Diskussion von Material und Methode

5.1.1. Probenmaterial

Das Hackfleisch der beiden Versuchsdurchläufe VD1 und VD2 wurde im Technikum des Institutes für Lebensmittelqualität und –sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover hergestellt. Die chemischen Analysenwerte des Hackfleisches entsprachen den Vorgaben der Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse (2.507.2.2). Die Zusammensetzung des Hackfleisches genügte damit den handelsüblichen Anforderungen an dieses Produkt. Für die Dotierungsversuche sollte das Hackfleisch zudem eine möglichst geringe Ausgangskeimbelastung besitzen. Daher wurde das verwendete Fleisch vor der Zerkleinerung an der Oberfläche abgeflammt. Um einen definierten Fettgehalt des hergestellten Hackfleisches in den beiden Versuchsdurchgängen zu gewährleisten wurde ausschließlich fett- und bindegwebearmes Material aus dem Hinterschinken vom Schwein verwendet. Der hinzugefügte Fettanteil des Hackfleisches entstammte unbehandeltem Rückenspeck vom Schwein, der vor der weiteren Verarbeitung ebenfalls an der Oberfläche abgeflammt wurde.

Hackfleisch vom Schwein konnte in verschiedenen Untersuchungen als mögliches Risikolebensmittel für eine Kontamination mit humanpathogenen Yersinia enterocolitica identifiziert werden (FREDRIKSSON-AHOMAA et al. 1999; JOHANN-ESSEN et al. 2000). Insbesondere wurde der pathogene Bioserotyp Yersinia enterocolitica 4/O:3 häufig aus Frisch- und Hackfleischproben isoliert (FREDRIKS-SON-AHOMAA u. KORKEALA 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Produkt Schweinehackfleisch als Grundlage für die Dotierung mit pathogenen Yersinia enterocolitica DSM 11502 verwendet. Zudem beinhaltet das Hackfleisch als Substrat für die zugeführten Mikroorganismen keine weiteren mikrobiologischen Hürden wie dies etwa bei anderen Produkten, z.B zubereitetem Hackfleisch

(Thüringer Mett) der Fall ist. Dadurch konnte weitgehend gewährleistet werden, dass außer den Parametern modifizierte Atmosphäre, mesophile aerobe Gesamtkeimzahl als kompetetive Hintergrundflora und Lagerungstemperatur keine zusätzlichen Einflussgrößen auf den Dotierungsstamm während des Untersuchungszeitraums einwirkten.

5.1.2. Eingesetzter Yersinia enterocolitica Stamm

Der für die Beimpfung des Hackfleisches verwendete Yersinia enterocolitica DSM 11502 Stamm entstammte der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ Nr. 11502, S. ALECSIC, Hygiene Institut, Hamburg; H 5823/96) Der Stamm wurde aus klinischem Untersuchungsmaterial in Deutschland isoliert und als Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica Biovar4/Serovar O:3 typisiert. Yersinia enterocolitica Stämme, die mit humanen Erkrankungsfällen in Verbindung gebracht werden, gehören am häufigsten diesem Bioserotyp an (EUROPÄISCHE UNION, 2002).

5.1.3. Methoden

5.1.3.1. Dotierung des Hackfleisches

Die initiale Keimzahl von Yersinia enterocolitica DSM 11502 betrug in dem ersten Versuchsdurchlauf lg 4,3 KbE/g und in dem zweiten Versuchsdurchlauf lg 2,7 KbE/g Hackfleisch. Repräsentative Untersuchungen zu Keimzahlen von Yersinia enterocolitica in natürlich kontaminiertem Hackfleisch liegen bislang nicht vor. Auch gibt es kaum gesicherte Erkenntnisse über die minimale Infektionsdosis dieses Bakteriums für den Menschen. SZITA et al. (1973) geben als Infektionsdosis um eine Yersinia enterocolitica induzierte Enteriitis auszulösen, 10⁹ Bakterien an. KLEINLEIN und UNTERMANN (1989) schließen daraus, dass bei einer Aufnahme von 100 g

