3. Untersuchungstiere, Material und Methoden
3.1 Prüfung verschiedener Methoden zum Nachweis von Yersinia enterocolitica Bevor die Untersuchungen der einzelnen Haltungsformen in Bezug auf die
Anwesenheit von Yersinia enterocolitica durchgeführt werden konnten, musste ein geeignetes Nachweisverfahren gewählt werden. Es gibt für Yersinia enterocolitica kein amtliches Nachweisprotokoll nach dem Beispiel eines § 35 Lebensmittel- und Bedarfgegenständegesetzes. Aus diesem Grund fanden Vorversuche zum Vergleich unterschiedlicher kultureller Nachweisverfahren untereinander und mit einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (MPCR) statt. Durch diese Vorversuchen sollte festgestellt werden mit welchen Untersuchungsmethoden sich Yersinia enterocolitica am sichersten nachweisen läßt. Dabei war es erst einmal unerheblich, ob es sich bei den detektierten Yersinia enterocolitica um humanpathogene Stämme handelte oder nicht. So wurde in den Vorversuchen bei den mikrobiologischen Methoden auf einen Pathogenitätstest der nachgewiesenen Yersinia enterocolitica verzichtet. Bei dem molekularbiologischen Untersuchungsverfahren (MPCR) war auf Grund der Primerauswahl jeder Nachweis von Yersinia enterocolitica auf humanpathogene Yersinia enterocolitica zurückzuführen.
3.1.1 Untersuchungstiere
Für die Voruntersuchungen wurden Proben von Mastschweinen gezogen, die in einem Betrieb im südlichen Niedersachsen geschlachtet wurden. Die Herkunft der einzelnen Tiere wurde nicht näher berücksichtigt. Der Schlachtbetrieb hat eine Schlachtkapazität von etwa 1000 Schweinen pro Woche und ist mit einem Fließbandschlachtsystem ausgestattet. Er besitzt eine Zulassung als EU-Schlachtbetrieb.
3.1.2 Material
Bei insgesamt 60 Schweinen wurden an drei festgelegten Lokalisationen jeweils die Mandeln (Tonsillen, n1), der Blinddarminhalt (Zäkum, n2) und eine Gruppe von Lymphknoten mit regionalem Einzugsgebiet aus Hüft- und Blinddarm (Nodi lymphatici ileocolici, n3) als Untersuchungsproben parallel im laufenden Schlachtprozess gewonnen (ntotal = 180). Abbildung 4 zeigt die Lokalisationen der Probenentnahme am Schlachttierkörper und am Darmkonvolut.
Die Tonsillen (n1 = 60) wurden mit einem Besteck aus Pinzette und Schere unmittelbar nach dem Spalten des Schlachttierkörpers in Hälften ausgelöst und jede Probe in einen eigenen sterilen und gekennzeichneten Plastikbeutel (Stomacher
Lab System, Modell 400 Bags, Fa. Seward Medical London, UK) verbracht. Das Instrumentarium wurde direkt vor jeder Berührung mit der nächsten Tierkörperhälfte in 96 % igen Alkohol getaucht und abgeflammt.
Der Blinddarminhalt (n2 = 60) wurde zunächst mit einem Teil des Darmes entnommen. Hierfür wurde der Magen-Darm-Trakt des Tieres an der Organrutsche abgefangen, ein etwa 15 cm langes Stück Darm mit Ligaturen verschlossen und an den Abbindungen mittels Scherenschlags abgetrennt. Jedes Blinddarmstück wurde in einen eigenen sterilen und beschrifteten Kunststoffbeutel gegeben.
Die Ileozäkallymphknoten (n3 = 60) wurden mit dem sie umgebenden Fettgewebe am Darmkonvolut im Schlachtbetrieb abgetrennt und in einem für jedes Tier eigenen, sterilen und gekennzeichneten Plastikbeutel verpackt.
Alle entnommenen Proben wurden unmittelbar nach ihrer Entnahme bei 4 °C gelagert und in das Labor des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Tierärztlichen Hochschule Hannover gebracht. Spätestes nach zwei Stunden wurden sie einer weiteren Behandlung unterzogen. Das Probenmaterial wurde so gewonnen und aufgeteilt, dass die mikrobiolgischen Verfahren und die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion mit gleichem Untersuchungsgut durchgeführt werden konnten.
