Enzyme des Kohlenhydratstoffwechsels .1 Cellulasen und Glucosidasen

Die meisten cellulolytischen Enzyme werden extrazellulär gebildet, einige weisen aber auch zellassoziierte Aktivität auf (PEARCE u. BAUCHOP 1985; WALLACE u. JOBLIN 1985;

LOWE et al. 1987 c; HÉBRAUD u. FÈVRE 1988). Cellulasen sind in ihrer Struktur wandelbar und enthalten häufig eine Bindungsdomäne, eine katalytische Domäne und Bindungspro-teine (GILKES et al. 1991). Sie haben ein pH-Optimum von 5,1 bis 6,0, ein Temperaturopti-mum von 45 bis 55 °C und zeigen Avicelase-, Filterpapier- (FPase), Carboxymethylcellulase- (CMCase) oder endo-Glucanase- und beta-Glucosidase- oder Cellobiaseaktivität. Darüber hinaus können sie andere Pflanzenzellwandpolymere wie Xylan abbauen (GILKES et al.

1991). Neben anaeroben Pansenpilzen können nur sehr wenige Mikroorganismen (z. B. Tri-choderm spp., Fusarium solani u. Clostridium thermocellum) Enzyme bilden, die amorphe und kristalline, hoch geordnete Cellulosepolymere (z. B. Baumwollfasern u. Avicel) abbauen (ERIKSSON u. WOOD 1985; WOOD u. GARCIA-CAMPAYO 1990; WOOD 1991; WILSON u. WOOD 1992 a). In den letzten Jahren fanden viele Untersuchungen über den Mechanis-mus der Biokatalyse der Cellulose statt. Die Konversion der Cellulose über Celludextrin und Cellubiose zu monomerer Glucose erfordert sequenzierte, kooperative Aktionen durch eine Reihe cellulolytischer Enzyme (WOOD u. GARCIA-CAMPAYO 1990; PERSSON et al. 1991;

WOOD 1991; LI u. CALZA 1991 b). Bei einigen Bakterien, besonders bei Clostridium thermocellum, formen die für den Celluloseabbau verantwortlichen Enzyme einen Komplex (Cellusom) auf der Zelloberfläche (LAMED et al. 1983; LAMED et al. 1987; LAMED u.

BAYER 1988). Ähnliche Verbindungen pflanzenzellwandabbauender Enzyme kommen auch als Komplexe in Pansenpilzen vor (WOOD et al. 1986; WILSON u. WOOD 1992 a). Der Komplex von Clostridium thermocellum besteht aus 14 bis 18 Polypeptiden und ist hochaktiv (MAYER et al. 1987). Die Bindung des Komplexes an die Cellulose wird durch nicht-cellulo-lytische Bindungsfaktoren initialisiert (WU et al. 1988). Die exakte Wirkungsweise des Kom-plexes ist aber noch nicht vollständig geklärt. Die Mechanismen des Celluloseabbaus von N.

frontalis gleichen denen in Clostridium thermocellum (WILSON u. WOOD 1992 a). Das Cellulosom von N. frontalis ist jedoch viel kleiner (700 kDa) als das von Clostridium thermo-cellum (2 x 10⁶ kDa) und stellt nur 4 % des gesamten extrazellulären Proteins dar. Es wird sezerniert und an Cellulose absorbiert (THEODOROU et al. 1996).

Die extrazellulären Enzymkomplexe anaerober Pansenpilze setzen sich aus exo-1,4,beta-D-Glucanasen (Cellobiohydrolase), endo-1,4,beta,D-exo-1,4,beta-D-Glucanasen (CMCase) und beta-D-Gluco-sidasen (Cellobiase) zusammen (WILLIAMS u. ORPIN 1987 a, b; HÉBRAUD u FÉVRE 1988; JOBLIN et al. 1990; CALZA 1991 a, b; LI u. CALZA 1991 b; WOOD 1991;

TEUNISSEN et al. 1992; WILLIAMS et al. 1994 c). Exo-Cellulasen haben eine geringere Aktivität gegenüber mikrokristalliner Cellulose (Avicel) als endo-Cellulasen (MOUNTFORT u.

