 77
3.2.6.2. Gesamtfettgehalt 77
3.2.6.3. Gesamteiweißgehalt 77
3.2.7. Statistische Auswertung 77
4.1.1. Ermittlung der für die Dotierung erforderlichen Gesamtkeimzahl 79
4.2. Mikrobiologische Untersuchungen 80
4.2.1. Quantitativer Nachweis von Yersinia enterocolitica DSM 11502 80
4.2.1.1. Oberflächenspatelverfahren 80
4.2.1.2. MPN-Verfahren (Most Probable Number) 83
4.2.2. Mesophile aerobe Gesamtkeimzahl 90
4.3. Physikalische Untersuchungen 93
4.3.1. pH-Wert 93
4.3.2. L*a*b*-Farbmessung 96
4.3.2.1. a*-Wert 96
4.3.2.2. L*-Wert 99
4.3.2.3. b*-Wert 101
4.3.2.4. L*a*b*-Farbänderungswerte 103
4.3.2.5. Gasanalysen der Schutzatmosphären (Vol.-% CO2, O2 und N2) 106
4.4. Chemische Untersuchungen 109
5. Diskussion 110
5.1. Diskussion von Material und Methode 110
5.1.1. Probenmaterial 110
5.1.2. Eingesetzter Yersinia enterocolitica Stamm 111
5.1.3. Methoden 111
5.1.3.1. Dotierung des Hackfleisches 111
5.1.3.2. Verpackung und Lagerung der Proben 112
5.1.3.3. Oberflächenspatelverfahren 113
5.1.3.4. MPN-Verfahren 114
5.1.3.5. L*a*b*-Farbmessung 115
5.2. Diskussion der Ergebnisse 115
5.2.1. Mesophile aerobe Gesamtkeimzahl 115
5.2.2. Quantitativer Nachweis von Yersinia enterocolitica DSM 11502 117
5.3. Risikoeinschätzung zu Yersinia enterocolitica in frischem Fleisch 125
6. Schlussfolgerungen 128
7. Zusammenfassung 130
8. Summary 133
9. Literaturverzeichnis 135
10. Anhang 158
10.1. Tabellenanhang 158
10.2. Geräte und Verbrauchsmaterialien 173
10.3. Verzeichnis der Tabellen 178
10.4. Verzeichnis der Abbildungen 180
Abb. Abbildung
Ail Attachment invasion locus
Bed. Bedingungen
bes. besonders
BHI Brain Heart Infusion
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CFU colony forming units
CIE Comission Internationale de l’Eclaire
CIN Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin DIN EN ISO Deutsches Institut für Normung Europäische Normung
International Standards Organisation
d. h. das heißt
EDTA Ethylendiamintetraacetat
et al. et alii
evtl. eventuell
Fa. Firma
°C Grad Celsius
g Gramm
geogr. geographisch
ggf. gegebenenfalls
GKZ Gesamtkeimzahl
h Stunde
H-Antigen Geißel-Antigen
hum. Human
IU International Units
inv Invasin locus
ITC Irgasan-Ticarcillin-Kaliumchlorat
Kons. Konservierungsstoffe
LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch
LM Lebensmittel
LPS Lipopolysaccharide
MA modifizierte Atmosphäre
MAP modified atmosphere packaging
mg Milligramm
min. Minute
ml Milliliter
MPN Most Probable Number
MRB Modifizierte Rappaportbouillon
μm Mikrometer
MW arithmetischer Mittelwert
n Anzahl der Proben
n. a. nicht auswertbar
NaCl Natriumchlorid
o. g. oben genannt
OSV Oberflächenspatelverfahren PBS Phosphat buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion
PE Polyethylen
PET Polyethylenterephthalat
pH pondus hydrogenii
PP Polypropylen
PS Polysterol
PVC Polyvinylchlorid
PVDC Polyvinylidenchlorid ppm parts per million
rRNS ribosomale Ribonucleinsäure
spp. Subspezies
SSDC Salmonella-Shigella-Desoxycholat-Citrat-Agar
TAE Tris-Acetat-EDTA
Tab. Tabelle
Taq Thermus aquaticus
URE Urease
VD Versuchsdurchlauf
Vol.- % Volumenprozent
Y. Yersinia
Yad Yersinia adhesin
Yop Yersinia outer membrane protein Yst. Hitzestabiles Protein YVE virulent Yersinia enterocolitica
z. B. zum Beispiel
1. Einleitung
Die humane Yersiniose gehört zu den lebensmittelbedingten Infektionen und ist laut der aktuellen Statistik meldepflichtiger Erkrankungen nach der Salmonellose und Campylobacteriose die dritthäufigste durch bakterielle Erreger verursachte Enteritisform (RKI 2005). Die klinischen Erkrankungen des Menschen reichen von selbstlimitierenden Enteritiden bis hin zu schwerwiegenden Krankheitsverläufen in Form einer Septikämie oder sekundären Erscheinungen wie reaktiver Arthritis.
Schweine stellen häufig als asymptomatische Träger das Hauptreservoir für die als humanpathogenen geltenden Yersinia enterocolitica Serovare 0:3, 0:9 und 0:5,27 (FUNK et al. 2000; NEUBAUER et al. 2001). Yersinia enterocolitica kann vor allem aus Tonsillenmaterial und Kot isoliert werden (FREDRIKSSON-AHOMAA et al.
2000). Mögliche Infektionsquellen für den Menschen sind somit unter anderem über Kreuzkontaminationen belastete rohe Schweinefleischprodukte, wie z.B. Hackfleisch (TAUXE et al. 1987).
Hackfleisch wird zunehmend zentral produziert und unterliegt weiten Distributionswegen. Um auch über einen längeren Zeitraum die mikrobiologische Stabilität und Frische des Hackfleisches gewährleisten zu können, wird dieses unter modifizierten Atmosphären verpackt und gelagert. Diese sollen durch den zugeführten Kohlendioxidanteil (CO2) ein Wachstum der unerwünschten Verderbnis- flora, sowie auch evtl. vorhandener pathogener Keime, weitgehend verhindern.
Aufgrund der psychrotrophen Eigenschaften von Yersinia enterocolitica, kann in kontaminierten Lebensmitteln ein Wachstum des Erregers noch bei den für Hackfleisch vorgeschriebenen Kühltemperaturen um 2°C stattfinden (DEVLIE- GHERE et al. 2000). Verschiedene Untersuchungen deuten zusätzlich darauf hin, dass Yersinia enterocolitica gegenüber Kohlendioxid nur eine geringe Empfindlichkeit besitzt.
Im Rahmen dieser Gesamtproblematik soll die vorliegende Arbeit einen Beitrag zur Frage eines möglichen Einflusses verschiedener Kohlendioxidkonzentrationen auf
das Wachstum von Yersinia enterocolitica DSM 11502 in künstlich kontaminiertem Hackfleisch liefern. Die quantitative Bestimmung von Yersinia enterocolitica DSM 11502 wird hierbei vergleichend mit einem Oberflächenspatelverfahren sowie einem MPN-Verfahren (Most-Probable-Number) durchgeführt. Zusätzlich werden die meso- phile aerobe Gesamtkeimzahl und die Farbeigenschaften des Hackfleisches als sensorische Parameter zur Beurteilung der Produktstabilität herangezogen.
2. Schrifttum
2.1. Yersinia enterocolitica
2.1.1 Geschichte
Die Gattung Yersinia enterocolitica ist nach dem Schweizer Tropenarzt Alexandre Emile Jean Yersin (1863-1943) benannt. Während Forschungsarbeiten, die er als Angehöriger des französischen Medizinkorps durchführte, entdeckte er im Jahr 1894 in Hongkong den für die menschliche Pest verantwortlichen Erreger Yersinia pestis.
(BERCOVIER u. MOLLARET 1984). Der heute als Yersinia enterocolitica bezeichnete Erreger wurde erstmals in den USA im Jahre 1934 von MC IVER und PIKE beschrieben. Sie nannten den Erreger, den sie aus Abszessproben eines Landwirtes isoliert hatten Flavobacterium pseudomallei (BOTTONE 1997). Fünf Jahre später wurde der Erreger erneut aus klinischem Material beim Menschen isoliert, die an akuter Enteritis erkrankt waren (SCHLEIFSTEIN u. COLEMAN 1939).
Aufgrund verschiedener morphologischer Ähnlichkeiten zu den Pasteurellen sind zu dieser Zeit verschiedene Bezeichnungen wie Pasteurella X, Pasteurella Type B oder Keim X (PUTZKER et al. 2001) gebräuchlich.
