Aus der Klinik fü r Rinderkrankheiten (im Richard-Götze-Haus)
der Tierä rztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Thiamingehalt und seinen Derivaten im Pansensaft des Rindes nach Verfü tterung von mit Ulocladium
chartarum verpilztem Heu unter Thiaminzulage (in vitro)
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinä rmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierä rztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Petra Krause
aus Göttingen
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. Scholz
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Scholz 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2002
Meinen Eltern und meinem Bruder in Liebe gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 11
2. Schrifttum 12
2.1 Bedeutung struktureller Pflanzenbestandteile
in der Wiederkäuerernährung 13
2.1.1 Mikrobielle Abbaubarkeit einiger Pflanzengewebe beim Wiederkäuer 14
2.1.1.1 Pflanzenzellen 15
2.1.1.2 Gewebe 18
2.1.1.3 Blatt und Stamm 23
2.1.1.4 Zellreife und Pflanzenwachstum 26
2.1.1.5 Besonderheiten bei Gräsern und Leguminosen 27 2.1.1.5.1 Besonderheiten der Pflanzen tropischer Klimate und Verdaulichkeit 29 2.1.2 Zum Pflanzenabbau genutzte Mechanismen
verschiedener Mikroorganismen 30
2.1.2.1 Bakterien 30
2.1.2.1.1 Spezifität der Zellulolyten 31
2.1.2.1.1.1 Zellulosom der Zellulolyten 32
2.1.2.1.1.2 Anheftung der Zellulolyten 32
2.1.2.1.1.3 Glykokalyx der Zellulolyten 32
2.1.2.1.1.4 Extrazelluläre Enzyme der Zellulolyten 33
2.1.2.1.2 Anheftungsmechanismen anderer Bakterien 34
2.1.2.1.3 Zeitpunkt der Pflanzenpartikelbesiedlung 35
2.1.2.1.4 Pflanzensubstrat 37
2.1.2.1.5 pH-Wert 38
2.1.2.1.6 Regulation des pH-Wertes in Bakterien 39
2.1.2.1.7 Konkurrenz 39
2.1.2.2 Pilze beim Abbau von Pflanzenstrukturen 40
2.1.2.2.1 Pflanzenstruktur und -substrat 40
2.1.2.2.2 Pflanzenabbau während des Entwicklungszyklus anaerober Pilze 42
2.1.2.3 Protozoen 43
2.1.2.3.1 Direkter und indirekter Einfluss auf den Pflanzenabbau 44
2.1.2.3.2 Anheftung 45
2.1.2.3.3 Abbau 46
2.1.3 Passage, bzw. Retention der strukturellen Pflanzenteile 46
2.1.3.1 Pansenschichtung 47
2.1.3.2 Funktionale spezifische Dichte 47
2.1.3.3 Osmotischer Druck 48
2.1.4 Abschließende Zusammenfassung 48
3. Eigene Untersuchungen 50
3.1 Versuchsziel 50
3.2 Material und Methodik 50
3.2.1 Das Langzeitinkubationssystem RUSITEC 50
3.2.1.1 Aufbau und Funktionsweise 50
3.2.1.2 Beladung und Bedienung des Systems 51
3.2.1.3 Fermentationsbetrieb 51
3.2.2 Futterkomponenten 52
3.2.2.1 Herkunft und Beschaffenheit des Heus 52
3.2.2.2 Herkunft und Beschaffenheit des autoklavierten Heus 52
3.2.2.3 Herkunft von Ulocladium (DSM 63070) 53
3.2.2.4 Herkunft und Beschaffenheit der Maisstärke 54
3.2.3 Spendertiere 54
3.2.3.1 Haltung und Fütterung des Spendertieres 54
3.3 Versuchsdurchführung 55
3.4 Analytik 56
3.4.1 Bestimmung des pH-Wertes 57
3.4.2 Bestimmung der Ammoniakkonzentration 57
3.4.3 Proben für die Protozoenzählung 57
3.4.4 Volumetrische Bestimmung der Gesamtgasproduktion 57
3.4.5 Bestimmung der Gaszusammensetzung 57
3.4.6 Bestimmung des Überstandsvolumens 58
3.4.7 Bestimmung des Natrium-, Kalium- und Chloridgehalts 58
3.4.8 Bestimmung der Thiaminkonzentration 58
3.4.9 Bestimmung der flüchtigen Fettsäuren 61
3.4.10 Bestimmung des Proteingehaltes der Bakterienfraktion 62 3.4.11 Enzymatische Bestimmung der Zellulaseaktivität 64 3.4.12 Folsäuremessung mit Chemilumineszenz-Technologie 66
3.4.12.1 Messung im ACS:180 66
3.4.12.2 Einzelne Aufbereitungsschritte 67
3.4.12.2.1 Zerkleinerung 67
3.4.12.2.2 Proteine 67
3.4.12.2.2.1 Antioxidantien und Hitzebehandlung 67
3.4.12.2.2.2 pH-Wert 68
3.4.12.3 Aufbereitung von Pansensaft und festem Panseninhalt 68
3.4.12.4 Ziel der Folsäuremessungen 71
3.4.12.5 Ergebnisse der Folsäuremessungen 71
3.4.12.5.1 Hitzebehandlung 71
3.4.12.5.2 Überprüfung der Präzision in Serie für die Probenaufbereitung 73 3.4.12.5.3 Überprüfung der Präzision in Serie für die Probenmessung 74
3.4.12.5.4 Überprüfung der Wiederfindungsrate 75
3.4.12.5.5 Überprüfung der Messgenauigkeit durch Doppelmessungen von
Doppelproben 76
3.4.12.5.6 Literaturwerte 77
3.4.12.5.7 Zusammenfassende Wertung 77
3.5 Datenerfassung und statistische Auswertung 78
4. Ergebnisse 78
4.1 pH-Wert in der Fermenterflüssigkeit 79
4.2 Ammoniakgehalt in der Fermenterflüssigkeit 80
4.3 Gasproduktion im Fermenterinhalt 81
4.4 Methanproduktion im Fermenterinhalt 82
4.5 Proteinkonzentration in der Fermenterflüssigkeit 83
4.6 Zellulaseaktivität im festen Fermenterinhalt 84
4.7 Summe der flüchtigen Fettsäuren 85
4.8 Essigsäure 87
4.9 Propionsäure 89
4.10 i-Buttersäure 91
4.11 n-Buttersäure 93
4.12 i-Valeriansäure 95
4.13 n-Valeriansäure 97
4.14 Hexansäure 99
4.15 Thiamin und seine Derivate im Überstand 101
4.15.1 Gesamtthiamingehalt 101
4.15.2 Thiamindiphosphat-Gehalt 102
4.15.3 Thiaminmonophosphat-Gehalt 103
4.15.4 Thiamingehalt 104
4.16 Thiamin und seine Derivate
in der Fermenterflüssigkeit (Gesamtfraktion) 105
4.16.1 Gesamtthiaminkonzentration 105
4.16.2 Thiamindiphosphat-Konzentration 106
4.16.3 Thiaminmonophosphat-Konzentration 107
4.16.4 Thiamingehalt 108
4.17 Thiamin und seine Derivate
in der Pflanzen- und Protozoenfraktion 109
4.17.1 Gesamtthiaminkonzentration 109
4.17.2 Thiamindiphosphat-Konzentration 110
4.17.3 Thiaminmonophosphat-Konzentration 111
4.17.4 Thiamingehalt 112
4.18 Thiamin und seine Derivate im bakterienfreien Überstand 113
4.18.1 Gesamtthiaminkonzentration 113
4.18.2 Thiamindiphosphat-Konzentration 114
4.18.3 Thiaminmonophosphat-Konzentration 115
4.18.4 Thiamingehalt 116
4.19 Thiamin und seine Derivate in der Bakterienfraktion 117
4.19.1 Gesamtthiaminkonzentration 117
4.19.2 Thiamindiphosphat-Konzentration 118
4.19.3 Thiaminmonophosphat-Konzentration 119
4.19.4 Thiamingehalt 120
4.20 Zusammenfassung der Ergebnisse 121
5. Diskussion 123
5.1 Intention der Arbeit 123
5.2 Kritische Betrachtung der Versuchsanstellung 123
5.2.1 Das RUSITEC-System 123
5.2.2 Beurteilung des inokulierten Panseninhalts 123
5.3 Verwendete Parameter 124
5.4 Beurteilung des verwendeten Futtermittels 124
5.5 Statistik 128
5.6 Auswirkungen des mit Ulocladium ssp. verpilzten Heus und einer zeitweilig erfolgenden zusätzlichen Thiamingabe auf die
Fermentationsvorgänge 129
5.6.1 Milieuparameter (pH-Wert) 129
5.6.2 Auswirkungen auf den Stickstoffstoffwechsel 130
5.6.3 Auswirkungen auf den Kohlenhydratstoffwechsel 132
5.6.3.1 Auswirkungen auf die Zellulaseaktivität 132
5.6.3.2 Auswirkungen auf die Gasproduktion und -zusammensetzung 134 5.6.4 Auswirkungen auf den Gehalt an flüchtigen Fettsäuren 135
5.6.4.1 Hexansäure 135
5.6.6 Zusammenfassende Wertung 136
5.6.7 Thiaminstoffwechsel 140
6. Zusammenfassung 147
7. Summary 150
8. Schrifttumsverzeichnis 153
9. Anhang 193
9.1 Eichkurve für die Proteinbestimmung nach BRADFORD 193 9.2 Eichkurve für die Zellulaseaktivitätsbestimmung 194
9.3 Statistische Daten 195
Abkürzungsverzeichnis
ACS:180 Automated NAD Nikotinsäureamidadenin-
Chemiluminescence dinukleotid
System (Fa. Bayer) NDF neutral detergent fiber
ADF acid detergent fiber (neutrale Detergentien-
(saure Detergentien-Faser) Faser)
ADL acid detergent lignin NEL Nettoenergie Laktation (saures Detergentien-Lignin) NPN non protein nitrogen
ADP Adenosindiphosphat (Nicht-Protein-Stickstoff)
Akl-Heu autoklaviertes Heu n.s. nicht signifikant Aqua bidest. Aqua bidestillata p Differenzsignifikanz
ATP Adenosintriphosphat zwischen KF und UF
B. Butyrivibrio PEM Polioencephalo-Malazie
BB1 Bakterienfraktion PPB1 Protozoen-Pflanzen-
(Probenaufbereitung der fraktion (Probenauf-
Thiaminbestimmung) bereitung der Thiamin-
BfB1 bakterienfreie Fraktion bestimmung)
(Probenaufbereitung der prim. primär
Thiaminbestimmung) R. Ruminococcus
BSA bovines Serumalbumin RLU Relative Lichteinheiten CBD Zellulose-Bindings-Domäne RUSITEC Rumen simulation
CCN Cerebrocorticale Nekrose technique
Cl. Clostridium s signifikant
DSMZ Deutsche Sammlung für sek. sekundär Mikroorganismen und sp./spp. Spezies
Zellkulturen (Braunschweig) TCA Trichloressigsäure
DTT Dithiothreitol TDF total dietary fiber
F. Fibrobacter TDP Thiamindiphosphat
Fa. Firma TMP Thiaminmonophosphat
FABP Folsäure-bindendes Protein TS Trockensubstanz FlFS Flüchtige Fettsäure(n) UF Testfermenter
FSD funktionale spezifische Dichte (Ulocladium chartarum)
G Gräser Ulo-Heu Ulocladium chartarum
h Stunde verschimmeltes Heu
HPLC High Performance Liquid U/min Umdrehungen pro
Chromatography Minute
I.E. Internationale Einheit U/l Units pro Liter
k. A. keine Angabe uS ursprüngliche
Kap. Kapitel Substanz
KF Kontrollfermenter VK Variationskoeffizient
L Leguminosen x arithmetischer Mittelwert
M molar ZW Zellwand
min Minute(n) ↑ Anstieg
MJ Megajoule ↓ Abfall
ML Mittellamelle ↔ keine Veränderung
n Anzahl der Messwerte ∆ Differenz
1. Einleitung
Die Hirnrindennekrose (Cerebrocortical necrosis = CCN; Polioencephalo-Malazie = PEM) des Wiederkäuers ist eine Erkrankung des zentralen Nervensystems, bei der einem Vitamin B1 (Thiamin)-Mangel eine entscheidende Rolle zukommt. Ein solcher Mangel kann durch verminderte Synthese (z.B. Störung innerhalb der Pansenflora), erhöhten Verbrauch (z.B.
