Aus der Klinik für Rinderkrankheiten (im Richard-Götze-Haus)
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Thiamin- und Thiaminderivatgehalt im Pansensaft des Rindes nach Verfütterung
von mit Mucor racemosus Fresenius verpilztem Heu (in vitro)
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von CHRISTIANE WULFF
aus Melle
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. Scholz
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Scholz
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2001
C A R P E D I E M
MEINEN ELTERN UND SUSU IN LIEBE UND DANKBARKEIT
GEWIDMET
Inhaltsverzeichnis Seite
1. Einleitung 1
2. Schrifttum 2
2.1 Anaerobe Pansenpilze 3
2.1.1 Einleitung 3
2.1.2 Höhepunkte in Geschichte und Entdeckung anaerober Pilze 4 2.1.3 Nomenklatur und taxonomische Stellung anaerober Pansenpilze 6 2.1.4 Vorkommen und Verbreitung anaerober Pansenpilze 9 2.1.5 Übertragung anaerober Pansenpilze von Tier zu Tier und Entwicklung
der Pilzpopulation in Jungtieren 12
2.1.6 Lebenszyklus, Aufbau und Ultrastruktur anaerober Pansenpilze 12
2.1.6.1 Lebenszyklus 12
2.1.6.1.1 Lebenszyklus monozentrischer Gattungen 15
2.1.6.1.2 Lebenszyklus polyzentrischer Gattungen 16
2.1.6.2 Identifizierung von Pilzphasen und Pilzstrukturen im Lebenszyklus an-
aerober Pansenpilze mittels Antikörper 16
2.1.6.3 Aufbau und Ultrastruktur anaerober Pansenpilze 18
2.1.6.3.1 Monozentrische Gattungen 19
2.1.6.3.1.1 Neocallimastix 19
2.1.6.3.1.2 Piromyces (Piromonas) 19
2.1.6.3.1.3 Caecomyces (Sphaeromonas) 20
2.1.6.3.1.4 Sphaeromonas 21
2.1.6.3.2 Polyzentrische Gattungen 21
2.1.6.3.2.1 Orpinomyces 21
2.1.6.3.2.2 Anaeromyces 22
2.1.7 Chemische Zusammensetzung anaerober Pansenpilze 22
2.1.7.1 Lipide und Fettsäuren 22
2.1.7.2 Proteine und Aminosäuren 23
2.1.7.3 Nukleinsäuren 23
2.1.7.4 Chitin 23
2.1.8 Nährstoffanforderung anaerober Pansenpilze 23
2.1.9 Fermentationsprozesse und Energiestoffwechsel anaerober Pansen-
pilze 24
2.1.9.1 Hydrogenosomen 24
2.1.9.2 Intermediärstoffwechsel (Hexosemetabolismus) 24
2.1.9.3 Endprodukte und zwischenartliche Wasserstoffübertragung 26 2.1.10 Isolierung, Kultur und quantitative Erfassung anaerober Pansenpilze 26 2.1.10.1 Isolierungs- und Kulturmethoden und -verfahren 26
2.1.10.2 Kulturbedingungen 27
2.1.10.3 Kulturmedien 28
2.1.10.4 Verfahren und Techniken zur Bestimmung der Populationsdichte von
Zoosporen und Ermittlung der Pilzbiomasse 29
2.1.10.5 Zählmodelle 30
2.1.11 Wachstumsstudien an anaeroben Pansenpilzen 30
2.1.12 Besiedlung und Abbau von Pflanzengewebe durch anaerobe Pansen-
pilze 31
2.1.12.1 Ausmaß des Abbaus pflanzlicher Biomasse 31
2.1.12.2 Art des Abbaus pflanzlicher Biomasse 32
2.1.13 Enzyme anaerober Pansenpilze zum Aufschluß pflanzlicher Biomasse
und deren Regulationsmechanismen 33
2.1.13.1 Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels 33
2.1.13.1.1 Cellulasen und Glucosidasen 33
2.1.13.1.2 Xylanasen 36
2.1.13.1.3 Esterasen 37
2.1.13.1.4 Pectinabbauende Enzyme 37
2.1.13.1.5 Ligninabbauende Enzyme 38
2.1.13.1.6 Stärkeabbauende Enzyme 38
2.1.13.2 Enzyme des Proteinstoffwechsels 39
2.1.13.3 Regulation der Enzymproduktion und der Katoboliten 39 2.1.14 Interaktionen zwischen Pansenmikroorganismen, Einflüsse und Wech-
selwirkungen von Futtermitteln und Pharmazeutika auf anaerobe Pan-
senpilze 41
2.1.14.1 Interaktionen zwischen Pansenpilzen und Bakterien 41 2.1.14.1.1 Interaktionen mit hydrogenotropen Bakterien 41 2.1.14.1.1.1 Interaktionen mit methanogenen Bakterien 41
2.1.14.1.1.2 Interaktionen mit Acetogenen 42
2.1.14.1.1.3 Interaktionen mit sulfat-reduzierenden Bakterien 42 2.1.14.1.1.4 Interaktionen mit Selenomonas ruminantium 42 2.1.14.1.1.5 Interaktionen mit lactatverwertenden Bakterien 43 2.1.14.1.2 Interaktionen mit nicht-hydrogenotropen Bakterien 43 2.1.14.1.3 Interaktionen mit fibrolytischen Bakterien 43 2.1.14.1.4 Interaktionen mit chitinolytischen Bakterien 44 2.1.14.1.5 Interaktionen mit pectinolytischen und xylanolytischen Bakterien 44 2.1.14.2 Interaktionen zwischen Pansenpilzen und Protozoen 44 2.1.14.3 Einflüsse und Wechselwirkungen von Futtermitteln auf die Pansenpilz-
population und Pilz-Wirt-Interaktionen 45
2.1.14.4 Wirkung von Pharmazeutika auf anaerobe Pansenpilze 46
2.1.15 Schlußfolgerung 46
3. Eigene Untersuchungen 48
3.1 Versuchsziel 48
3.2 Material und Methodik 48
3.2.1 Das in-vitro-Fermentationssystem RUSITEC (RUmen SImulation
TEChnique) 48
3.2.1.1 Aufbau und Funktionsweise 48
3.2.1.2 3.2.1.3 3.2.2 3.2.3 3.2.3.1 3.2.4 3.2.5 3.2.5.1 3.2.5.2 3.2.5.3 3.2.5.4 3.2.5.5 3.2.5.6 3.2.5.7 3.2.5.8 3.2.5.9 3.2.5.10
Beladung und Bedienung Fermentationsbetrieb Futterkomponenten Spendertier
Haltung und Fütterung des Spendertiers Versuchsdurchführung
Analytik
Bestimmung des pH-Werts
Bestimmung des Ammoniakgehalts
Messung der gebildeten Gasvolumina und Gasanalyse Bestimmung der Natrium-, Kalium- und Chloridgehalte Enzymatische Bestimmung der Cellulaseaktivität
Bestimmung der Proteinkonzentration in der Bakterienfraktion Bestimmung des Überstandvolumens
Thiaminbestimmung
Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren Probenaufbereitung für Protozoenzählung
48 50 51 52 52 53 54 55 55 56 57 57 59 60 60 63 64
3.2.5.11 3.3 3.3.1 3.4
Aufbereitung der Proben zur Bestimmung der Nukleobasen und von Allantoin
Methode zur Bestimmung der Diaminopimelinsäure (DAP) HPCL-Methode zur Messung der DAP
Statistische Berechnung
65 66 70 71
4. Ergebnisse der eigenen Untersuchung 72
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7
pH-Wert in der Fermenterflüssigkeit
Ammoniakgehalt in der Fermenterflüssigkeit Methanproduktion im Fermenter
Proteinkonzentration in der Bakterienfraktion Cellulaseaktivität im festen Fermenterinhalt Gasproduktion im Fermenter
Kohlendioxidproduktion im Fermenter
73 74 75 76 77 78 79 4.8
4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 4.9 4.9.1 4.9.2 4.9.3 4.9.4 4.10 4.10.1 4.10.2 4.10.3 4.10.4 4.11 4.11.1 4.11.2 4.11.3 4.11.4 4.12 4.12.1 4.12.2 4.12.3 4.12.4
Thiamin und seine Derivate im Überstand Gesamtthiamingehalt im Überstand Thiamingehalt im Überstand
Thiaminmonophosphatgehalt im Überstand Thiamindiphosphatgehalt im Überstand
Thiamin und seine Derivate in der Fermenterflüssigkeit Gesamtthiaminkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Thiaminkonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Thiaminmonophosphatkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Thiamindiphosphatkonzentration in der Fermenterflüssigkeit Thiamin und seine Derivate in der Pflanzen- und Protozoenfraktion Gesamtthiaminkonzentration in der Pflanzen- und Protozoenfraktion Thiaminkonzentration in der Pflanzen- und Protozoenfraktion
Thiaminmonophosphatkonzentration in der Pflanzen- und Protozoen- fraktion
Thiamindiphosphatkonzentration in der Pflanzen- und Protozoenfrak- tion
Thiamin und seine Derivate im bakterienfreien Überstand Gesamtthiaminkonzentration im bakterienfreien Überstand Thiaminkonzentration im bakterienfreien Überstand
Thiaminmonophosphatkonzentration im bakterienfreien Überstand Thiamindiphosphatkonzentration im bakterienfreien Überstand Thiamin und seine Derivate in der Bakterienfraktion
Gesamtthiaminkonzentration in der Bakterienfraktion Thiaminkonzentration in der Bakterienfraktion
Thiaminmonophosphatkonzentration in der Bakterienfraktion Thiamindiphosphatkonzentration in der Bakterienfraktion
80 80 81 82 83 84 84 85 86 87 88 88 89 90 91 92 92 93 94 95 96 96 97 98 99 4.13
4.13.1 4.13.2 4.13.3 4.13.4 4.13.5 4.13.6 4.13.7 1.13.8 4.13.9
Flüchtige Fettsäuren
Summe der Produktion der flüchtigen Fettsäuren im Überstand Summe der Konzentration der flüchtigen Fettsäuren in der Fermenter- flüssigkeit
Essigsäureproduktion im Überstand
Essigsäurekonzentration in der Fermenterflüssigkeit Propionsäureproduktion im Überstand
Propionsäurekonzentration in der Fermenterflüssigkeit i-Buttersäureproduktion im Überstand
i-Buttersäurekonzentration in der Fermenterflüssigkeit n-Buttersäureproduktion im Überstand
100 100 101 102 103 104 105 106 107 108
4.13.10 4.13.11 4.13.12 4.13.13 4.13.14 4.14 4.14.1 4.14.2 4.14.3 4.14.4 4.14.5 4.14.6 4.15 4.16
n-Buttersäurekonzentration in der Fermenterflüssigkeit
i-Valeriansäureproduktion im Überstand und i-Valeriansäurekonzentra- tion in der Fermenterflüssigkeit
