3. Eigene Untersuchungen 1 Versuchsziel
3.3 Methode zur Bestimmung der Diaminopimelinsäure (DAP)
DAP ist eine Aminosäure, die Bestandteil des Glycopeptids Murein in der Zellwand gramne-gativer (ALLAM et al. 1982) und einiger grampositiver Bakterien ist (s. Tab. 3.24; HOANG et al. 1997). In tierischem Gewebe und höheren Pflanzen kommt sie nicht vor und in Protozoen werden nur nach Aufnahme von Bakterien geringe Spuren gefunden (WORK u. DEWEY 1953; HUTTON et al. 1971; LING u. BUTTERY 1978; SMITH et al. 1978; DUFVA et al. 1982;
SIDDONS et al. 1982; MERRY u. McALLAN 1983; QUIGLEY u. SCHWAB 1987; DENHOLM u. LING 1989; VÖLKER et al. 1991; NAGASAWA et al. 1993; EL-WAZIRY et al. 1995;
PAVELKA u. JAKOBS 1996; HOANG et al. 1997; LEDWIDGE u. BLANCHARD 1998;
WEHRMANN et al. 1998). Die Diaminopimelinsäue wird deshalb für den Nachweis be-stimmter Bakterienarten genutzt.
Tab. 3.24: DAP-Gehalte in den Zellwänden verschiedener Bakterien Bakterienart Gehalt an DAP in
Bakterienzellwand
Actinomycetes keine Angaben GOODFELLOW et al. 1989;
ZANOL u. GASTALDO 1991 Bacillus
keine Angaben PAVELKA et al. 1997 LIU u. SHAW 1997
FREHEL u. RYTER 1980;
MASSON et al. 1991 LIU u. SHAW 1997
LIU u. SHAW 1997; ROTEN et al. 1994 Bacteroides succinogenes 2,6 µg/mg Protein STYRIAK et al. 1992
Brucella abortus keine Angaben RIGBY u. FRASER 1988 Butyrivibrio fibrisolvens 10,8 µg/mg Protein STYRIAK et al. 1992 Citrobacter Ha-1
keine Angaben LECHEVALIER u. LECHEVALIER 1970;
PITCHER 1977
FERNÀNDEZ-GARAYZÀBAL et al. 1998 PAVELKA et al. 1997
WEHRMANN et al. 1998 Clostridium spp. 164 µg/mg Protein STYRIAK et al. 1992 C. bacterium Br-34 15,3 µmol/g TS AULING et al. 1991 Fortsetzung s. nächste Seite
Tab. 3.24: Fortsetzung
Bakterienart Gehalt an DAP in Bakterienzellwand
Autor u. Jahr
Kineosporia aurantiaca keine Angaben ZANOL u. GASTALDO 1991 Kitasatosporia keine Angaben ZANOL u. GASTALDO 1991 Nocardia/Nocardiae
N. crassostreae N. lurida
keine Angaben LECHEVALIER u. LECHEVALIER 1970;
FRIEDMAN et al. 1998 FRIEDMAN et al. 1998 ZANOL u. GASTALDO 1991 Megasphera elsdenii 108,4 µg/mg Protein STYRIAK et al. 1992
Moraxella Fo-14 66,7 µmol/g TS AULING et al. 1991 Mycobakterien
Mycobacterium smegmatis
keine Angaben LECHEVALIER u. LECHEVALIER 1970;
PAVELKA et al. 1997 PAVELKA u. JAKOBS 1996 Pseudomonas Br-33 Rickettsia prowazekii 20,3 - 23,7 µmol/g
Protein
PANG u. WINKLER 1993 Saccharopolyspora
gregorii
Saccharopolyspora hordei
3,6 µg/mg TS 2,15 µg/mg TS
GOODFELLOW et al. 1989
Salmonellen
Salmonella typhimurium
keine Angaben HOANG et al. 1997 HOANG et al. 1997;
PAVELKA et al. 1997 Selenomonas ruminantium 198 µg/mg Protein STYRIAK et al. 1992 Streptomyces
Streptococcus bovis AO 24/85 und AECR
Streptococcus faecium AL6 und AEC
ZANOL u. GASTALDO 1991 STYRIAK et al. 1992
Vibrio spp. keine Angaben HOANG et al. 1997
Das DAP-Protein-Verhältnis ist in den einzelnen Bakterienarten sehr konstant (WORK u.