Abb. 4: Lokalisationen der Untersuchungsproben am Tierkörper und Darmkonvolut (modifiziert nach RIEVEL [1957] und BAUM u. GRAU [1938])
3.1.3 Methoden
3.1.3.1 Mikrobiologische Verfahrensschritte
Es wurden sechs kulturelle Methoden zum Nachweis von Yersinia enterocolitica herangezogen. Sie umfassten unter anderem das Untersuchungsprotokoll nach Internationalem Standard ISO 10273 (DRAFT INTERNATIONAL STANDARD 1993).
Es wurde lediglich auf den in ISO 10273 aufgeführt Pathogenitätsnachweis aus oben genannten Gründen verzichtet.
Methode 1 (M1): Voranreicherung in Yersinia-Selektivanreicherungsbouillon nach OSSMER und Selektivanreicherung auf Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin-Nährboden (CIN) nach SCHIEMANN
Methode 2 (M2): Voranreicherung in Yersinia-Selektivanreicherungsbouillon nach OSSMER und Selektivanreicherung auf Salmonella-Shigella-Desoxycholat-Citrat-Agar nach WAUTERS (SSDC-Agar)
Methode 3 (M3): Voranreicherung mit Irgasan-Ticarcillin-Chlorat-Nährbouillon (ITC) und Selektivanreicherung auf SSDC-Agar
Methode 4 (M4): Voranreicherung in Pepton-Sorbit-Gallensalz-Bouillon (PSB), Laugenbehandlung und Selektivanreicherung auf CIN-Agar
Methode 5 (M5): Voranreicherung in Pepton-Sorbit-Gallensalz-Bouillon (PSB) und Selektivanreicherung auf CIN-Agar
Methode 6 (M6): Voranreicherung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 °C über 7, 14 und 21 Tage und Selektivanreicherung auf
CIN-Agar
Das Vorgehen gliederte sich bei der kulturellen Methodik in eine Voranreicherung, eine Selektivanreicherung und eine biochemische Untersuchung verdächtiger Kolonien. Die Abbildung 5 gibt zusammenfassend für die einzelnen Arbeitsschritte eine Übersicht.
Die Voranreicherungsmedien wurden vor der Probenzugabe zu je 100 ml in 300 ml Erlenmeyerkolben verbracht. Als Verschluss diente Aluminiumfolie. Die Kolben mit dem Voranreicherungsmedium wurden anschließend für 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Eine Ausnahme stellte die phosphatgepufferte Salzlösung PBS
(phosphat-buffered saline) für die Kälteanreicherung dar, die zehn Minuten bei 115 °C entkeimt wurde.
Die Aufarbeitung der Proben im Laboratorium sah unabhängig von den gewählten weiteren Untersuchungsmethoden so aus, dass bei den Tonsillen 10 g in 100 ml der verschiedenen Voranreicherungen in einen Stomacherbeutel mit Einsatz (Stomacher Lab System, Modell 400 Bags, filter bags, Fa. Seward Medical London, UK) gegeben und für 120 Sekunden auf der höchsten Stufe mittels eines Stomacherapparates (Stomacher 400 Laboratory Blender, Fa. Seward Medical London, UK) durchmengt wurden. Der Darminhalt wurde mit einem sterilen Tupfer aus den entnommenen Darmteilen (Abstrichbesteck, steril, 12 x 160 mm, Fa.
Technolab, Herne) gewonnen und daraufhin in 100 ml Anreicherungslösung verbracht. Die Ileozäkallymphknoten wurden unter sterilen Kautelen aus dem sie umgebenden Fettgewebe gelöst und 10 g lymphatisches Gewebe in 100 ml Anreicherung gegeben. Es folgte, wie bei den Mandeln, eine Homogenisierung durch einen Stomacherapparat. Als Werkzeuge dienten auch hier eine Pinzette und eine Schere, die unmittelbar vor jedem Gebrauch mit 96 % igen Alkohol benetzt und dann in die Flamme eines Bunsenbrenners gehalten wurden. Lediglich bei Methode M3 wurde nur 1 g statt 10 g Probenmaterial in die Voranreicherung gegeben.