Hackfleisch, dieses mit einer Keimmenge von 10⁷ Yersinia enterocolitica belastet sein muss. Die Autoren geben aber weiterhin an, dass die zu erwartenden Keimzahlen von Yersinia enterocolitica in natürlich kontaminiertem Fleisch wesentlich geringer sind. Auch dürfte bei immunsupprimierten Personen oder Kindern eine niedrigere minimale Infektionsdosis unterstellt werden. In der hier vorliegenden Untersuchung wurden daher in den beiden Versuchdurchläufen Keim-zahlen von etwa lg 4 KbE/g Yersinia enterocolitica DSM 11502 (VD1) bzw. lg 2 KbE/g Yersinia enterocolitica DSM 11502 (VD2) bei der Dotierung des Hackfleisches gewählt, um diesem Aspekt gerecht zu werden.

5.1.3.2. Verpackung und Lagerung der Proben

Die Lagerung von Frischfleisch unter modifizierten Atmosphären stellt ein weit verbreitetes Instrument zur Verbesserung verschiedener Produkteigenschaften des Lebensmittels dar. Insbesondere die Erhaltung der mikrobiologischen Stabilität und damit die Aufrechterhaltung positiver sensorischer Eigenschaften des Lebensmittels über einen längeren Zeitraum sind die Hauptgründe für den Einsatz der MAP Technologie (THIPPAREDDI u. PHEBUS 2003). Den Verpackungsmaterialien kommt dabei eine besondere Bedeutung zu, denn die Konstanz der Gasvolumina in der Verpackungsatmosphäre über den Lagerungszeitraum ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Wirksamkeit dieser Technologie. Als Verpackungsmaterial kam daher eine handelsübliche Polypropylenschale (PP) zum Einsatz. Als Oberfolie wurde ein PET-Material mit einer zusätzlichen Sauerstoffsperrschicht aus PVDC ausgewählt. Die Verpackung der Proben erfolgte mittels einer halbautomatischen Schalenversiegelungsanlage (Fa. Sealpac GmbH, Oldenburg). Diese ist besonders für kleinere Produktionseinheiten und für Versuchszwecke in Laboratorien geeignet.

Durch die Verwendung dieser Anlage in Kombination mit den handelsüblichen Verpackungsmaterialien konnte so eine praxisübliche Verpackung des Hackfleisches mit modifizierten Atmosphären gewährleistet werden.

In dem ersten Versuchsdurchlauf (VD1) wurde das Hackfleisch in 5 Chargen aufgeteilt, die jeweils unter einer anderen modifizierten Atmosphäre verpackt und gelagert wurden. Der Kohlendioxidanteil wurde dabei von 0 % bis auf 100

Vol.-% CO2 erhöht, das Restvolumen bildete jeweils Sauerstoff (O2). Die Charge C2 (30 Vol.-% CO2 / 70 Vol.-% O2) kann dabei als handelsübliche Verpackungsvariante angesehen werden. Die Abstufungen in den CO2 Konzentrationen sollten der Ermittlung des optimalen Mischungsverhältnisses der eingesetzten Schutzgase im Hinblick möglicher Effekte auf das Wachstumsverhalten von Yersinia enterocolitica DSM 11502 als auch auf sensorische Eigenschaften wie der mesophilen Gesamtkeimzahl und den Farbeigenschaften des Hackfleisches dienen.

In dem zweiten Versuchsdurchlauf wurden zwei Chargen mit 30 Vol.-% CO2 (C6) und 100 Vol.-% CO2 (C7) gebildet, das Restvolumen bildete wie im ersten Versuchsdurchlauf Sauerstoff (O2). Dadurch sollte die 100 Vol.-% CO2 Charge, die sich in dem ersten Versuchsdurchlauf als effektivste Schutzatmosphäre hinsichtlich der Entwicklung der mesophilen aeroben Gesamtkeimzahl des Hackfleisches herausgestellt hat, nochmals mit der handelsüblichen Verpackungsvariante verglichen werden. Der Unterschied in dem Versuchsaufbau zwischen den beiden Versuchsdurchläufen bestand aber vor allem in einer Erniedrigung der initialen Yersinia enterocolitica DSM 11502 Keimzahl bei der Beimpfung des Hackfleisches um 1,6 Logstufen von lg 4,3 KbE/g auf lg 2,7 KbE/g gegenüber dem ersten Versuchsdurchlauf. Hierdurch sollten mögliche Einflüsse einer deutlichen Verringerung der initialen Yersinia enterocolitica DSM 11502 Keimbelastung des Hackfleisches auf das Wachstumsverhalten während der Lagerung aufgezeigt werden.