n-Valeriansäureproduktion im Überstand
n-Valeriansäurekonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Hexansäureproduktion im Überstand und Hexansäurekonzentration in der Fermenterflüssigkeit
Nukleobasen in der Bakterienfraktion
Summe der Nukleobasenkonzentration in der Bakterienfraktion Cytosinkonzentration in der Bakterienfraktion
Guaninkonzentration in der Bakterienfraktion Adeninkonzentration in der Bakterienfraktion Thyminkonzentration in der Bakterienfraktion Uracilkonzentration in der Bakterienfraktion Allantoinkonzentration in der Bakterienfraktion Zusammenfassung der Ergebnisse
109 110 112 113 114 116 116 117 118 119 120 121 122 123
5. Diskussion 126
5.1 Intention der Arbeit 126
5.2 Kritische Betrachtung des Versuchsaufbaus 126
126 5.2.1
5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.4.1
Das RUSITEC-System
Voraussetzungen für die Vergleichbarkeit des RUSITEC-Versuchs mit in-vivo-Verhältnissen
Kritische Betrachtung des Fermentationsguts Parameter
Verwendete Parameter und kritische Betrachtung
126 127 129 129
5.3 Statistik 130
Wirkung von Mucor racemosus Fresenius und kombinierter Mucor- Thiamin-Inkubation auf die Fermentationsvorgänge im RUSITEC Auswirkung von Mucor und Thiamin auf den Milieuparameter pH-Wert
130 130 5.4
5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 5.4.7 5.4.8
Auswirkung von Mucor und Thiamin auf die bakterielle Proteinkonzen- tration und den Ammoniakgehalt
Auswirkung von Mucor und Thiamin auf die mikrobielle Produktion flüchtiger Fettsäuren
Auswirkung von Mucor und Thiamin auf die Hexansäure
Auswirkung von Mucor und Thiamin auf die mikrobielle Kohlendioxid- und Methanproduktion
Auswirkung von Mucor und Thiamin auf die mikrobielle Cellulaseakti- vität
Zusammenfassung
Auswirkung von Mucor und Thiamin auf den Thiaminstoffwechsel (Thiamin und seine Derivate)
131 132 133 133 134 136 138
6. Zusammenfassung 142
7. Summary 144
8. Literaturverzeichnis 146
9. Anhang 191 9.1 Eichkurve für die Proteinbestimmung nach BRADFORD 191 9.2 Eichkurve für die Cellulaseaktivitätsbestimmung 192 9.3 Statistische Daten zu den gemessenen Parametern 193
9.4 Messung der Diaminopimelinsäure 221
Abkürzungsverzeichnis
A. Anaeromyces
Abb. Abbildung
ADF acid detergent fiber (saure Detergentien-Faser) ADL acid detergent lignin (saures Detergentien-Lignin) ad libitum zur freien Verfügbarkeit
ADN acid detergent nitrogen (saurer Detergentien-Stickstoff)
Akl-Heu autoklaviertes Heu
Aqua bidest. zweifach destilliertes Wasser Art.-Nr. Artikelnummer
ATP Aminotriphosphat
BB1 Thiamin aus Bakterienfraktion
BfB1 Thiamin aus bakterienfreiem Überstand
bzw. beziehungsweise
C. Caecomyces
CCN Cerebrocorticalnekrose
DAD Dioden-Array-Detektor
DNA Desoxyribonukleinacid (Desoxyribonukleinsäure)
DAP Diaminopimelinsäure
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
et al. und andere
F Fermenter
FID Flammenionisationsdetektor
FlFS Flüchtige Fettsäuren
G Gassammelbeutel
GC Gaschromatograph
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
Kap. Kapitel
KF Kontrollfermenter
Lsg. Lösung
Min. Minute
MS Microsoft
MF Mucor (racemosus Fresenius) Fermenter
Muc-Heu Mucor verpilztes Heu
n Anzahl der Meßwerte
N. Neocallimastix
NDF neutral detergent fiber (neutrale Detergentien-Faser) neg. dek. Log. negativ dekadischer Logarithmus
NEL Nettoenergielaktation
NfE Stickstoffreie Extraktstoffe
NPN Nicht-Protein-Stickstoff
n. s. nicht signifikant
O. Orpinomyces
oS organische Substanz
p Differenzsignifikanz zwischen KF- und MF-Mittelwert
p. page
P. Piromyces/Piromonas
PEM Polioenzephalomalazie
PPB1 Thiamin aus Pflanzen/Protozoenfraktion Prod.-Nr. Produktions-Nummer
Ra Rohasche
Ref. Referenz
Rfa Rohfaser
Rfe Rohfett
RNA Ribonukleinsäure
Rp Rohprotein
RUSITEC RUmen SImulation TEChnique
RT Raumtemperatur
s Standardabweichung
s. siehe
S. Sphaeromonas
Sp undifferenzierte Sporangie
Sera dest. entionisiertes Wasser sp./spp. Spezies
Subsp. Subspezies
Std. Stunde
Tab. Tabelle
TCA Trichloressigsäure
TDP Thiamindiphosphat
tfu thallusforming unit (thallusbildende Einheit)
TMP Thiaminmonophosphat
TS Trockensubstanz
u. und
u. a. unter anderen/m
Ubh-Heu unbehandeltes Heu
uS ursprüngliche Substanz
Ü Überstand
UV Ultraviolett
VK Variationskoeffizient
x arithmetrischer Mittelwert
xg Erdanziehungskraft (g = 9,81 m/sec2)
z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
0 keine Veränderung
+ Anstieg
- Abfall
1. Einleitung
Die Cerebrocorticalnekrose (CCN) bzw. die bovine Polioenzephalomalazie (PEM) ist eine beim Wiederkäuer auftretende Erkrankung, die durch niedrige Thiamingehalte im Blut, Ge- hirngewebe, Liquor und Lebergewebe gekennzeichnet ist. Die Ätiologie der CCN bzw. PEM wird noch diskutiert. Bei artgerechter Fütterung ist die Thiaminversorgung durch die ruminale mikrobielle Synthese gewährleistet (PERRY 1995). Ätiologische Faktoren sind eine vermin- derte Synthese, z. B. eine Störung innerhalb der Pansenflora, eine gestörte Darmresorption, z. B. bei Enteritis, Antagonisten wie Amprolium (PLITT 1995; WITTE 1998), Schwefel und Schwefelverbindungen (MITTROWANN 1999), ein erhöhter Verbrauch, z. B. bei einer Pan- senacidose (ELIAS 1999) oder thiaminolytische Wirkungen, z. B. durch Thiaminasen in Pflanzen, im Fischmehl, von Bakterien (ROSSOW u. HORVÀTH 1988; PLITT 1995) und Pilzen (Schimmelpilzen).
Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe des Langzeitinkubationssystems RUSITEC die Auswirkun- gen von Mucor racemosus Fresenius ohne und mit Thiaminzulage auf die Pansenfermenta- tion zu untersuchen. Insbesondere sollte die Frage geklärt werden, ob die Pilzgabe nachhal- tige und klinisch relevante Wirkungen auf den intraruminalen Thiaminstoffwechsel ausübt, da Mucor racemosus Fresenius in Futterproben von an CCN erkrankten Rindern im Landkreis Friesland gefunden wurde (PLITT 1995).
2. Schrifttum
Im Pansenlabor der Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden in den letzten Jahren durch die Arbeit am künstlichen Pansen (RUSITEC) mehrere Dissertationen veröffentlicht (SCHIRMER 1990; HÖLTERSHINKEN 1990; KRAKOW 1992; BECKER 1994;
MAIWORM 1994; PLITT 1995; BRÖCKER 1996; MAURUSCHAT 1996; ELIAS 1999;
MITTROWANN 1999; RATHJENS 1999; HÖHLING 2000; JASPER 2000; TIADEN 2000;
WENDELKEN 2000; HÜBNER 2001; JANSON 2001).
In der Aufarbeitung des Schrifttums zu diesen Arbeiten griffen die Autoren jeweils spezielle Aspekte des ruminalen Stoffwechsels auf (s. Tab. 2.1), um am Ende der Versuchsreihe die Kenntnisse über metabolische Abläufe im Pansen zu vervollständigen und auf den neuesten wissenschaftlichen Stand zu bringen.
Tab. 2.1: Literaturthemata, der in den letzten Jahren erstellten Dissertationen des Pansenlabors der Rinderklinik
Literaturthema Autor u. Jahr
Kohlenhydratstoffwechsel Kohlenhydratstoffwechsel Celluloseabbau
Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels
ZIPORI 1989 DIRKSEN 1990 a KRAKOW 1992 ODENKIRCHEN 1992
Stickstoffstoffwechsel HÖLTERSHINKEN 1990
Der Pansen als Ökosystem SCHIRMER 1990
Purinstoffwechsel FELDMANN 1992
Antibiotikawirkungen auf Pansenfermentati- onsvorgänge
KRAMER 1993 Fremdbakterien im Pansen
Bedeutung der Pansenbakterien
Interaktionen zwischen Pansenbakterien
RAAZ 1993
MAURUSCHAT 1996 FRANK 1998
Wirkungen von Pansenstimulantien auf die Pansenfermentation
BECKER 1994 Mykotoxinwirkungen auf die Pansenfermen-
tation
MAIWORM 1994 Einfluß von Saccharomyces cerevisae auf
die Pansenfermentation DE FIGUEIREDO1994
Thiaminstoffwechsel PLITT 1995
WITTE 1998
Aminosäurestoffwechsel BRÖCKER 1996
Kompartimentsysteme des Pansens ELIAS 1999 Einfluß von Schwefel auf die Fermentations-
vorgänge des Pansens
MITTROWANN 1999 Chronische Pansenazidose, Amylase RATHJENS 1999 Bedeutung der Pansenprotozoen HÖHLING 2000 Der ruminale intermediäre Wasserstoff TIADEN 2000 Vitaminstoffwechsel im Pansen WENDELKEN 2000 Lipidstoffwechsel mittel- und langkettiger
Fettsäuren
JASPER 2000 Fortsetzung s. nächste Seite
Tab. 2.1: Fortsetzung
Literaturthema Autor u. Jahr
Vergleich aller weltweit durchgeführten RUSITEC-Versuche
HÜBNER 2001 Wachstums- und Förderstoffe für Pansen-
bakterien
JANSON 2001
In dieser Dissertation wird die Literatur zu den anaeroben Pansenpilzen recherchiert und ge- wertet.