Laktazidose), gestörte Resorption im Darm (z.B. Enteritis), durch thiaminolytische Wirkungen (z.B. Thiaminasen bakteriellen und/oder pflanzlichen Ursprungs, Synthese durch Pilze bzw. Schimmelpilze) oder durch Antagonisten wie Amprolium verursacht werden.
Auf norddeutschen Weiden, auf denen an CCN erkrankte Rinder gegrast hatten, wurde verpilztes Weidegras gefunden und untersucht. Es konnte eine Wirkung des verpilzten Heus auf den Thiaminstoffwechsel festgestellt werden (PLITT 1995). Einer der vorgefundenen Pilze war Ulocladium ssp.
In der vorliegenden Arbeit soll die Beeinflussung des Pansenstoffwechsels durch Ulocladium chartarum mit Hilfe des Langzeitinkubationssystems RUSITEC untersucht werden. Besondere Beachtung findet hierbei der Thiaminstoffwechsel.
2. Schrifttum
Mit Hilfe des künstlichen Pansens (RUSITEC) wurden in den vergangenen Jahren mehrere Dissertationen im Pansenlabor der Rinderklinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt (SCHIRMER 1990; KRAKOW 1992; BECKER 1994; MAIWORM 1994;
PLITT 1995; BRÖCKER 1996; MAURUSCHAT 1996; ELIAS 1999; MITTROWANN 1999; RATHJENS 1999; HÖHLING 2000; JASPER 2000; TIADEN 2000;
WENDELKEN 2000; HÜBNER 2001; JANSON 2001 und WULFF 2001). Die Literaturschwerpunkte dieser Arbeiten befassten sich mit unterschiedlichen Aspekten des ruminalen Stoffwechsels (s. Tab. 2.1). So kann die Darstellung der metabolischen Abläufe im Pansen jeweils auf den neusten Stand gebracht werden.
Die Literaturschwerpunkte der verschiedenen Arbeiten sind in nachfolgender Tabelle (Tab.
2.1) aufgeführt.
Tab. 2.1: Literaturthemen verschiedener Dissertationen aus dem Pansenlabor der Rinderklinik
Literaturthema Autor/ Jahr
Kohlenhydratstoffwechsel Zelluloseabbau
Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels
ZIPORI 1989; DIRKSEN 1990 KRAKOW 1992;
ODENKIRCHEN 1992 Stickstoffstoffwechsel HÖLTERSHINKEN 1990 Der Pansen als Ökosystem SCHIRMER 1990
Purinstoffwechsel FELDMANN 1992
Antibiotikawirkungen auf Pansenfermentationsvorgänge
KRAMER 1993 Fremdbakterien im Pansen
Bedeutung der Pansenbakterien
Interaktionen zwischen Pansenbakterien
RAAZ 1993;
MAURUSCHAT 1996;
FRANK 1998 Wirkungen von Pansenstimulantien
auf die Pansenfermentation
BECKER 1994 Mykotoxinwirkungen auf die
Pansenfermentation
MAIWORM 1994 Einfluß von Saccharomyces cerevisae
auf die Pansenfermentation
DE FIGUEIREDO 1994
Thiaminstoffwechsel PLITT 1995; WITTE 1998
Aminosäurenstoffwechsel BRÖCKER 1996 Kompartimentsysteme des Pansens ELIAS 1999 Einfluß von Schwefel auf die
Fermentationsvorgänge des Pansens
MITTROWANN 1999 Chronische Pansenazidose, Amylase RATHJENS 1999 Bedeutung der Pansenprotozoen HÖHLING 2000 Der ruminale intermediäre Wasserstoff TIADEN 2000 Vitaminstoffwechsel im Pansen WENDELKEN 2000 Fortsetzung der Tabelle s. nächste Seite
Tab. 2.1: Fortsetzung
Lipidstoffwechsel mittel- und langkettiger Fettsäuren
JASPER 2000 Vergleich aller weltweit durchgeführten
RUSITEC-Versuche
HÜBNER 2001 Wachstumsstoffe für Pansenbakterien JANSON 2001 Bedeutung der Pansenpilze WULFF 2001
Mit der vorliegenden Arbeit sollen diese unterschiedlichen Themen durch die Darstellung des mikrobiellen Abbaus der strukturellen Pflanzenbestandteile im Pansen ergänzt werden.
2.1 Bedeutung struktureller Pflanzenbestandteile in der Wiederkäuerernährung Der Erfolg der weltweit zu findenden Wiederkäuer liegt in ihrer Fähigkeit zur Verdauung strukturellen Pflanzenmaterials. Möglich wurde dies durch die Symbiose mit Mikroorga- nismen, welche im Vormagensystem des Wiederkäuers leben. Diese Mikroorganismen, bestehend aus Bakterien, anaeroben Pilzen und Protozoen, sind in der Lage, die den Säugetierenzymen nicht zugänglichen Polysaccharide abzubauen (HUNGATE 1966), und die Metaboliten dem Wirtstier zur Verfügung zu stellen.
Das Rind gehört als Vormagenverdauer zu einer Gruppe von Tieren, die besonders die Zellulose effektiv nutzen können (s. Abb. 2.1).
Der Vormagen des Rindes hat sich zusammen mit den in ihm enthaltenen Mikro- organismen seit Millionen von Jahren entwickelt. Er setzt sich aus dem Pansen als grö ßter Abteilung sowie dem Blättermagen und der Haube zusammen.
Abb. 2.1: Zelluloseverdauungseffizienz bei Dickdarm- und Vormagenverdauern (ENGELHARDT 1988)
Rind Vormagenverdauer
Dickdarmverdauer
Zelluloseverdauung (%)
Körpergewicht (kg) 70
60
50 40
30 20
10 0
0 100 200 300 400 500 600
Die mikrobielle Population des Pansens steht untereinander in stabiler Wechselbeziehung (RUSSELL u. RYCHLIK 2001). Innerhalb bestimmter Grenzen ist ihnen eine Anpassung an ein sich veränderndes Pansenmilieu möglich. So hatten nach dem zweiten Weltkrieg wachsende Leistungsanforderungen an Rinder einen starken Anstieg des Konzentratfutter- mittelanteils an der Gesamtration aufgrund des höheren und schneller verfügbaren Energie- gehalts zur Folge (WALDO 1973; RUSSELL u. WILSON 1996). Dieses hat zu Veränderungen des Pansen-pH-Werts und damit der ruminalen Mikroorganismen- populationszusammensetzung und ihrer Fermentation geführt (ALLEN 1997; RUSSELL u.
RYCHLIK 2001). Der an zellulosereiche Pflanzenfuttermittel gewöhnte Wiederkäuer und seine Vormagenmikroorganismen können jedoch nicht auf strukturiertes Futter verzichten.
Folge eines Mangels ist eine Reihe von Erkrankungen, die als sogenannte „Leistungs- krankheiten“ bezeichnet werden (GASTEINER 2001). Hierunter fallen verminderte oder wechselnde Futteraufnahme, reduzierte Verdauung und Gewichtszunahme, abnehmende Leistung, verringerter Milchfettgehalt (MERTENS 1997; DEBRABANDER et al. 1999), Lahmheit (MERTENS 1997; NOCEK 1997), und besonders die subklinische Pansen- azidose, die in der modernen Rinderintensivhaltung häufig auftritt und starke Leistungs- einbußen verursacht (NOCEK 1997; OWENS et al. 1998; näheres s. RATHJENS 1999).
Dieses zeigt, dass ein gewisser Anteil an strukturellen Bestandteilen in der Futterration zur Aufrechterhaltung einer leistungsfähigen Mikroorganismenpopulation und Pansenfunktion eines gesunden und zur Leistung befähigten Rind im Gefolge notwendig ist. Die Struktur stellt eine wesentliche Verdauungshilfe dar, und ist nicht allein reine Mikroorganismen- nahrung.
