Braunschweig
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Untersuchungen zur intrauterinen Besamung mit reduzierter Spermienzahl
bei Jungsauen und Altsauen
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Claudia Krüger aus São Paulo - Brasilien
Hannover 2000
1. Gutachter: Priv. - Doz. Dr. D. Rath 2. Gutachter: Priv. - Doz. Dr. D. Waberski
Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2000
Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit dem Zentralverband der Deutschen Schweineproduktion e.V. (ZDS), Bonn, durchgeführt
Publilius Syrus
ä. D. äußerer Durchmesser Aqua bidest. Aqua bidestillata
BSA Bovine Serum Albumin, Bovines Serumalbumin BSST Beltsville sperm sexing Technology
cAMP cyclic adenosin monophosphate C.l. Corpora lutea
CO2 Kohlendioxid
FCS Fetal Calf Serum, Fetales Kälberserum FSH Follikelstimulierendes Hormon
GnRH Gonadotropin releasing hormone GV Germinal vesicle
h hour (Stunde)
hCG human Chorionic Gonadotropin ICM Inner Cell Mass, Innere Zellmasse i.m. intramuskulär
IE Internationale Einheiten k.A. keine Angaben
K.B. Künstliche Besamung LH Luteinisierendes Hormon x Mittelwert
mM Millimol
mOsm Milliosmol NaCl Natriumchlorid NBCS Newborn calf serum
NCSU North Carolina-State-University
Ø Durchmesser
p Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS Phosphate Buffered Salt Solution, phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH pondus Hydrogenii = Gewicht des Wasserstoffs pro Liter Lösung PMSG Pregnant Mare`s Serum Gonadotropin
PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten
± SD Standardabweichung
TE Trophektoderm
UTV Uterotubale Verbindung
v.s. versus
1. Einleitung 1
2. Schrifttum 3
2.1. Anatomie der Geschlechtsorgane des weiblichen Schweines 3
2.2. Sexualzyklus des weiblichen Schweines 5
2.2.1. Östrusdauer 6
2.2.2. Ovulation 7
2.3. Besamungszeitpunkt 8
2.3.1. Besamungsmanagement und Besamungsfrequenz 10
2.4. Zyklusinduktion bei präpuberalen Jungsauen 12
2.5. Spermientransport im weiblichen Genitale 13
2.5.1. Allgemein 13
2.5.2. Selektion befruchtungskompetenter Spermien während der Passage durch den
weiblichen Genitaltrakt 15
2.5.2.1. Selektive Funktionen der Zervix bei Spezies mit intravaginaler
Ejakulatdeponierung 16
2.5.2.2. Spermienselektion in der uterotubalen Verbindung und dem kaudalen
Isthmusabschnitt 17
2.5.3. Spermieneliminierung aus dem weiblichen Genitaltrakt 21 2.5.4. Terminierung der Spermienfreisetzung aus dem Spermienreservoir 22
2.6. Die Kapazitation 24
2.7. Einfluß des Seminalplasmas 27
2.8. Spermiendosierung und Besamungsvolumen 28
2.8.1. Anreicherung der Spermien im Eileiter bei Besamung mit reduzierter
Spermienmenge 32
2.8.1.1. Tief-intrauterine Besamung 32
2.8.1.2. Reduzierung des Ejakulatrückflusses aus der Vagina 33
2.8.3. Zusätze zu Besamungsportionen bzw. exogene Applikation 35
2.9. Ermittlung von Fertilisationsraten 36
2.9.1. Embryonenbeurteilung 36
3. Material und Methoden 38
3.1. Versuchsabschnitt I: Chirurgische Insemination synchronisierter,
präpuberaler Jungsauen 39
3.1.1. Tiere und Haltungsbedingungen 39