Die sechs herangezogenen Nachweisverfahren (M1 bis M6) unterschieden sich im Einzelnen wie folgt:
Bei M1 schloss sich an die eintägige Voranreicherung mit Selektivanreicherungsbouillon nach OSSMER bei 30 °C (Fa. Merck, Darmstadt) eine Überimpfung von Material auf Cefsulodin-Irgasan-Novobicin-Nährboden nach SCHIEMANN (CIN-Agar, Fa. Merck, Darmstadt) an. Das CIN-Selektivmedium bestand generell aus einer Basis- und einer Supplementkomponente und wurde bei allen unterschiedlichen Methoden gleich angesetzt. Die Basiskomponente wurde 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert, auf etwa 50 °C abgekühlt, das Supplement (Fa.
Merck, Darmstadt), bestehend aus den Antibiotikabestandteilen (Cefsulodin, Irgasan, Novobiocin), destilliertem Wasser und Ethanol, zugefügt und in Petrischalen gegeben. Das Ausstreichen wurde mit Hilfe einer vor jedem Gebrauch abgeflammten Drahtöse bei allen methodischen Ansätzen vollzogen.
Bei M2 unterschied sich das Vorgehen gegenüber M1 nur dadurch, dass anstatt CIN-Agar Salmonella-Shigella-Desoxycholat-Agar nach WAUTERS (SSDC-Agar, Fa.
Merck, Darmstadt) verwendet wurde. Das SSDC-Selektivmedium wurde keiner Hitzebehandlung unterzogen.
Bei M3, die aus einer Vorstufe aus Irgasan-Ticarcillin-Chlorat-Selektivanreicherungsbouillon nach WAUTERS (ITC, Fa. Merck, Darmstadt) und einer Selektivanreicherung mit SSDC-Selektivmedium bestand, wurde nur 1 g Probe zu 100 ml Bouillon gegeben. Von ITC fand die Übertragung von Flüssigkeit auf Agar nach zwei Tagen der Inkubation bei 25 °C statt. Das beimpfte SSDC-Medium wurde zwei Tage bei 30 °C bebrütet. Ein Untersuchungsschritt mit CIN-Medium wurde nicht durchgeführt.
Bei M4 wurde das Untersuchungsmaterial zwei Tage bei 25 °C durch einen Magnetrührer in Pepton-Sorbit-Gallensalz-Bouillon (PSB, Fa. Merck, Darmstadt) in Bewegung gehalten. Hier schloss sich ein begleitkeimreduzierender Schritt an.
Dieser Schritt beinhaltete, dass 0,5 ml aus der beimpften PSB-Anreicherung in 4,5 ml Kalilauge (KOH) eingemischt wurde. Nach 20 Sekunden folgte dann die Übertragung aus der Kalilauge auf das CIN-Medium. Der CIN-Agar wurde einen Tag bei 30 °C inkubiert.
Bei M5 wurde das Untersuchungsgut zwei Tage bei 25 °C durch einen Magnetrührer in Pepton-Sorbit-Gallensalz-Bouillon (PSB, Fa. Merck, Darmstadt) in Bewegung gehalten und dann direkt auf CIN-Medium ausgebracht. Das CIN-Medium wurde für einen Tag bei 30 °C bebrütet.
Bei M6 handelte es sich um die Kälteanreicherung bei 4 °C in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, Fa. Merck, Darmstadt). Es folgte jeweils nach 7, 14 und 21 Tagen ein Ausstrich von jeder Probe auf CIN-Medium. Der CIN-Agar wurde anschließend einen Tag bei 30 °C inkubiert.
Inkubation
Kligler-Agar 1 Tag bei 35 °C Ureasetest 1 Tag bei 28 °C Vordifferenzierung
Abb. 5: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei den unterschiedlichen kulturellen Nachweisverfahren für Yersinia enterocolitica
Verdächtige Bakterienanhäufungen haben auf CIN-Nährboden nach einem Tag ein rotes Zentrum und einen durchsichtigen Rand gebildet, sie wachsen in einem Durchmesser von 2 bis 4 mm (SCHIEMANN 1979). Die vermutlich Yersinia enterocolitica beherbergenden Konglomerate auf SSDC-Agar stellten sich nach zweitägigem Bebrüten unter 10-facher Vergrößerung als nicht scharfkantig, nicht irisierend und mit fein granuliertem Zentrum dar (WAUTERS 1973).
