Vergleich der Untersuchungsmethoden zum Nachweis von Yersinia enterocolitica

3. Untersuchungstiere, Material und Methoden

4.1 Vergleich der Untersuchungsmethoden zum Nachweis von Yersinia enterocolitica

Bei den kulturellen Nachweisen von Yersinia enterocolitica aus speziellen Geweben und Darminhalt (Zäkum) von Schlachtschweinen wurden insgesamt sechs unterschiedliche Verfahren untersucht. Bei allen sechs Methoden wurden 180 Einzelproben (ntotal = 180) von 60 geschlachteten Schweinen bearbeitet. Die gleichen 180 Proben wurden auch einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (MPCR) unterzogen. Die 180 Proben verteilten sich auf 60 Tonsillenproben, 60 Proben von Darminhalt und auf 60 Lymphknotenproben (Nll. Ileocolici). Pro Tier wurde je eine Probe von den Tonsillen, dem Darminhalt und den Lymphknoten entnommen. Als positiv im Sinne von mit Yersinia enterocolitica belastet, wurden solche Untersuchungsergebnisse bei den Kulturen gewertet, die bei der Vordifferenzierung und bei der sich anschließenden Bearbeitung mittels API 10 S durch biochemische Reaktionsmuster eindeutige Resultate lieferten. Da das Ziel der Vorversuche war, festzustellen, welche Untersuchungsmethode für den Nachweis von Yersinia enterocolitica geeigneter ist, wurde auf eine weitergehende Sero- bzw.

Biovarbestimmung bei den durch die mikrobiologischen Untersuchungsmethoden detektierten Yersinia enterocolitica verzichtet. Daher ist eine Aussage über die Pathogenität der mit den mikrobiologischen Methoden nachgewiesen Yersinia enterocolitica nicht möglich.

Alle mit der molekularbiologischen Methode (MPCR) nachgewiesenen Yersinia enterocolitica Isolate waren humanpathogen. Mit Hilfe des Primerpaars 1 (P1-P2) konnte das Gen ail nachgewiesen werden. Dieses Gen kodiert für den Pathogenitätsfaktor „Anheftung und Invasion“ in eukaryotische Zellen und kommt nur bei den humanpathogenen Stämmen von Yersinia enterocolitica vor. In Deutschland sind dies die Biovar/ Serovarkombinationen 4/O:3, 2/O:9, 3/O:9, 2/O:5,27 und 3/O:5,27 (ZEN-YOJI et al. 1973, MOLLARET et al. 1979, BUTTLER 1983, ALEKSIĆ u. BOCKEMÜHL 1996). Die Proben wurden als mit humanpathogenen Yersinia enterocolitica belastet beurteilt, wenn in der Gelelektrophorese die Bande eines 303 und 359 Basenpaar(bp)amplifikats erschien. Das Primerpaar 1 war für das 359 bp und das für alle Yersinia spp. spezifische Primerpaar 2 (Y1-Y2) für das 303 bp

Amplifikat verantwortlich. Als Nachweis für Yersinia spp. galt das alleinige Erscheinen des 303 bp Fragmentes.

Von den 60 untersuchten Schweinen konnten mit den mikro- und molekularbiologischen Methoden bei 20 Tieren Yersinia enterocolitica nachgewiesen werden. Die Yersinia enterocolitica Isolate bei diesen 20 geschlachteten Schweinen verteilten sich auf 30 Untersuchungsproben. Die 30 Proben umfassten zehn positive Tonsillenproben, 14 positive Proben von Darminhalt und sechs positive Lymphknotenproben. Die Abbildung 10 gibt die absoluten Häufigkeiten der insgesamt ermittelten positiven Befunde von Yersinia enterocolitica in den untersuchten Proben nach Lokalisation am Schlachtschwein geordnet wieder. Auf der Abszisse sind die drei Lokalisationen der Probenentnahmen aufgetragen. Die Ordinate gibt die Anzahl (n) der positiven Befunde an.