Im Jahre 1944 entdeckte VAN LOGHEM grundsätzliche Unterschiede zu den Pasteurellen und führte die Bezeichnung Yersinia und die Zuordnung zur Familie der Enterobacteriaceae ein. 1964 wurde von FREDRIKSEN die Bezeichnung Yersinia enterocolyticum vorgeschlagen und 1997 wurde der Erreger endgültig in Yersinia enterocolitica umbenannt (BOTTONE 1997).
2.1.2 Systematik
Die Gattung Yersinia gehört zu der Gruppe der gramnegativen, fakultativ anaeroben, pleomorph und peritrich begeißelten Stäbchenbakterien und dort zur Familie der
Enterobacteriaceae (ALEKSIC u. BOCKEMÜHL 1990). Yersinien sind bei Temperaturen unter 30°C beweglich, da unter diesen Bedingungen Geißeln ausgebildet werden (COVER u. ABER 1989, BOCKEMÜHL 1999).
Die Gattung Yersinia unterteilt sich derzeit in 11 Spezies (nach CARNIEL 2003):
- Yersinia pestis
- Yersinia pseudotuberculosis
- Yersinia enterocolitica
- Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica - Yersinia enterocolitica ssp. palearctica
- Yersinia frederiksenii
- Yersinia intermedia
- Yersinia kristensii
- Yersinia aldovae
- Yersinia aldovae
- Yersinia molaretii
- Yersinia bercovieri
- Yersinia ruckeri
Die Spezies Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia frederiksenii, Yersinia aldovae, Yersinia rohdei, Yersinia mollaretii und Yersinia bercovieri wurden ursprünglich Yersinia enterocolitica zugeordnet und stellen inzwischen eigenständige Spezies dar.
Yersinia pestis ist der Erreger der Nagerpest und der Pest des Menschen. Die Nagerpest wird durch befallene Flöhe übertragen. Das Reservoir bilden asympto- matisch infizierte Nager welche die Krankheit, die sich durch eine septikämische Verlaufsform auszeichnet, überlebt haben (ROLLE u. MAYR 1993). Die Pest des Menschen zeigt sich in den zwei Verlaufsformen Beulenpest und Lungenpest. Sie hat in mehreren Seuchenzügen im Mittelalter Millionen Todesopfer verursacht und
wird hauptsächlich durch infizierte Nager übertragen. Endemische Herde sind bis heute in Teilen Asiens, Afrikas und Südamerikas existent.
Yersinia pseudotuberculosis (Rodentiose) befällt vor allem kleine Nager, empfänglich sind aber auch Vögel, Haustiere und Zootiere. Die Pseudotuberkulose ist eine Anthropozoonose und wird durch Nagetiere auch auf den Menschen übertragen. Das Krankheitsbild zeigt sich beim Menschen vor allem in akuten bis chronischen Gastroenteritiden bis hin zu septisch-typhösen Verlaufsformen. Vor allem das letztere Krankheitsbild stellt eine ernste Komplikation dar und verläuft in 50% der Fälle letal (DEDIÉ et al. 1993).
Modifikationen dieser Einteilung sind in der Zukunft zu erwarten, da mit der Aufschlüsselung des Genoms von Yersinia enterocolitica auch die Einführung neuer Spezies und Subspezies einhergeht (FENWICK et al. 1996; NEUBAUER et al.
2000c, 2001).
2.1.3. Biotyp
Anhand von biochemischen Merkmalen lassen sich innerhalb der Spezies Yersinia enterocolitica fünf verschiedene Biotypen unterscheiden. Ein allgemein verbindliches Schema zur Typisierung wurde von WAUTERS (1987) eingeführt (Tabelle 1).
Ursprünglich erfolgte eine Einteilung in die Gruppen 1-5, zusätzlich zum Biotyp 3 gab es jedoch aufgrund von Zuordnungsschwierigkeiten die Biotypen 3A und 3B. Diese wurden später zum Biotyp 6 zusammengefasst und der Biotyp 1 wurde in den apathogenen Typ 1A und den pathogenen Typ 1B unterteilt. (WAUTERS et al. 1987).
Für den Menschen sind die Biotypen 1A, 2, 3 und 4 pathogen.
Tab. 1: Biotypisierungsschema nach WAUTERS et al. (1987)
Reaktionen 1A 1B 2 3 4 5
Lipase + + - - - -
Aesculin + - - - - -
Salicin + - - - - -
Indol + + (+) - - -
Xylase + + + + - v
Trehalose + + + + + -
Pyrazinamidase + - - - - - ß-Glucoronidase + - - - - - Voges-Proskauer + + + + + (+)
Prolinpeptidase d - - - - - Inkubation bei 28°C, 48h
+ : positiv (+) : schwach positive Reaktion - : negativ v : variabel
2.1.4. Serotyp
Die Serotypisierung von Yersinia enterocolitica wird über verschiedene Antigene durchgeführt. Hierbei besitzen hauptsächlich O-Antigene und H-Antigene eine Bedeutung. Die Oberflächenantigene (O-Antigene) werden mit arabischen Ziffern und die Geißelantigene (H-Antigene) mit lateinischen Buchstaben bezeichnet. Frühe Schemata zur O- und H-Typisierung wurden von WAUTERS et al. (1971) entwickelt.
In diesen Schemata, die bis zu 60 O-Gruppen enthalten, sind aber sowohl Yersinia enterocolitica als auch die früher als „Yersinia enterocolitica-like“ bezeichneten Arten Yersinia intermedia, Yersinia kristensii und Yersinia frederiksenii integriert (ALEKSIC u. BOCKEMKÜHL 1990). Auf Yersinia enterocolitica sensu stricto entfallen hierbei aber nur 28 Serogruppen. 1984 wurde daher ein vereinfachtes Antigenschema eingeführt, welches nur Serovare der Spezies Yersinia enterocolitica enthält (ALEKSIC u. BOCKEMÜHL 1984). Diese Einteilung orientiert sich an der klinischen Bedeutung der verschiedenen Serovare von Yersinia enterocolitica für den Menschen.
Die Serotypisierung von O-Antigenen dient der Identifizierung pathogener Isolate.
Kreuzreaktionen mit anderen Erregern können aber nicht ausgeschlossen werden.
So wird unter anderem von Kreuzreaktionen zwischen Yersinia enterocolitica und dem Erreger der bovinen Brucellose sowie mit dem Salmonellen-Antigen O:47 berichtet (AHVONEN u. SIEVERS 1969; HURVELL 1972). Für epidemiologische oder diagnostische Zwecke ist eine genaue Abgrenzung über die H-Antigene möglich. Im Routinelabor findet die Serotypisierung heute über Agglutinationsreaktionen mittels kommerziell erhältlicher Testkits statt. In Europa sind die humanen Yersiniosen auf die Serogruppen O:3, O:9 und O:5,27 zurückzuführen. In den USA (s. Tab. 2) hingegen dominieren die als „American strains“ bezeichneten Serovare O:8, O:4,32, O:13, O:18, O:20 und O:21 (ALEKSIC u. BOCKEMÜHL 1990).
Tab. 2: O- und H-Antigene, Biovarzugehörigkeit, Herkunft und geographische Verbreitung humanpathogener Yersinia enterocolitica (ZEN-YOJI et al. 1973;
MOLLARET et al. 1979; BUTTLER 1983)
O-Antigen H-Antigen Biovar Herkunft Vorkommen
1, 2a, 3 2a, 2b, 3
a, b, c, b, c
3 5
Chinchilla Hase, Ziege Kaninchen, Affe
Europa, USA Europa
3 a, b, c a, b, c, v a, c c
4 Mensch, Schwein Hund, Katze, Ratte
Mensch, Schwein
Europa, S.afrika Kanada, Japan USA, S.amerika BRD, Norwegen 4,32 b, e, f, i 1B Mensch,
Lebensmittel
USA
5,27 a, b, c
B, c
2 oder 3
2 oder 3
Mensch, Hund, Affe, Wildtiere Milchprodukte
BRD, Niederlande
USA, Kanada, Japan, Australien Oberflächenwasser
8 b, e, f, i b, e, f, i, v
1B Mensch, Schwein Milchprodukte,
Trinkwasser
USA
Kanada, Italien, Niederlande
9 a, b
a, b, c a, b, c, v a, c
2 selten 3
Mensch, Schwein Hund, Katze Ratte
Europa Japan
13 a, b, i 1B Mensch, Affe USA 18 b, e, f, i 1B Mensch USA 20 b, e, f, i 1B Mensch, Hund USA 21 b, e, f, i 1B Mensch USA
2.1.5. Pathogenität
Nach HEESEMANN (1990) lassen sich die Pathogenitätseigenschaften von Yersinia enterocolitica auf chromosomal-kodierte und plasmid-kodierte Faktoren zurückführen.