2.1 Anaerobe Pansenpilze 2.1.1 Einleitung
Herbivore Säugetiere leben mit einer Vielzahl von Pilzen, Bakterien und Protozoen in ihrem Verdauungstrakt in Symbiose. Während die Bedeutung von Bakterien und Protozoen bei den Fermentationsvorgängen in herbivoren Säugetieren seit langem bekannt ist, wurde die Exi- stenz anaerober Pansenpilze immer wieder bezweifelt. Sie wurden über viele Jahrzehnte für Protozoen gehalten (ORPIN 1994; THEODOROU et al. 1996). Heute stehen anaerobe Pan- senpilze im Mittelpunkt vieler Untersuchungen. Es konnte nachgewiesen werden, daß sie Bestandteil der physiologischen Mikroflora in Ruminanten und Nicht-Ruminanten sind (ORPIN 1994; ORPIN u. JOBLIN 1988) und am Aufschluß pflanzlicher Kohlenhydrate be- sonders von Cellulose beteiligt sind (ORPIN 1994; s. Kap. 2.1.12). So kann der Aufschluß von Pflanzenmaterial durch Pansenpilze die Verdauung beschleunigen, da die Rumination im Verringern der Partikelgröße und in der Erhöhung der Verdauung durch Bakterien und Protozoen effektiver wird. Dadurch kommt ihnen für den Stoffwechsel und das Wohlbefinden ihres Wirts eine vergleichbare Bedeutung zu wie Bakterien und Protozoen (s. Kap. 2.1.14).
Im Schrifttum dieser Arbeit soll ein Überblick über die bisher zum Thema anaerobe Pansen- pilze erschienene Literatur gegeben werden. Dabei werden ihr Aufbau, ihre Verbreitung und Kultivierung, der Abbau pflanzlicher Kohlenhydrate durch sie sowie ihre Interaktionen mit Bakterien und Protozoen und auch die Wechselwirkungen mit dem Wirtstier dargestellt.
2.1.2 Höhepunkte in der Geschichte und Entdeckung anaerober Pilze
Anaerobe Pilze kamen nach Auffassung der wissenschaftlichen Welt bis Mitte des 20. Jahr- hunderts in der Natur nicht vor und FOSTERs (1949) Auffassung, daß ein wesentlicher Un- terschied zwischen Pilzen und Bakterien der sei, daß Pilze niemals anaerob sein könnten, wurde allgemein anerkannt. Die Auffassung, daß Pilze Sauerstoff zum Wachsen brauchen, hielt sich, bis ORPIN (1975) nachwies, daß bestimmte begeißelte Zellen - früher fälschlich den Protozoen zugeordnet - in Wirklichkeit Zoosporen anaerober Pilze sind (s. Tab. 2.2).
Tab. 2.2: Höhepunkte in der Entdeckung anaerober Pilze
Jahr Höhepunkte Autor
1910;
1913
einzelbegeißelte, sphärisch bis ovoide Einzeller, die für Protozoen gehalten werden, werden entdeckt;
unterschiedliche morphologische Typen werden be- schrieben und in verschiedene Gattungen eingeteilt: Cal- limastix (heute Neocallimastix) frontalis, Piromonas (heute Piromyces) communis und Sphaeromonas (heute Caecomyces) communis
LIEBETANZ;
BRAUNE
1929;
1961;
1966;
1994
vielbegeißelte Organismen, die C. frontalis (BRAUNE 1913) ähnlich sind, werden in verschiedenen Tieren ge- funden: C. equi im Caecum des Pferds (HSUING 1929), C. jolepsi in einer Lungenschnecke (BOVEE 1961) und C. cyclopis im Krustentier Cyclops stenuus (VAVRA u.
JOYON 1966);
Untersuchungen zu C. cyclopsis ergeben, daß dieser
“Flagellat” eine Pilzzoospore mit einer plasmodischen, vegetativen Phase ist, die sich in der Körperhöhle eines Wirts entwickelt und “Flagellaten” freisetzt, durch die in einem neuen Wirt der Lebenszyklus fortgesetzt wird (ORPIN 1994)
HSUING;
BOVEE;
VAVRA u. JOYON;
ORPIN
1960 es wird festgestellt, daß die begeißelten Organismen in Form und Gestalt der vegetativen Pilzphase ähnlich sind, und daß ihr Lebenszyklus dem aquatischer Phycomyce- ten, besonders den Chytridiomyceten, gleicht
SPARROW
1966 Callimastix frontalis (BRAUNE 1913) wird den Zooflagel- laten, Gattung Neocallimastix, zugeordnet
VAVRA u.
JOYON 1966 die Populationskinetik im Schaf wird untersucht:
die Anzahl Callimastix (Neocallimastix) frontalis ähnlicher Organismen steigt eine Stunde nach der Fütterung an
WARNER
1974 der Anstieg der Populationsdichte ist größer als von WARNER (1966) festgestellt wurde (Maximum 15 bis 30 Min. nach der Fütterung); er wird in vitro verdoppelt, wenn große, von der Pansenflüssigkeit abzentrifugierte, Verdauungsfragmente mit einem Extrakt aus Hafer in Wasser behandelt werden; die Flagellaten auf oder in den Pflanzenfragmenten bzw. reproduktive Phasen der Organismen werden dafür verantwortlich gemacht
ORPIN
Fortsetzung s. nächste Seite
Tab. 2.2: Fortsetzung
Jahr Höhepunkte Autor
1975, 1976, 1977 a, b, 1994;
1979 a, b, 1980, 1981
die Flagellaten sind begeißelte Zoosporen anaerober Pansenpilze; sie leben saprophytisch im Pansen und Verdauungstrakt von Herbivoren und entwickeln sich dort zur vegetativen Form
ORPIN;
BAUCHOP 1975,
1976, 1977 a
anaerobe Pansenpilze werden aus dem Schafpansen isoliert
ORPIN
1976, 1977 a, 1994;
1986
Sphaeromonas (Caecomyces) communis, Piromonas (Piromyces) communis, Neocallimastix patriciarum und nicht identifizierte, morphologisch unterschiedliche Stämme werden kultiviert; sie haben alle ähnliche Le- benszyklen, sind strikt anaerob und cellulolytisch aktiv
ORPIN;
ORPIN u. MUNN 1977 a die Zellwand der Organismen enthält Chitin ORPIN
1980, 1983 anaerobe Pansenpilze werden in Rind, Reh, Impala und Känguruh entdeckt
BAUCHOP 1981 a, b aus dem Verdauungstrakt des Pferds werden anaerobe
Pansenpilze isoliert
ORPIN 1983 die Gattungsbeschreibung Neocallimastix wird anerkannt HEATH et al.
1983 anaerobe Pansenpilze werden im Elefanten entdeckt BAUCHOP 1985 anaerobe Pansenpilze werden in Rentieren gefunden ORPIN et al.
1986 a;
1989
die Flagellatenzellwand enthält Chitinsynthetase BROWNLEE;
GAY et al.
1987 b aus Speiseröhre und Kot von Schafen werden anaerobe Pansenpilze isoliert
LOWE et al.
1988 anaerobe Pansenpilze werden in Ziegen entdeckt ORPIN u. JOBLIN 1988 im Moschus werden anaerobe Pansenpilze gefunden ORPIN et al.
1988 anaerobe Pansenpilze werden aus Kamel und Nashorn isoliert
JOBLIN 1991;
1992;
1992
die Guanin-Cytosin-Verhältnisse anaerober Pansenpilze werden analysiert; die Basensequenzen der 5 S und 18 S rRNA bestätigten nochmals, daß die Pansenpilze echte Pilze und keine Protozoen sind und eine monophyleti- sche Gruppe mit großer Ähnlichkeit zwischen den Arten bilden
DORÉ u. STAHL;
BOWMAN et al.;
LI u. HEATH
2.1.3 Nomenklatur und taxonomische Stellung anaerober Pansenpilze
Nomenklatur und taxonomische Stellung (s. Tab. 2.3) der anaeroben Pansenpilze haben sich seit ihrer Entdeckung (LIEBETANZ 1910; BRAUNE 1913) laufend verändert und sind auch heute noch im Wandel begriffen.
Tab. 2.3: Systematik der anaeroben Pansenpilze
Reich: Mycota, Pilze
I. Abteilung: Myxomycota, Schleimpilz II. Abteilung: Eumycota, echte Pilze I. Unterabteilung: Mastigomycotina
Klasse: Chytridiomycetes/Chytridiomycota Ordnung: Neocallimastigales
Familie: Neocallimastiaceae/Neocallimastigaceae Gattung: Anaeromyces
Art: A. elegans*1 (HO et al. 1990, 1993 b) Art: A. mucronatus (BRETON et al. 1990) Gattung: Caecomyces
Art: C. communis*2 (GOLD et al. 1988) Art: C. equi (GOLD et al. 1988)
Gattung: Neocallimastix
Art: N. frontalis (HEATH et al. 1983)
Art: N. patriciarum*3 (ORPIN u. MUNN 1986; MUNN et al. 1981, 1987, 1988 a, b; YARLETT et al. 1986 a, b)
Art: N. hurleyensis (WEBB u. THEODOROU 1988, 1991) Art: N. variabilis (HO et al. 1993 a)
Art: Stamm StO5 (ORPIN 1994) Gattung: Orpinomyces
Art: O. bovis (BARR et al. 1989) Art: O. joyonii*4 (BRETON et al. 1989) Gattung: Piromyces
Art: P. communis*5 (ORPIN 1977 a; GOLD et al. 1988; BARR et al.