ASHER 1985). Endo-Cellulasen (endo-Glucanasen) und exo-Cellulasen kommen in ver-schiedenen anaeroben Pansenpilzen vor (MOUNTFORT u. ASHER 1985; WOOD et al.

1986; WILLIAMS u. ORPIN 1987 a; XUE et al. 1993; WOOD u. WILSON 1995) und erzielen nur in Kombination die maximale Hydrolyse sehr widerstandsfähiger Cellulose (Baumwollfa-sern). An der Cellulolyse ist auch Cellodextrinase beteiligt. Sie hat eine höhere spezifische Aktivität als CMCase und wirkt auf kurzkettiges Cellodextrin, wobei Cellobiose und Glucose gebildet werden (XUE et al. 1992 b). BISARIA u. GHOSE (1981) beschreiben den klassi-schen Celluloseaufschluß wie folgt: Endo-Glucanasen bewirken Einschnitte in der linearen Cellulosekette und ermöglichen den exo-Glucanasen dort anzugreifen. Die dadurch gebil-dete Cellobiose wird durch beta-Glucosidase (Cellobiase) zu Glucose hydrolysiert. Die Hauptprodukte beim Celluloseabbau sind Lactat, Acetat, Hydrogen, Kohlendioxid, Format und Ethanol. N. patriciarum bildet im Vergleich zu N. frontalis (BAUCHOP u. MOUNTFORT 1981) und zwei Piromycesarten (PHILLIPS u. GORDON 1988; WILLIAMS et al. 1994 a) nur geringe Mengen an Format und Ethanol (ORPIN u. MUNN 1986).

CHEN et al. (1994) isolierten aus Orpinomyces sp. eine extrazelluläre beta-Glucosidase, die auf Avicel wuchs. Sie ist ein monomerisches Glycoprotein (8,55 % w/v Kohlenhydrate) mit einem Molekulargewicht von 86 kDa und einem pl von 3,95. Ihre optimale Aktivität liegt bei einem pH-Wert von 6,2 und einer Temperatur von 50 °C. Die beta-Glucosidase ist bis 40 °C thermostabil und wird durch Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺ und Ni²⁺ stimuliert, durch Ag⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, SDS und p-Chloromercuribenzoat gehemmt. Ihr pH-Optimum und ihre Thermostabilitätsei-genschaften (CHEN et al. 1994) ähneln der von N. frontalis (HÉBRAUD u. FÈVRE 1990 a, b) und Piromyces sp. (TEUNISSEN et al. 1993) und entsprechen den physiologischen pH- und Temperaturverhältnissen im Pansen. Die Ergebnisse von CHEN et al. (1994) lassen vermu-ten, daß die beta-Glucosidase in verschiedenen Formen auftreten kann, was für cellulolyti-sche Mikroorganismen nicht ungewöhnlich ist. So wurden auch verschiedene beta-Glucosi-dasen bei Clostridium thermocellum (LAMED u. BAYER 1988), Trichoderma reesei (CHEN u. WAYMAN 1992) und N. frontalis (LI u. CALZA 1991 c) entdeckt. Jede dieser beta-Gluco-sidasen wird entweder jeweils von einem Gen kodiert (XUE et al. 1992 b) oder ist die Folge der unterschiedlichen Kohlenhydratverhältnisse in den Glycoproteinen (SHEWALE 1982).

Diese Formenvielfalt wird auch bei endo-1,4-Glucanase und Cellobiohydrolase beobachtet (LI u. CALZA 1991 a; BARICHIEVICH u. CALZA 1990 a). XUE et al. (1992 a, b) legten eine cDNA Expressionsgenbank von N. patriciarum in Escherichia coli an und entdeckten zwei Gentypen, die für Cellulasen und andere Polysaccharidhydrolasen auf dem Genom anaero-ber Pansenpilze kodieren, darunter waren wenigstens vier endo-beta-1,4-Glucanasegene.