5.1.3.3. Oberflächenspatelverfahren

Das Oberflächenspatelverfahren stellt ein in der mikrobiologischen Untersuchung von Lebensmitteln übliches Verfahren zur Ermittlung der Keimzahl dar. In den

vorliegenden Untersuchungen wurde bei der Erfassung der Kolonie-bildenden Einheiten (KbE/g) von Yersinia enterocolitica DSM 11502 in einem definierten Volumen Untersuchungsmaterial der CIN-Agar nach Schiemann (SCHIEMANN 1979) verwendet. Der Vorteil der Verwendung von CIN Agar liegt in den darin enthaltenen Supplementen Cefsulodin, Irgasan und Novobiocin, die ein Wachstum der unerwünschten Begleitflora weitgehend hemmen. Andererseits fördert eine hochwertige Nährstoffbasis zusammen mit Pyruvat das Wachstum der Yersinien.

Diese bauen das vorhandene Mannit unter Säurebildung ab, so dass ihre Kolonien infolge des Farbumschlags des Indikators Neutralrot eine rote Farbe annehmen.

Kolonien von Yersinia enterocolitica erscheinen dabei dunkelrot und zeigen eine typische Kuhaugenmorphologie, da sie von einem transparenten Hof umgeben sind.

Vergleichende Untersuchungen konnten zeigen, dass für die Isolierung von Yersinia enterocolitica aus Lebensmitteln der CIN Agar besonders geeignet ist (DE BOER u.

SELDAM 1987).

5.1.3.4. MPN-Verfahren

Der MPN-Methode als quantitativem Nachweisverfahren wird eine optimale Anwachsrate der Keime zugeschrieben (HILDEBRANDT u. SCHOTT 2001). In der vorliegenden Untersuchung kam daher das MPN-Verfahren als zusätzliche Methode zur Ermittlung der Keimzahl von Yersinia enterocolitica DSM 11502 in dem Probenmaterial zur Anwendung. Dieses Vorgehen lag zum einen darin begründet, dass insbesondere im zweiten Versuchsdurchlauf das Hackfleisch nur mit einer geringen Keimzahl Yersinia enterocolitica DSM 11502 dotiert wurde. Zum anderen war eine deutliche Verringerung der initialen Keimzahl von Yersinia enterocolitica DSM 11502 in den verschiedenen Chargen während des Lagerungszeitraumes nicht auszuschließen. Um auch eventuelle kleinste Keimmengen in dem Hackfleisch erfassen zu können, wurde das MPN-Verfahren in die Untersuchungen integriert, da es im Vergleich zum Oberflächenspatelverfahren eine niedrigere Nachweisgrenze besitzt (HILDEBRANDT u. ARNDT 1982; HILDEBRANDT u. SCHOTT 2001).

5.1.3.5. L*a*b*-Farbmessung

Die Farbe eines Frischfleischproduktes stellt für den Verbraucher ein kaufentscheidendes Kriterium dar (BECKER et al. 2000). Insbesondere die Höhe der eingesetzten Sauerstoffkonzentration in der modifizierten Atmosphäre hat hierbei maßgeblichen Einfluss auf die Farbstabilität des verpackten Fleisches (PENNEY u.

BELL 1993; PHILLIPS 1996; MARTINEZ et al. 2005). Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Schutzatmosphären variierten in ihrem Sauerstoffanteil zwischen 0 und 100 Vol.-% O2. Um die Auswirkungen dieser unterschiedlichen Sauerstoffpartial-drücke auf die Farbe des Hackfleisches zu berücksichtigen wurde die Farbstabilität des Fleisches während der gesamten Lagerungsdauer an den Tagen 0, 1, 4, 8 und 12 untersucht.