In dieser Arbeit soll auf die am Abbau pflanzlicher Strukturkomponenten beteiligten Mikroorganismen im Pansen des Rindes mit ihren unterschiedlichen Strategien sowie auf den Einfluss der strukturellen Nahrungsquellen auf die mikrobielle Population eingegangen werden. Begonnen wird mit der mikrobiellen Abbaubarkeit einiger Pflanzen- gewebe (s. Kap. 2.1.1), darauf werden die zum Abbau genutzten Mechanismen der verschiedenen Mikroorganismen (Bakterien s. Kap. 2.1.2.1, anaerobe Pansenpilze s. Kap.
2.1.2.2, Protozoen s. Kap. 2.1.2.3), und schließlich die Passage bzw. Retention der strukturellen Pflanzenbestandteile (s. Kap. 2.1.3) erläutert
2.1.1 Mikrobielle Abbaubarkeit einiger Pflanzengewebe beim Wiederkäuer Die Abbaubarkeit pflanzlicher Komponenten wird als Verdaulichkeit oder biologische Verfügbarkeit erfasst. Sie kann in drei Klassen unterteilt werden (VAN SOEST 1967;
1994):
(1) vollständige Verfügbarkeit
hierunter fallen die sowohl von Säugetierenzymen als auch von Mikroben abbaubaren zellularen Inhaltstoffe (lösliche Kohlenhydrate, Stärke, organische Säuren, Protein) und die in der Zellwand enthaltenen und nur von den ruminalen Mikroorganismen abbaubaren Pektine (s. Kap. 2.1.2.1.6)
(2) unvollständige Verfügbarkeit
hierunter fallen die strukturellen Kohlenhydrate der Zellwand, wie Zellulose und Hemizellulosen; aufgrund verschiedener chemischer Verbindungen kommen sowohl abbaubare als auch dem Abbau gegenüber widerstandsfähige Anteile vor;
ein Abbau erfolgt nur durch Mikroorganismen (3) vollständige Nichtverfügbarkeit
hierunter fallen die weder von Säugetierenzymen noch von Pansenmikro-
organismen abbaubaren Anteile wie Lignin, Kutin, Silikate, Tannine, Polyphenole und Wachse
Je nach Pflanzenart, -alter, -gewebe und -reifestadium liegen unterschiedliche Anteile der drei Klassen vor. Das Ausmaß der vollständigen Verfügbarkeit im Pansen wird im wesentlichen durch die Retentionszeit der Pflanzenpartikel bestimmt, das der unvollständigen Verfügbarkeit zusätzlich durch den Lignifizierungsgrad der Pflanze, sowie die Einlagerung von Silikat und Kutin bzw. Suberin (VAN SOEST 1994). Nicht verfügbare Stoffe können den Zugang zu abbaubaren Zellkomponenten begrenzen und darüber hinaus Proteasen und Zellulasen hemmen oder auch die Anheftung von Mikroorganismen behindern (VAN SOEST 1967, 1994).
Somit bestimmt der Pflanzenaufbau die „Netto“-Verfügbarkeit der pflanzlichen Nährstoffe.
2.1.1.1 Pflanzenzellen
Pflanzen- und Tierzellen unterscheiden sich darin, dass Tierzellen lediglich Plasmamembranen besitzen, während pflanzliche Zellen von festen Zellwänden umgeben sind (CUNNINGHAM 1997; LÜTTGE et al. 1999; s. Abb. 2.2).
Es gibt primäre und sekundäre Zellwände, die mit benachbarten Zellen durch eine Mittellamelle verbunden werden (s. Abb. 2.2).
Abb. 2.2: Zellwandschichtung im Querschnitt (schematisch; NULTSCH 2001)
as – Außenschicht; i – Interzellularen; is – Innenschicht; m – Mittellamelle; pw – Primär- wand; sw – Sekundärwand; t – Tüpfel; ü – Übergangslamelle; zs – Zentralschicht
t
sw m
ü pw
as zs
is i
Primäre Zellwände sind Abscheidungsprodukt der lebenden Zellen (GOULD u.
NORTHCOTE 1985; SITTE et al. 1998), sekundäre Zellwände hingegen entstehen durch kontinuierliche Modifikation und Addition der bzw. zur inneren oder äußeren Oberfläche der primären Zellwand nach Verringerung oder Beendigung der Zellausdehnung (GOULD u. NORTHCOTE 1985). Eine mindestens dreischichtige Mittellamelle, die von durch Mikroorganismen leicht abbaubarem Pektin gebildet wird, verbindet die Zellwände benachbarter Zellen als Kitt- oder Interzellularsubstanz fest miteinander (NULTSCH 1996;
SITTE et al. 1998; s. Tab. 2.1 u. Abb. 2.2). Die sekundäre Verdickung wird von Lignifizierung, die zu Tod der Zelle und Verlust des Zellinhalts führt, begleitet (CHESSON u. FORSBERG 1997). Die wachsenden Lignin-Riesenmoleküle durchwuchern das Mikrofibrillengerüst der Zellwände in allen Raumrichtungen (NORTHCOTE 1972; NULTSCH 1996; CHESSON u. FORSBERG 1997; SITTE et al.
1998). Lignin beeinträchtigt den mikrobiellen Abbau der Strukturpolysaccharide als physikalische Barriere (BUXTON u. REDFEARN 1997), und hat dadurch einen verzögernden Effekt auf den Gewebeabbau insgesamt (BAKER u. HARRIS 1947).
Zwischen Lignin und Hemizellulosen werden kovalente Bindungen gebildet (MORRISON 1974; WHITMORE 1978; TANNER u. MORRISON 1983; VAN SOEST 1994;
NULTSCH 1996). Hemizellulosen sind dadurch enger als jedes andere Polysaccharid an Lignin gekoppelt (SULLIVAN 1966; VAN SOEST 1994), und die Verdaulichkeit der Hemizellulose ist somit umgekehrt mit der Lignifizierung verbunden. Auch die strukturelle Zellulose aus Grobfutter ist (neben der Verbindung zu Hemizellulosen, Kutin und Mineralien) in der Pflanzenzellwand zu einem bestimmten Grad mit Lignin kombiniert, wodurch ihre Abbaubarkeit begrenzt wird (VAN SOEST 1994). Die Lignifizierung schreitet von der Mittellamelle über die primäre Zellwand zur sekundären Zellwand in Richtung des Pflanzenzelllumens hin fort (s. Abb. 2.3).
Zu besonders hohen Lignineinlagerungen kommt es in der außen gelegenen Mittellamelle, die so durch Mikroorganismen weder kolonisiert, noch abgebaut werden kann und nun
Abb. 2.3: Pflanzenzelle und Wandentwicklung (schematisch; JUNG u. ALLEN 1995)
Mittel- lamelle Primäre Zellwand
Sekundäre Zellwand
Zell- lumen Richtung der Zell-
wandverdickung
gering
hoch Lignin-
Konzentrations- Gradient
eine Barriere darstellt (ENGELS 1989). Der mikrobielle Abbau kann somit zunächst nur sehr begrenzt an der Oberfläche erfolgen (BREVES u. LEONHARD-MAREK 2000), wird i.w. aber vom Lumen her erfolgen (ENGELS 1989; JUNG u. ALLLEN 1995; WILSON u.
MERTENS 1995). Das Ausmaß der Zellwandlignifizierung ist abhängig von Reifestadium, Gewebe und Art der Pflanze (s. Kap. 2.1.1.4).
Zwischen den im Wachstum sich abrundenden Zellen entstehen luftgefüllte Hohlräume, die Interzellularen (NULTSCH 1996; s. auch Kap. 2.1.1.2, parenchymaler Interzellular- raum und Kap. 2.1.3.2, FSD), in denen Bakterien anhaften, sich vermehren und Kolonien bilden können (s. Kap. 2.1.1.2).
Zusammengefasst können sich grundsätzlich verdauliche Zellwandanteile, wie Zellulose und Hemizellulosen durch die Verbindung mit Lignin dem mikrobiellen Abbau entziehen.
Der Abbau schnell fermentierbarer Zellinhaltsstoffe wie lösliche Kohlenhydrate, Proteine und Fette wird durch den Mikroorganismen nicht zugängliche Barrieren erschwert oder gar verhindert (DEHORITY u. JOHNSON 1961; MINSON 1990).
In nachfolgender Tabelle (2.1) wird die Zusammensetzung von primärer Zellwand und Mittellamelle von Gräsern und Leguminosen derjenigen der sekundären Zellwand gegenübergestellt (zu Gräsern und Leguminosen s. auch Kap. 2.1.1.5).
Tab. 2.1: Zusammensetzung der primären und sekundären Wandregionen der reifen, lignifizierten Zellen in Gräsern und Leguminosen (BACIC et al. 1988;
TERASHIMA et al. 1993; JUNG u. ALLEN 1995) Wandpolymerkomponenten ZW-
region Polysaccharide (u.v.)
Lignin (n.v.)
Phenolsäuren (n.v.)
Proteine (v.v.)
G
Zellulose, Glucuron- arabinoxylane, β-Glucane (versch.
Bindungen), Hetero- glucane, Pektinpoly- saccharide (-)
Guaiacyl (+++), Syringyl (-), p-Hydroxy- phenyl (nur ML)
Ferulasäureester u. ether, p-Cumar- säureester (-)
Proteine (mit:
Hydroxy- prolin
= - bis 0), Extensin (-) ML/
prim.
Wand L
Pektinpolysaccharide, Zellulose, Hetero- glucane, Hetero- xylane (-)
Guaiacyl (+++), Syringyl (-)
Ferulasäureether u. -ester (-), p-Cumarsäure- ester (-); a
Extensine, andere Proteine
G
Zellulose, Glucurono- arabinoxylane, Hetero- glucane, β-Glucane (versch. Bindungen; -)
Syringyl (+++), Guaiacyl (-)
p-
Cumarsäureester u. -ether
keine sek.