2.1.5.1. Plasmid-kodierte Pathogenität
Ein Virulenzplasmid, dass bei allen pathogenen Yersinia Spezies zu finden ist, ist das Virulenzplasmid pYV (Plasmid for Yersinia Virulence) (GEMSKI et al. 1980).
Dieses ca. 70 Kilobasen (Kb) große Plasmid ist verantwortlich für die Produktion der
„yersinia outer proteins“ (Yops). Eine ca. 20 Kb umfassende Region auf dem pYV unterteilt sich in die vier Loci Vir A, Vir B, Vir C und Vir F wobei vor allem Vir F ein Schlüsselaktivator für die Produktion der Yops zu sein scheint. Serumresistenz, Phagozytenresistenz und die Bildung von verschiedenen Zytokinen sind die Hauptaufgaben dieser Polypeptide. Mit Hilfe des sogenannten Typ III Sekretionsapparates gelangen die Yops direkt in die Wirtszelle und können dort unspezifische Abwehrmechanismen durch den Wirt, z.B. die Phagozytose, durch Makrophagen verhindern (ROSQVIST et al. 1994)
Ein weiteres wichtiges plasmidkodiertes Protein ist ein äußeres Membranprotein, das als „Yersinia adhesin A“ oder Yad A bezeichnet wird. Dieses Adhäsin spielt bei der Kolonisierung des Darms und der Invasion in die Peyer´schen Plaques eine tragende Rolle (HEESEMANN u. GRÜTER 1987). Das fibrilläre Protein verfügt über eine Vielzahl von Zielstrukturen, so bindet es an Zelloberflächen und an extrazelluläre Matrixproteine wie Kollagen und Fibronektin (MANTEL et al. 1989; PAERREGAARD et al. 1991). Yad A ist essentiell für die Pathogenität von Yersinia enterocolitica, da es zusätzlich für die Serumresistenz des Erregers verantwortlich ist (HEESEMANN et al. 1983).
Die Expression der plasmidkodierten Pathogenitätsmerkmale und das Wachstum von Yersinia enterocolitica ist abhängig von der Temperatur und der Calciumionen- konzentration, so wird bei einer Temperatur von +37°C und der Abwesenheit von Calciumionen das Wachstum von Yersinia enterocolitica eingestellt und es kommt zu einer maximalen Expression dieser Proteine (MURIANA 2002).
2.1.5.2. Chromosomal-kodierte Pathogenität
Zusätzlich zu den plasmidkodierten Virulenzfaktoren spielen bei der Pathogenität von Yersinia enterocolitica chromosomal kodierte Eigenschaften eine wichtige Rolle (MILLER u. FALKOW 1988). Hier sind die beiden Adhäsine Inv (Invasin) und ail (attachment invasion locus) zu nennen. Inv ist ein 103 kDa großes äußeres Membranprotein (ISBERG 1989) und reagiert spezifisch mit Proteinen auf der Oberfläche von M-Zellen. Die M-Zellen sind eine spezialisierte Zellpopulation des Epithels der Peyer´schen Platten. Durch die Interaktion mit den M-Zellen wird die Transzytose der Yersinien in die Peyer´schen Plaques und dadurch die Initiierung der Infektion eingeleitet (PEPE et al. 1994). Das Inv-Gen ist bei allen Yersinia enterocolitica Stämmen zu finden die Funktionsfähigkeit und die damit verbundene Bildung der Inv-Proteine ist aber nur bei pathogenen Stämmen vorhanden. Ein weiteres Gen, das für Adhärenz und Invasivität verantwortlich ist, ist das ail-Gen (MILLER u. FALKOW, 1988). Dieses kommt nur bei pathogenen Stämmen von Yersinia enterocolitica vor und kodiert für die Synthese eines Oberflächenproteins (ail). Während ein experimentelles Ausschalten des Inv-Gens nicht zu einer Verminderung der Virulenz des Erregers führte, scheint das ail-Gen eine besondere Rolle bei der Pathogenität von Yersinia enterocolitica zu spielen. Ein typisches Merkmal einer Infektion mit Yersinia enterocolitica , der wässrige Durchfall, wird durch das yst-Gen kodierte, hitzestabile Enterotoxin Yst vermittelt (HEESEMANN 1990; GRANT 1998). Das Enterotoxin bewirkt eine Aktivierung der Guanylat-Cyclase im Darm. Die genaue Rolle des yst-Gens im Infektionsgeschehen von Yersinia enterocolitica ist jedoch noch nicht abschließend geklärt.
Yersinia enterocolitica gehört zu den ureasepositiven Bakterien, da es in der Lage ist ein auf dem chromosomalen Urease-Genkomplex (ure) kodiertes Enzym, die Urease zu bilden (DE KONINGWARD et al. 1994). Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniak und Carbamat. Dies ist mit einem Anstieg des pH-Wertes und einer Erleichterung der Magenpassage für Yersinia enterocolitica von Vorteil (DE KONINGWARD u. ROBINS-BROWNE 1995). Eine Untersuchung von GRIPPEN-
BERG-LERCHE et al. (2000) zeigt die besondere Rolle des Urease-Gens (ure).
Nach einer oralen Infektion mit urease-negativen Yersinia enterocolitica-Mutanten war eine deutliche Abnahme der Virulenz des Erregers zu beobachten. Einen Überblick über die plasmid- und chromosomalkodierten Pathogenitätsfaktoren von Yersinia enterocolitica gibt die Tabelle 3.
Tab. 3: Pathogenitätsfaktoren von Yersinia enterocolitica (nach BOTTONE 1997) Lokalisation Pathogenitätsfaktor Exprimiert bei
37 °C ≤25 °C
Struktur der LPSx kurzkettig langkettig Kolonieform rau glatt zelluläre Morphologie pleomorph kokkoid
Adhärenz an
Phagozyten schwach stark
Anwesenheit von
Geißeln (Motilität) nein ja
Chromosom
Invasin (inv) gering stark Hydrophobizität der
Zelloberflächen ja nein
Calziumabhängigkeit
des Wachstums ja nein
Resistenz gegen
Serumbakterizide ja nein
Resistenz gegen
Phagozytose ja nein
Plasmid
Resistenz gegen
intrazelluläre Abtötung ja nein
x) LPS: Lipopolysaccharide
2.2. Lebensmittelhygienische Bedeutung von Yersinia enterocolitica
2.2.1. Vorkommen bei Schlachtkörpern vom Schwein
Die Schweineschlachtung ist ein offener Prozess, der mit vielen Risiken der Kontamination der Schlachtkörper mit potentiell pathogenen Bakterien verbunden ist (REUTER, 1986; REUTER, 1994). Die Technik der Eviszeration und die Einhaltung der guten Hygienepraxis während des Schlachtvorganges und den weiteren Untersuchungs- und Verarbeitungsschritten scheinen dabei vor allem für die Kontamination der Schlachtkörper mit Yersinia enterocolitica eine übergeordnete Rolle zu spielen. ANDERSEN (1988) untersuchte die Präsenz von pathogenen Yersinia enterocolitica auf der Oberfläche von Schweineschlachtkörpern (n= 1458).
Bei der Eviszeration der Tierkörper kamen zwei Techniken zum Einsatz, eine manuelle und eine automatische Eviszerationsmethode. Die manuelle Technik führte zu hohen Kontaminationsraten von bis zu 26,3 % Yersinia enterocolitica auf der Oberfläche der Schlachtkörper. Mit der automatischen Eviszerationsmethode hingegen waren nur Kontaminationsraten von bis zu 2,2 % feststellbar. Zu ähnlichen Ergebnissen kommen auch NESBAKKEN et al. (1994). Die Autoren konnten nachweisen, dass bei einer Umhüllung des Rektums mit einem Plastikbeutel während der Eviszeration, die Nachweisrate von Yersinia enterocolitica auf dem Schlachtkörper signifikant niedriger war als ohne diese Methode. Mit der Umhüllung des Rektums waren nur 0,8 % der untersuchten Tiere Yersinia enterocolitica auf der Oberfläche des Schlachtkörpers nachzuweisen, ohne die Umhüllung hingegen 10 %.
NESBAKKEN (1988) konnte aus dem Rachenraum von frisch geschlachteten Schweinen 83,3 % (n= 30) Yersinia enterocolitica isolieren. An den Schnittflächen der Schlachtkörper konnte der Autor noch 63,3 % Yersinia enterocolitic nachweisen, wobei die kraniale Inzision die häufigste (46,7 %), die circumanale Inzision die niedrigste (26,7 %) Nachweishäufigkeit ergab. SHIOZAWA et al. (1991) isolierten bei 85 % von 40 untersuchten Schweinen mittels Rachentupfer pathogene Yersinia enterocolitica O:3. FREDRIKSSON-AHOMAA et al. (2000) untersuchten in einer Studie an neun Schlachthöfen in Finnland das Vorkommen von pathogenen Yersinia
enterocolitica DSM 11502 in Tonsillen vom Schwein. Die Autoren konnten in Abhängigkeit von der Untersuchungsmethode (PCR und mikrobiologische Verfahren) im Mittel bei 37 % der untersuchten Tiere Yersinia enterocolitica isolieren.