Zwei von ihnen exprimieren Genprodukte mit bedeutender Cellobiohydrolaseaktivität. N.

frontalis scheint folglich viele endo-beta-1,4-Glucanasegene zu besitzen. Es ist aber noch nicht endgültig bestätigt, ob verschiedene Gene für die Bildung der unterschiedlichen En-zyme mit ähnlicher Substratwirkung verantwortlich sind, oder ob diese Folge der Degenera-tion bzw. der proteolytischen Wirkung eines einzelnen Genprodukts sind. Es wurde nur ein Gentyp in mehreren Kopien gefunden (celA, celB u. celC), der eine Cellulase mit hoher Akti-vität gegen kristalline und amorphe Cellulose (celA) und Carboxymethylcellulose (celB, celC) kodiert. CelA, celB und celC kodieren für eine Cellobiohydrolase und zwei endo-Glucanasen.

Die Expression wird durch Cellulose induziert (XUE et al. 1992 b). Das Enzym (celB Gen) enthält eine voll funktionsfähige katalytische Domäne, die homolog zu einigen bakteriellen endo-Glucanasen ist (GILBERT et al. 1992; GILBERT u. HAZELWOOD 1993; ZHOU et al.

1994). Das Fehlen von Intronen des celB Gens, die Homologie zwischen den katalytischen Domänen der celB und einer Reihe von endo-Glucanasen anaerober Pansenbakterien kann als Beweis dafür angesehen werden, daß in der Evolution der Cellulase Gentransfere zwi-schen Prokaryonten und Eurkaryonten stattgefunden haben (ZHOU et al. 1994). Ein anderer Gentyp (celD) wurde in einer Kopie, die eine multifunktionale Polysaccharidhydrolase mit drei katalytischen Domänen kodiert, gefunden. Jede Domäne besitzt endo-Glucanase-, Cel-lobiohydrolase- und Xylaseaktivität. Das Enzym celD hat auch eine Cellulosebindungsaffini-tät (XUE et al. 1992 a). Es wird konstitutiv gebildet und nicht durch Cellulose im Kulturme-dium beeinflußt. Durch diese Eigenschaften bestätigt sich (THEODOROU et al. 1996), daß Xylanase konstitutiv gebildet wird (LOWE et al. 1987 c) und daß geringe Cellulaseaktivitäten in Kulturen auf Glucose vorkommen (BARICHIEVICH u. CALZA 1990 a).

Einige Kulturen anaerober Pansenpilze haben erstaunliche Eigenschaften: Die Kulturfiltrate von N. frontalis können 16 % der Baumwollfasern in 72 Std. lösen. Eine wesentlich höhere Aktivität zeigt sich bei Anwesenheit eines Methanogenen (s. Kap. 2.1.14.1). Es werden bis zu 98 % der Baumwollcellulose in der gleichen Zeit gelöst (WOOD et al. 1986). Die Cellula-seaktivität dieser Kokultur ist sogar noch höher als die von Trichoderma reesei (Stamm C-30), von dem vermutet wurde, er habe die höchste Cellulaseaktivität. Die molekularen Inter-aktionen sind noch nicht vollständig geklärt. Bislang ist nur bekannt, daß die zwischenartliche Wasserstoffübertragung (s. Kap. 2.1.9.3) das Pilzwachstum stimuliert und Biomasse- und Enzymproduktion steigert (MOUNTFORT et al. 1982, WOOD et al. 1986; BERNALIER et al.

1990, 1991). Obwohl schon eine Reihe unterschiedlicher glycosylierender Hydrolaseaktivi-täten in den Kulturüberständen anaerober Pansenpilze nachgewiesen wurden (PEARCE u.

BAUCHOP 1985; WILLIAMS u. ORPIN 1987 a, b; HÉBRAUD u. FÈVRE 1988), ist noch of-fen, wie viele Enzyme tatsächlich für die Aktivitäten verantwortlich sind. Eine nicht spezifi-sche glycosylierende Hydrolase in N. frontalis (HÉBRAUD u. FÈVRE 1988) weist hohe Akti-vitäten gegenüber Aryl-beta-D-Glycopyranosid und Aryl-beta-D-Galactosid, geringe Aktivität gegenüber p-Nitrophenyl-beta-D-Galactosid, aber keine Xylosidase-, Lactosidase-, Cellu-lase- und Xylanaseaktivitäten auf. LI u. CALZA (1991 b) beschrieben eine beta-Glucosidase (N. frontalis), die Aryl-Glucoside und auch Cellobiose hydrolysieren kann. WILLIAMS u.