1989)
Art: P. mae (LI et al. 1990) Art: P. dumbonica (LI et al. 1990)
Art: P. rhizinflata (LI et al. 1990; BRETON et al. 1991) Art: P. minutus (HO et al. 1993 c)
Art: P. spiralis (HO et al. 1993 d)
*1 ehemals: Ruminomyces elegans (HO et al. 1990); *2 ehemals: Sphaeromonas communis (ORPIN 1976); *3 ehemals: Neocallimastix frontalis (ORPIN 1975); *4 ehemals: Orpinomyces bovis (BARR et al. 1989) und Neocallimastix joyonii (BRETON et al. 1989); *5 ehemals:
Piromonas communis (ORPIN 1977 b)
Die Gattungszuordnung der anaeroben Pansenpilze basiert auf der Grundlage der mono- zentrischen und polyzentrischen Thalli, der filamentösen oder bulösen Rhizoide und der mono- oder polybegeißelten Zoosporen (s. Abb. 2.1). Die Artzugehörigkeit wird hauptsäch- lich durch die Feinstruktur der Zoosporen (MUNN et al. 1988 a, b; MUNN 1994) und die der
Kinetosomen (BARR 1981, 1988) bestimmt. Ein einfacher Schlüssel zur Identifizierung und Bestimmung der Gattung anaerober Pansenpilze ist in Tab. 2.4 dargestellt.
Tab. 2.4: Schlüssel zur Identifizierung anaerober Pilze und Gattungszuordnung (ORPIN 1994)
1 Vegetatives Wachstum: monozentrisch polyzentrisch
s. 2 s. 5 2 Zoosporen mit mehr als 7 (bis 15) Geißeln
Zoosporen mit 1 bis 4 Geißeln
Neocallimastix s. 3
3 Vegetatives Wachstum mit bulösem Rhizoid
Vegetatives Wachstum ohne bulöses Rhizoid; filamentöses Rhizoid s. 4
Piromyces 4 Nur ein bulöses Rhizoid und (in alten Kulturen) dicke Filamente
Einige fibrilläre oder korallenartige Rhizoide
Sphaeromyces Caecomyces 5 Einzelbegeißelte Zoosporen
Vielbegeißelte Zoosporen
Anaeromyces (Ruminomyces) Orpinomyces
Alle bislang beschriebenen Arten anaerober Pansenpilze bilden Zoosporen aus und werden in den Stamm Chytridiomycota (MOUNTFORT u. ORPIN 1994), Abteilung Eumycotina, Un- terabteilung Mastigomycotina, eingeordnet (BARR 1988; BARR et al. 1989; SPARROW 1960; ORPIN u. JOBLIN 1997). Die Mastigomycotina umfassen eine Reihe phylogenetisch nicht verwandter Klassen (BARR 1988), denen nur die Bildung von Zoosporen gemeinsam ist. Zu dieser Unterabteilung gehört auch die Klasse der Chytridiomycetes mit den Ordnun- gen Spizellomycetales, zu der die anaeroben Pansenpilze wegen ihrer Zoosporenfeinstruktur ursprünglich gerechnet wurden, sowie Neocallimasticales (= Neocallimastigales; HEATH et al. 1983; BARR 1988). Innerhalb der Familie Neocallimastigaceae (Ordnung Neocallimastigales) gibt es fünf Gattungen (ORPIN 1994; THEODOROU et al. 1996) mit einzel- oder vielbegeißelten Zoosporen und mit monozentrischem oder polyzentrischem Thallus (s. Tab. 2.5).
Obwohl aktuelle Familienbeschreibungen auch Pansenpilze, deren Zoosporen zwei Geißeln tragen (LIEBETANZ 1910; ORPIN 1994), mit berücksichtigen, ist bis jetzt keine Art bekannt, die überwiegend zweibegeißelte Zoosporen hat. In Reinkulturen einzelbegeißelter Arten wie z. B. Piromyces (BARR et al. 1989; KUDO et al. 1990) und Sphaeromonas (ORPIN 1976) kommen auch zwei-, drei und vierbegeißelte Zoosporen nur in geringer Zahl vor. Da im Pan- sen und in Kulturen undifferenzierte Zoosporen von Sporangien als vielbegeißelte Strukturen (ORPIN 1975) freigesetzt werden, ist anzunehmen, daß die zwei-, drei- und vierbegeißelten Zoosporen undifferenzierte Zoosporen einzelbegeißelter Arten darstellen.
Tab. 2.5: Vorkommen verschiedener Gattungen/Arten anaerober Pilze in Herbivoren
Gattung/Art Herkunft Autor u. Jahr
Neocallimastix N. frontalis N. patriciarum*3 N. hurleyensis N. variabilis
Schaf Schaf Schaf Kuh
HEATH et al. 1983 ORPIN u. MUNN 1986
WEBB u. THEODOROU 1991 HO et al. 1993 a
Orpinomyces
O. joyonii*4 Schaf BRETON et al. 1989
Piromyces*6 P. communis*5 P. mae
P. dumbonica P. rhizinflata P. minutus P. spiralis
Schaf Pferd Elefant Elefant Reh Ziege
GOLD et al. 1988 LI et al. 1990 LI et al. 1990
BRETON et al. 1991 HO et al. 1993 c HO et al. 1993 d Caecomyces*6
C. communis*2 C. equi
Schaf Pferd
GOLD et al. 1988 Anaeromyces
A. elegans*1 A. mucronatus
Kuh Schaf
HO et al. 1993 b BRETON et al. 1990
*1 ehemals: Ruminomyces elegans (HO et al. 1990); *2 ehemals: Sphaeromonas communis (ORPIN 1976); *3 ehemals: Neocallimastix frontalis (ORPIN 1975); *4 ehemals: Orpinomyces bovis (BARR et al. 1989) und Neocallimastix joyonii (BRETON et al. 1989); *5 ehemals:
Piromonas communis (ORPIN 1977 b); *6 Sphaeromonas und Piromonas wurden zu Caecomyces u. Piromyces
Die vielbegeißelten Arten gehören zur Gattung Neocallimastix mit fünf Arten und der Gattung Orpinomyces mit zwei Arten (s. Tab. 2.3 u. Tab. 2.5). Die Gattung Neocallimastix ist für mo- nozentrische Arten mit vielbeißelten Zoosporen gebildet worden (ORPIN 1977). Die Be- schreibung der Gattung Neocallimastix (HEATH et al. 1983) basiert auf der Ultrastruktur der Zoosporen bzw. der Kinetosomen von N. frontalis (BRAUNE 1913). Die Originalbeschrei- bung der Gattung Neocallimastix wurde schließlich von ORPIN u. MUNN (1986) vervollstän- digt, um N. patriciarum mit einzubeziehen.
Es gab bezüglich der Identität innerhalb dieser Gattung anfangs gewisse Unstimmigkeiten.
Es stellte sich heraus, daß Orpin und Bauchop (ORPIN 1994) zwei unterschiedliche Arten als N. frontalis (HEATH et al. 1983) beschrieben hatten. Der von Orpin bis 1986 (ORPIN 1994) untersuchte Pansenpilz wurde daraufhin in N. patriciarum (ORPIN u. MUNN 1986) umbenannt.
Zu den einzelbegeißelten Gattungen zählen Piromyces (GOLD et al. 1988; LI et al. 1990) mit sechs Arten, Caecomyces (GOLD et al. 1988) mit zwei Arten und einer noch nicht näher beschriebenen Art aus dem Verdauungstrakt des schwarzen Nashorns sowie Anaeromyces (BRETON et al. 1990) mit zwei Arten (s. Tab. 2.3 u. Tab. 2.5).
Piromyces communis wurde von LIEBETANZ (1910) und ORPIN (1977 a) unter dem Namen Piromonas communis beschrieben. Als feststand, daß es sich um einen Pilz und nicht um ein Protozoon handelte, wurde er in Piromyces communis umbenannt (GOLD 1988). BARR et al. (1989) bewirkten daraufhin weitere Änderungen in der Gattungsbeschreibung.
Caecomyces communis, den LIEBETANZ (1910) und ORPIN (1976) anfangs als Sphaero- monas communis bezeichneten, wurde in Caecomyces communis umbenannt (GOLD et al.
1988). ORPIN (1994) hielt jedoch entgegen, daß Sphaeromonas und Caecomyces unter- schiedlich seien (s. Kap. 2.1.6.1.1.4).
Anaeromyces elegans war zuerst die Typspezies der Gattung Ruminomyces (HO u.
BAUCHOP 1990), wurde aber dann der Gattung Anaeromyces zugeordnet.
2.1.4 Vorkommen und Verbreitung anaerober Pansenpilze
Anaerobe Pansenpilze kommen in herbivoren Säugetieren vor (s. Tab. 2.6 u. Tab. 2.7) und können aus allen Bereichen des Verdauungstrakts (Pansen, Omasum, Abomasum, Dünn- und Dickdarm, Caecum und Rectum) isoliert werden (DAVIES et al. 1993 a, b; ORPIN 1994).
Tab. 2.6: Verbreitung der einzelnen Gattungen anaerober Pansenpilze in Ruminanten
Tierart Pilzgattung Autor u. Jahr
Schaf (Ovis aries) Rind (Bos taurus)
Rind (Bos indicus) Ziege (Capra hircus) Schaf (Ammatragus lervia) Gaur (Bos gaurus) (Kot)
Moschusochse (Ovibos moschatus) Moufflon (Ovis ammon musimon) Wasserbüffel (Bubalus arnee) Rotwild (Cervus elephus) Impala (Aepyceros melampus) Norwegisches Rentier (Rangifer tarandus)
Svalbard Rentier (Rangifer tarandus platyrhynchus)
N, P, S, O N, P, S, O, A
N, P N, S, P S, N S, N S, P S, N, P S, N, O Sp Sp N N
ORPIN 1975, 1977,1976; LOWE et al.
1987 d
BAUCHOP 1979 a, b; HEATH et al.
1983; BARR et al. 1989; HO u.
BAUCHOP 1990
PHILLIPS 1988; HO et al. 1988 b ORPIN u. JOBLIN 1988
ORPIN u. JOBLIN 1988 MILNE et al. 1989 ORPIN u. JOBLIN 1988 ORPIN u. JOBLIN 1988
PHILLIPS 1988; HO et al. 1988 a BAUCHOP 1980
MILNE et al. 1989 ORPIN u. JOBLIN 1988 ORPIN et al. 1988
N = Neocallimastix spp.; P = Piromyces spp.; S = Sphaeromyces spp.; O = Orpinomyces spp.; A = Anaeromyces spp.; Sp = unidentifizierte Sporangie
Vegetative Phase und Zoosporen anaerober Pansenpilze sind strikt anaerob und können nicht außerhalb ihres Wirts existieren (ORPIN 1981 a; LOWE et al. 1987 b; TRINCI et al.