FREDRIKSSON-AHOMAA et al. (1999) untersuchten die Kontaminationshäufigkeit von Schweineschlachtkörpern, den Geschlingen sowie Arbeitsgeräten in einem Schlachthof mit pathogenen Yersinia enterocolitica. In der Studie konnte die besondere Bedeutung der Tonsillen als Kontaminationsrisiko für die Schlachtkörper herausgestellt werden. Auch BÜLTE et al. (1991) konnten im Rahmen einer umfangreichen Literaturstudie die besondere Bedeutung der Tonsillen als Kontaminationsquelle für pathogene Yersinia enterocolitica eindeutig belegen.
Die Untersuchungen zeigen, dass der Darm und insbesondere die Tonsillen ein erhebliches Kontaminationsrisiko für den Schlachtkörper darstellen. Insofern ist auch die während der Schlachttieruntersuchung durch amtliches Personal durch- zuführende Inzision der Kopflymphknoten (Lnn. mandibularis) kritisch zu betrachten (BÜLTE et al. 1991; NESBAKKEN et al. 2002). Forderungen nach einem Absetzten der Köpfe in toto und einer separaten Weiterverarbeitung scheinen aber nach BÜLTE et al. (1991) nicht sinnvoll, da dadurch ein neues problembeladenes Produktfeld geschaffen würde. Vielmehr ist nach Ansicht der Autoren eine vorschriftsmäßige Herangehensweise durch sachkundige Untersucher sinnvoller, um eine Kontamina- tionsgefahr durch Yersinia enterocolitica zu unterbinden.
2.2.2. Vorkommen in Fleisch und Fleischerzeugnissen vom Schwein
Der Zusammenhang zwischen dem Verzehr von Schweinefleisch und der Infektion mit humanpathogenen Yersinia enterocolitica führte zu weit reichenden Untersuchungen über das Vorkommen dieser pathogenen Keimspezies in Lebensmitteln insbesondere vom Schwein. Die Tabelle 4 gibt einen Überblick über Untersuchungen zum Vorkommen von pathogenen Yersinia enterocolitica in Schweinefleisch und Hackfleisch vom Schwein. Im Gegensatz zu den relativ hohen
Nachweisraten aus den Tonsillen oder dem Darm von Schlachtschweinen kann Yersinia enterocolitica nur relativ selten in Lebensmitteln nachgewiesen werden. Der Grund für die geringen Nachweisraten in Lebensmitteln liegt nach Ansicht von FREDRIKSSON-AHOMAA u. KORKEALA (2003) an unzureichenden Unter- suchungsmethoden älterer Studien. So konnten in verschiedenen Arbeiten, in denen mikrobiologische mit molekularbiologischen Methoden verglichen wurden, mit den PCR-Methoden wesentlich höhere Nachweisraten von Yersinia enterocolitica aus Lebensmitten erzielt werden (NOWAK et al. 2006). VISHNUBHATLA et al. (2001) isolierten mit einer PCR-Methode 47 % Yersinia enterocolitica aus Schweinehack- fleisch, mit dem kulturellen Nachweis nur 32 %. Zu noch deutlicheren Unterschieden kommen FREDROKSSON-AHOMAA et al. 1999). Sie untersuchten ebenfalls Schweinehackfleisch und konnten mit der kulturellen Methode lediglich in 1,6 % der Proben Yersinia enterocolitica nachweisen, mit der PCR-Methode in 24,7 % (n=255). Diese Ergebnisse lassen sich mit einer Untersuchung von BOYAPALLE et al. (2001) vergleichen. In künstlich kontaminiertem Schweinehackfleisch konnten die Autoren mit der kulturellen Methode in keiner der untersuchten Proben (n=350) Yersinia enterocolitica nachweisen. Die molekularbiologische Methode erbrachte hingegen eine Nachweisrate von 38%. Allerdings muss bei der Interpretation der PCR-Ergebnisse beachtet werden, dass hier auch nicht lebensfähige Yersinia enterocolitica detektiert werden. Die Untersuchungen zeigen aber, dass in älteren Studien eine Unterschätzung des Vorkommens von Yersinia enterocolitica in Schweinefleisch aufgrund unzureichender Methoden unvermeidbar war und somit kritisch betrachtet werden müssen. Die aufgezeigten Studien geben Hinweise, dass Produkte vom Schwein wesentlich häufiger mit Yersinia enterocolitica kontaminiert sein könnten, als bisher angenommen wurde.
Tab. 4 Untersuchungen zum Nachweis von Yersinia enterocolitica in Schweine- fleisch
Probenart Anzahl der Proben
Pathogene. Y.
enterocolitica Isolate
Anteil
(%) Literatur Land
Schweinefleisch 91 2 2% SCHIEMANN
(1980) Kanada Schweinefleisch 110 0 0% NESBAKKEN et al.
(1985) Norwegen Schweinefleisch 267 6 2% CHRISTENSEN
(1987) Dänemark Schweinefleisch 50 0 0% IBRAHIM u. McRAE
(1991) Australien Schweinefleisch 48 2 4 % KARIB u. SEEGER
(1994) Marokko Schweinefleisch 263 0 0 % DE BOER
(1995) Niederlande Schweinefleisch 1278 37 3 % FUKUSHIMA et al.
(1997) Japan Schweinefleisch 300 6 2 % JOHANNESSEN et
al. (2000) Norwegen Hackfleisch 12 1 8 % NESBAKKEN et al.
(1985) Norwegen Hackfleisch 157 75 0 % KLEINLEIN et al.
(1989) Schweiz Hackfleisch 400 4 1 % DE BOER u.
NOUWS (1991) Niederlande Hackfleisch 195 0 0 % STEFANOV u.
BOZHKOVA (1998) Bulgarien
Hackfleisch 255 4 1,6 %
FREDRIKSSON- AHOMAA et al.
(1999)
Finnland
Hackfleisch 100 32 32 % VISHNUBATHLA et
al. (2000) USA
2.3. Epidemiologie und Krankheitsbild der humanen Yersiniose
Im Gegensatz zu den gut untersuchten klinischen Erscheinungen der Yersiniose beim Menschen, sind detaillierte epidemiologische Daten zum Vorkommen der humanen Yersiniose in der Europäischen Union nur unzureichend vorhanden.
(NEUBAUER u. SPRAGUE 2003). Die Gründe hiefür liegen nach Ansicht der Autoren vor allem darin begründet, dass die Yersiniose in vielen Ländern der EU keine meldepflichtige Erkrankung darstellte. Nach dem Europäischen Trendbericht über den Verlauf und den Quellen von Zoonoseerregern (2004) wurden von 10 Mitgliedsstaaten (und Norwegen) im Jahr 2003 insgesamt 9399 Fälle von humaner Yersiniose gemeldet. In Deutschland (mit Ausnahme der früheren DDR) ist die Yersiniose erst seit dem Jahr 2000 im Infektionsschutzgesetz verankert, der direkte und der indirekte Erregernachweis beim Menschen muss, sobald er in einem Zusammenhang mit einer akuten Infektion steht, nach §7 IfSG gemeldet werden.
Laut der aktuellen Jahresstatistik meldepflichtiger Krankheiten des Robert-Koch- Institutes wurden in Deutschland im Jahr 2005 insgesamt 5624 Yersiniosefälle gemeldet (RKI 2006). Nach der Salmonellose und der Campylobacteriose ist die Yersiniose damit die dritthäufigste Enteritisform bakteriellen Ursprungs. In der DDR wurde bereits im Jahr 1978 eine Yersiniosemeldepflicht eingeführt. In einem Zeitraum von 12 Jahren von 1978 bis 1989 wurden fast 30.000 Yersinia enterocolitica Isolierungen gemeldet, was einem Anteil von 13 % an allen gemeldeten Darminfektionen entspricht.
Yersinia enterocolitica ist weltweit verbreitet, vor allem aber in den gemäßigten bis subtropischen Klimazonen Europas, Nordamerikas, Australiens und Südafrikas, in den tropischen Regionen Afrikas und Asiens ist der Erreger hingegen nicht nachzuweisen. Die dominierenden Stämme in den genannten Regionen sind den Serogruppen O:3 und O:5,27 zugehörig, zusätzlich sind in Europa, Nordamerika und Japan Stämme der Serogruppe O:9 nachweisbar (ALEKSIK u. BOCKEMÜHL 1990).