Der Standard-II-Agar wurde nach einer Sterilisation bei 121 °C für 15 Minuten mit einer Temperatur von etwa 50 °C auf Petrischalen verteilt. Zur Sicherstellung von Reinkolonien wurden vom CIN-Agar nach einem und vom SSDC-Medium nach zwei Tagen verdächtige Kolonien auf ihn überimpft und einen Tag bei 30 °C inkubiert.
Anschließend wurden die vermutlichen Yersinia enterocolitica Kolonien einer Vordifferenzierung unterzogen, um andere Keime, zum Beispiel Eschericha spp. und Hafnia spp., weitestgehend von Yersinia spp. zu trennen.
Als Vordifferenzierungstest wurde Kligler-Agar herangezogen. Er wurde 15 Minuten bei 121 °C autoklaviert und als Schrägagar in Reagenzgläser zum Erkalten gebracht.
Zu untersuchende Kolonien wurden auf ihn übertragen, indem sie mit einer Öse vom Standard-II-Agar abgenommen und tief in das Kligler-Medium eingebracht wurden.
Ein mäanderförmiges Ausstreichen auf der Oberfläche schloss sich an. Bei Yersinia spp. kommt es im Stichkanal mit Glukose zu einer typischen Säure- und auf der Oberfläche zu einer Alkalibildung. Angezeigt wird dies durch eine Gelbfärbung des Stichkanals bzw. durch eine rote Farbreaktion auf der Oberfläche. Eine Gas- oder H2S-Bildung kommt bei Yersinia spp. nicht vor.
Die zweite Reaktion, die zur Vordifferenzierung zur Anwendung kam, war der Urease-Nachweis. Das Harnstoffmedium wurde ebenfalls in Kulturröhrchen als Schrägagar angesetzt. Er bestand aus einem Basis- und einem Supplementanteil.
Nur das Grundmedium wurde zur Sterilisation einer Hitzebehandlung (15 Minuten bei 121 °C) unterzogen, und nach dem es auf eine Temperatur von etwa 50 °C abgekühlt war, ist eine 40 % ige Harnstofflösung zugegeben worden. Bei der Beimpfung des Nährbodens wurden verdächtige Kolonien auf der Oberfläche ausgestrichen. Eine positive Reaktion wurde angezeigt durch einen Farbumschlag von gelb nach rot. Diese war dann der Fall, wenn durch Urease Harnstoff zu Kohlendioxid und Ammoniak hydrolysiert wurde. Yersinia spp. rufen eine Rotfärbung
hervor und sind damit Urease-positiv. Eine Ausnahme bilden Yersinia pestis und Yersinia ruckeri.
Hatte sich bei den Vordifferenzierungen der Verdacht auf die Anwesenheit von Yersinia spp. erhärtet, wurden die betreffenden Kolonien in einem API 10 S weiter biochemisch untersucht, um Yersinia enterocolitica sicher nachzuweisen. Beim API 10 S von bioMérieux (Fa. bioMérieux SA, Marcy-l´Etoile, Frankreich) handelt es sich um ein gebrauchsfertiges Testsystem, bei dem bis zu 12 biochemische Reaktionen parallel überprüft werden können. Die Ergebnisse werden anhand eines Ableseschlüssels, in dem die Resultate der Einzelreaktionen eingetragen werden und eines computergestützten Auswertungsprogramms ausgewertet. Eine Einteilung der detektierten Yersinia enterocolitica in pathogene und apathogene Stämme ist nicht möglich.
3.1.3.2 Molekularbiologische Verfahrensschritte
Beim molekularbiologischen Verfahren, der Untersuchung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von Yersinia spp., war ebenfalls eine Voranreicherung der Untersuchungsproben nötig. Gewählt wurde die Anreicherung nach OSSMER. Es schloss sich eine Aufarbeitung des Probenmaterials durch die Cetyltrimethylammoniumbromid-Methode (CTAB-Methode) an, dann folgte die eigentliche PCR (ZHANG u. WEINER 2000). Das Ergebnis wurde mit einer Gelelektrophorese visualisiert.