ORPIN (1987 b) berichten über Cellobiaseaktivitäten in Kulturüberständen verschiedener Pansenpilze und auch CALZA (1991 b) untersuchte eine spezifische Cellobiase in einem Stamm von N. frontalis. Er stellte dabei fest, daß geringe Mengen dieses Enzyms zu finden waren, wenn der Pansenpilz auf Glucose wuchs, aber fünfmal höhere Konzentrationen auf Cellulose. Dieses läßt vermuten, daß die Menge induktiv gesteuert wird. Die Bedeutung von Cellobiosidase bei der Cellulolyse ist noch unklar, da Glucosidase ebenfalls vorhanden ist.

Es ist ein weiteres Enzym in der großen Vielzahl von pflanzenzellwandabbauenden Enzy-men anaerober Pansenpilzen.

2.1.13.1.2 Xylanasen

Xylan ist ein hoch verzweigtes Heteropolymer mit einem Grundgerüst aus beta-(1-4)-verbun-denen D-Xylopyranosylresten und mit Acetyl-, Arabinosyl- und Glucosyluronsäureresten. Bei einigen Xylanmolekülen (z. B. im Getreide) kommen Phenolsubstituenten vor, die kovalent an Arabinosylreste gebunden sind (THEODOROU et al. 1996). Am Xylanabbau sind endo-(1-4)-beta-D-Xylanase, beta-Xylobiase, beta-Xylosidase und Enzyme, welche die Seiten-gruppen spalten können, beteiligt. Diese Enzme kommen in mehreren anaeroben Pansenpil-zen vor (ORPIN u. LETCHER 1979; PEARCE u. BAUCHOP 1985; LOWE et al. 1987 c;

WILLIAMS u. OPRIN 1987a, b; HÉBRAUD u. FÈVRE 1988; MOUNTFORT u. ASHER 1989;

TEUNISSEN et al. 1991). Das Optimum der Xylanaseaktivität liegt bei einem pH-Wert von 5,5 bis 6,0 und bei einer Temperatur von 50 °C. Die Aktivität ist teilweise zellgebunden, hauptsächlich aber extrazellulär (LOWE et al. 1987 c; MOUNTFORT u. ASHER 1989). Xylan ist der effektivste Stimulus für die Xylanaseproduktion. Es werden allerdings auch Xylanasen gebildet, wenn die Pansenpilze auf Weizenstroh, Cellulose, Cellobiose, Glucose oder Xylose wachsen (LOWE et al. 1987 c). Offensichtlich wird ständig eine gewisse Menge an Xylanase produziert. Die Produktion wird allerdings nur durch Xylan gesteigert. Xylanase und Xylo-biase sind gemeinsam am Xylanabbau beteiligt, wenn sich Xylose, Xylobiose und Xylo-Oli-gosaccharide anhäufen (LOWE et al. 1987 c; MOUNTFORT u. ASHER 1989).

Für die Abspaltung von L-Arabinosylseitenketten von Arabinoxylan ist eine unverzweigte Arabinosidase notwendig. Obwohl L-Arabinosidaseaktivität in Kulturüberständen anaerober Pansenpilze nachgewiesen werden konnte, ist bislang weder eine Arabinosidase isoliert, noch ein Pansenpilz gefunden worden, der L-Arabinose zum Wachsen verwertet. Offenbar ist L-Arabinosidase nur bei der Abspaltung von nicht umwandelbaren Seitenketten von Pflanzenzellwänden von Bedeutung. Die niedrigen Gehalte an L-Arabinosidase (WILLIAMS u. ORPIN 1987 b) deuten daraufhin, daß diese Aktivitäten durch unspezifische Glycosidasen verursacht werden.

Das XynB Gen von N. patriciarum (XUE et al. 1992 b) kodiert für ein Enzym, das besonders gegenüber langkettigem Xylan Exoaktiviät aufweist und Xylan in Xylobiose umwandelt. Auch die von HÉBRAUD u. FÈVRE (1990 b) isolierten Enzyme weisen exo-Xylanaseaktivität auf.

Sie spalten langkettige Xylo-Oligosaccharide, die von endo-Xylanasen freigesetzt werden.