In den USA war über lange Zeit das Serovar O:8 vorherrschend, dieses wird aber
zunehmend zugunsten des auch in Europa dominierenden Serotyps O:3 verdrängt (BOTTONE et al. 1997).
Die minimale Infektionsdosis von Yersinia enterocolitica ist nicht bekannt. (BORCH et.al. 1996). Die Übertragung von Mensch zu Mensch ist grundsätzlich möglich, so berichten LEE et al. (1991) von Yersinia enterocolitica Erkrankungen bei Kindern, die sich durch den Kontakt mit ebenfalls an Yersiniose erkranktem Pflegepersonal infizierten. Eine sehr gefährliche Infektionsroute ist die indirekte Übertragung von Mensch zu Mensch durch kontaminierte Blutkonserven, aus der sich in den meisten Fällen septikämische Verlaufsformen entwickeln, die letal enden können (JACOBS et al. 1989; ABER 1990). Hier kommen die psychrotrophen Eigenschaften von Yersinia enterocolitica zum Tragen, da sich der Erreger auch bei sachgemäßer Kühllagerung der Blutkonserven vermehren kann (NESBAKKEN 1992).
Das Krankheitsbild des Menschen ist abhängig von dem Infektionsweg, so sind bei der Yersiniose grundsätzlich eine orale und eine parenterale Infektion bekannt, wobei der oral-alimentären die größte Bedeutung beizumessen ist. Hierfür sprechen der häufige Erregernachweis aus dem Stuhl betroffener Patienten und der Sitz des Primärinfektes in der Darmschleimhaut (DEDIÉ et al. 1993). Die klinischen Erscheinungen der Yersiniose des Menschen können in drei verschiedene Verlaufsformen eingeteilt werden: eine enterale Verlaufsform, eine immunpathologische Verlausform und septische Verläufe mit extraabdominellen Organmanifestationen.
Der oral-alimentäre Infektionsweg hat in der Regel eine enterale Verlaufsform zur Folge, deren Verlauf aber von dem Alter des Erkrankten abhängig ist (HOOGKAMP- KONSTANJE u. DE KONING 1990; PUTZKER et al. 2001). Die Enteritis ist das Hauptsymptom der Yersinia enterocolitica-Infektion. Als Anfangssymptome zeigen sich Fieber, Bauchschmerzen und Diarrhoe, auch Erbrechen kann hinzukommen (DEDIÉ et al. 1993). In den meisten Fällen verläuft die Erkrankung selbstlimitierend (HEIN u. KNAUFF 1978; TAUXE et al. 1987). Gelegentlich kann auch eine terminale
Ileitis mit einhergehender mesenterialer Lymphadenitis auftreten, man spricht in diesem Fall von einer pseudoappendizitischen Verlaufsform. Diese Form der Erkrankung wird in der Regel durch Yersinia pseudotuberculosis hervorgerufen. Vor allem bei heranwachsenden Kindern und Jugendlichen lassen sich diese Symptome aber auch bei Infektionen mit Yersinia enterocolitica beobachten. (AHVONEN 1972, BOTTONE 1999).
Die immunpathologische Verlaufsform kann als Folgeerscheinung der überstandenen enteralen Infektionen in Erscheinung treten und den Charakter einer eigenständigen Erkrankung annehmen (DEDIÉ et al. 1993). Als Komplikationen sind hier vor allem die reaktive Arthritis sowie das häufig bei Frauen vorkommende Erythema nodosum zu nennen (NAKTIN u. BEAVIS 1999; PUTZKER et al. 2001).
Die septische Verlaufsform führt zu multiplen Organabszessen, Vaskulitis mit hohem Fieber und Gewichtsverlust sowie Hepatitis und Splenomegalie (HOOGKAMP- KONSTANJE 1987; MERCIE et al. 1996). Die septische Verlaufsform hat eine hohe Letalitätsrate, als prädisponierende Faktoren sind unter anderem Immundefiziens, Eisenüberladung sowie Unterernährung und Alkoholismus bekannt (BOELAERT et al. 1987; BOTTONE 1997).
2.4. Zusammenhang zwischen humaner und porziner Infektion
Schweine stellen, häufig als asymptomatische Träger, das Hauptreservoir für die als humanpathogen geltenden Yersinia enterocolitica Serovare 0:3, 0:9 und 0:5,27 dar (DOYLE et al. 1981; NESBAKKEN 1985; FUNK et al. 2000; NEUBAUER et al. 2001).
NESBAKKEN et al. (1987) konnten in Virulenzplasmiden von humanen und porcinen Yersinia enterocolitica Isolaten gleiche Restriktionsmuster bestimmen.
Restriktionsanalysen der chromosomalen DNS dieser Stämme unterstützen die Vermutung der Autoren, dass das Schwein ein wichtiges Erregerreservoir für humane Yersiniosen darstellt. FREDRIKSSON-AHOMAA et al. (2001) untersuchten
die Ursprünge und Übertragungswege von sporadischen Yersinia enterocolitica- Infektionen in Finnland. In der Untersuchung wurden 212 humane Yersinia enterocolitica Stämme mit denen von Schlachtkörpern und Schweinefleisch auf der Einzelhandelsebene verglichen. Die Autoren fanden heraus, dass 71 % der humanen Stämme sich nicht von den porcinen Stämmen unterschieden. Der Verzehr von rohem oder nur unzureichend erhitztem Schweinefleisch wird daher von vielen Autoren als Ursache für sporadische Yersinia enterocolitica-Infektionen gesehen (TAUXE et al. 1987; OSTROFF et al. 1994, FREDRIKSON-AHOMAA et al. 2001). In Belgien konnte in den achtziger Jahren im Rahmen einer Fallstudie ein Zusammenhang zwischen dem Verzehr von rohem Schweinefleisch und der Infektion mit Yersinia enterocolitica belegt werden (TAUXE et al. 1987). Als Ursache für das Auftreten von klinischen Yersiniosen wurde die Verwendung von Kopffleisch bei der Hackfleischzubereitung herausgestellt. Über kontaminiertes Tonsillenmaterial war so ein Eintrag von pathogenen Yersinia enterocolitica in das Hackfleisch möglich. Belgien hatte zu dieser Zeit die höchste Inzidenzrate für Yersiniosen des Menschen. Durch gezielte Aufklärungsmaßnahmen durch die Medien sowie Veränderungen im Herstellungsprozess konnte die Inzidenz der humanen Yersiniosefälle in den folgenden zehn Jahren zwischen 1986 und 1996 um die Hälfte gesenkt werden (VERHAEGEN et al. 1998). SAMADI et al. (1982) sehen in dem geringen Vorkommen von Yersinia enterocolitica Infektionen des Menschen in muslimischen Ländern ebenfalls einen indirekten Hinweis auf die wichtige Rolle von Schweinefleisch als Überträger dieser Infektion, da in diesen Ländern kein Schweinefleisch verzehrt wird. Einen Zusammenhang zwischen dem Verzehr von Schweinefleisch und der Infektion mit Yersinia enterocolitica konnten auch OSTROFF et al. (1994) belegen. Sie untersuchten im Rahmen einer prospektiven Fallstudie 76 Patienten, die an Yersiniose erkrankt waren und zeigten auf, dass die an der Yersinia enterocolitica Infektion erkrankten Patienten im Vergleich zu einer Kontrollgruppe in den zwei Wochen vor der Erkrankung signifikant mehr Schweinefleischprodukte verzehrt hatten. Darüber hinaus gaben die Mitglieder der Patientengruppe im Gegensatz zu denen der Kontrollgruppe an, roh zubereitetes oder nur leicht angebratenes Schweinefleisch zu bevorzugen. Im Jahre 2002 konnte
in den USA ein Zusammenhang zwischen der Herstellung von „Chitterlings“, einer speziellen Zubereitung aus dem Dünndarm von Schweinen und der Yersinia enterocolitica Infektion bei Säuglingen und Kleinkindern hergestellt werden (Anonym 2003). Die Erregerübertragung erfolgte aufgrund mangelnder Hygiene während der Herstellung und der nachfolgenden Kontamination der Säuglingsflasche.
2.5. Epidemiologie und Krankheitsbild der porzinen Yersiniose
Nachweise von Yersinia enterocolitica können in der unbelebten als auch in der belebten Natur geführt werden. So ist der Erreger in Gemüse und Trinkwasser nachgewiesen worden, aber auch Oberflächenwasser und das Erdreich können mit Yersinia enterocolitica kontaminiert sein (MOLLARET et al. 1979; KAPPERUD 1981). Besonders aber in belebten Habitaten ist die Verbreitung und das Wirtsspektrum von Yersinia enterocolitica hoch. Das Wirtsspektrum umfasst sowohl kaltblütige Tiere wie Reptilien, aber auch Fische und Schalentiere können Träger des Bakteriums sein. Obwohl der Erreger bei vielen Nutztierarten, unter anderem Rinder, kleine Wiederkäuer, Pferden und Nutzgeflügel nachgewiesen werden konnte, soll hier vor allem auf das Schwein als häufig asymptomatischen Träger von Yersinia enterocolitica eingegangen werden.