Die Probenaufarbeitung für die Voranreicherung nach OSSMER und auch die Voranreicherung selbst fand wie bei den beschriebenen mikrobiologischen Verfahren statt (Kapitel 3.1.3.1).
Die Isolierung von genomischer DNS erfolgte in Anlehnung an die Extraktion nach der CTAB-Methode (ZHANG u. WEINER 2000).
Die Extraktion wurde wie folgt durchgeführt:
1. 1 ml der Voranreicherungskultur im 2 ml Reaktionsgefäß auftauen, 2. bei 10.000 g 10 Minuten abzentrifugieren,
3. der Überstand verwerfen,
4. das Bakterienpellet in 1 ml CTAB-Puffer aufnehmen und mit der Pipette suspendieren,
5. kurz vortexen,
6. 50 µl Lysozymlösung (10 mg/ ml) und 50 µl RNAse (20 mg/ ml) hinzugeben,
7. kurz vortexen,
8. 1 h bei 37 °C inkubieren,
9. 25 µl Proteinase K (20 mg/ ml) hinzufügen, 10. kurz vortexen,
11. 1 h bei 65 °C inkubieren (im Heizblock), 12. kurz vortexen,
13. 1 Vol. (dem Probevolumen entsprechende Menge) Phenolchloroform hinzugeben,
14. 1 Minute auf mittlerer Stufe vortexen und 15 Minuten bei 8.000 g zentrifugieren,
15. Überstand abnehmen,
16. 1 Vol. (dem Probevolumen entsprechende Menge) Chloroform hinzugeben, 17. 1 Minute auf mittlerer Stufe vortexen und 15 Minuten bei 8.000 g
zentrifugieren,
18. Überstand abgenommen,
19. 1 Vol. (dem Probevolumen entsprechende Menge) Isopropanol und 0,1 Vol. (1/ 10 dem Probevolumen entsprechende Menge) Natriumacetat zu dem Überstand geben, schütteln und 30 Minuten bei Raumtemperatur fällen,
20. 15 Minuten bei 14.000 g zentrifugieren und den Überstand verwerfen, 21. 500 µl 75 % iger Ethanol zugeben und 2 Minuten anzentrifugieren, 22. Überstand verwerfen,
23. Pellet bei 60 °C im Heizblock trocknen lassen,
24. getrocknetes Pellet in 100 µl 0,2 Tris-EDTA aufnehmen und bei -25 °C lagern
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde als Multiplex-PCR (MPCR) durchgeführt. Es wurden zwei Genloki ausgewählt, mit deren Hilfe eine klare Trennung von humanpathogenen Yersinia enterocolitica und anderen Yersinia enterocolitica bzw. Yersinia spp. möglich war. Lokus 1 ist das chromosomale ail Gen, dem Primerpaar 1 (P1-P2) zugeordnet wurde. Dieses Gen kodiert bei humanpathogenen Yersinia enterocolitica die Pathogenitätsfaktoren zur Anheftung und Invasion in die Zelle und kommt nur bei diesen vor. In Deutschland sind bei humanpathogenen Yersinia enterocolitica die Serovar/ Biovarkombinationen 4/O:3, 2/O:9, 3/O:9, 2/O:5,27 und 3/O:5,27 von Bedeutung (ZEN-YOJI et al. 1973;
MOLLARET et al. 1979; BUTTLER 1983; ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1996). Das humanpathogene Serovar O:8 von Yersinia enterocolitica ist in den USA vorherrschend (ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1987a). Es kommt in Kombination mit dem Biovar 1B vor (ZEN-YOJI et al. 1973; MOLLARET et al. 1979; BUTTLER 1983).
Mit Hilfe des Primerpaar 1 war das ail Gen sicher nachzuweisen. So konnten in den untersuchten Proben alle in Deutschland vorkommenden humanpathogenen Yersinia enterocolitca sicher entdeckt werden. Die Spezifität dieses Primerpaars 1 für humanpathogene Yersinia enterocolitica ist in Tabelle 11 wiedergegeben. Lokus 2 wird durch eine Yersinia spp. 16S-rRNS Genregion dargestellt. Diesem Ort wurde
das Primerpaar 2 (Y1-Y2) zugewiesen. Die Spezifität dieser Primer wurde von LANTZ et al. (1998)ermittelt. Veranschaulicht wird dies in Tabelle 12.