DEWEY 1953; MEINL u. KREIFENBRINK 1985; JEHL u. GIDENNE 1995; PHILIPCZYK et al. 1995). Allerdings variiert der DAP-Gehalt zwischen verschiedenen Bakterienarten erheb-lich (s. Tab. 3.24) und gram-positive enthalten mehr DAP als gram-negative Bakterien (SYNGE 1953; WORK u. DEWEY 1953; PURSER u. BUECHLER 1966; SMITH et al. 1975;
LING u. BUTTERY 1978; MERRY u. McALLAN 1983; BOGART et al. 1989). Große Bakte-rien haben einen geringeren DAP-Gehalt als kleine (s. Tab. 3.25; CZERKAWSKI 1974, 1976;
KRAWIELITZKI u. VOIGT 1988) und einige Bakterien enthalten überhaupt kein DAP (Tab.
3.26; WORK u. DEWEY 1953). Bei Untersuchungen gemischter Bakterienpopulationen er-gaben sich in Abhängigkeit von der Bakterienzusammensetzung unterschiedlich hohe DAP-Gehalte (s. Tab. 3.25).
Tab. 3.25: DAP-Gehalt in verschiedenen Bakterienpopulationen
Bakterienpopula-tion
DAP-Gehalt Autor u. Jahr
Kleine Bakterien 7,1 mg/g N CZERKAWSKI 1974 Große Bakterien 6,2 mg/g N CZERKAWSKI 1976
4,84 - 9,76 mg/g Gesamt-aminosäuren
JOHN 1984
4,7 - 9,5 mg DAP N/g N COCKBURN u. WILLIAMS 1984 5,8 mg DAP N/g Bakterien
N
ALLAM et al. 1982 2,23 - 2,80 mg/g Bakterien
TS bzw.
2,39 - 2,57 mg/g TS
KRAWIELITZKI u. VOIGT 1988
5 - 11 mg/g N RAHNEMA u. THEURER 1986 34 - 71 mg/g N bzw.
5,1 - 10,4 mg DAP N/g Bakterien N
LING u. BUTTERY 1978
6,8 mg/g Bakterien N HAGEMEISTER u. KAUFMANN 1974 8,1 mg/g Bakterien N HUTTON et al. 1971
65 mg/g Bakterien N MEINL u. KREIFENBRINK 1985
5,4 mg/g N QUIGLEY u. SCHWAB 1987
41 mg/g N HOGAN u. WESTON 1970
48 mg/g N CHAMBERLAIN et al. 1976
Gemischte Bakteri-enpopulation
52 mg/g N HUTTON et al. 1971
Tab. 3.26: DAP-freie Bakterien
Bakterien Autor u. Jahr
Achromabacter Ha-2 AULING et al. 1991 Moraxella St-8 AULING et al. 1991 Xanthomonas Br-31
Xanthobacter Fo-10
AULING et al. 1991 Grampositive
Milchsäure-bildner
WORK u. DEWEY 1953
gram-positive Coccen LATHAM 1980; WORK u. DEWEY 1953
Nicht-Actinetobacterarten AULING et al. 1991, 1988; BUSSE et al. 1989;
BUSSE u. AULING 1988; HAMANA et al. 1985, 1989;
YAMAMOTO et al. 1983
DAP liegt in den drei Stereoisomeren DD, LL und DL vor (s. Abb. 3.4; ZANOL u.
GASTALDO 1991; EL-WAZIRY et al. 1995).