In der Literatur wird das Schwein häufig als Hauptreservoir von Yersinia enterocolitica O:3, O:9 und O:5,27 beschrieben (BOTTONE 1997). Dennoch gilt die Yersiniose beim Schwein im Vergleich zu der Yersiniose des Menschen als kaum untersucht (NEUBAUER et al. 2001). ANDERSEN et al. (1984) ermittelten in den Jahren 1982 und 1983 das Vorkommen von Yersinia enterocolitica in 99 dänischen Schweinebeständen. Sie konnten in 82 % der untersuchten Herden und in insgesamt 25 % der getesteten Schweine den Erreger nachweisen. SKJERVE et al. (1998) untersuchten konventionelle Schweinemastbetriebe in Norwegen und konnten in 63,4 % aller untersuchten Herden (n= 287) mit einem ELISA-Test seropositive Schweine identifizieren. GURTLER et al. (2005) konnten in deutschen
Schweinemastbeständen eine Yersinia enterocolitica Prävalenz von bis zu 65,4 % aufzeigen.
Die Yersiniose tritt beim Schwein vor allem bei Jungtieren in einer klinisch apparenten Form auf. Ältere Tiere gelten in der Regel als asymptomatische Träger des Keims (NEUBAUER et al. 2001). TZIPORI et al. (1987) infizierten experimentell Ferkel und konnten daraufhin Enteritiden oder Enterocolitiden mit einhergehender Anorexie und Diarrhoe vereinzelt auch mit Todesfällen beobachten. Ein häufiger Befund bei asymptomatischen Trägertieren nach Feldinfektionen sind Entzündungen der Tonsillen mit makroskopisch sichtbaren Mikroabszessen. Über den Einfluss dieser persistenten Infektionen beim Schwein auf mögliche immunsuppressive Effekte oder die Zunahme der Körpermasse während der Mast liegen aber keine Informationen vor (NEUBAUER et al. 2001)
Die Erregerübetragung erfolgt nach DEDIÉ et al. (1993) vor allem über Kot und die durch Kot kontaminierte Umgebung im Stall, aber auch in evtl. vorhandenen Ausläufen durch Oberflächenwasser. Gründe für feststellbare regionale Unterschiede in der Inzidenz von Yersinia enterocolitica liegen nach VARNHAM und EVANS (1991) vor allem an unterschiedlichen hygienischen Standards der einzelnen Betriebe. In Dänemark konnte ein drastisches Ansteigen der Nachweisraten für Yersinia enterocolitica in Schweinepopulationen auf offene Herdenmanagement- systeme zurückgeführt werden. Hier waren zugekaufte Ferkel in den meisten Fällen die Ursache für eine schnelle Durchseuchung des Betriebes (CHRISTENSEN 1980).
2.6. Nachweismethoden für Yersinia enterocolitica
2.6.1. Mikrobiologische Verfahren
In Deutschland ist seit 2005 eine amtliche Methode nach § 64 LFGB für den Nachweis von Yersinia enterocolitica aus Lebensmitteln festgeschrieben. Grundlage
für diese Methode ist das schon früher in Europa etablierte Verfahren nach ISO 10273 (DRAFT INTERNATIONAL STANDARD 1993).
2.6.1.1 Voranreicherung
Der Nachweis von Yersinia enterocolitica aus Lebensmitteln setzt in der Regel spezielle Anreicherungsverfahren voraus, denn häufig sind Lebensmittelproben mit einer hohen Hintergrundflora belastet, die es zu minimieren gilt. Es stehen hierzu verschiedene nichtselektive, wenig selektive und selektive Anreicherungsmedien zur Verfügung. Diese dienen dem Zweck, den Zielkeim von relativ niedrigen Ausgangskeimgehalten in dem Lebensmittel auf ein nachweisbares Niveau anzuheben und/oder die unerwünschte Hintergrundflora zu unterdrücken und so den Nachweis zu erleichtern (DEDIÉ et al. 1993). Bei den nichtselektiven Anreicherungsverfahren sind vor allem die phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Brain-Heart-Infusion (BHI) oder Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon (CASO) zu nennen.
Bei dem Kälteanreicherungsverfahren macht man sich die psychrotrophen Eigenschaften von Yersinia enterocolitica zunutze (SCHIEMANN 1989). Hierbei wird eine nichtselektive phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit dem Untersuchungs- material beimpft und bei +4°C für 14 bis 21 Tage bebrütet. Stämme von Yersinia enterocolitica können sich im Gegensatz zu der Hintergrundflora bei diesen Temperaturen besser vermehren und so den anschließenden Nachweis mit Selektivnährböden ermöglichen. Dieses Vorgehen findet vor allem bei klinischem Material Anwendung, hat sich aber für den Nachweis aus Lebensmitteln als weniger geeignet erwiesen (Bucher 2001). Da dieses Verfahren sehr zeitaufwendig ist, wurden verschiedene Selektivnährmedien entwickelt, die einen Nachweis auch bei höheren Bebrütungstemperaturen zulassen. Hier sind vor allem die Irgasan- Ticarcillin-Novobiocin-Bouillon (ITC) und die modifizierte Rappaport Bouillon (MRB) zu nennen, die durch eine geeignete Supplementierung das Wachstum der
unerwünschten Begleitflora weitgehend unterdrücken. Das modifizierte Rappaportmedium stellt eine Weiterentwicklung des in der Salmonellen-Diagnostik gebräuchlichen Rappaportmediums dar (WAUTERS 1973). Eine von AULISIO et al.
(1980) vorgeschlagene Methode beinhaltet einen KOH –Behandlungsschritt. Hierbei wird die Anreicherungskultur vor dem Ausstrich auf den festen Selektivnährboden für etwa 20 Sekunden mit einer 0,5%igen Kalilauge vermischt. Stämme von Yersinia enterocolitica zeigen sich gegenüber diesem Behandlungsschritt weniger empfindlich als die Begleitflora, die unterdrückt werden soll. Dennoch ist diese Untersuchungsmethode nur als ein zusätzliches Verfahren zu verstehen, da das Risiko einer deutlichen Reduzierung der Yersinia enterocolitica Keimzahl hoch ist.
2.6.1.2. Isolierung auf festen Nährmedien
Die ersten festen Nährböden zur Isolierung von Yersinia enterocolitica leiteten sich von den gängigen Selektivnährböden für die Enterobacteriaceae-Diagnostik ab. Zur Anwendung kam hier unter anderem der MacConkey-Agar, der Salmonella-Shigella- Agar oder Desoxycholat-Citrat Agar (DE BOER 1992). Hier ist aber in der Regel keine Unterscheidung zwischen Yersinia spp. und anderen Enterobacteriaceae möglich. Aus diesem Grund wurden verschiedene Selektivnährböden entwickelt, die einen gezielten Nachweis von Yersinia spp. aus verschiedenen Substraten ermöglichen (VARNHAM u. EVANS 1991). Für einen gezielten Nachweis von Stämmen des Biotyp 1 von Yersinia enterocolitica eignet sich eine modifizierte Rezeptur des MacConkey-Agars, der zu diesem Zweck mit Tween 80 supplementiert wird. Für andere Biotypen von Yersinia enterocolitica ist dieser Agar weniger geeignet (DE BOER u. SELDAM 1987). Eine Weiterentwicklung des Salmonella- Shigella-Agars stellt der SSDC-Agar (Salmonella-Shigella-Desoxycholat-Agar) dar.
Stämme von Yersinia enterocolitica zeigen eine Resistenz gegen Desoxycholat, wodurch der spezifische Nachweis dieses Keims erleichtert wird.
Einer der gebräuchlichsten Selektivnährböden für die Isolierung von Yersinia spp.
aus klinischem Material und Lebensmitteln ist der von Schiemann entwickelte CIN- Agar (Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin-Agar) (SCHIEMANN 1979; SIERRA et al.