Wand L
Zellulose, 4-O-Methyl- glucuronoxylane, Glucomannane (-)
Syringyl (+++), Guaiacyl (-)
p-
Cumarsäureether u. -ester (-);a
keine
ZW = Zellwand; ML = Mittellamelle; G = Gräser; L = Leguminosen; +++ = große Mengen; - = geringe Anteile; 0 = keine Anteile; v.v. = vollständig verdaulich; u.v. = unvollständig verdaulich; n.v. = nicht verdaulich; a = Lokalisation der Phenolsäuren in Leguminosenzellwänden wurde aus den Daten anderer Pflanzenspezies abgeschätzt
Die Tabelle zeigt, dass deutliche Unterschiede zwischen den Zellwänden sowie den Pflanzenarten bestehen.
Weiterhin haben auch die einzelnen am Aufbau einer Pflanze beteiligten Gewebe Einfluss auf den Anteil der verschiedenen Zellwandbestandteile.
2.1.1.2 Gewebe
Der zwischen den Geweben variierende Zellwandaufbau innerhalb einer Pflanze (GORDON et al. 1977) und zwischen verschiedenen Pflanzen (BAILEY 1973;
Futterpflanzen: i.w. Leguminosen und Gräser; s. Kap. 2.1.1.5), ist Ursache für das unterschiedliche Ausmaß des Abbaus durch die ruminalen Mikroorganismen (s. Tab 2.2).
Tab. 2.2: Pflanzengewebe und ihre relative Verdaulichkeit (AKIN 1989; AKIN u.
CHESSON 1989; WILSON 1993; BUXTON u. REDFEARN 1997) Gewebe Funktion Verdaulichkeit Bemerkung
Parenchym metabolisch mittel bis hoch
in Grasmittelrippe und
Leguminosenblatthauptgefäß, Blattscheide, Grasstamm, Blattstiel und Leguminosenstamm; hochgradig verdaulich, wenn unreif
Mesophyll Träger von
Chloroplasten hoch
dünne Wand, kein Lignin;
locker angeordnet in Leguminosen und C3-Gräsern
Parenchym-
bü ndelscheiden mittel bis hoch
umgibt die Gefäßgewebe in C4- Blattscheiden; Wand ist mitteldick und nur gering lignifiziert
Kollenchym strukturell mittel bis hoch
in Leguminosenblättern und - stämmen; dicke Wand, nicht lignifiziert
Sklerenchym strukturell nicht bis gering
bis zu 1200 µm lang und 5 – 20 µm im Durchmesser, dicke, lignifizierte Wand
Gefäßgewebe vaskular nicht bis mittel
umfasst Phloem und Xylem;
Hauptanteil an der unverdaulichen Fraktion
Phloem Träger von
Chloroplasten mittel
in Leguminosenblattstielen und -stämmen; oft ohne
Lignineinlagerung Xylem keine
Angaben
keine
Angaben keine Angaben Epidermis Oberflächen-
überzug gering
äußere Pflanzenwand verdickt, lignifiziert und mit Kutikular- und Wachslagen bedeckt
Das Parenchym ist das Grundgewebe, in das die anderen Gewebe eingebettet sind (NULTSCH 1996). Bei krautigen Pflanzen bildet es die Hauptmasse des Vegetations- körpers, ein erheblicher Volumenanteil des Grundgewebes entfällt auf Interzellularräume (SITTE et al. 1998). Besonders das zu den Parenchymen zählende, zwischen oberer und unterer Epidermis vorliegende, chloroplastenreiche Mesophyllgewebe des Blattes kann durch Pansenmikroorganismen sehr leicht kolonisiert und schnell und vollständig abgebaut werden (AKIN et al. 1974b; AKIN u. AMOS 1975; AKIN 1979), z.T. auch ohne vorherige Anheftung an die Zellwand (AKIN et al. 1973; AKIN et al. 1974a, b; AKIN u. AMOS 1975; z. Anheftung s. Kap. 2.1.2.1.3). In den parenchymalen Interzellularräumen werden von den eingedrungenen Bakterien Mikrokolonien gebildet, die stark wachsen und schließlich den grö ßten Teil der Interzellularräume ausfüllen (CHENG et al. 1980).
Das Mesophyll ist gemeinsam mit dem Phloem dasjenige Gewebe, welches am leichtesten und damit als erstes von Mikroorganismen abgebaut wird (AKIN u. BURDICK 1975;
AKIN 1989; WILSON 1991). Ursache ist eine nur geringe sekundäre Wandverdickung des
Blattmesophylls und die fast fehlende Ablagerung von Lignin (DELMER u. STONE 1988). Bei Inkubation mit Pansenbakterien wird das Mesophyll der Gräser gemäßigter Klimate (C3-Pflanzen) wesentlich schneller als dasjenige der Tropengräser (C4-Gräser;
AKIN et al. 1973; s. Kap. 2.1.1.5.1) abgebaut. Die Fähigkeit der Mikroorganismen zur Invasion dieses Gewebes wird ebenso wie die Verfügbarkeit der darin enthaltenen Nährstoffe durch die unterschiedliche Menge (AMOS u. AKIN 1978) und Anordnung der Mesophyllzellen beeinflusst (AKIN u. BURDICK 1975; s. Kap. 2.1.1.5.1).
Sklerenchym ist ein nur in ausgewachsenen Pflanzenteilen auftretendes, totes Gewebe aus sehr dickwandigen, hochgradig lignifizierten, englumigen Zellen (SITTE et al. 1998), welches deswegen durch Pansenmikroorganismen nur sehr schwer, also langsam, unvollständig und vom Lumen her abgebaut wird (AKIN 1979; BUXTON u. REDFEARN 1997). Sklerenchymfasern kommen in Sprossen und großen Monokotyledonenblättern vor.
Alle Wände sind etwa gleichmäßig erfasst, bei krautigen Stengeln, die biegungsfest sein müssen, sind die Sklerenchymfasern meist peripher angeordnet. Oft begleiten sie als Leitbündelscheiden die Leitelemente (NULTSCH 1996).
Das Phloem gehört zu den Leitsystemen, ist englumig und die Zellen schließen über spitzwinklig-schrägstehende Endwände an die jeweils nächsten Siebzellen der Zellreihe an, bei Längskontakt auch an die Seitenwände. Vergrö ßerte Plasmodesmen (Siebporen) sind gruppenweise zu Siebfeldern vereinigt und durchbrechen die Wände. Als die Weiter- entwicklung des primitiven Leitungssystem ist ein kontinuierliches Siebröhrensystem aus langgestreckten Zellen mit grö ßerem Durchmesser und siebartig durchbrochenen Schräg- oder Querwänden (Siebröhrenglieder; SITTE et al. 1998) anzusehen. Einige Forscher (AKIN et al. 1974a, b; AKIN u. AMOS 1975; AKIN 1979) beobachteten, dass Phloem- gewebe verschiedener Grobfuttermittel gemeinsam mit dem Mesophyll schneller durch Bakterien abgebaut wurde als andere Gewebe. AKIN et al. (1973; 1974a) und AKIN u.
AMOS (1975) zeigten darüber hinaus, dass dieses auch ohne vorherige Anheftung an die Grobfutterzellwand möglich war, wahrscheinlich durch den geringen Lignifizierungsgrad in Verbindung mit den siebporenhaltigen Kontaktfeldern.
Bedeckt werden Pflanzenoberflächen von Epidermis und Kutikula. Diese stellen gemeinsam besonders widerstandsfähige Barrieren gegen den mikrobiellen Angriff dar.
Besonders durch ihren wirkungsvollen Schutz gegenüber der Kolonisation durch Mikro- organismen wird die Fermentation deutlich begrenzt (BREVES u. LEONHARD-MAREK 2000).
Die Epidermis ist ein einschichtiges Abschlussgewebe und überzieht als mechanischer Schutz die Oberflächen der oberirdischen Organe höherer Pflanzen (NULTSCH 1996).
Zellen schließen lückenlos aneinander, Interzellularen fehlen (NULTSCH 1996; SITTE et al. 1998). Gasaustausch mit der Außenluft erfolgt über regulierbare Spaltöffnungen (SITTE et al. 1998).
Außen wird die Epidermis von einer Kutikula überzogen (SITTE et al. 1998). Darunter liegen kutinhaltige Wandschichten (Kutikularschichten; NULTSCH 1996). Kutin bildet eine Polymermatrix, in die zusätzlich als besonders hydrophobe Komponenten verschiedene Wachse eingelagert sind (SITTE et al. 1998). In einigen Fällen kommt es zur Verkalkung oder - häufiger - Verkieselung (Silikateinlagerung) der Epidermisaußenwände
besonders bei Gräsern und Riedgräsern, die dadurch starr werden (SITTE et al. 1998).
Silikat hemmt die mikrobielle Verdauung (VAN SOEST 1994).
Der hohe Kutin- und Wachsgehalt der kutanen Pflanzenoberfläche macht gegenüber der mikrobiellen Verdauung resistent (BAKER u. HARRIS 1947; BAUCHOP 1980; AKIN 1989; McALLISTER et al. 1990; VAN SOEST 1994; WILSON u. KENNEDY 1996), so dass an intakten kutanen Pflanzenoberflächen nur wenige Mikroorganismen anhaften können (BAUCHOP 1989; VAN SOEST 1994). Eine Anhaftung der Mikroorganismen ist jedoch für den Abbau i.d.R. notwendig (s. Kap. 2.1.2.1.3). Außerdem hemmen Kutin und Wachse die Verdauung von Pflanzenkomponenten (VAN SOEST u. JONES 1968;
MONSON et al. 1972; POND et al. 1984; VAN SOEST 1970, 1994) indem sie das Wachstum und die metabolische Aktivität der Pansenmikroorganismen negativ beeinflussen (HOOVER u. MILLER 1991).
Da die Oberflächen von Pflanzen den Mikroorganismen kein abbaubares Material bieten, müssen letztere ins Innere gelangen. Von den ruminalen Mikroorganismen besitzen jedoch lediglich die Hyphen der anaeroben Pilze die Fähigkeit zur direkten Penetration, wenn sie mit derartig widerstandsfähigem Material konfrontiert werden (AKIN u. RIGSBY 1987;
HO et al. 1988; s. Kap. 2.1.2.2.1). Dieser Vorgang setzt die Festigkeit der Gewebe deutlich herab und kann zusätzliches, zuvor geschütztes Pflanzengewebe für Anheftung und Abbau durch Bakterien freilegen (AKIN et al. 1983). Alle weiteren am pflanzlichen Abbau beteiligten Mikroorganismen sind auf andere Eintrittsmöglichkeiten angewiesen.