Die beta-D-Xylosidase von N. frontalis verfügt über exo-Xylanaseaktivität (HÉBRAUD u.

FÈVRE 1990 b; GARCIA-CAMPAYO u. WOOD 1993). Sie hat eine pI von 4,6 und ist ein Dimer aus zwei Polypeptiduntereinheiten mit einer Molekularmasse von 83 und 53 kDa. Un-klar ist, ob die katalytische Aktivität in einem oder in beiden Polypeptiduntereinheiten ent-halten ist. Das Temperaturoptimum liegt bei 37 °C und das pH-Optimum bei 6,4 (GARCIA-CAMPAYO u. WOOD 1993). Das Enzym hydrolysiert Xylobiose und Xylo-Oligosaccharide und wird kompetetiv durch D-Xylose gehemmt. Andere Hemmfaktoren sind Cu²⁺, Ag⁺ und Zn²⁺ und SDS, während Ca⁺ und Mg²⁺ stimulierend wirken.

GILBERT et al. (1992) isolierten aus dem aus Escherichia coli stammenden xylA aus einer cDNA Bank die rekombinante Xylanase XYLA. Die Bank stammte aus der mRNA von N.

patriciarum. Das Enzym hydrolysiert Xylan in Haferspelzen zu Xylobiose und Xylose und wirkt nicht auf cellulosehaltiges Substrat. Der Aufbau des Enzyms ist wandelbar. Es verfügt über unterschiedliche katalytische Domänen. Sequenzvergleiche zwischen diesem Enzym und einigen bakteriellen Xylanasen deckten Homologien auf, die auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung hinweisen. Ein horizontaler Gentransfer zwischen Pansenprokary-onten und niederen EukaryPansenprokary-onten könnte hierfür verantwortlich sein (GILBERT et al. 1992;

GILBERT u. HAZLEWOOD 1993).

Mittels Phagen und Plasmidvektoren wurde das aus N. frontalis stammende Gen für die endo-aktive beta-1,4-Xylanase in E. coli kloniert (TAMBLYN LEE et al. 1993). Die Xylana-seaktivität dieses rekombinaten Enzyms wird vermutlich durch den eigenen Promotor im pe-riplasmatischen Bereich des Wirts ausgedrückt. Das Synthesesystem von Escherichia coli kann folglich den Promotor von N. frontalis erkennen. Das Temperaturoptimum der

peri-plasmatischen Enzyme liegt bei 40 °C und das pH-Optimum bei 6,2. Neben der Aktivität ge-gen Xylan zeigt das Enzym Aktivität gege-gen Carboxymethylcellulose. Die katalytische Affinität zu Xylan wird nicht durch die Bildung in Escherischia coli beeinflußt, da der K_m Wert der re-kombinanten Enzyme gegenüber Xylan in Haferspelzen ähnlich hoch ist wie der von anderen Xylanasen anaerober Pansenpilze. Die Enzymaktivität wird weder durch divalente Kationen (Ca²⁺, Mg²⁺, oder Co²⁺) stimuliert noch durch EDTA gehemmt. Zn²⁺ hingegen wirkt hemmend und Cu²⁺ reduziert die Aktivität um 90 %. Die Analyse mittels Elektrophoresezymogramm zeigt drei Aktivitätsbanden bei 48, 58 und 52 kDa.

2.1.13.1.3 Esterasen

Anaerobe Pansenpilze haben durch die Bildung von Esterasen (z. B. Acetylxylanesterase, Feruloylesterase u. p-Coumaroylesterase) die besondere Fähigkeit ligninhaltige pflanzliche Biomasse zu kolonialisieren und abzubauen (BORNEMAN u. AKIN 1990; BORNEMAN et al.

1990, 1991, 1992). In Pflanzenzellwänden ist Phenolsäure über Carboxyl- oder Phenolgrup-pen an Ester und Ether gebunden. P-Coumarin- und Ferulinsäure bilden Kreuzbindungen zwischen Xylan, Hemicellulose und Lignin aus, wobei die p-Coumaroyl- und Feruloylhälften an Lignin und Hemicellulose gebunden sind (ATUSHI et al. 1984; SCALBER et al. 1985;

CHESSON 1988). Esterasen (Feruloylesterase u. Coumaroylesterase) hydrolysieren p-Coumaroyl- und Feruloylreste in diesen Lignin- und Hemicellulosekomplexen. Aryl-Esterasen hydrolysieren einige der Esterverbindungen zwischen Hemicellulose und Lignin. Ihre Aktivität ist wichtig für die Spaltung des Lignins aus Hemicellulose und Cellulose (BORNEMAN u.