Tonsillen

Zäkum

Nll. ileocolici

0 2 4 6 8 10 12 14 absolute Häufikeit pos. Ergebnisse

(n)

Abb. 10: Verteilung der mit Kultur und MPCR nachgewiesenen Yersinia enterocolitica positiven Proben in absoluten Häufigkeiten und nach Lokalisationen am geschlachteten Tier geordnet

Die 30 nachgewiesenen Yersinia enterocolitica positiven Proben verteilten sich bei den 20 Schlachtschwein wie folgt:

Bei sechs geschlachteten Tieren waren parallel zwei positive Nachweise an den Tonsillen und in den Blindärmen möglich. Bei vier Tieren waren im Zäkum und den Lymphknoten Yersinia enterocolitica zu detektieren. Die restlichen zehn positiven Nachweise verteilten sich auf die Tonsillen (4 Tiere), das Zäkum (4 Tiere) und die Nll.

ileocolici (2 Tiere).

Mit Hilfe der mikrobiologischen Untersuchungsmethoden (M1 bis M6) konnten 18 der insgesamt 30 positiven Untersuchungsproben ermittelt werden; bei der durchgeführten MPCR waren es 28 Proben. Die Differenz von zwei Proben ergab sich, da in diesen Untersuchungsproben Yersinia enterocolitica allein durch das mikrobiologische Vorgehen nachzuweisen war.

Werden nur die sechs kulturellen Nachweisverfahren für Yersinia enterocolitica betrachtet, so war bei dem Untersuchungsmaterial aus den Tonsillen die Methode 2 (Kombination von Anreicherungsbouillon nach OSSMER und SSDC-Selektivmedium, M2), mit vier Yersinia enterocolitica Nachweisen am sensitivsten. Daran schloss sich die Methode 6 (M6, Kälteanreicherung in PBS) mit zwei positiven Ergebnissen an.

Diese Tonsillen, die mit M6 als positiv festgestellt wurden, wurden auch bei M2 als Yersinia enterocolitica positiv ermittelt. Bei der Methode M6 wurde je Probe nach 7, 14 und 21 Tagen der Anreichung ein Ausstrich auf ein Nährmedium gegeben. Vor dem 14. Tag war bei keiner Probe ein Yersinia enterocolitica Nachweis möglich.

Proben, die am 14. Tag Yersinia enterocolitica positiv waren, waren dies stets auch am 21. Tag der Anreicherung. Dass Proben nur am 21. Tag der Anreicherung positive Ergebnisse zeigten, konnte nicht beobachtet werden. Mit den Methoden Voranreicherung nach OSSMER + CIN-Agar (M1), ITC-Anreicherungsbouillon + SSDC-Agar (M3), Voranreicherung in PSB + Laugenbehandlung + CIN-Agar (M4) und Voranreicherung in PSB + CIN-Agar (M5) war hier kein Nachweis von Yersinia enterocolitica möglich. Die MPCR bestätigte die Ergebnisse aus den Kulturen und deckte zusätzlich sechs weitere Tonsillen als Yersinia enterocolitica positiv auf.

In Abbildung 11 sind die Resultate der verschiedenen Untersuchungsmethoden für die Probenlokalisation Tonsillen dargestellt. Auf der x-Achse sind die einzelnen Nachweismethoden aufgetragen und auf der y-Achse befindet sich die Anzahl (n) der

mit dem jeweiligen Verfahren erlangten Yersinia enterocolitica positiven Ergebnisse der insgesamt 60 untersuchten Tonsillen.

OS/CIN

OS/CIN (M1): Voranreicherung nach OSSMER + CIN-Agar OS/SSDC (M2): Voranreicherung nach OSSMER + SSDC-Agar ITC (M3): ITC-Anreicherungsbouillon + SSDC-Agar

PSB/KOH (M4): Voranreicherung in PSB + Laugenbehandlung + CIN-Agar PSB (M5): Voranreicherung in PSB + CIN-Agar