Bevorzugte Eintrittsstellen in das Innere von Pflanzenbestandteilen sind jedoch für die anaeroben Pilze (BAUCHOP 1989), ebenso wie auch für Bakterien (LATHAM et al.
1978a, b; CHENG et al. 1980) und Protozoen (BAUCHOP u. CLARKE 1976; BAUCHOP 1989) Lokalisationen mit zerstörter Epidermis (BUXTON u. REDFEARN 1997).
Wichtiger Faktor ist deshalb die Zerkleinerung des Pflanzenfutters durch Kauen und Wiederkauen (BALCH u. CAMPLING 1962; POND et al. 1984; HOOVER 1986;
MARTZ u. BELYEA 1986; ULYATT et al. 1986; McLEOD u. MINSON 1988; VAN SOEST 1994). Nach MONSON et al. (1972) bewirkt eine intakte Kutikula eine Verzögerung von 6- bis 48-h bis zum Beginn der mikrobiellen Fermentation von Pflanzenpartikeln, wobei Variationen zwischen verschiedenen Pflanzen-Spezies bestehen.
So erscheint die Epidermis bei Leguminosen und C3-Gräsern nach 24 Stunden, bei C4- Gräsern jedoch erst nach mehr als 48 Stunden abgelöst (AKIN 1989; WILSON 1993). Der zeitliche Unterschied wird dadurch verursacht, dass die Epidermis von C3-Gräsern mit dünnwandigen Parenchymzellen, diejenige der C4-Gräser hingegen mit dickwandigen Bündelscheidenzellen verbunden ist (BUXTON u. REDFEARN 1997).
Neben dem Zugang zu Pflanzengeweben über beschädigte Stellen der Pflanzenepidermis hat der Zutritt der Mikroorganismen durch Blattstomata (CHESSON u. FORSBERG 1997; BAUCHOP 1989; CHENG et al. 1991; VAN SOEST 1994; BREVES u.
LEONHARD-MAREK 2000) eine besondere Bedeutung. Blattstomata sind charakteristisch für die von einer Kutikula überzogenen Epidermen. Gehäuft finden sie sich an Laubblattunterseiten, fehlen aber auch in den Epidermen von Sproßachsen fast nie.
Jedes Stoma besteht aus 2 länglichen Schließzellen deren mittlerer Bereich durch einen Interzellularspalt, den Porus, von einander getrennt ist. Durch den Porus wird eine Verbindung zwischen Außenluft und Interzellularraum des Mesophyll- bzw.
Rindengewebes durch Epidermis und Kutikula hindurch hergestellt. An Laubblattunter- seiten liegen in der Regel zwischen 100 und 500 Stomata pro mm2 (SITTE et al. 1998).
Abb. 2.5: Querschnitt durch eine Spaltöffnung, schematisch; dunkel-grau: turgeszent gespannt und geöffnet; hellgrau: entspannt und geschlossen
(DENFFER 1998)
Abb. 2.4: Spaltöffnung von Helleborus niger (Christrose) von der Blattunterseite betrachtet. Schließzellen quer angeschnitten (NULTSCH 1996)
c = Cuticula; ch = Chloroplasten; e = benachbarte Epidermiszellen; hg = Hautgelenk;
hh = Hinterhof; s = Schließzelle; vh = Vorhof; zs = Zentralspalt
s zs hh s ch hg e
vh
c
CHENG et al. (1980) fanden nach Inkubation von Grobfutterblättern mit Bakterien eine besonders schnelle Besiedlung um die Stomata herum, die deutlich stärker als die am Rest der Oberflächen ausfiel. Die Bakterien gelangten durch die Spaltöffnungen hindurch ins Innere der Blätter, hafteten im Interzellularraum an den Zellwänden an, und vermehrten sich in dieser nährstoffreichen Nische, um zusammenhängende Mikrokolonien beträchtlichen Ausmaßes zu bilden. Diese bakterielle Proliferation vergrö ßert die inter- zellularen Räume durch Separation der Pflanzenzellen beträchtlich und ermöglicht damit den Zugang zu weiteren Anhaftungsstellen und Nährstoffen.
2.1.1.3 Blatt und Stamm
In Pflanzen werden aus den einzelnen Geweben die beiden wesentlichen Struktureinheiten Blatt und Stamm gebildet. Der mit der Funktion des jeweiligen Pflanzenteils verbundene anatomische Aufbau erleichtert oder begrenzt dabei die Zugänglichkeit für Mikroorganismen (CHESSON 1993; VARGA u. KOLVER 1997), und es bestehen somit hinsichtlich der Verdaulichkeit deutliche Unterschiede. Blätter sind besser verdaulich als Stämme von Pflanzen (MINSON 1990; BOURQUIN u. FAHEY 1994; VAN SOEST 1994). Dieses liegt an dem in Blättern vorliegenden, geringeren Zellwand- und Ligningehalt im Vergleich zu den Stämmen (BOURQUIN u. FAHEY 1994; BUXTON u.
REDFEARN 1997), sowie dem hohen Anteil dünnwandiger Mesophyllzellen (BUXTON u. REDFEARN 1997). Stämme hingegen besitzen höhere Anteile struktureller Gewebe, sowie großer, verholzter Leitstrukturen verglichen mit Blättern (VAN SOEST 1994).
Aus dem funktionellen Aufbau resultiert in den Blättern ein zwischen den äußeren Oberflächen (s. Abb. 2.6: „ “oe“ und “ue“) liegendes, mikrobiell leichter und vollständig abbaubares Gewebe (Parenchyme; s. Abb. 2.6: “pp“ und “sp“) mit Interzellularen, mit leichterer Zugänglichkeit über die in großer Anzahl vorhandenen Stomata (s. Abb. 2.6:
“sz“).
Beim Stamm (s. Abb. 2.7) erfolgt der Abbau neben beschädigten Stellen (s. auch Kap.
2.1.1.2), v.a. von innen her. Die Besiedlung der inneren Oberflächen hohler Stämme erfolgt sehr schnell. An Schnittstellen bilden Mikroorganismen einen kompletten Ring um das Schnittende des Stammes und dringen von dort aus zwischen Epidermis und Gefäßzylinder ein. Besonders das Phloem wird schnell besiedelt. Es folgt der ausgeprägte Abbau von Phloem und Rindengewebe, mit daraus resultierender Exposition des Gefäßzylinders. Die Epidermis wird dabei nicht abgebaut sondern lediglich abgelöst.
Durch den Abbau des Pflanzengewebes entstehen Einbuchtungen, in denen die Mikroorganismen geschützt vorliegen und der Abbau weiter voranschreiten kann (BAUCHOP 1989).
Nachfolgend wird der grobe Aufbau von Blatt (Abb. 2.6) und Stamm (Abb. 2.7) im Querschnitt schematisch dargestellt.
Abb. 2.6: Bau des Blattes von Helleborus niger (Christrose; MÄGDEFRAU 2001)
c = Cuticula; oe = Epidermis der Oberseite; pp = Palisadenparenchym; sp = Schwamm- parenchym; sz = Schließzellen einer Spaltöffnung; ue = Epidermis der Unterseite;
vh = Vorhof
oe pp c
oe
pp
sp
ue c
vh sz
Beginn der Ausbildung der Procambiumstränge
Beginn der Ausbildung des Phloems
Beginn der Ausbildung des Xylems
Beginn der Ausbildung der
prim. Bastfasern Primäre Ausfertigung abgeschlossen
Beginn des sekundären Dickenwachstums Differenzierungszone (0,04– 25 mm) Sekundäres Dickenwachstum
Embryonalzone(ca. 0 – 0,02 mm) Determinationszone
(ca. 0,02 – 0,04 mm)
Abb. 2.7: (A) Längsschnitt durch eine verholzende Dikotylensprossachse (B) Entsprechende Querschnitte (nach DENFFER 1998);
Legende s. nächste Seite
A B
Um Pd Ur Uk Rm Bm Ps
Ed pr R Pp Pc Px M
Ed pr R Ps Rm M
Ed pr R pr Bf pr P C pr X M
Edg K Kc pr R pr Bf Mp sP C sX pX M
Rm
2.1.1.4 Zellreife und Pflanzenwachstum
Mit fortschreitender Reife verändert sich die Zusammensetzung der Pflanze zunehmend.
Das Verhältnis der metabolisch nutzbaren Zellinhalte zur zunehmenden strukturellen Zellwand nimmt mit dem Alter der Pflanze ab. Photosynthetischer Kohlenstoff wird irreversibel in die Masse des strukturellen Materials abgelagert (MOWAT et al. 1965;
TILLEY u. TERRY 1963; MINSON 1990; VAN SOEST 1994). Die Zelldifferenzierung mit fortschreitender Reife schließt Ligninablagerung auf Kosten von Wasser und Pektin ein (MONGEAU 1993), so dass die mikrobielle Abbaubarkeit (wie in Kap. 2.1.1.1 beschrieben) sinkt (JUNG u. DEETZ 1993; ABREU 1994; VAN SOEST 1994;
TRAXLER et al. 1998; BREVES u. LEONHARD-MAREK 2000). Die unterschiedliche Verdaulichkeit jüngerer (frisches Wachstum oberer Stämme) und reiferer (alte, reife Blätter unterer Stamme) Pflanzenanteile ist in Abb. 2.8 dargestellt:
Abb. 2.8: Verdaulichkeitsvariationen von Stamm- und Blattanteilen tropischer Gräser (Angabe des Anteils der verdaulichen Bestandteile in %; McDOWELL 1972) Aufgrund der stärkeren Lignineinlagerung nehmen die Stämme in ihrer Verdaulichkeit mit zunehmender Reife sehr viel schneller und stärker als die Blätter ab (MINSON 1990; VAN SOEST 1994; BUXTON u. REDFEARN 1997). Zusätzlich steigt mit fortschreitender Reife auch der Gehalt struktureller Anteile im Grobfutter an, wodurch das Verhältnis von Blatt:Stamm mit zunehmender Pflanzenreifung abnimmt (BUXTON u. REDFEARN
reife Blätter (60 – 70 %) frisches Wachstum (60 – 70 %)
oberer Stamm (45 – 55 %)
unterer Stamm (35 – 45 %)
alte Blätter (50 – 55 %)
normale Schnitthöhe (15 cm) Legende zu Abb. 2.7:
Bm = Blattmeristem; C = Cambium; Ed = Epidermis; Edg = Epidermis gesprengt; K = Kork; Kc = Korkcambium; M = Mark; Mp = Metaphloem; Pc = Procambium; Pd = Protoderm; Pp = Protophloem; pr Bf = primäre Bastfasern; pr P = primäres Phloem;
pr R = primäre Rinde; pr X = primäres Xylem; Ps = Procambiumstrang; Px = Protoxylem; Rm = Restmeristem; sP = Sek. Phloem; sX = sekundäres Xylem Uk = Urmark; Um = Urmeristem; Ur = Urrinde
1997); z.B. bei Luzerne von 1,5 im frühen vegetativen Stadium auf 0,5 im späten Blütestadium (ALBRECHT et al. 1987). Zuweilen wird für die Qualitätsbewertung dieses Stamm-zu-Blatt-Verhältnis herangezogen.