Tab. 11: Spezifität des Primerpaars P1-P2 nach NILSON et al. (1997)
Spezies Quelle Bezeichnung ail human-pathogen
Yersinia enterocolitica O:3 Hundefutter DFH G 1 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human DFH G 2 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human CCUG 21476 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human Kapperud 29C-46 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human Kapperud 4147 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human DFH G 3 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human CCUG 4586 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human CCUG 8233 + +
Yersinia enterocolitica O:3 human Kapperud 1084/86 + +
Yersinia enterocolitica O:3 unbekannt DSM 11502 + +
Yersinia enterocolitica O:9 human CCUG 8239 + +
Yersinia enterocolitica O:9 unbekannt CCUG 7758 + +
Yersinia enterocolitica O:9 human SMI Y 289 + +
Yersinia enterocolitica O:8 human CCUG 8238 + +
Yersinia enterocolitica O:8 unbekannt SMI P 311 + +
Yersinia enterocolitica O:8 human SMI 115 + +
Yersinia enterocolitica O:5,27 unpasteur. Milch SLV 028 + + Yersinia enterocolitica O:5a unpasteur. Milch SLV 033 - - Yersinia enterocolitica O:5a unpasteur. Milch SLV 025 - -
Yersinia enterocolitica O:12 Rindfleisch SLV 158 - -
Yersinia enterocolitica O:13 unpasteur. Milch SLV 027 - - Yersinia enterocolitica O:25 unpasteur. Milch SLV 030 - -
Yersinia frederiksenii Frischwasser SLV 425 - -
Yersinia kristensenii unbekannt SLV 286 - -
Yersinia intermedia unbekannt SLV-Y 38 - -
Yersinia pseudotuberculosis unbekannt SMI Y 507 - -
Yersinia ruckeri unbekannt SLV-Y 41 - -
Tab. 12: Spezifität des Primerpaars Y1-Y2 nach LANTZ et al. (1998)
Spezies Stamm 16S-rRNS
Yersinia enterocolitica O:3;4 Y 79 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 CCUG 8233 +
Yersinia enterocolitica O:3 SMRICC 484 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 29C-43P + +
Yersinia enterocolitica O:3;4 SMRICC 484 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 SMRICC 486 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 SMRICC 487 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 SMRICC 488 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 Y 187 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 SMRICC 485 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 DSM 11502 +
Yersinia enterocolitica O:3;4 SMRICC 490 +
Yersinia enterocolitica O:5 CCUG 8235 +
Yersinia enterocolitica O:6,30;1A Y 383 +
Yersinia enterocolitica O:7,8;1A Y 362 +
Yersinia enterocolitica O:8;1 CCUG 11291 +
Yersinia enterocolitica O:9;3 CCUG 8239A +
Yersinia enterocolitica O:12;1A Y 381 +
Yersinia enterocolitica O:13;1A Y 334 +
Yersinia frederiksenii O:35 Y 898 +
Yersinia frederiksenii CCUG 11293 +
Yersinia intermedia O:57 Y 344 +
Yersinia intermedia O:4,33 Y 877 +
Yersinia kristensenii O:12,25 Y 385 +
Yersinia kristensenii O:28 Y 883 +
Yersinia pseudotuberculosis CCUG 5855 +
Yersinia pseudotuberculosis CCUG 24690 +
Brochothrix thermosphacta SMRICC 347 -
Carnobacterium divergens SMRICC 204 -
Citerobacter freundii DSM 30039 -
Fortsetzung Tab. 12: Spezifität des Primerpaars Y1-Y2 nach LANTZ et al. (1998)
Spezies Stamm 16S-rRNS
Enterobacter agglomerans SMRICC 368 -
Escherichia coli SMRICC 380 -
Hafnia alvei CCUG 15720 -
Klebsiella pneumonite CCM 5792 -
Lactobacillus sake SMRICC 259 -
Leuconostoc carnosum NCFR 2776 -
Pseudomonas fluorescens SMRICC 445 -
Pseudomonas frafi SMRICC 100 -
Pseudomonas lundensis SMRICC 437 -
Rahnella aquatilis SMRICC 522 -
Serratia liquefaciens SMRICC 365 -
Tab. 13: Basenstrukturen der Primerpaare P1 – P2 und Y1 – Y2 (NILSON et al.