1988). Dennoch wurden Pansenpilze aus Omasum, Dünndarm und Kot isoliert, die Tem- peraturschwankungen, Trocknung und Luftzufuhr bis zu zehn Monate überlebten (TRINCI et al. 1988; MILNE et al. 1989; THEODOROU et al. 1990; DAVIES et al. 1993 b). Darüber- hinaus war die Pilzpopulation im Kot vergleichbar mit der im Pansen (104 bis 105 tfug-1; THEODOROU et al. 1990; DAVIES et al. 1993 b).
Dieser Widerspruch veranlaßte THEODOROU et al. (1990) nach einem resistenten Stadium oder einem Überdauerungsstadium (Zyste oder resistente Sporangie) zu suchen. WUBAH et al. (1991) entdeckten daraufhin dickwandige Sporangien, die Melanin und hohe DNA Ge- halte aufwiesen. Allerdings waren diese nicht lebensfähig. DAVIES et al. (1993 a) und
THEODOROU et al. (1993) versuchten mehrmals, vergleichbare Strukturen anaerober Pan- senpilze aus getrocknetem Panseninhalt zu gewinnen. Aber selbst bei Einhaltung anaerober Bedingungen während der Waschung und Trocknung blieben sie lange erfolglos. Schließlich isolierten THEODOROU et al. (1996) das Überdauerungsstadium eines anaeroben Pansen- pilzes aus Wiederkäuerkot und DAVIES et al. (1993 b) fügten dem Lebenszyklus der anaero- ben Pansenpilze ein Überdauerungsstadium hinzu (s. Abb. 2.1).
bewegliche Zoospore Vegetative Phase
Lebenszyklus B
Überdauerungsstadium
Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Lebenszyklus anaerober Pansenpilze Der Lebenszyklus A stellt die Entwicklung im Pansen dar, während der
Zyklus B ( ) einen alternativen Weg im Falle sich verschlechternder Um- weltbedingungen aufzeigt (THEODOROU et al. 1996).
Tab. 2.7: Lokalisation anaerober Pilze in Herbivoren
Herbivore Herkunft Autor u. Jahr
Äthiopisches (Zebus) Rind (Bos sp.) Kot MILNE et al. 1989 Äthiopisches Schaf (Ovis sp.) Kot MILNE et al. 1989 Afrikanischer Elefant (Loxodonta africana) Kot BAUCHOP 1979 b Asiatischer Elefant (Elephas maximus) Kot MILNE et al. 1989 Arabischer Oryx (Oryx leucoryx) Kot MILNE et al. 1989
Axisreh (Cervus axis) Kot LAWRENCE 1993
Baktrian Kamel (Camelus bactrianus) Kot MILNE et al. 1989
Blue Duiker (Cephalophus monticola) Pansen, Caecum DEHORITY u. VARGA 1991 Bongo (Taurotragus euryceros) Kot MILNE et al. 1989
Chinisches Wasserreh (Hydropotes inermis)
Kot ORPIN 1981 a
Gewöhnliches Zebra (Equus burchelli) Kot MILNE et al. 1989 Domestiziertes Rind (Bos taurus) Verdauungstrakt,
Kot
MILNE et al. 1989; DAVIES et al. 1993 b
Domestiziertes Schaf (Ovis aries) Verdauungstrakt, Kot
MILNE et al. 1989;
LOWE et al. 1987 d;
DAVIES et al. 1993 b Domestizierte Ziege (Capra hircus) Pansen, Kot ORPIN u. JOBLIN 1988;
Fortsetzung s. nächste Seite
Lebenszyklus A
Tab. 2.7: Fortsetzung
Herbivore Herkunft Autor und Jahr
Gaur (Bos gaurus) Kot MILNE et al. 1989
Graues Kängeruh (Macropus giganticus) Vormagen BAUCHOP 1983;
THEODOROU et al. 1996 Großer Kudo (Tragelaphus strepsiceros) Kot MILNE et al. 1989
Impala (Aepyceros melampus) Pansen BAUCHOP 1979 b Indisches Nashorn (Rhinoceros unicornis) Kot TEUNISSEN et al. 1991 Japanisches Reh (Cervus nippon) Pansen HO et al. 1993 a
Kedah kelantan Rind (Bos indicus) Pansen ORPIN 1981 a, b Lama glama
Lama guanicoe
Lama pacos
Kot Kot
Kot
MILNE et al. 1989;
MILNE et al. 1989;
MARVIN-SIKKEMA et al.
1990;
MILNE et al. 1989 Mara (Dolichotis patagonum) Kot TEUNISSEN et al. 1991 Moschusochse (Ovibos moschatus) Pansen ORPIN et al. 1981 a Nilgai (Boselaphus tragocamelus) Kot LAWRENCE 1993 Onager (Equus hemionus onager) Kot LAWRENCE 1993 Pére Davids Reh (Elaphunis davidianus) Kot LAWRENCE 1993 Pferd (Equus caballus) Kot, Caecum BAUCHOP 1979 b;
ORPIN 1989 Przewalski Pferd (Equus caballus
przewalski)
Kot LAWRENCE 1993
Redneck Wallaby (Macropus rufogrieseu) Vormagen BAUCHOP 1983 Roan Antilope (Hippotragus equinus) Kot MILNE et al. 1989
Rotwild (Cervus elaphus) Pansen BAUCHOP 1979 b
Schwarzes Nashorn (Diceros bicornis) Kot ORPIN u. JOBLIN 1988;
TEUNISSEN et al. 1991 Scimitar gehörntes Oryx (Oryx dammah) Kot LAWRENCE 1993 Svalbard Rentier (Rangifer tarandus
platyrhynchus)
Pansen ORPIN et al. 1985 Swamp Wallaby (Wakkabua bicolor) Vormagen BAUCHOP 1983
Vicuna (Vicugna vicugna) Kot MILNE et al. 1989
Walleroo (Macropus robustus) Vormagen BAUCHOP 1983
Wapiti (Cervus canadiensis) Kot LAWRENCE 1993
Wasserbüffel (Bubalus bubalis) Pansen HO et al. 1988 a;
FOONG et al. 1987
Yak (Bos trunniens) Kot SIJTSMA u. TAN 1993
2.1.5 Übertragung anaerober Pansenpilze von Tier zu Tier und Entwicklung der Pilzpopulation in Jungtieren
Pansenpilze werden zwischen Tieren über Aerosole, über getrockneten Kot und wahrschein- lich auch über “Grooming”, d. h. über die Körperpflege untereinander, ausgetauscht (ORPIN 1989; ORPIN u. JOBLIN 1988, 1997). Dabei ist das von THEODOROU et al. (1993) ent- deckte Überdauerungsstadium von Bedeutung (s. Kap. 2.1.4). Allerdings ist noch unbekannt, welcher Faktor das Wachstum des Überdauerungsstadiums auslöst. So ist es in vitro not- wendig, alte Kulturen in neue Medien zu übertragen, um ruhende Kulturen von Neocallimastix sp. wiederzubeleben (JOBLIN 1981).
In den ersten zehn Tagen nach der Geburt kommt es beim Schaf zur Übertragung von Pan- senpilzen von der Mutter auf die Nachkommen (FONTY et al. 1987). Es bilden sich schnell große, aber nicht stabile Populationen. Später, wenn das Tier faserhaltiges Futter aufnimmt und sich der Pansen in ein voll funktionsfähiges Organ entwickelt hat, stabilisiert sich die Pilzpopulation. Diese kann in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Futters variieren.
So benötigen einige Pilze strukturelle, andere nicht strukturelle Kohlenhydrate (FONTY et al.
1987; FONTY u. GRENET 1994).
ORPIN u. JOBLIN (1997) demonstrierten, daß auch die Übertragung von Pilzen zwischen Ruminanten und Nicht-Ruminanten möglich ist. Pilzkulturen aus Rentier- und Pferdekot wur- den im Pansen isoliert aufgezogener Lämmer inokuliert und bildeten große, stabile Popula- tionen.
2.1.6 Lebenszyklus, Aufbau und Ultrastruktur anaerober Pansenpilze 2.1.6.1 Lebenszyklus
Der Lebenszyklus (s. Abb. 2.2 u. Kap. 2.1.4) anaerober Pansenpilze (ORPIN 1975, 1976, 1977 a, 1994; ORPIN u. MUNN 1986) besteht aus einem Wechsel zwischen einer nicht be- weglichen vegetativen Phase (= Thallus; s. Abb. 2.3) mit einem oder mehreren fruchtenden Körpern (= Sporangie; s. Abb. 2.3) und einer frei beweglichen (mobilen) Phase (= Zoospo- ren; s. Abb. 2.3). Er dauert bei Neocallimastix spp. ungefähr 24 bis 32 Stunden (JOBLIN 1981; BAUCHOP 1983; LOWE et al. 1987 a). Die Zoosporogenese junger Sporangien kann aber unter guten Bedingungen (z. B. kontinuierliche Fütterung) schon acht Stunden nach der Verkapselung abgeschlossen sein (ORPIN 1977 c; LOWE et al.1987 a; FRANCE et al. 1990;
THEODOROU et al. 1993; ORPIN u. JOBLIN 1988, 1997).
Abb. 2.2: Schematischer Lebenszyklus eines monozentrischen anaeroben Pansenpilzes
Die vegetative Phase (Thallus) lebt saprophytisch auf Pflanzenteilen. Die Rhizoide der Pilzthalli durchbohren die Pflanzenteile und breiten sich in ihnen aus, während sich auf der Pflanzenoberfläche Sporangien entwickeln (s. Abb. 2.2). Form und Gestalt der Sporangien sind sehr unterschiedlich (BAUCHOP 1980). Nach Entwicklung und Reifung der Sporangien werden zahlreiche begeißelte Zoosporen aus ihnen freigesetzt (Zoosporulation; s. Abb. 2.2).