Kälte 7 (M6): Anreicherung in PBS bei 4 °C, Übertragen auf CIN-Agar nach 7 Tagen Kälte 14 (M6): Anreicherung in PBS bei 4 °C, Übertragen auf CIN-Agar nach 14 Tagen Kälte 21 (M6): Anreicherung in PBS bei 4 °C, Übertragen auf CIN-Agar nach 21 Tagen MPCR: Voranreicherung nach OSSMER + Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion Abb. 11: Anzahl der Yersinia enterocolitica Nachweise in den Tonsillen (ngesamt = 60)

nach unterschiedlichen Untersuchungsmethoden

Aus dem Zäkuminhalt gelang die kulturelle Isolierung von Yersinia enterocolitica vor allem mit der Kälteanreicherung (M6) nach 14 bzw. 21 Tagen. Bei der Kälteanreicherung waren die sechs positiven Proben des 14. Tages identisch mit denen des 21. Tages. Ein Nachweis am 7. Tag der Kälteanreicherung (M6) gelang nicht. Die vier Yersinia enterocolitica positiven Zäkumproben, die mit der Kombination der Voranreicherung nach OSSMER und CIN-Medium (M1) nachgewiesen wurden, konnten mit der Voranreicherung nach OSSMER und SSDC-Agar (M2) bestätigt werden. Die anderen Nachweismethoden ITC-Anreicherungsbouillon + SSDC-Agar (M3), Voranreicherung in PSB + Laugenbehandlung + CIN-Agar (M4) und Voranreicherung in PSB + CIN-Agar (M5) erzielten keine positiven Resultate. Mit der molekularbiologischen Nachweismethode (MPCR) war eine Absicherung der oben genannten Befunde möglich, darüber hinaus gelang es mit ihrer Hilfe noch in vier weiteren Blinddärmen Yersinia enterocolitica nachzuweisen.

In der Abbildung 12 sind diese Ergebnisse veranschaulicht. Auf der Abszisse sind die einzelnen Nachweisverfahren wiedergegeben. Die Ordinate zeigt die Anzahl (n) der positiven Yersinia enterocolitica Befunde im Zäkuminhalt an.

OS/CIN S/CIN (M1): Voranreicherung nach OSSMER + CIN-Agar

OS/SSDC (M2): Voranreicherung nach OSSMER + SSDC-Agar ITC (M3): ITC-Anreicherungsbouillon + SSDC-Agar

PSB/KOH (M4): Voranreicherung in PSB + Laugenbehandlung + CIN-Agar PSB (M5): Voranreicherung in PSB + CIN-Agar

Abb. 12: Anzahl der Yersinia enterocolitica Nachweise in den Blinddarminhalten (ngesamt = 60) nach unterschiedlichen Untersuchungsmethoden

Bei den sechs positiven Yersinia enterocolitica Proben des Lymphgewebes war keine der sechs hier erprobten kulturellen Untersuchungsverfahren im Vorteil. Es gelangen je zwei Isolierungen mit der Anreicherungsbouillon nach OSSMER mit SSDC-Agar (M2) sowie bei der Verwendung von PSB-Voranreicherung mit Laugenbehandlung auf CIN-Agar (M4). Bei diesen beiden positiven Yersinia

enterocolitica Befunden handelte es sich um Proben von den selben Tieren. Mit ITC-Selektivbouillon auf CIN-Agar (M3) gelangen zwei Yersinia enterocolitica Nachweise, die aber durch kein anderes Untersuchungsverfahren, weder durch eine andere mikrobiologische Methode noch durch die MPCR, bestätigt werden konnten. Mit den Methoden Voranreicherung in PSB + CIN-Agar (M5) und Kälteanreicherung (M6) gelang kein Nachweis von Yersinia enterocolitica. Mit der MPCR konnten neben den beiden positiven Proben von Voranreicherung nach OSSMER + SSDC-Agar (M2) bzw. Voranreicherung in PSB + Laugenbehandlung + CIN-Agar (M4) noch zwei weitere Proben als positiv auf Yersinia enterocolitica beurteilt werden.

Die Abbildung 13 zeigt die positiven Yersinia enterocolitica Ergebnisse bei den Untersuchungen der Lymphknoten. Auf der x-Achse sind die unterschiedlichen Untersuchungsverfahren aufgetragen und auf der y-Achse die absoluten Häufigkeiten (n) der positiven Yersinia enterocolitica Nachweise.