1996). Ausführliche Supplementstudien zeigten, dass Yersinia spp. gute Wachstums- eigenschaften bei Anwesenheit der oben genannten Zusätze besitzt und andererseits die Begleitflora wie z.B. die meisten Enterobacteriaceae unterdrückt wird. Andererseits fördert eine hochwertige Nährstoffbasis zusammen mit Pyruvat das Wachstum der Yersinien. Diese bauen das vorhandene Mannit unter Säure- bildung ab, so dass ihre Kolonien eine rote Farbe infolge des Farbumschlags des Indikators Neutralrot annehmen. Kolonien von Yersinia enterocolitica zeigen eine typische Koloniemorphologie mit einem dunkelrotem Zentrum und einer schmalen, transparenten Hämolysezone. Jedoch können Stämme von Aeromonas spp., Citrobacter spp. und Enterobacter agglomerans eine ähnliche Koloniemorphologie wie Yersinia enterocolitica auf dem CIN-Agar zeigen.
2.6.1.3. Biochemische und serologische Identifizierung
Zur Identifizierung verdächtiger Kolonien werden diese zunächst auf einen nichtselektiven Agar, beispielsweise Standard-I-Agar, überimpft und bei +25 °C für 24 Stunden inkubiert. Soll anschließend ein Plasmidnachweis durchgeführt werden, empfiehlt sich nach SCHIEMANN und WAUTERS (1992) diese Vorgehensweise, um das Risiko eines Plasmidverlustes zu minimieren. Für eine erste Orientierung eignen sich der Oxidasenachweis, das Wachstum auf Kligler-Eisen-Zweizucker-Agar und der Ureasenachweis auf Urea-Agar. Bei entsprechendem Reaktionsausfall stehen mehrere standardisierte Testsysteme zur Identifizierung von Yersinia enterocolitica zur Verfügung. Der Api 20E bietet nach einer Studie von NEUBAUER et al. (1998) eine sehr gute Möglichkeit, Yersinia enterocolitica zu identifizieren. In der Studie konnten 95 % der Yersinia enterocolitica positiven Proben korrekt bestimmt werden.
Die Biotypisierung, die ein wichtiges Kriterium zur Unterscheidung von Stämmen innerhalb der Spezies Yersinia enterocolitica darstellt, kann mit dem in Kapitel 2.1.3.
beschriebenem Biotypisierungsschema nach WAUTERS et al. (1987) erfolgen. Die in Europa vorkommenden, für den Menschen pathogenen Stämme gehören in der Regel den Biotypen 2, 3 oder 4 an. Für die eindeutige Identifizierung von Yersinia enterocolitica innerhalb der Serovarsubtypen eignen sich kommerziell erhältliche spezifische Antiserentests, die mittels Objektträgeragglutination durchgeführt werden.
2.6.1.4. Pathogenitätstests
Die Untersuchung von Pathogenitätsfaktoren von Yersinia enterocolitica umfasst sowohl plasmid- als auch chromosomalkodierte Eigenschaften. Diese können im Rahmen der bakteriologischen Untersuchung mittels verschiedener biochemischer Reaktionen festgestellt werden, nach ZINK et al. (1980) und SCHIEMANN (1989) sollte aber der mögliche Plasmidverlust infolge der Kultivierungsschritte beachtet werden. Einige dieser Untersuchungen sind auch im Routinelabor mit relativ geringem Aufwand durchführbar. Für die Untersuchung von Virulenzplasmid- tragenden Isolaten eignet sich die Autagglutination im Voges-Proskauer-Medium, zum Nachweis des Adhäsinfaktors yadA (LAIRD u. CAVANAUGH 1980;
SCHIEMANN u. DEVENISH 1982). Weitere plasmidvermittelte Reaktionen sind calciumabhängiges Wachstum bei 37°C (GEMSKI et al.1980) sowie die Bindung der Farbstoffe Kongorot und Kristallviolett bei ebenfalls 37°C (PRPIC et al. 1983;
BHADURI et al. 1987; NATTERMANN 1992).
Einige chromosomale Faktoren, die eine Unterscheidung zwischen pathogenen und apathogenen Isolaten erlauben, sind Bestandteil der schon für die Biotypisierung durchgeführten Reaktionen nach WAUTERS et al. (1987). Der Pathogenitäts- nachweis mittels Pyrazinamidaseaktivität, Salicinfermentation und Äskulinhydrolyse ist nach Ansicht von CHIESA et al. (1993) geeignet, pathogene und apathogene
Isolate zu unterscheiden. Pathogene Stämme von Yersinia enterocolitica sind pyrazinamidasenegativ, die Äskulinhydrolyse bei +25°C ist negativ, ebenso wie die Salicinfermentation bei + 35°C (FARMER et al. 1992; BOTTONE 1997).
2.6.2. Molekularbiologische Nachweismethoden
Molekularbiologische Methoden bieten bei der Diagnostik von Yersinia enterocolitica viele Vorteile, so können sie durch den gezielten Nachweis plasmidkodierter Gene den Pathogenitätsnachweis durch biochemische Methoden ersetzen. Gleichzeitig stellt es eine sehr effiziente und hoch spezifische Methode für den Nachweis von Yersinia enterocolitica aus z.B. Lebensmittelproben dar (NEUBAUER et al. 2000b;
VISHNUBATLA et al. 2000; BHADURI 2002). Verschiedene Vergleichsstudien belegen die Vorteile gegenüber mikrobiologischen Methoden (NESBAKKEN et al.
1991; LAMBERTZ et al. 1996; BOYAPALLE et al. 2001).
Grundsätzlich sind bei Yersinia enterocolitica verschiedene Genorte bekannt, die sich sowohl für die Identifizierung und Unterscheidung gegenüber anderen pathogenen Keimen als auch für den direkten Pathogenitätsnachweis eignen. Es kommen hierfür sowohl chromosomale als auch plasmidiäre Zielsequenzen in Betracht. Als chromosomale Genorte für einen Nachweis von pathogenen Yersinia enterocolitica kommen das ail-Gen (attachment invasion locus), das inv-Gen (Invasin) und das yst-Gen (Yersinia enterocolitica heat-stable enterotoxin) in Betracht. Das ail-Gen ist spezifisch für pathogene Stämme von Yersinia enterocolitica (KWAGA et al. 1992), das inv-Gen kommt in allen Yersinia enterocolitica Stämmen vor und ist deshalb nur in Kombination mit Nachweisen anderer Genregionen geeignet. Der Nachweis von plasmidiären Gensequenzen sollte immer in Kombination mit chromosomalen Genorten stattfinden, um die Gefahr falsch negativer Ergebnisse durch einen Plasmidverlust zu reduzieren. Als plasmidiäre Zielsequenzen eignen sich der VirF (virulence faktor) und vor allem der YadA (Yersinia adhesin A) Nachweis. VirF erfasst nicht alle pathogenen Stämme von
Yersinia enterocolitica (NEUBAUER et al. 2001a), zusätzlich ist eine Unterscheidung zwischen Yersinia pestis und Yersinia enterocolitica nicht möglich (WREN u.
TABAQCHALI 1990; NAKAJIMA et al. 1991). Eine Übersicht über sinnvolle Genorte und auch Kombinationen von Zielsequenzen in der PCR gibt die Tabelle 5.
Tab. 5: Übersicht über sinnvolle Zielsequenzen und Zielgenkombinationen zur Identifizierung und Pathogenitätsprüfung Yersinia enterocolitica
PCR-Methode Zielgen Diagnostischer
Nutzen Autor
yopT Nachweis
pathogener Stämme
ARNOLD et al.
(2001)
yadA Nachweis
pathogener Stämme
KAPPERUD et al.
(1993)
virF Nachweis
pathogener Stämme
WREN und TABAQCHALI
(1990)
invA Nachweis
pathogener Stämme
RASMUSSEN et al.
(1994) yst Nachweis Yersinia
enterocolitica
DURISIN et al.
(1998) Einfache PCR
ail Nachweis
pathogener Stämme
FENWICK u.
MURRAY (1991);
JOURDAN et al.
(2000)
virF + ail Nachweis pathogener Stämme
NAKAJIMA et al.
(1991); NILSSON et al. (1998) virF + ail+ yst Nachweis
pathogener Stämme
HARNETT et al.
(1996) Multiplex-PCR
yadA + 16S-rRNS Nachweis
pathogener Stämme LANTZ et al. (1998)
2.7. Hackfleisch als Risikolebensmittel für Yersinia enterocolitica
2.7.1. Rechtliche Grundlagen
Die Verordnung (EG) Nr. 853/20 vom 29. April 2004 (Anhang 1 Begriffs- bestimmungen Nr. 1.15) definiert den Begriff Hackfleisch, als entbeintes Fleisch, das durch Hacken zerkleinert wurde und weniger als 1% Salz enthält. Im Rahmen des neuen EU-Lebensmittelrechts entfallen mit dem Inkrafttreten der VO 853/20 die bisherige Fleischhygieneverordnung und die Hackfleischverordnung und damit auch die Aufteilung von zugelassenen und registrierten Betrieben. Lebensmittelunter- nehmen, für die spezifische Vorschriften im Anhang der VO 853/20 festgelegt sind, wie dies bei der Herstellung von Hackfleisch der Fall ist, unterliegen damit generell einer Zulassungspflicht. Der Anhang der VO 853/20 enthält somit detaillierte Hygienevorschriften der Herstellungsbedingungen für die fleischverarbeitenden Betriebe, die dem bisher geltenden Spezialrecht für die einzelnen Bereiche entsprechen.