HOOC COOH HOOC COOH
Epimerase
NH2 H H NH2 NH2 H H NH2
DD-DAP LL-DAP
Epimerase Epimerase
HOOC COOH
NH2 H H NH2 DL-DAP
Abb. 3.4: Strukturformel der drei Stereoisomere von Diaminopimelinsäure (NAGASAWA et al. 1993)
3.3.1 HPLC-Methode zur Messung der DAP (s. auch Anhang: Kap. 9.4, Tab. 9.57- 9.61) Eine HPLC-Methode zur Messung der Diaminopimelinsäure in der Bakterienfraktion nativer Pansenflüssigkeit sollte für den routinemäßigen Einsatz etabliert werden. Wesentliche Aus-wahlkriterien für die anzuwendende Methode waren einfache Handhabung und geringer technischer Aufwand, gute vorhersagbare Reproduzier- und Detektierbarkeit, sowie geringer Kostenaufwand.
Erste Wahl war die HPLC-Methode nach EL-WAZIRY et al. (1995), da sie obige Auswahl-kriterien am besten zu erfüllen schien. Sie wurde geringfügig, z. B. bei der Probenaufberei-tung modifiziert (s. Tab. 9.1). Die mit dieser Methode erwarteten Ergebnisse stellten sich aber in der Praxis als nicht reproduzierbar heraus. Es gelang weder, DAP in der Standardlö-sung (Standard und Derivatisierung nicht verändert; s. Tab. 9.2 u. 9.3) noch in der Pansen-flüssigkeit nachzuweisen. Daraufhin wurden weitere Veränderungen vorgenommen:
1. der DAP-Standard wurde stärker konzentriert (0,1 mM bis 0,25 M)
2. eine Verdünnungsreihe mit einer 50 mM DAP-Standardlösung (1 : 1 bis 1 : 5) wurde erstellt
3. der DAP-Standard wurde wie eine Probe behandelt und wie diese hydroly-siert:
1 ml DAP-Standard
+ 4 ml 6 M HCl Hydrolysierung für 20 Std. bei 110 °C
4. die Inkubation bei der Derivatisierung (bei 40 °C, für 1 Std.) wurde ausgelas-sen
5. die Probenaufbereitung wurde verändert:
1. Bakterienpellet + 4 ml 6 M HCl 2. Bakterienpellet + 8 ml 6 M HCl
3. Bakterienpellet + 1 ml DAP-Standard + 4 ml 6 M HCl 4. Bakterienpellet + 2 ml DAP-Standard + 4 ml 6 M HCl
6. Standard und Probe wurden im UV-Detektor bei 200 - 800 nm gemessen 7. Standard und Probe wurden mittels DAD-Detektion gemessen
Doch auch diese Maßnahmen brachten nicht den erwünschten Erfolg. Daraufhin wurde die Methode nach TAKAHASHI et al. (1989) getestet. Die Probenaufbereitung wurde beibehal-ten (s. Tab. 9.1) und die HPLC-Säule Develosil ODS-5 (100 x 6,0 mm I.D., Partikelgröße 5 µm) wurde durch eine Maisch Nukleosil (125 x 4,6 mm I.D.; s. Tab. 9.5) ersetzt. Als auch mit dieser Methode die Messung von DAP weder im Standard noch in der Pansenflüssigkeit möglich war (s. Tab. 9.4), wurden, wie bei der Methode nach EL-WAZIRY et al. (1995) zu-sätzliche Veränderungen vorgenommen (s. o.: Maßnahmen 1. bis 3., 5. und 7.), die jedoch wieder keinen Erfolg brachten.
Trotz intensiver Bemühungen und verschiedener Lösungsansätze konnten die Ergebnisse von EL-WAZIRY et al. (1995) und TAKAHASHI et al. (1989) nicht reproduziert werden. Es gelang weder DAP in der DAP-Standardlösung noch in der Pansenflüssigkeit nachzuweisen.
Damit schied dieser Untersuchungsgang für die Charakterisierung der mikrobiellen Verände-rungen im RUSITEC aus.