Abb. 2.3: Mobile und vegetative Phase eines anaeroben Pansenpilzes
Die Zoosporogenese und Freisetzung der Zoosporen findet, wenn Tiere einmal pro Tag ge- füttert werden, kurz nach der Fütterung statt (ORPIN 1975, 1976, 1977 a). Die Zoosporen sind vielgestaltig und haben eine oder mehrere rückwärts gerichtete Geißeln oder einen Geißelapparat. Sie sind aktiv beweglich bzw. können sich amöboid fortbewegen, um die op- timale Stelle für die Verkapselung (Enzystierung; s. Abb. 2.2) zu finden (ORPIN u. JOBLIN 1988). Dadurch besiedeln sie frisch aufgenommene Pflanzenteile (ORPIN 1977 a, b) oder
reinfizieren dasselbe Gewebe, soweit es noch intakte Bereiche aufweist. Sie können meh- rere Stunden beweglich in der Pansenflüssigkeit verweilen, bevor sie sich ansiedeln und enzystieren (LOWE et al. 1987 a; FRANCE et al. 1990). Kurz vor der Enzystierung werfen sie ihre Geißeln ab und bilden einen Pilzthallus aus (BAUCHOP 1979 a, b, 1980, 1981; s.
Abb. 2.2).
Bei Neocallimastix wird die maximale Zoosporendichte 15 bis 30 Minuten nach der Fütterung erreicht (ORPIN 1974, 1975), bei Caecomyces und Piromyces erst nach etwa einer Stunde (ORPIN 1976, 1977 a). Die Zoosporogenese wird bei Neocallimastix durch eine wasserlös- liche Komponente im Futter ausgelöst (WARNER 1966; ORPIN 1974, 1977 c). Hierbei scheint u. a. Haem (s. Kap. 2.1.8) eine Rolle zu spielen (ORPIN u. GREENWOOD 1986 a).
Freie Zoosporen von Neocallimastix zeigen eine chemotaktische Reaktion auf gelöste Koh- lenhydrate (ORPIN u. BOUNTIFF 1978). Diese sind in frisch verdauten Pflanzenteilen ent- halten und diffundieren in die Pansenflüssigkeit. Die Zoosporen finden diese Pflanzenfrag- mente, indem sie sich entlang des Kohlenhydratgradienten zu den beschädigten Oberflä- chenbereichen bewegen (ORPIN u. JOBLIN 1988, 1997). Bisher sind vier Chemorezeptoren für Glucose, Fructose, Mannitol und Mannose identifiziert worden. Aber auch niedrige Kon- zentrationen von Glucose-Sucrose-Fructose-Mischungen können von Zoosporen entdeckt werden. Die chemotaktische Antwort ist sehr sensitiv und findet bereits bei einer Konzentra- tion von 1 µl Sucrose statt (ORPIN u. JOBLIN 1988, 1997).
Anaerobe Pansenpilze bilden, bei sich verschlechternden Umweltbedingungen, Über- dauerungsstadien (Zysten oder resistente Sporangien; THEODOROU et al. 1990). Diese resistenten Stadien sind offensichtlich in der Lage, für gewisse Zeit auch in einer nicht anae- roben Umgebung zu überleben, und spielen bei der Übertragung zwischen den Tieren eine Rolle (s. Kap. 2.1.4 u. Kap. 2.1.5). HO et al. (1988 a) fanden außerdem warzenartige Spo- ren, die nach dem Aufbrechen nur zwei bis vier Zoosporen entlassen. Sie sollen aufgrund ihrer Morphologie pilzlichen Ursprungs sein. Diese Strukturen sind allerdings noch nicht in in- vitro-Kulturen beobachtet worden. ORPIN u. JOBLIN (1997) nehmen an, daß diese warzen- artigen Sporen das Ergebnis der Fusion zweier Zoosporen sind. Dieses läßt auf eine mög- liche, aber bisher noch nicht bewiesene sexuelle Phase im Lebenszyklus anaerober Pan- senpilze schließen.
2.1.6.1.1 Lebenszyklus monozentrischer Gattungen
Bei monozentrischen Arten (Neocallimastix, Piromyces und Sphaeromyces/Caecomyces) kann die Entwicklung endogen oder exogen erfolgen. Bei der endogenen Entwicklung wan- delt sich der Kern in eine enzystierte Zoospore um, die sich in ein Sporangium vergrößert.
Bei der exogenen Entwicklung wandert der Kern aus der Zoospore heraus und das Sporan- gium bildet sich im Keimschlauch oder der Sporangiophore (KARLING 1978; BARR et al.
1989; HO et al. 1993 c). In beiden Fällen wird nur ein Sporangium pro Thallus gebildet. Die vorhandenen Kerne multiplizieren sich während der Entwicklung des Sporangiums und sind nicht mehr im rhizoidalen System zu finden (LOWE et al. 1987 c). Die Zoosporogenese gip- felt in der Produktion eines kernlosen vegetativen Thallus, der sich nicht mehr weiter ent- wickeln kann und sich nach der Zoosporenfreisetzung auflöst (LOWE et al. 1987 a, b). Die begrenzte Lebensdauer der vegetativen Phase ist unter Chytriden weit verbreitet (THEODOROU et al. 1996).
2.1.6.1.2 Lebenszyklus polyzentrischer Gattungen
Bei polyzentrischen Arten (Anaeromyces und Orpinomyces) ist die Entwicklung exogen. Auf die Enzystierung der Zoospore folgt die Bildung eines Rhizoids (ORPIN 1994) in das die Kerne einwandern (BARR et al. 1989; GAILLARD et al. 1989). Das Rhizoid ist stark ver- zweigt, häufig verflochten und vielkernig. Mitten oder endständig im Rhizoid bilden sich auf Sporangiophoren Sporangien. Sie bilden sich etweder einzeln oder in Gruppen bis zu sechs Stück (BARR et al. 1989; BRETON et al. 1989; HO et al. 1990). Anders als bei monozentri- schen Arten ist dadurch kein zentraler Kern aus Sporangien zu sehen (ORPIN 1994). Nach der Reifung entlassen die Sporangien Zoosporen mit 1 bis 16 Geißeln (BRETON et al. 1989, 1990; HO et al. 1990).
Da die vegetative Reproduktion durch die Fragmentierung des Rhizoids erfolgt, ist der Le- benszyklus polyzentrischer Pilze unbegrenzt und das Überleben weniger von der Umwand- lung zu Zoosporen abhängig (BRETON et al. 1989; THEODOROU et al. 1996). Die Fähigkeit polyzentrischer Arten viele Sporangien pro Thallus (= polyzentrischer Thallus) zu bilden, gilt als großer Entwicklungsschritt in der Evolution der Chytridiomyceten (BARR 1983).
2.1.6.2 Identifizierung von Pilzphasen und Pilzstrukturen im Lebenszyklus anaerober Pansenpilze mittels Antikörper
Verschiedene Entwicklungsstufen (vegetative Phase, freie und enzystierte Zoosporen) und Strukturen (Thallus, Rhizoid, Sporangien und Geißelapparat) anaerober Pansenpilze können mittels monoklonaler und polyklonaler Antikörper identifiziert und quantitativ erfaßt werden (s. Tab. 2.8), um
1. die Pilzentwicklung,
2. die Gattungs-, Art- und Isolatspezifitäten,
3. die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen den Pansenpilzen und
4. die Wirtstiere zu untersuchen und zu bestimmen (THEODOROU et al. 1996).
Zur Immunisierung von Ratten bzw. zur monoklonalen und polyklonalen Antikörperproduk- tion wird Tieren gewaschene Pilzbiomasse injiziert. Drei Ratten, denen die Schafisolate, Neocallimastix Ed2, SR1 und N. hurleyensis injiziert wurden, produzierten polyklonale Anti- körper. Diese reagierten mit fast allen morphologischen Strukturen, u. a. mit dem Rhizoid, den Sporangien, Zoosporen und Flagellen (THEODOROU et al. 1996).
Tab. 2.8: Isolierung verschiedener polyklonaler und monoklonaler Antikörper anaerober Pansenpilze, ihre Antigenerkennung und Besonderheiten (THEODOROU et al. 1996)
Antikörper Herkunft aus einer Erkennt Antigen- struktur auf
Besonderheiten Polykonale An-
tikörper
SR1 zoo Balb/c Maus, im- munisiert mit fixierten Zoosporen von Neocallimastix sp. SR1 (Schaf)
Flagellen, die in der gesamten Länge des Flagellums vor- kommen u. die mit einem 45 kDa Pro- tein korrespondieren
Antikörper markiert alle Flag- ellen der speziellen SR1 Zoo- spore oder gar keine; bisher konnte keine Kreuzreaktion mit anderen Pansenpilzen festge- stellt werden; SR1 ist aus einer einzelnen Kolonie subkultiviert worden, um sicherzustellen, daß es ein einzelner Klon ist u.
daß die Färbetechniken bei diesem Klon gleich geblieben sind; das Auftreten oder Nicht- Auftreten des Antigens, daß durch den Antikörper erkannt wird, wird entwicklungsabhän- gig reguliert
unbenannter Antikörper
Ratte, immunisiert mit Neocallimastix- stamm Ed2 (Schaf)
den meisten mor- phologischen Strukturen (Rhizoid, Sporangien, Zoo- sporen u. Flagellen) unbenannter
Antikörper
Ratte, immunisiert mit Neocallimastix- stamm SR1 (Schaf)
den meisten mor- phologischen Strukturen (Rhizoid, Sporangien, Zoo- sporen u. Flagellen) unbenannter
Antikörper
Ratte, immunisiert mit N. hurleyensis (Schaf)
den meisten mor- phologischen Strukturen (Rhizoid, Sporangien, Zoo- sporen u. Flagellen) Fortsetzung s. nächste Seite
Tab. 2.8: Fortsetzung
Antikörper Herkunft aus einer Erkennt Antigen- struktur auf
Besonderheiten monoklonale
Antikörper
CYST 1 Ratte, immunisiert mit Stamm ED2
enzystierten Zoo- sporen
Milzzellen wurden mit den Myelomazellinien Y3AG 1.2.3.