Die nachfolgende Tabelle zeigt das Verhältnis von Stamm zu Blatt bei Luzerne, Glatt- hafergras und Weizenstroh.
Tab. 2.3: Ertrag der Blatt- und Stammfraktionen isoliert aus Luzerne, Glatthafergras und Weizenstroh angegeben in % der TS (BOURQUIN u. FAHEY 1994)
Luzerne Glatthafergras Weizenstroh Blatt Stamm Blatt Stamm Blatt Stamm
% der TS
Fraktionsertrag 35,6 64,4 51,4 38,6 39,6 60,4
TS 88,6 93,1 87,2 92,9 87,0 91,8
TDF 36,0 72,0 63,5 80.1 73,3 83,8
NDF 26,6 64,1 66,5 80,3 74,0 83,5
NDF, uS 25,5 62,8 64,3 79,0 70,1 82,2
ADF 17,8 55,7 42,1 52,4 53,5 58,9
ADL 3,6 11,2 4,9 6,9 6,5 8,9
TS = Trockensubstanz; TDF = total dietary fibre; NDF = neutral detergent fibre; NDF uS = neutral detergent fibre in der uS = ursprünglichen Substanz; ADF = acid detergent fiber;
ADL = acid detergent lignin
Wie aus der Tabelle ersichtlich sind die Unterschiede zwischen Stamm und Blatt in Leguminosen grö ßer als in Gräsern (VAN SOEST 1994; BUXTON u. REDFEARN 1997), weshalb eine Anwendung des Stamm-zu-Blatt-Verhältnisses hier sinnvoller ist als bei Gräsern (VAN SOEST 1994).
2.1.1.5 Besonderheiten bei Gräsern und Leguminosen
Gräser und Leguminosen stellen die wesentlichen Futterpflanzengruppen in der Wiederkäuerernährung dar. Sie unterscheiden sich im Aufbau voneinander.
Bei gleicher Verdaulichkeit enthalten Leguminosenzellwände nahezu zweimal soviel Lignin wie Gräser (VAN SOEST 1994), allerdings ist der Pflanzenzellwandanteil in Leguminosen geringer als in Gräsern (ABREU 1994; VAN SOEST 1994). Die Zellwand von Gräsern ist wegen des geringeren Ligningehalts (ABREU 1994) verdaulicher als die der Leguminosen (VAN SOEST 1994; BUXTON u. REDFEARN 1997). In einem ähnlichen Wachstumsstadium werden Leguminosen allein deswegen schneller als Gräser fermentiert, weil die stärker lignifizierten Leguminosenzellwände in insgesamt geringerer Menge vorliegen als die weniger lignifizierten Graszellwände (VAN SOEST 1994).
Die Blätter der Grobfutterleguminosen (Dikotyle) stellen metabolische Organe dar und besitzen somit nur wenig strukturelles, schwer verdauliches Material (VAN SOEST 1994;
s. Abb. 2.9).
Die Blätter der Gräser (Monokotyle) hingegen enthalten die lignifizierte Mittelrippe, die eine wichtige strukturelle, stabilisierende Funktion besitzt sowie die ebenfalls stützenden und deswegen stark lignifizierten Blattscheiden. Die oftmals vorhandene zusätzliche Einlagerung von Silikaten mindert ebenfalls die Verdaulichkeit (VAN SOEST 1994; s.
Abb. 2.10).
Abb. 2.9: Schema einer dikotylen Pflanze (NULTSCH 2001)
b = Blatt; hy = Hypokotyl; k = Achsel- knospen; ko = Kotyledonen; sw = Seiten- wurzel; ss = Sprossscheitel; w = Haupt- wurzel; ws = Wurzelscheitel
Abb. 2.10: Stück eines Getreidehalms, teils in Übersicht, teils im Längsschnitt
dargestellt (nach NULTSCH 2001) e = meristematisches Gewebe; k = Knoten;
mr = Mittelrippe; o = Oberblatt; sp = Spross- achse; u = scheidenförmiges Unterblatt
o u
k
sp
e sp
b
sw
ws w hy k b ss
b
ko
k k
k
mr
ko
2.1.1.5.2 Besonderheiten der Pflanzen tropischer Klimate und Verdaulichkeit
Besondere Bedingungen bestehen für die Pflanzen der tropischen Klimate. Bei einem ausreichenden Feuchtigkeitsangebot können Pflanzen in diesen Gegenden ein mehr oder weniger kontinuierliches Wachstum entfalten. Dieses verringert die Verdaulichkeit des tropischen Grobfutters (VAN SOEST 1994). Durch die langen, warmen Nächte werden hohe Respirationsraten erreicht. Die insgesamt hohen Temperaturen fördern die Lignifizierung. Verbunden damit ist ein hoher Zellwandanteil und ein vergleichsweise geringer Gehalt an löslichen Kohlenhydraten (MINSON 1990; VAN SOEST 1994).
Gewebetypen in Grobfutterpflanzen der tropischen Klimate werden von deutlich weniger Mikroorganismen angegriffen und langsamer durch diese abgebaut, als die entsprechenden Gewebe der Pflanzen gemäßigter Klimate (HANNA et al. 1973; AKIN u. BURDICK 1975).
Die mittlere TS-Verdaulichkeit unterschiedlicher Leguminosen gemäßigter und tropischer Klimate zeigt nur eine geringe Differenz (MINSON u. WILSON 1980), da keine Unterschiede im photosynthetischen Weg bestehen (MINSON 1990). Allerdings besitzen tropische Leguminosen einen höheren Gehalt an Lignin und Protein, wiederum aber einen geringeren Zellwandgehalt als tropische Gräser. Im Vergleich zu den meisten Leguminosen gemäßigter Klimate weisen die tropischen Leguminosen einen höheren Zellwand- und Ligninanteil auf (VAN SOEST 1994).
Gräser tropischer Klimate hingegen haben eine sich von den Gräsern gemäßigter Klimate unterscheidende Photosynthesestrategie, welche folglich eine andere anatomische Struktur notwendig macht (SITTE et al. 1998). Die sich durch ihren Stoffwechselweg von den Pflanzen der gemäßigten Breiten unterscheidenden Gräser der Tropen werden C4-Pflanzen genannt (VAN SOEST 1994). Sie besitzen höhere Konzentrationen strukturreicher Bestandteile in Form großer Mengen an Gefäßbündeln pro Querschnitt (AKIN u.
BURDICK 1975), sowie dickwandige, von Mikroorganismen schwer zu penetrierende Parenchymbündelscheidenzellen (HANNA et al. 1973; AKIN u. BURDICK 1975). Es sind somit mehr Ansatzstellen für die Lignifizierung sowie eine eng gepackte Zellstruktur vorhanden. Besonders Menge und Anordnung der Mesophyllzellen zeigen Unterschiede (AKIN u. BURDICK 1975). Verglichen mit C3-Pflanzen (10 – 15; JONES 1985; VAN SOEST 1994) haben C4-Pflanzen zwischen den Gefäßbündeln nur wenig Mesophyllzellen (2 – 3; JONES 1985). AKIN u. BURDICK (1975) fanden, dass das Mesophyll der C3- Gräser mehr als 50 % des Blattgebietes ausmacht, in C4-Gräsern jedoch lediglich etwa 25
%. Während erstere Gräser locker, unregelmäßig angeordnete Mesophyllzellen mit einer relativ großen Luftraummenge zwischen den Zellen besitzen, weisen letztere dichter gepackte, oftmals radiär um die Gefäßgewebe herum orientierte Mesophyllzellen auf (BROWN 1958). Die Mesophyllzellen der Gräser gemäßigter Klimate sind nicht lignifiziert (VAN SOEST 1994).
Somit besitzen tropische Gräser aufgrund des Aufbaus und der Anordnung ihrer Mesenchym- und Bündelscheidenzellen eine deutlich geringere Verdaulichkeit als Gräser gemäßigter Klimate (MINSON u. McLEOD 1970). In C3-Spezies sind Mesophyll, Phloem, epidermale und Parenchymzellen gesamthaft abbaubar (BUXTON u. REDFEARN 1997).
Im Gegensatz dazu sind in C4-Gräsern die epidermalen und Parenchymbündelscheiden- zellen langsam und nur teilweise abbaubar (AKIN 1989).
2.1.2 Zum Pflanzenabbau genutzte Mechanismen verschiedener Mikroorganismen Der Abbau strukturreichen Pflanzenmaterials im Pansen erfolgt durch Mikroorganismen.