Mikrobiologische Kriterien für das Produkt Hackfleisch sind in der VO (EG) Nr.
2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel festgelegt. Für ein mikrobiologisches Kriterium nach dieser Verordnung sollen über den Zahlenwert beim Nachweis eines bestimmten Erregers in einem Lebensmittel hinaus noch weitere Informationen verfügbar sein. Unter anderem sind dies Angaben über die einzusetzenden Analyseverfahren einschließlich deren Messungenauigkeit, die Stufe in der Lebensmittelkette, auf die sich das Kriterium bezieht, sowie Maßnahmen, die zu treffen sind, wenn das Kriterium nicht erfüllt wird (HEESCHEN 2006).
Der Begriff Prozesshygienekriterium ist im Sinne dieser Verordnung ein Kriterium, das die akzeptable Funktionsweise des Herstellungsprozesses angibt. Dieses Kriterium gilt nicht für im Handel befindliche Erzeugnisse. Vielmehr sollen hierüber Richtwerte für die Kontamination festgelegt werden, bei dessen Überschreitung Korrekturmaßnahmen notwendig sind. Ein Lebensmittelsicherheitskriterium ist im
Gegensatz dazu ein Kriterium, mit dem die Akzeptabilität eines Erzeugnisses oder einer Partie Lebensmittel festgelegt wird. Dieses gilt für im Handel befindliche Erzeugnisse. Die Tabelle 6 zeigt die mikrobiologischen Kriterien nach der VO (EG) Nr. 2073/2005 Anhang 1 Kap. 1 u. 2) für das Produkt Hackfleisch.
Tab. 6 Mikrobiologische Kriterien für Hackfleisch gemäß der VO (EG) Nr. 2073/2005 Probennahme-
plan
Grenzwert Kriterium Lebensmittel-
kategorie
Mikroorga- nismen
n c m M
Referenz- methode
Aerobe mesophile Keimzahl
5 2 5x105
KBE/g
5x106 KBE/g
ISO 4833 Prozess-
Hygiene- kriterium
Hackfleisch/
Faschiertes
E. coli 5 2 50
KBE/g
500 KBE/g
ISO 16649 Hackfleisch
Bestimmung:
Rohverzehr
Salmonella 5 0 In 25 g nicht nachweisbar
EN/ISO 6579 LM-
Sicher- heitskrit-
erium Hackfleisch Bestimmung:
Verzehr nach Durcherhitzen
Salmonella 5 0 In 10 g nicht EN/ISO nachweisbar
n = Anzahl der Probeneinheiten der Stichprobe
6579
c = Anzahl der Probeneinheiten, deren Werte über m oder zwischen m und M liegen dürfen m = Richtwert
M = Grenzwert
2.7.2. Mikrobiologie von Hackfleisch
Ein großer Teil der in Hackfleisch vorkommenden Verderbniserreger aber auch vieler pathogener Keime gehört zu der Gruppe der psychrotrophen mesophilen Mikroorganismen (GILL u. NEWTON 1978; REUTER 1990). Psychotrophe, mesophile Bakterien sind dadurch charakterisiert, dass sie zwar ein Temperaturoptimum von 20 – 30 °C aufweisen, sich aber auch noch bei Tempe-
raturen bis zu -5 °C vermehren können ((ICMSF 1980; FEHLHABER u. JANET- SCHKE 1992; KRÄMER 1997). Die aerobe, mesophile Gesamtkeimzahl bei frischem Hackfleisch vom Schwein setzt sich vor allem aus Pseudomonaden, Brochotrix thermosphacta, Enterobakteriazeen und Milchsäurebakterien zusammen (LOUWERS et al. 1997; HILDEBRAND et al. 2001).
Bei der Hackfleischherstellung sind verschiedene Besonderheiten zu beachten, da aufgrund der erheblichen Oberflächenvergrößerung des Fleisches während der Herstellung, die Kontaminationsgefahr durch die Umgebung, das Personal und Arbeitsgeräte besonders hoch ist. Zusätzlich ist bei der Produktion von Hackfleisch die mikrobiologische Qualität des Ausgangsmaterials von besonderer Bedeutung (KLEIN u. LOUWERS 1994; EISEL et al. 1997; REUTER 1999; HILDEBRAND et al.
2001). Grundsätzlich lassen sich für die Vermehrung von Mikroorganismen verschiedene Einflussfaktoren herausstellen (NYCHAS u. DROSINOS 2000). Die intrinsinc factors stellen hierbei die Eigenschaften des Substrates selber dar, z.B. das Nährstoffangebot, den Zerkleinerungsgrad des Fleisches, den pH-Wert oder natürliche Barrieren. Aufgrund der starken Zerkleinerung der Rohmaterialien bei der Herstellung besitzt Hackfleisch gegenüber dem Rohmaterial Fleisch eine erheblich vergrößerte Oberfläche. Zudem sind natürliche strukturelle Barrieren wie Faszien, die eine bakterielle Besiedlung in der Tiefe der Muskulatur behindern, nicht mehr vorhanden (SCHALCH et al. 1996). Der pH-Wert von Hackfleisch liegt in einem Bereich von 5,6 bis 6,3 und der aw-Wert bei ca. 0,98, so dass die Summe der Faktoren das Produkt Hackfleisch zu einem idealen Nährboden für Mikrooganismen machen. (REUTER 1999).
Die extrinsic factors beschreiben die äußeren Einflüsse, die das Bakterienwachstum und damit die Haltbarkeit eines Produktes beeinflussen, wie die Lagerungs- temperatur oder die Zusammensetzung der Gasatmosphäre bei der Verwendung von modifizierten Atmosphären. Die Temperatur ist dabei als der wichtigste Einzelfaktor für das Wachstum von Mikroorganismen bei der Lagerung von Frischfleisch anzusehen (JACKSON et al. 1997). Die Kühllagerung stellt ein produktschonendes
und hygienisch sicheres Verfahren der Haltbarmachung dar (SINELL 1989; BEM u.
HECHELMANN 1994). Durch die Herabsetzung der Lagerungstemperatur unter das Temperaturoptimum der Fleischflora wird deren Generationszeit und die lag-Phase erhöht. Dieser Effekt wirkt sich bei den für Hackfleisch vorgeschriebenen Lagerungstemperaturen aber vor allem auf das mesophile Keimspektrum aus. Die psychrotrophen Anteile der Mikroflora, zu denen auch pathogene Bakterien wie Yersinia enterocolitica gehören können, sind bei einer Kühllagerung dann die dominierenden Bakterienspezies. (JACKSON et al. 1997; REUTER 1999).
Mit der Anwendung von modifizierten Atmosphären im Rahmen der Verpackung und Lagerung von Hackfleisch verändert sich auch die Mikroflora des Fleisches. Bei der aeroben Lagerung von Frischfleisch, aber auch bei den für Hackfleisch handels- üblichen Kohlendioxid-Sauerstoff-Gemischen, sind vor allem psychotrophe Pseudo- monaden die dominierende Keimspezies. Sie sind auch, neben anderen Lipolyten wie Aeromonaden und Enterobacteriaceae, für den lipolytischen Abbau der Fette verantwortlich (ABD EL-RHMAN et al 1998; HEESCHEN 1999). Bei einer anaeroben Lagerung von Frischfleisch unter Vakuum oder unter Kohlendioxid-Stickstoff- Gemischen hingegen dominieren Milchsäurebakterien, insbesondere Lactobacillus curvatus und Lactobacillus sakei, zusätzlich kommen Brochotrix thermosphacta, Pediokokken und Enterokokken vor (REUTER 1999; NYCHAS u. DROSINOS 2000).
Das Vorkommen speziell von Yersinia enterocolitica als pathogener, psychrotropher Keim in Frisch- und Hackfleisch vom Schwein ist in Kapitel 1.9.2 beschrieben.
2.7.3. Farbe
Die Farbe eines unter Schutzatmosphäre verpackten Frischfleischproduktes wird maßgeblich durch die gewählte Verpackungsform bestimmt. Insbesondere die Volumenverhältnisse des eingesetzten Sauerstoffs und Kohlendioxides spielen hierbei eine Rolle. Da in den eigenen Untersuchungen der Einfluss der modifizierten Atmosphären auch auf die Farbeigenschaften des Fleisches untersucht werden soll,