(668) fusioniert
6DI Ratte, immunisiert
mit N. hurleyensis
Oberfläche des Rhi- zoid
zeigt eine Kreuzreaktion gegen das Schalenchitin eines Kreb- ses
9A6 Zelloberfläche von
ED2 Zoosporen unbenannter
Antikörper
Ratte fixierten Zoosporen
unbenannter Antikörper
Ratte fixierten Zoosporen
8D3 Oberfläche aller
Flagellen einer spe- ziellen ED2 Zoo- spore
erkennt alle Antigenstrukturen oder keine
2.1.6.3 Aufbau und Ultrastruktur anaerober Pansenpilze
Die Arten/Gattungen (s. Tab. 2.5) unterscheiden sich untereinander in der Begeißelung der Zoosporen (einzel- und vielbegeißelt), in der Art ihres Wachstums (monozentrisch = ein Spo- rangium bzw. polyzentrisch = mehrere Sporangien) und der Morphologie und Entwicklung des Rhizoids (THEODOROU et al 1996; ORPIN 1994). Das Rhizoid kann stark verzweigt und spitz zulaufend wie bei Anaeromyces, Orpinomyces, Neocallimastix und Piromyces sein oder aus einem oder mehreren kugeligen Körpern wie bei Caecomyces bestehen (ORPIN 1976, 1977 b, 1994; GOLD et al. 1988). Die Ultrastruktur der anaeroben Pansenpilze, beson- ders die der Zoosporen, spielt bei der Pilztaxonomie eine große Rolle. Die Zelloberfläche wird von einer spezifischen Partikelschicht umgeben (MUNN et al. 1981) und setzt sich im Bereich der Geißeln aus parallel angeordneten Fibrillen zusammen. Die Zoosporen enthalten zwei Arten von Hydrogenosomen (YARLETT et al. 1986 a), die mit den Kinetosomen (MUNN et al. 1981) und kleinen behüllten bläschenartigen Strukturen (MUNN et al. 1988 a, b) ver- bunden sind. Sie finden sich überall im Rhizoid und in nicht differenzierten Sporangien. Ri- bosomen liegen in Form von Ribosomenspiralen und Ribosomengranula vor (MUNN et al.
1981).
2.1.6.3.1 Monozentrische Gattungen 2.1.6.3.1.1 Neocallimastix
Der Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen ist in Tab. 2.9 dargestellt.
Tab. 2.9: Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen bei Neocallimastix Gattung/Art vegetative Phase Zoosporen
Neocallimastix einzelne Sporangie;
filamentöses Rhi- zoid
rund bis breit ellipsoid; vielbegeißelt; Geißelzahl variabel (MUNN et al. 1981; HEATH et al. 1983);
Geißeln entspringen aus zwei angrenzenden, fast parallelen Reihen; einzelne lokomotrische Orga- nelle mit fest zusammenliegendem Flagellarbündel;
Plasmalemm umhüllt von fibrösem Material (ORPIN 1994); zentraler Kern; Organellen in Hau- fen; fächerartig angeordnete Mikrotuben (ORPIN u.
JOBLIN 1988, 1997) N. patriciarum
(ORPIN u.
MUNN 1986)
vielverzweigtes Rhi- zoid
9 bis 17 Geißeln (ORPIN u. JOBLIN 1997); Orga- nellen (außer Hydrogenosomen) verstreut im Zy- toplasma
N. frontalis (HEATH et al.
1983)
wenig ausgedehntes Rhizoid (ORPIN 1994)
eingeschnürt/tailliert (ORPIN 1994); 7 bis 10 Gei- ßeln (ORPIN u. JOBLIN 1997); größere Organellen sind mit Zellende verbunden u. bilden zwei Haufen
2.1.6.3.1.2 Piromyces (Piromonas)
Der Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen ist in Tab. 2.10 dargestellt.
Tab. 2.10: Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen bei Piromyces Gattung/Art vegetative Phase Zoosporen
Piromyces ein oder zwei filamentöse Rhizoide;
monozentrisch
rund bis ovoid; einzelbegeißelt (selten zwei bis vier Geißeln;
ORPIN 1977; BARR et al. 1989;
KUDO et al. 1990) P. communis einzelnes stark verzweigtes, kleines
Rhizoid, z. T. unter einzelnem Spo- rangium vorgewölbt (ORPIN 1994;
ORPIN u. JOBLIN 1997); ovoid- längliches, unregelmäßiges, Spo- rangium, z. T. papillär
NF und F Sporangiophore sporangiennahe eingeschnürt (ORPIN 1994)
große Zoosporen (WILLIAMS u.
ORPIN 1987 a, b)
2.1.6.3.1.3 Caecomyces (Sphaeromonas)
Der Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen ist in Tab. 2.11 dargestellt.
Tab. 2.11: Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen bei Caecomyces
Gattung/Art vegetative Phase Zoosporen
Caecomyces unverzweigtes korallenartiges Rhizoid mit bla- senartigen Strukturen u. fibrillären Wurzeln (ORPIN 1976; WUBAH u. FULLER 1991); mo- nozentrisch/polyzentrisch; kurze und lange Spo- rangiophoren
rund, elipsoid oder amöboid (ORPIN 1994); einzelbegei- ßelt (selten zwei Geißeln); runde Haftscheibe; Orga- nellen verstreut oder in Haufen nahe Gei- ßelbasis; zweireihig, radiär liegende Mi- krotuben
(THEODOROU et al.
1996); Hydrogeno- somen liegen ver- streut zwischen den Flagellarwurzeln;
Ribosomen in Heli- ces u. Haufen;
Plasmalemm umge- ben von fibrösem Material
(THEODOROU et al.
1996) C. communis
(GOLD et al. 1988)
großgelapptes, korallenartiges Rhizoid (ORPIN 1994); monozentrisch/polyzentrisch
C. equi (GOLD et al. 1988)
ein/mehrere große blasenartige Strukturen mit einzelnen fibrillären Wurzeln (ORPIN 1994) Stamm aus dem
Schwarzen Nas- horn
verzweigtes Sporangium (ORPIN u JOBLIN 1997)
2.1.6.3.1.4 Sphaeromonas
ORPIN (1994) betrachtet Caecomyces und Sphaeromonas aufgrund des unterschiedlichen Rhizoids als getrennte Gattungen. Sphaeromonasarten besitzen im Gegensatz zu Caeco- mycesarten kein feinfilamentöses, korallenartiges oder blasenartiges Rhizoid und Caecomy- cesarten bilden anders als Caecomyces (Sphaeromonas) communis nur ein basenartiges Rhizoid. Der Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen ist in Tab. 2.12 dargestellt.
Tab. 2.12: Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen bei Sphaeromonas
Gattung/Art vegetative Phase Zoosporen
Sphaeromonas monozentrisch; kaum verzweigtes Rhizoid mit einer Sporangie bzw. einer oder mehreren run- den Strukturen (ORPIN 1976; MUNN et al. 1988 a, b)
rund, ellipsoid oder amöboid; einzelbe- geißelt; zentraler Kern; Organellen verteilt im Cyto- plasma; Hydrogeno- somen nahe bei Ki- netosomen; zusam- mengelagerte Ribo- somen; Plasmalemm umhüllt von fibrösen Material (ORPIN 1976; MUNN et al.
1988 a, b) S. (C.) communis Rhizoid z. T. mit kernhaltigen Filamenten
(WUBAH et al. 1991); kurze Sporangiophoren (ORPIN 1994)
2.1.6.3.2 Polyzentrische Gattungen 2.1.6.3.2.1 Orpinomyces
Der Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen ist in Tab. 2.13 dargestellt.
Tab. 2.13: Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen Orpinomyces
Gattung/Art vegetative Phase Zoosporen
Orpinomyces polyzentrisch; ausgedehntes, filamentöses, viel- kerniges Rhizoid (BRETON et al. 1989); end- ständig/mittig im Rhizoid liegende verzweigte Sporangiophore (ORPIN 1994)
vielbegeißelt; neocal- limastix-ähnlich (ORPIN u. JOBLIN 1997)
2.1.6.3.2.2 Anaeromyces
Die Gattung Anaeromyces ist zuerst von BRETON et al. (1990) beschrieben worden und scheint mit Ruminomyces (HO et al. 1990) identisch zu sein. Der Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen ist in Tab. 2.14 dargestellt.
Tab. 2.14: Aufbau der vegetativen Phase und der Zoosporen bei Anaeromyces
Gattung/Art Vegetative Phase Zoosporen
Anaeromyces polyzentrisch; filamentöses Rhiozoid einzelbegeißelt A. mucronatus
(BRETON et al.
1990)
polyzentrisch; starkverzweigtes, vielkerniges Rhizoid; elliptische Sporangien (29 bis 120 x 15 bis 75 µm)
rund; einzelbegeißelt (THEODOROU et al.
1996) A. elegans (HO et
al. 1993 b)
polyzentrisch; groß u. stark verzweige Hyphen, z.
T. eingeschnürt bzw. fein und wurzelähnlich;
einzelne, unverzweigte seitlich oder endständig liegende Sporangiophoren; einzelne breit el- lipsoide und fusiforme Sporangien mit scharfer Spitze (THEODOROU et al. 1996)
rund bis polymorph;
einzelbegeißelt (THEODOROU et al.
1996)
2.1.7 Chemische Zusammensetzung anaerober Pansenpilze 2.1.7.1 Lipide und Fettsäuren
Die Lipide von P. communis und Neocallimastix sp. sind sehr ähnlich (KEMP et al. 1984;
BODY u. BAUCHOP 1985 b). Die Hauptphospholipide sind Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin und Phosphatidylinositol. Pansenpilze enthalten aber keine Sphingoli- pide, Glycolipide, Plasmalogene oder Phosphonyllipide, wohl aber freie Fettsäuren, Triacyl- glycerole, 1,2- und 1,3-Diacylglycerole sowie geringe Mengen an Squalenen und einem Tri- terphenol, bei dem es sich vermutlich um Tetrahymanol handelt (ORPIN u. JOBLIN 1997).
Obwohl BODY u. BAUCHOP (1985 b) in einem Stamm von Neocallimastix sp. Sterol ent- deckt haben, bestehen noch Zweifel daran (KEMP et al. 1984; ORPIN u. JOBLIN 1988;
LOWE et al. 1987 a). Die anaerobe Lebensweise der Pansenpilze spricht gegen das Vor- handensein von Sterol, da für dessen Synthese molekularer Sauerstoff benötigt wird (ORPIN u. JOBLIN 1988). Zudem hemmen Amphotericin B oder Nystatin nicht wie bei anderen ste- rolsynthetisierenden Pilzen das Wachstum der anaeroben Pansenpilze (LOWE et al. 1987 a).