Es konnte die Beteiligung von Protozoen (BAUCHOP u. CLARKE 1976; AMOS u. AKIN 1978; BAUCHOP 1989; BREVES u. LEONHARD-MAREK 2000), Pilzen (BAUCHOP 1981, 1989) und Bakterien (BAUCHOP 1989; BREVES u. LEONHARD-MAREK 2000) gezeigt werden. Die bakterielle Population war in Menge und Aktivität vorherrschend (AMOS u. AKIN 1978; STEWART et al. 1979; CHENG et al. 1979, 1980; FAY et al.
1981; WINDHAM u. AKIN 1984; AKIN u. BRENNER 1988).
Die ruminalen Mikroorganismen (Bakterien, s. Kap. 2.1.2.1; anaerobe Pilze, s. Kap.
2.1.2.2; Protozoen, s. Kap. 2.1.2.3) haben unterschiedliche Methoden für den Abbau der strukturellen Pflanzenteile entwickelt. So zeigen Bakterien Kolonisation mit Anheftung und nachfolgendem Abbau (DINSDALE et al. 1978; LATHAM et al. 1978a, b; AKIN 1980; FORSBERG et al. 1981; AKIN u. BARTON 1983; CHENG et al. 1983/84;
GAUDET u. GAILLARD 1987; LAMED et al. 1987; MORRIS u. COLE 1987; MIRON et al. 1989; s. Kap. 2.1.2.1), anaerobe Pilze dringen über ihre Hyphen in die Zwischenräume der Pflanzenstrukturen ein (ORPIN 1976; BAUCHOP 1989; JOBLIN 1989; s. Kap.
2.1.2.2) und Protozoen nehmen Fragmente zur Verdauung auf (HUNGATE 1942, 1943;
BAKER u. HARRIS 1947; KUDO 1966; AKIN u. AMOS 1979; COLEMAN 1992; s.
Kap. 2.1.2.3).
Zu Enzymen des Abbaus s. ODENKIRCHEN (1992; Zellulasen Hemizellulasen), KRAKOW (1992; Zellulasen). Zum Abbau der Kohlenhydrate s. DIRKSEN (1990).
2.1.2.1 Bakterien
Quantitativ und qualitativ leisten die Bakterien den wesentlichen Anteil in der Verdauung des strukturellen Pflanzenmaterials im Pansen (BRYANT 1973; AMOS u. AKIN 1978;
STEWART et al. 1979; CHENG et al. 1979, 1980; PRINS u. CLARKE 1980; FAY et al.
1981; WINDHAM u. AKIN 1984; AKIN u. BRENNER 1988). Sie sind vielfältig (KRAUSE u. RUSSELL 1996) und in großer Menge (> 1010 Zellen/g) im Pansen vorhanden (HUNGATE 1966). Die zellulolytischen Mikroorganismen F. succinogenes, R.
albus und R. flavefaciens herrschen dabei vor (HUNGATE 1966; BRYANT 1973;
CHENG et al. 1991; DEHORITY 1991; WEIMER 1992, 1996; FLINT 1994). Besonders F. succinogenes baut umfangreich Zellulose ab (DEHORITY u. SCOTT 1967; STEWART et al. 1979). Bei der Grobfutterpflanzenverdauung machen Ruminokokken (R. flavefaciens u. R. albus) etwa einen Anteil von 22 % aus (AKIN 1976), Ruminokokken und F.
succinogenes zusammen stellen etwa 70 % der an Grobfutter anhaftenden und dieses abbauenden Bakterien (AKIN 1979, 1980).
Zellulolyten, die primär andere Substrate, also nicht die Strukturpolysaccharide der Pflanzen im Wiederkäuerpansen abbauen (= sekundäre Zellulolyten), sind Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium lochheadii und Cl. longisporum (WEIMER 1996). B. fibrisolvens produziert Zellulase nur in geringem Umfang und ist in der Hemizellulose-Hydrolyse wichtiger (VARGA u. KOLVER 1997).
Zu Stoffwechselprodukten der Zellulolyten s. MAURUSCHAT (1996).
2.1.2.1.1 Spezifität der Zellulolyten
Die drei vorherrschenden Zellulolyten (F. succinogenes, R. albus und R. flavefaciens) sind nicht aktiv motil (HUNGATE 1966). Der initiale Kontakt zwischen den nicht-adhärenten Zellen und frischen Grobfutterpartikeln findet als zufälliges Ereignis statt, welches durch die vom Tier ausgehenden Aktivitäten, wie Pansenkontraktionen, Kauen und Wiederkauen sowie die hohe Mikroorganismendichte im Pansen ermöglicht wird (WEIMER 1996). Der Nachteil der Immotilität muss durch andere Mechanismen ausgeglichen werden.
Das gemeinsame Charakteristikum der drei vorherrschenden zellulolytischen Spezies (F.
succinogenes, R. albus und R. flavefaciens) ist die Nährstoffspezialisierung (WEIMER 1996), denn sie verwenden Zellulose und die Produkte der Hydrolyse als Wachstumssubstrate (HUNGATE 1966).
HUANG et al. (1988), McGAVIN u. FORSBERG (1988) und GONG u. FORSBERG (1989) fanden, dass F. succinogenes nur an spezifischen Stellen der Zellulose bindet, die nicht von proteinogenen Strukturen oder unspezifischen Organismen (wie anderen Bakterien) geblockt werden. In gemischten Kulturen heften R. flavefaciens und F.
succinogenes nicht-kompetetiv an jeweils spezifische Stellen auf Struktursubstraten an (LATHAM et al. 1978b; BHAT et al. 1990). Diese ausgeprägte, feste und spezifische Anheftung erfolgt über die Glykokalyx (WEIMER 1996; s. Kap. 2.1.2.1.4). Der nachfolgende Zelluloseabbau wird durch einen Multienzymkomplex (Zellulosom; s. Kap.
2.1.2.1.2) vermittelt, welcher sehr effektiv den Abbau der Zellulose ermöglicht (WEIMER 1996).
Die starke Anheftung ermöglicht es den ruminalen Mikroorganismen sich im Wettbewerb hervorragend durchzusetzen (WEIMER 1996):
1) zellulolytische Enzyme werden auf das Substrat fokussiert
2) andere Mikroorganismen und deren Enzyme werden vom Ort der Hydrolyse ausgeschlossen, wodurch sich die Zellulolyten den ersten Zugang zu den Produkten der Zellulosehydrolyse sichern
3) die zellulolytischen Enzyme selbst werden vor den im Pansen weit verbreiteten Proteasen geschützt
4) es entsteht ein starker Zell-Substrat-Kontakt und ein Schutz der anhaftenden ruminalen zellulolytischen Bakterien vor der Aufnahme durch Protozoen
Der Adhäsion folgt die fortschreitende mikrobielle Kolonisation mit Wachstum und nachfolgender Nährstofffreisetzung aus der Substratverdauung (CHENG et al. 1991).
Während die Nährstoffspezifität mit den entsprechenden Anheftungs- und Abbau- mechanismen die schnelle Kolonisation zu Beginn des Abbaus der unlöslichen strukturellen Bestandteile sicherstellt (LATHAM et al. 1978a; AKIN 1979; CHENG et al.
1983/84; CRAIG et al. 1987; BAUCHOP 1989), wird der sich anschließende weitere Abbau durch das Zusammenwirken vieler verschiedener Spezies durchgeführt (HUNGATE 1966; DEHORITY u. SCOTT 1967; DEHORITY 1973; AKIN et al. 1974a, AKIN u. AMOS 1975; CHENG et al. 1977; AKIN 1980).
2.1.2.1.1.1 Zellulosom der Zellulolyten
Das Zellulosom ist ein Multienzymkomplex (AURILIA 2000), mit darin enthaltenen Zellulose-Bindungs-Domänen (CBD) (FORSBERG 1986; McGAVIN u. FORSBERG 1989; GILBERT et al. 1990). Dieser Oberflächen-gebundene Komplex von 18 – 20 Proteinen ermöglicht die Bindung an und die Hydrolyse von Zellulose (LAMED u.
BAYER 1988; GONG u. FORSBERG 1989; FELIX u. LJUNGDAHL 1993).
FORSBERG et al. (1981), CHENG et al. (1983/84), GAUDET u. GAILLARD (1987) sowie ROGER et al. (1990) beobachteten bei F. succinogenes extrazellulare Vesikel, mit zellulolytischen Aktivitäten. Eine Beteiligung an der bakteriellen Anheftung wurde vermutet. COXWORTH et al. (1981) fanden eine Fortsetzung der Substratverdauung durch die Enzyme dieser Zellwandvesikel noch nach zellularer Autolyse von F. succinogenes.
Versuche von VAREL et al. (1995) ergaben, dass sich z.B. Cl. longisporum als Bakterium im Pansen nicht durchsetzen konnte, weil diese Spezies keine Zellulosom-ähnliche Struktur produziert.
2.1.2.1.1.2 Anheftung der Zellulolyten
Etwa drei Viertel der ruminalen Bakterien haften direkt und eng an Futterpartikel an (HUNGATE 1966). Zur Verteilung der Bakterien im Pansen s. ELIAS (1999;
Kompartimente).
Die bakterielle Anheftung der Zellulolyten an die Pflanzenzellwand ist in der ruminalen Zellulose- und Pflanzenpartikelverdauung für eine effektive Zellulosehydrolyse essentiell (HUNGATE 1947; LATHAM et al. 1978a, b; AKIN 1980; CHENG et al. 1983/84; KUDO et al. 1987; MORRIS u. COLE 1987; VARGA u. KOLVER 1997; AURILIA 2000). Diese Anheftung an Zellulose und Pflanzenzellwände konnte vielfach bei den drei wesentlichen ruminalen, zellulolytischen Pansenbakterien R. albus, R. flavefaciens und F. succinogenes nachgewiesen werden (DINSDALE et al. 1978; LATHAM et al. 1978a, b; AKIN 1980;
FORSBERG et al. 1981; AKIN u. BARTON 1983; CHENG et al. 1983/84; GAUDET u.
GAILLARD 1987; LAMED et al. 1987; MIRON et al. 1989). Vermittelnd wirkt hier die nachfolgend beschriebene Glykokalyx.