1997; LANTZ 1998)
Primer Basenfolge 5´>3´ Primerlänge Lage und Länge des Fragmentes P1 CTA TTG GTT ATG CGC AAA GC
20bp
Startpunkt 576
Endpunkt 934 P2 TTG AAG TGG GTT GAA TTG C 19bp
359Bp
Y1 GGA ATT TAG CAG AGA TGC TTT A
22bp Startpunkt 1277 Y2 GGA CTA CGA CAG ACT TTA TCT 21bp Endpunkt 975
303Bp
Die Primerpaare wurden durch die Fa. Roth, Karlsruhe, synthetisiert. Dort wurden die Primer über eine RP-Säule gereinigt, um störende Salze zu entfernen. Die Bedingungen für die MPCR mit dieser Primerpaarung wurde mit Hilfe eines
Computerprogramms ausgearbeitet und verifiziert (Primer Designer, Fa. Scientific &
Educational Software, Version 2.0). Der Mastermix für jede Reaktion bestand aus 24,3 µl dest. Wasser, 1 µl desoxy-Nukleinsäuren (10 mmol/ ml dNTP, Roti-Mix PCR, Fa. Roth, Karlsruhe), 5 µl 10x PCR-Puffer (beinhaltet 15 mM MgCl), 10 µl 5x Q-Solution, 0,7 µl Taq-Polymerase (HotStarTaq, alle drei Bestandteile Fa. Qiagen GmbH, Hilden) und 2 µl (P1/P2 30 pmol/ µl, Y1/Y2 40 pmol/ µl) von jedem Primer. Zu diesem Volumen von 45 µl wurde dann 5 µl Probe pipettiert. Die eigentliche PCR wurde durch Zugabe des Mastermixes mit gereinigtem Probenmaterial in den Thermozykler (GeneAmp PCR System 9700, Fa. Perkin Elmer Applied Biosystems, Norwalk, USA) gestartet. Die einzelnen Arbeitsschritte des Thermozyklers sind in Abbildung 8 dargestellt.
35 Zyklen Anfangsdenaturierung (15 Minuten bei 95 °C)
Denaturierung der DNS (45 sec. bei 94 °C) Anheftung der Primer an DNS (45 sec. bei 58 °C) Elongation der Primer (45 sec. bei 72 °C)
Endelongation (10 Minuten bei 72 °C)
Lagerung (bei 4 °C)
Abb. 8: Arbeitsschritte der MPCR im Thermozykler
Nach der MPCR wurde jede Probe der Agarosegelelektophorese unterzogen. Es wurden 300 ml Gel pro Ansatz gegossen. Das Gel setzte sich wie folgt zusammen:
- 300 ml 1x TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA-Puffer)
- 2,5 g Agarose
- 10,5 µl Ethidiumbromid
Die Proben wurden mit Blaumarker (TAE-Puffer, Glycerin, Bromphenolblau) gefärbt und in das Gel verbracht. Als Längenstandard diente pUC 19 DNA geschnitten mit Msp I (Fa. Roth, Karlsruhe). Es enthält Fragmente mit den Längen 501/ 489 Basenpaare (bp), 404 bp, 331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp und 111/ 110 bp. An die Elektophoresekammer (Fa. Whatman Biometra, UK) wurde eine Spannung von 200 Volt für 30 Minuten angelegt, dabei erfolgte eine Auftrennung der MPCR - Produkte nach ihrer Länge, wobei kleine Fragmente weiter wanderten als grosse. Bei positivem Nachweis von humanpathogenen Yersinia enterocolitica wurden zwei Banden an der Position für 303 und für 359 Basenpaare im Agarosegel sichtbar.
Dabei handelt es sich in Deutschland um die Biovar/ Serovarkombinationen 4/O:3, 2/O:9, 3/O:9, 2/O:5,27 und 3/O:5,27 (ZEN-YOJI et al. 1973, MOLLARET et al. 1979, BUTTLER 1983, ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1996). War nur eine Bande bei der Position für 303 Basenpaare zu erkennen, war der Nachweis von anderen Yersinia spp. positiv. Anschließend wurde das Gel unter ultraviolettem Licht visuell ausgewertet und mittels Polaroidfoto (Fa. Polariod, USA) dokumentiert.