OS/CIN

OS/SSDC

ITC

PSB/KOH

PSB

Kälte 7

Kälte 14

Kälte 21

0 MPCR

1 2 3 4

absolute Häufigkeit (n) pos. Ereignisse

OS/CIN (M1): Voranreicherung nach OSSMER + CIN-Agar OS/SSDC (M2): Voranreicherung nach OSSMER + SSDC-Agar ITC (M3): ITC-Anreicherungsbouillon + SSDC-Agar

PSB/KOH (M4): Voranreicherung in PSB + Laugenbehandlung + CIN-Agar PSB (M5): Voranreicherung in PSB + CIN-Agar

Abb. 13: Anzahl der Yersinia enterocolitica positiven Ergebnisse in den Nll. ileocolici (ngesamt = 60) nach unterschiedlichen Untersuchungsmethoden

Wie aus den Abbildungen 11 bis 13 zu erkennen ist, hat das molekularbiologische Verfahren (MPCR) bei allen drei Untersuchungslokalisationen am Schlachtschwein (n1 = Tonsillen, n2 = Zäkuminhalt, n3 = Lymphknoten) im Gegensatz zu den hier eingesetzten kulturellen Methoden die höchste Nachweishäufigkeit von Yersinia enterocolitica. Mit der MPCR konnten die mit der Kultur erzielten Yersinia enterocolitica positiven Befunde, bis auf zwei positive Nachweise in ITC-Bouillon aus

Lymphgewebe, bestätigt werden. Daneben konnten mittels des molekularbiologischen Verfahrens noch zusätzlich zwölf mit Yersinia enterocolitica behaftete Proben aufgezeigt werden. Diese zwölf Proben bestanden aus sechs Tonsillen-, vier Zäkumproben und zwei weiteren Lymphgewebsproben.

In der Abbildung 14 sind die absoluten Nachweishäufigkeiten der kulturellen Methoden zu einem Wert zusammengefasst und den Ergebnissen der MPCR gegenübergestellt. Die x-Achse stellt die drei untersuchten Lokalisationen am geschlachteten Tier dar. Auf der y-Achse ist die Anzahl der Yersinia enterocolitica positiven Nachweise aufgetragen (n= 60 für jede Lokalisation). Die z-Achse ist in drei Abschnitte aufgeteilt. Im Vordergrund sind die Yersinia enterocolitica positiven Befunde der kulturellen Nachweisverfahren gemeinsam gezeigt. Dahinter befinden sich die positiven Yersinia enterocolitica Befunde, die mit der MPCR ermittelt wurden.

Im Hintergrund sind die absoluten Häufigkeiten der Yersinia enterocolitica Nachweise aus Kultur und MPCR als Summation (weiße Säulen) nach Lokalisationen getrennt abgebildet. Dabei wurden Mehrfachnachweise, die sowohl in der Kultur als auch in der MPCR ermittelt wurden, nur einmal gewertet. Vergleicht man die Ergebnisse der MPCR mit der Summation (Kultur und MPCR), so ist zu erkennen, dass die Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion bei den Tonsillen und den Zäkuminhalten alle Yersinia enterocolitica Nachweise der Kultur bestätigen konnte. Lediglich bei den Lymphknoten gelang es zweimal nicht.

Tonsillen Zäkum

Nll.

ileocolici

0 2 4 6 8 10 12 14

absolute Häufigkeit (n) pos. Ergebnisse

Kultur MPCR

MPCR+Kultur

Abb. 14: Gegenüberstellung der Yersinia enterocolitica Nachweise aus der Kultur und der MPCR nach Lokalisationen am geschlachteten Tier und absoluten Häufigkeiten ihres Auftretens

4.2 Vorkommen von humanpathogenen Yersinia enterocolitica bei

Im Dokument Untersuchungen zum Vorkommen von humanpathogenen Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen aus verschiedenen Haltungsformen (Seite 72-82)