2.1.2.1.1.3 Glykokalyx der Zellulolyten
Mehrere Autoren beobachteten die Anheftung von Bakterien an Substrate über extrazellulare Substanzen (JONES et al. 1969; MARSHALL et al. 1971; BAE et al. 1972;
FLETCHER u. FLOODGATE 1973; COSTERTON et al. 1974, 1978; AKIN u. AMOS 1975; CHENG u. COSTERTON 1975; AKIN 1976; CHENG et al. 1977) bei intakter Zellhülle (LEATHERWOOD 1973; PATTERSON et al. 1975; LATHAM 1980). Auch bei den ruminalen, zellulolytischen Bakterien (F. succinogenes, R. flavefaciens und R. albus) wird der Kontakt zum Pflanzensubstrat durch die Synthese einer extrazellularen Glykoprotein-Kontakt-Struktur stabilisiert, der sogenannten Glykokalyx (PATTERSON et al. 1975; LATHAM et al. 1978a; CHENG et al. 1977, 1980; STACK u. HUNGATE 1984;
KUDO et al. 1987; VARGA u. KOLVER 1997). Die fibröse Polysaccharid-Glykokalyx
besitzt eine stabilisierende und schützende Funktion für die Verdauungsenzyme der Bakterien (CHENG et al. 1981; LAPPIN-SCOTT et al. 1992). Sie besteht aus externen Filamenten, passt sich der Substratoberfläche an und vermittelt die Anheftung der zellulolytischen Bakterien R. albus und R. flavefaciens sowie F. succinogenes an Pflanzenzellwandmaterial (LATHAM et al. 1978a; COSTERTON et al. 1981; PELL u.
SCHOFIELD 1993). Die Glykokalyx ist Teil der zellularen Masse, nicht ihr Produkt (VAN SOEST 1994). Die vermittelte Bindung ist sehr intensiv (AKIN 1979, 1980), eine Zerstörung der Glykokalyx verhindert die bakterielle Anheftung (LATHAM 1980).
Die Glykokalyces von R. flavefaciens und R. albus sind deutlich dicker als die von F.
succinogenes (COSTERTON et al. 1974; LATHAM et al. 1978b; LATHAM 1980). Reine Kulturen von F. succinogenes zeigen Bakterien mit irregulärer äußerer Membran und kleinen, ungleichmäßigen Mengen von Hüllmaterial (COSTERTON et al. 1974;
PATTERSON et al. 1975), mit lediglich dünner Oberflächenlage (COSTERTON et al.
1974; LATHAM et al. 1978b). F. succinogenes besitzt eine der dünnsten Hüllen unter den Zellulolyten (COSTERTON et al. 1974). Die mikrobielle Zellwand von F. succinogenes ist sehr flexibel, passt sich an die Topographie des Substrats an und ermöglicht so eine besonders feste Anheftung (AKIN 1976; FORSBERG et al. 1981; CHENG et al. 1983/84).
An Stellen des Kontakts mit dem Substrat ist die Hülle oftmals dicker als auf der freien Oberfläche des Bakteriums (AKIN 1976). Die Anpassung an die Substrattopographie ermöglicht eine grö ßere Kontaktfläche zwischen Mikroorganismus und Substrat, als dies bei inflexibler Hülle möglich wäre (LATHAM et al. 1978b).
2.1.2.1.1.4 Extrazelluläre Enzyme der Zellulolyten
Einige Forscher (AKIN et al. 1974a, b; AKIN u. AMOS 1975; AKIN 1979) beobachteten, dass Mesophyll und Phloem (s. Kap. 2.1.1.2) verschiedener Grobfuttermittel oft schneller durch Bakterien abgebaut wurden als andere Gewebe. Sie zeigten darüber hinaus, dass dies auch ohne vorherige Anheftung an die Grobfutterzellwand möglich war. Für Pansenbakterien konnte die Fähigkeit zum Abbau von Grobfutterzellwandkomponenten durch extrazellulare Enzyme gezeigt werden (GILL u. KING 1957; DEHORITY 1968;
SMITH et al. 1973; AKIN 1980). AKIN (1980) fand Hinweise auf eine Diffusion von zellwandabbauenden Enzymen aus Ruminokokken in das Medium hinein. R. albus ist in der Lage zur Entlassung von zellulolytischen Enzymen ins Milieu (SMITH et al. 1973;
PETTIPHER u. LATHAM 1979a, b) im Gegensatz zu R. flavefaciens, welches enger anhaftet (LATHAM et al. 1978a; AKIN 1980; GROLEAU u. FORSBERG 1981) deutliche Verdauungsgruben bildet und die meisten zellulolytischen Enzyme während des exponentiellen Wachstums in Verbindung mit den Zellen verbleiben (PETTIPHER u.
LATHAM 1979a, b). Nach HALLIWELL u. BRYANT (1963) produzieren einige dieser fest anhaftenden Bakterien keine extrazellulare Zellulase, wohingegen nach GROLEAU u.
FORSBERG (1981) auch intakte Zellen dieser Spezies die meisten ihrer zellulolytischen Enzyme in die Kulturflüssigkeit entlassen. F. succinogenes hat eine fragile Zellwand und dadurch eine deutliche Tendenz zur Lyse noch während der Anheftung mit anschließender Freisetzung der Enzyme (CHENG u. COSTERTON 1973; STEWART et al. 1981;
CHENG et al. 1983/84). Durch die in F. succinogenes vorkommenden fest zellgebundenen extrazellularen Zellulasen (HUNGATE 1947) ist die Adhäsion von Vorteil für das Voranbringen der Zellulolyse (LATHAM et al. 1978b).
2.1.2.1.2 Anheftungsmechanismen anderer Bakterien
Die Anheftung von ruminalen Bakterien an Substrate bezieht unterschiedliche Mechanismen ein. Initial erfolgt der nicht-spezifische Anheftungsprozess mit ionischer oder hydrophober Wechselwirkung, unter Einbezug der Van-der-Waals-Kräfte (STOTZKY 1980; PELL u. SCHOFIELD 1993). Die Intensität des Anhaftens der Mikroorganismen hängt u.a. von der Kationen-Austausch-Kapazität ab. Über bivalente Kationen (z.B. Ca++, Mg++) haftet das negativ geladene Bakterium an der weniger negativ geladenen Pflanzenzellwandfraktion an (JEROCH et al. 1993; s. a. Abb. 2.11).
Großen Anteil haben die untereinander vernetzten Polygalacturonsäureketten der Pektine, indem jeweils zwei Carboxylgruppen durch zweiwertige Kationen, wie Ca++ und Mg++, miteinander verbunden sind (CHESSON et al. 1995; NULTSCH 1996; s. auch Abb. 2.12 u. 2.13).
Abb. 2.11: Anhaften negativ geladener Bakterien an weniger negativ geladene Zellwandfraktionen über Liganden bivalenter Kationen (schematisch; JEROCH et al. 1993) Zellwand-
fraktion Ca2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Ca2+
Mg2+
Für die feste Anheftung werden spezifische Mechanismen (LATHAM et al. 1978a, b;
PELL u. SCHOFIELD 1993), die Adhäsine (GONG u. FORSBERG 1989; PELL u.
SCHOFIELD 1993; VARGA u. KOLVER 1997) und/oder Rezeptoren einbeziehen, benötigt (PELL u. SCHOFIELD 1993). Auch über Fimbrien können Bakterien anhaften.
Lektine können vermittelnd wirken (VAN SOEST 1994).
2.1.2.1.3 Zeitpunkt der Pflanzenpartikelbesiedlung
Im Pansen werden Pflanzenpartikel sehr schnell durch fibrolytische Mikroorganismen besiedelt (MINATO et al. 1966a, b; MINATO u. SUTO 1976, 1978, 1979; LATHAM et al. 1978a; AKIN 1979). Das Ausmaß der bakteriellen Kolonisation ist zeitabhängig (WILLIAMS et al. 1989a). Die anhaftende Subpopulation etabliert sich nach WILLIAMS u. WITHERS (1990) ca. 2 Stunden nach der Fütterung.
Eine schnelle Anheftung ist in einer Umwelt mit starker Konkurrenz durch andere Mikroorganismen ein deutlicher Vorteil (ROGER et al. 1990). Tatsächlich konnte eine nahezu sofortige Bindung von R. flavefaciens (< 1 Minute) direkt an Zellulose gefunden werden (CHENG et al. 1980). Auch ROGER et al. (1990) fanden bereits 1 Minute nach Kontakt 80 – 90 % der Zellen von R. flavefaciens (007) mit Zellulose verbunden. Für R.
albus konnten MORRIS u. COLE (1987) eine Anheftung innerhalb von 5 Minuten nach Zugabe des Substrats nachweisen. AKIN (1979, 1980), AKIN et al. (1974a) sowie ROGER et al. (1990) beobachteten erst in den späteren Stadien der Zellulolyse eine Adhäsion von F. succinogenes an Pflanzenzellen. ROGER et al. (1990) fanden für F. succinogenes (S85) die höchsten Anheftunsquoten an Zellulose nach 15 - 30 Minuten. Nach 1 Minute hafteten hier lediglich 30 % der Zellen.
Zur zeitabhängigen Anheftung s. auch Abb. 2.14 u. 2.15 Abb. 2.12: Ionenbindung zwischen zwei
Galacturonsäure-Molekülen unter Beteiligung eines Calcium-Ions.
(R = Polygalacturonsäure-Kette;
LÜTTGE et al. 1999)
Abb. 2.13: Vernetzung von Poly-
galacturonsäure-Ketten durch Ionen-bindungen mit Pektin (LÜTTGE et al. 1999)
anhaftende Zellen (%) anhaftende Zellen (%) Optische Dichte (600 nm) Optische Dichte (600 nm)
Zeit (h)
Zeit (h)
Abb. 2.14: Einfluss der Wachstumsphase auf die Adhäsion von F. succinogenes S85 (ROGER et al. 1990)
Abb. 2.15: Einfluss der Wachstumsphase auf die Adhäsion von R. flavefaciens 007 (ROGER et al. 1990)
8 14 20 26 32 38 44
100 80
60
40
20
0
7 12 17 22 27 32
1,0
0,8
0,6
0,4 0,2 0,0 Symbole: ▲ = Wachstum
♦ = anhaftende Zellen (%) 80
60
40
20
0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