Jede Probe wurde halbiert. Die eine Probenhälfte wurde durch Zugabe der MPCR – Reagenzien (Mastermix) auf Anwesenheit von humanpathogenen Yersinia enterocolitica bzw. Yersinia spp. untersucht. Der anderen Hälfte dieser Probe wurde Yersinia enterocolitica DNS beigefügt und anschliessend wurde sie wie die erste Probenhälfte behandelt (Inhibitionskontrolle). Waren bei der Inhibitionskontrolle zwei Banden bei 359 bp und 303 bp im Agarosegel sichtbar, so war sichergestellt, dass sich in der Probe keine MPCR inhibierenden Substanzen befanden. Bei jedem MPCR – Ansatz wurde darüber hinaus eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle und eine Extraktionskontrolle mituntersucht. Die Positivkontrolle enthielt neben den MPCR – Reagenzien nur noch einen Zusatz von Yersinia enterocolitica DNS. Sie musste ein positives Ergebnis geben, um zu gewährleisten, dass die MPCR korrekt ablief. Die in den Kontrollen zugefügte Yersinia enterocolitica DNS stammte von Yersinia enterocolitica DSM 11502 (DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland). Die Negativkontrolle umfasste nur den Mastermix ohne weitere Zusätze. Die Negativkontrolle durfte im Agarosegel keine Banden anzeigen. So konnte überprüft werden, dass es zu keiner Verunreinigung des Mastermixes während des Ansetzens der Proben gekommen war. Die Extraktionskontrolle wurde für jeden Extraktionsansatz durchgeführt. Die Extraktionskontrolle durchlief alle Verfahrensschritte wie eine zu untersuchende Probe, ausser das ihr kein
Probenmaterial zugesetzt bzw. sie nicht halbiert und ihr keine Yersinia enterocolitica DNS beigeben wurde. Die Extraktionskontrolle durfte wie die Negativkontrolle keine Banden im Agarosegel zeigen. Mit Hilfe der Extraktionskontrolle wurde nachgewiesen, dass es beim Arbeitschritt der Extraktion zu keiner Kontamination mit Yersinia enterocolitica gekommen war. Die Abbildung 9 gibt hierfür ein Beispiel. Die Banden (B) 1 und 11 stellen den Längenstandard (pUC 19 Msp I) dar. Bande B2 zeigt eine für humanpathogene Yersinia enterocolitica positive Probe (TB76). Bande B3 ist Inhibitionskontrolle für diese Probe (TB76). Banden B4 und B6 präsentieren je eine Probe in der keine humanpathogenen Yersinia enterocolitica nachgewiesen werden konnten (B4: TB77; B6: TB 78). B5 und B7 sind die Inhibitionskontrollen zu den Proben TB77 bzw. TB 78. B8 gibt die Positivkontrolle und B9 die Negativkontrolle für diesen MPCR - Ansatz wieder. B10 steht für die Extraktionskontrolle.
303 bp 359 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Abb. 9: Beispiel einer Auswertung der MPCR mit Agarosegel zur Identifikation von humanpathogenen Yersinia enterocolitica.
Bande (B) 1: DNS – Längenstandard (pUC 19 Msp I);
B2: Probe TB76 pos. für humanpathogene Y. enterocolitica
B3: Inhibitionskontrolle für Probe TB76 (mit Zusatz von Y. enterocolitica DNS)
B4: Probe TB77 neg. für humanpathogene Y. enterocolitica
B5: Inhibitionskontrolle für Probe TB77 (mit Zusatz von Y. enterocolitica DNS)
B6: Probe TB78 neg. für humanpathogene Y. enterocolitica
B7: Inhibitionskontrolle für Probe TB78 (mit Zusatz von Y. enterocolitica DNS)
B8: Positivkontrolle (MPCR - Reagenzien mit Y. enterocolitica DNS ohne Probe)
B9: Negativkontrolle (MPCR - Reagenzien ohne Zusatz von Y. enterocolitica DNS)
B10: Extraktionskontrolle (Extraktionsreagenzien und MPCR – Reagenzien ohne Zusätze)
B11: DNS – Längenstandard (pUC 19 Msp I);
3.2 Humanpathogene Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen aus