AKIN 1990). Dieses erleichtert den Hemicellulasen und Cellulasen den Aufschluß der Pflan-zenzellwände. Acetyl-Xylanesterase spaltet Acetylgruppen in Arabinoxylan, die mit L-Arabi-noseseitenketten verestert sind (BORNEMAN u. AKIN 1990).

Pansenpilze produzieren mehr p-Coumaroylesterase und Feruloylesterase als Pansenbakte-rien und haben dadurch eine wichtige Funktion bei der Spaltung der Lignin-Polysaccharid-bindungen. Durch die Rhizoidausdehnung penetrieren sie die Pflanzenpartikel und machen so den Bakterien das Innere der Partikel zugänglich. P-Coumaroylesterase ist ein Dimer mit einem pI von 4,7, einem pH-Optimum von 7,2 und einem Molekulargewicht von 11 kDa (BORNEMAN et al. 1991) und besteht aus zwei Untereinheiten mit jeweils 5,8 kDa (BORNEMAN et al. 1990). Sie ist spezifisch für p-Coumaroylesterverbindungen und hat nur eine minimale Aktivität gegenüber Feruloylestern. Sie hydrolysiert u. a. p-Coumaroyltetra-saccharide in Pflanzenzellwänden. Ihre Aktivität wird durch Xylanase oder andere zellwand-abbauende Enzyme erhöht (BORNEMAN et al. 1991), da das Substrat durch die Xyla-nabspaltung leichter zugänglich wird. Während p-Coumaroylesterase bislang noch in keinem Pansenbakterium nachgewiesen wurde, kommt Feruloylesterase auch in einigen Pansen-bakterien vor. Die Enzymaktivität ist jedoch bei Pansenpilzen um ein 10- bis 20-faches höher als bei fibrolytischen Pansenbakterien (BORNEMAN u. AKIN 1990). Das Enzym ist aktiver gegenüber Methylestern als gegenüber Feruloylverbindungen und zeigt eine gewisse Aktivi-tät gegenüber p-Coumaroylverbindungen.

2.1.13.1.4 Pectinabbauende Enzyme

Pectin ist ein wichtiger Bestandteil der Pflanze, aber nur wenige anaerobe Pilze sind fähig, diesen Polymer zu verwerten (BARICHIEVICH u. CALZA 1990 b; GORDON u. PHILLIPS 1989). Im Kulturfiltrat von N. frontalis und N. patriciarum wurden z. B. geringe Mengen pec-tinabbauender Enzyme gefunden (WILLIAMS u. ORPIN 1987 a; GORDON u. PHILLIPS 1992 a, b). ORPIN (1983/84) ermittelte, daß 20 bis 40 % des Pectingehalts in Weizenstroh abgebaut werden. Pectin und seine Abbauprodukte D-Galactouronsäure und Polygalactou-ronsäure werden allerdings nicht fermentiert, wenn sie die alleinige Kohlenstoffquelle

dar-stellen (PHILLIPS u. GORDON 1988). Außerdem können anaerobe Pansenpilze offensicht-lich nicht Pectinabbauprodukte verstoffwechseln. Wie Phenolsäure kann Pectin Ester- und Etherverbindungen mit Lignin und Hemicellulose bilden und spielt damit eine wichtige Rolle bei der Bindung von Lignin an Hemicellulose (JEFFRIES 1990). Der Pectinabbau führt zum Aufbrechen der Bindungen zwischen Lignin und Hemicellulose und macht diese Kohlenhy-drate Pansenpilzen zugänglich.