Etwa die Hälfte der Fettsäuren sind geradkettige, geradzahlige, 12 - 24 gesättigte Kohlen- stoffsäuren. Der Rest setzt sich aus geradzahligen, 16 - 24 einfach ungesättigten Kohlen- stoffsäuren, mit einer Doppelbindung an der 9 omega Position zusammen. Eine Ausnahme bildet die C16 Kohlenstoffsäure, bei der die Doppelbindung an Position 7 omega ist. Die Synthese flüchtiger Fettsäuren findet sowohl mit 14C-Acetat als auch mit 14C-Glucose statt (KEMP et al. 1984) und vermutlich existiert ein anaerober Weg für die Biosynthese mo- noenoischer flüchtiger Fettsäuren in Neocallimastix sp. (BODY u. BAUCHOP 1985 b). Lang- kettige Fettsäuren, z. B. 14C-markiertes Cholin, Ethanolamin und Serin, werden in komplexe Lipide eingebaut (ORPIN u. JOBLIN 1997). Ethanolamin wird in Phosphatidylcholin und in Phosphatidylethanolamin aufgenommen, während Serin entweder in Phosphatidyletha- nolamin oder in Phosphatidylserin eingebaut wird (ORPIN u. JOBLIN 1988).
2.1.7.2 Proteine und Aminosäuren
KEMP et al. (1985) bestimmten die freien und proteingebundenen Aminosäuren von zwei Pansenpilzen. Beide Pansenpilze weisen ein dem Kasein und der Luzerne Fraktion 1 Protein vergleichbares Aminosäurenprofil auf. Die Rohproteingehalte (N x 6,25) betragen für N.
patriciarum 44 % und für P. communis 42 %. Ungefähr 50 % der mittels HPLC Technik un- tersuchten Proteine haben ein Molekulargewicht von 200.000 kDa, 40 % eines von 50.000 kDa und die nativ dissoziierten Proteine eines zwischen 25.000 und 50.000 kDa.
2.1.7.3 Nukleinsäuren
Anaerobe Pansenpilze enthalten ein oder mehrere Satelliten-DNAs, darunter die mitochon- driale DNA und die DNA, die ribosomale Zistrone trägt. Die Guanin- und Cytosin-Gehalte anaerober Pansenpilze sind ungewöhnlich niedrig und machen weniger als 20 % aus (BROWNLEE 1986 b, 1989; BILLON-GRAND et al. 1991). Aufgrund der niedrigen Guanin- und Cytosin-Gehalte und der Ultrastruktur der anaeroben Pansenpilze bilden sie eine ho- mologe Gruppe, die sich von der Taxonomie anderer Pilze abhebt (LI u. HEATH 1992). Ade- nin- und Thymindinreiche Sequenzen finden sich weit verstreut im Genom (BROWNLEE 1989).
2.1.7.4 Chitin
Die Zellwände der vegetativen Phase anaerober Pansenpilze enthalten je nach Art zwischen 8 bis 22 % Chitin (ORPIN 1977 d) und in den Rhizoiden findet sich eine Chitinsynthetase (BROWNLEE 1986 a)
2.1.8 Nährstoffanforderung anaerober Pansenpilze
ORPIN u. GREENWOOD (1986 b) untersuchten die Wachstumsbedingungen anaerober Pansenpilze am Beispiel von N. patriciarum, den sie unter minimalen Bedingungen (Mini- malmedium) kultivierten. Die Grundbestandteile des Minimalmediums zum Wachstum auf Cellubiose unter Kohlendioxidatmosphäre sind Haem (prosthetische Gruppe eines Enzyms), D-Biotin, Thiamin oder seine Vorstufen, Ammoniumionen, reduzierter Schwefel sowie Spu- renelemente. Aminosäuren, gerade und verzweigte kurzkettige flüchtige Fettsäuren, niedrige Konzentrationen an langkettigen Fettsäuren und eine Reihe von Vitaminen wirken zusätzlich wachstumsfördernd. Essigsäure und lösliche, fermentierbare Kohlenhydrate wirken positiv auf die Entwicklung der Zoosporen (ORPIN u. GREENWOOD 1986 b).
Haem ist nicht nur für das Wachstum sondern auch im Zusammenwirken mit anderen Futter- komponenten bei der Auslösung der Zoosporogenese von Bedeutung (s. Kap. 2.1.6; ORPIN u. GREENWOOD 1986 a). Es kommt in allen lebenden Pflanzen in oxidierter und reduzierter Form, in toten Pflanzen nur in oxidierter Form vor (ORPIN u. JOBLIN 1988, 1997). Die Zoo- sporogenese einzelbegeißelter Arten wird vermutlich durch ähnliche Verbindungen ausgelöst (ORPIN 1977 c).
2.1.9 Fermentationsprozesse und Energiestoffwechsel anaerober Pansenpilze
Anaerobe Pansenpilze haben wie viele andere Eukaryonten, die an eine anaerobe Umwelt angepaßt sind, keine Mitochondrien (YARLETT et al. 1986 b; O`FALLON et al. 1991). Sie gewinnen ihre Energie aus anaerober Fermentation von Kohlenhydraten, die sowohl Elek- tronenakzeptoren als auch -donatoren sind. Hierbei spielen Hydrogenosomen eine wichtige Rolle. Im Gegensatz zur aeroben Atmung werden bei der Fermentation die Substrate nicht vollständig zu Wasser und Kohlendioxid abgebaut und sind daher noch relativ energiehaltig (STANIER et al. 1987). Die anaerobe Fermentation (2 Moleküle ATP) ist dadurch weniger effizient als die aerobe Atmung (36 Moleküle ATP; CALDWELL u. TRINCI 1973; LOWE et al.
1987 b).
2.1.9.1 Hydrogenosomen
Anaerobe Pansenpilze besitzen wie anaerobe Protozoen an Stelle von Mitochondrien Hy- drogenosomen (MÜLLER 1980; YARLETT et al. 1986 b). Die Hydrogenosomen sind Orga- nellen, die in der Lage sind, den Hexosemetabolismus mit der zellulären Energiebildung zu koppeln, wobei gleichzeitig Wasserstoff gebildet wird (YARLETT et al. 1986 a, b). In den Zoosporen liegen die Hydrogenosomen überwiegend in der Nähe der Basalkörper des Fla- gellarapparats (MUNN 1994; MUNN et al. 1988 a, b; WEBB u. THEODOROU 1988, 1991).
Dieses läßt darauf schließen, daß der Hauptteil der produzierten Energie für die Motilität der Zoosporen verbraucht wird (THEODOROU et al.1996).
Die Entwicklung der Hydrogenosomen wird auf die endosymbiotische Aufnahme von Eu- bakterien zurückgeführt (VAN DER GIEZEN et al. 1993). Dieses erklärt auch das Vorliegen eubakterieller Gene in anaeroben Pilzen (GILBERT et al. 1992).
2.1.9.2 Intermediärstoffwechsel (Hexosemetbolismus)
Der Kohlenhydrat- und Elektronenflußweg für den Glucosemetabolismus wurde an N.
frontalis und N. patriciarum untersucht (YARLETT et al. 1986 b; O`FALLON et al. 1991).
In N. frontalis wird das Pyruvat (s. Abb. 2.4) aus der Glycolyse über die Pyruvat-Carboxylase zu Oxaloacetat konvertiert, welches dann durch die Malat-Dehydrogenase zu Malat reduziert wird. Das gebildete Malat wird in die Hydrogenosomen transportiert, wo hydrogenosomale Enzyme Energie gewinnen, indem sie die Oxidation mit dem Elektronentransfer über die NADH:Ferridoxin Oxidoreduktase koppeln. Die Protonenreduktion geschieht durch Ferridoxin und Hydrogenasen, wobei gleichzeitig Wasserstoff gebildet wird. Das durch Oxidation von Malat produzierte Pyruvat wird wieder in das Cytoplasma zurücktranportiert. Dort wird es in Oxaloacetat umgewandelt und durch zytosolische Lactat-Dehydrogenase zu Lactat reduziert.
Die Pyruvat-Decarboxylase metabolisiert dieses dann zu Acetat oder es wird zu Acetaldehyd decarboxyliert (YARLETT et al. 1986 a, b; O`FALLON et al. 1991). In Kulturen, die besser unter einer Stickstoff- als unter einer Kohlendioxid-Atmosphäre wachsen, wird Acetaldehyd durch niedrige Konzentrationen einer Alkohol-Dehydrogenase schließlich in Ethanol umge- wandelt (YARLETT et al. 1986 a). Kohlenstoffdioxid scheint die hydrogenosomale Acetat- produktion und die cytosolische Ethanolproduktion zu unterdrücken. Hierbei handelt es sich um eine Endprodukthemmung der Pyruvat:Ferridoxin-Oxidoreduktase und Pyruvat-Decarbo- xylase-Reaktion.
Bei N. patriciarum ist der Embden-Meyerhof Weg für die Glycolyse von Bedeutung (YARLETT et al. 1986 a; O`FALLON et al. 1991; YARLETT 1994). Dieses wird an der Ver- teilung von 14CO2 deutlich, welches von Kulturen gebildet wird, die C-1, C-2 und C-6 mar- kierte Glucose fermentieren (ORPIN u. JOBLIN 1988). Der Glucosemetabolismus von N.
patriciarum (YARLETT et al. 1986 a, b) ist in den Grundzügen dem von N. frontalis
(O`FALLON et al. 1991) ähnlich. Dennoch gibt es feine Unterschiede. Glucose wird zu Phosphoenolpyruvat konvertiert und dann zu Oxaloacetat carboxyliert, bevor es zu Malat re- duziert wird. Das in den Hydrogenosomen gebildete Pyruvat wird durch die Pyruvatkinase in Phosphoenolpyruvat bzw. in Fermentationsendprodukte konvertiert.
Glucose Ethanol NAD+
Acetat NADH
Glycolyse Lactat Acetaldehyd
CO2
NAD+
NADH
Pyruvat Pyruvat
HCO3-, ATP
NADPH, NADH
Pi, ATP
NADP + Ferridoxin Oxaloacetat NAD+ reduziert
NADH Ferridoxin 2H+ oxidiert
NAD+ H2
Malat Malat Hydrogenosom
Abb. 2.4: Schema der Konversion von Glucose zu Acetat, Ethanol und Lactat in N. frontalis (THEODOROU et al. 1996)
Das in Abb. 2.4 dargestellte Schema der Konversion von Glucose zu Acetat, Ethanol und Lactat in N. frontalis (THEODOROU et al. 1996) gilt für die meisten gemischten Säurefer- mentationsprodukte, nicht aber für die Produktion von Format in anaeroben Pansenpilzen (THEODOROU et al. 1992). Die Formatproduktion bedingt die Anwesenheit einer Pyruvat- Format-Lyase, ein Enzym, das für die Spaltung des Pyruvats in Format und Acetyl-CoA ver- antwortlich ist. Acetyl-CoA wird weiter zu Ethanol und Acetat abgebaut (GOTTSCHALK 1985).