Unter den pectionolytischen Enzymen von Neocallimastix sp. (GORDON u. PHILLIPS 1992 b), findet sich eine endo-Pectinlyase mit einem pH-Optimum von 8,4. Sie wird durch Ca⁺ sti-muliert und baut das Pectin in Zitronen ab. Ihre Aktivität entspricht der von endo-Pectinlyase verwandter aerober Pilze (z. B. Blastocladia ramosa; TORZILLI 1978). Pectinmethylesterase (bildet Polygalactouronat aus Pectin) und endo-Polygalactouronatlyase (REXOVA-BENKOVA u. MARKOVIC 1976) haben eine ähnliche Wirkung wie die von GORDON u.

PHILLIPS (1992 b) entdeckten Enzyme. Allerdings entsteht keine monomere Galacturon-säure, wenn Polygalactouronsäure als Substrat zur Verfügung steht (PEARCE u. BAUCHOP 1985; GORDON u. PHILLIPS 1992 b). Neocallimastixisolate aus dem Kot malaysischer Wasserbüffel können z. T. sogar auf Polygalactouronat (LAWRENCE 1993) und vorgewa-schenem Apfelpectin wachsen, wenn diese die alleinigen Kohlenhydrat- und Energiequellen darstellen (THEODOROU et al. 1996)

2.1.13.1.5 Ligninabbauende Enzyme

In Kulturfiltraten der aeroben Pilze Streptomyces cyanus, Trichoderma mesophila und Ac-tionmadura spp. werden große Mengen an Lignin aus geschroteten Gerstenzellwänden ge-löst (ZIMMERMAN u. BRODA 1989). Bisherige Untersuchungen zeigen aber, daß freige-setzte Phenole von Pilzen nicht als Kohlenstoffquelle verwertet werden können (GORDON u.

PHILLIPS 1989) und nur eine begrenzte Mineralisierung (BERNARD-VAILHÉ et al. 1995) mit Freisetzung von Ligninphenolen als Lingnin-Kohlenhydrat-Komplex stattfindet (McSWEENEY et al. 1994). Anaerobe Pansenpilze bilden vermutlich auch keine ligninab-bauenden Enzyme (GORDON u. ASHES 1984; WINDHAM u. AKIN 1984; THEODOROU et al. 1989), obwohl in einigen Untersuchungen das Gegenteil behauptet wird (ORPIN 1981 b;

AKIN et al. 1983). Die Ringspaltung im Ligninabbau erfordert die Anwesenheit von molekula-rem Sauerstoff (s. Kap. 2.1.7.1) und somit ist es unwahrscheinlich, daß anaerobe Pansen-pilze Lignin abbauen können. Dennoch enthalten die Überstände aus Pansenfermentern Ligninabbauprodukte (KIVAISI et al. 1990).

2.1.13.1.6 Stärkeabbauende Enzyme

Obwohl viele anaerobe Pansenpilze Maltose und Stärke verstoffwechseln (WILLIAMS u.

ORPIN 1987 a, b; PHILLIPS u. GORDON 1988), fanden nur wenige Untersuchungen über Produktion, Eigenschaften und Regulation der Amylase anaerober Pansenpilze statt (PEARCE u. BAUCHOP 1985; PHILLIPS u. GORDON 1988; MOUNTFORT u. ASHER 1988). McALLISTER et al. (1993) untersuchten z. B. den Stärkeabbau von O. joyonii, N.

patriciarum sowie P. communis. Sie stellten fest, daß diese Maisstärke schneller als Gerste- und Weizenstärke abbauten. In welchem Ausmaß diese Aktivität im Pansen auftritt, wurde jedoch nicht geklärt. MOUNTFORT u. ASHER (1988) studierten den Stärkeabbau von N.

frontalis. So führt Amyloglucosidase zu einem unvollständigen Stärkeabbau, bei dem sich Glucose anhäuft, während Oligosaccharide fehlen. Alpha-Amylase bildet Maltose, Malto-biose, Maltotetrose und längerkettige Oligosaccharide. Sie ist hauptsächlich extrazellulär aktiv, hat ein Temperaturoptimum von 55 °C und ein pH-Optimum von 5,5. Ihre Hauptsub-strate sind Stärke und Maltose. Sie zeigt auch geringe Aktivität gegenüber Cellulose, Xylan, löslichen Zuckern, Cellobiose, Glucose und Xylose (MOUNTFORT u. ASHER 1988).