3.1.2. Hormonelle Zyklusinduktion präpuberaler Jungsauen 39
3.1.3. Samengewinnung und Ejakulataufbereitung 39
3.1.4. Chirurgischer Eingriff und Insemination 40
3.1.5. Trächtigkeitsdiagnose 42
3.2. Versuchsabschnitt II: Chirurgische Insemination bei spontan ovulierenden
Sauen nach dem Absetzen 43
3.2.1. Tiere und Haltungsbedingungen 43
3.2.2. Samengewinnung und Aufbereitung 43
3.2.3. Brunstkontrolle 43
3.2.4. Chirurgischer Eingriff und Insemination 44
3.2.5. Kontrollbesamungen 44
3.2.6. Trächtigkeitsuntersuchung 44
3.3. Versuchsabschnitt III: Chirurgische Insemination synchronisierter, präpuberaler Jungsauen und anschließende Beurteilung des Befruchtungserfolges anhand der
Entwicklungskompetenz früher Embryonalstadien 45
3.3.1. Tiere und Haltungsbedingungen 45
3.3.2. Hormonelle Zyklusinduktion präpuberaler Jungsauen 45
3.3.3. Samengewinnung und Ejakulataufbereitung 45
3.3.4. Chirurgischer Eingriff und Insemination 45
3.3.5. Künstliche Besamung 46
3.3.6.1. Embryonengewinnung 46 3.3.6.2. Morphologische Beurteilung der gewonnen Embryonen 47 3.3.6.3. Zytogenetische Färbung der ungeteilten Stadien 48 3.3.7. Beurteilung der weiteren Entwicklungskompetenz der Embryonen unter
In-vitro-Bedingungen nach 5-tägiger Kultur in NCSU23 48
3.3.7.1. Bestimmung der Zellkernzahl 49
3.4. Statistische Auswertung 50
4. Ergebnisse 51
4.1. Versuchsabschnitt I: Chirurgische Insemination synchronisierter,
präpuberaler Jungsauen 51
4.1.1. Versuchstiere 51
4.1.2. Spermabeurteilung 51
4.1.3. Ovarbefunde 51
4.1.4. Trächtigkeits- und Abferkelraten 52
4.1.5. Wurfergebnisse 54
4.2. Versuchsabschnitt II: Chirurgische Insemination bei spontan ovulierenden
Sauen nach dem Absetzen 56
4.2.1. Versuchstiere 56
4.2.2. Spermabeurteilung 57
4.2.3. Ovarbefunde 57
4.2.4. Trächtigkeits- und Abferkelraten 58
4.2.5. Wurfergebnisse 60
4.3. Versuchsabschnitt III: Chirurgische Insemination synchronisierter, präpuberaler
Jungsauen und Gewinnung früher Embryonalstadien 61
4.3.1. Versuchstiere 61
4.3.2. Spermabeurteilung 61
4.3.3. Ovulationsergebnisse und Embryonengewinnung 62
4.3.3.2. Bewertung der ungeteilten Stadien 48 Stunden nach Besamung durch
Lacmoid-Färbung 64
4.3.4. Überprüfung des Entwicklungsverhaltens der Embryonen anhand
morphologischer Kriterien der Entwicklungsstadien und Bestimmung der
Zellkernzahlen nach 5-tägiger In-Vitro-Kultur in NCSU23 67
4.3.4.1. Zellkernzahlen 68
5. Diskussion 69
6. Zusammenfassende Betrachtung und Schlußfolgerung 78
7. Zusammenfassung 79
8. Summary 82
9. Literaturverzeichnis 85
10. Anhang 113
10.1. Zusammensetzung der verwendeten Medien 113
10.1.1. Hancock-Lösung 113
10.1.2. Lacmoid-Färbelösung 113
10.1.3. Hoechst-33342-Färbelösung 113
11. Verzeichnis der Abbildungen 114
12. Verzeichnis der Tabellen 115
1. Einleitung
Schlüsseltechnik für die Durchführung moderner Zuchtprogramme ist die instrumentelle Samenübertragung. Während in der Rinderzucht schon seit mehreren Jahrzehnten zunächst zur Unterbindung venerischer Erkrankungen und dann im Rahmen von intensiven Zuchtprogrammen auf die Besamung zurückgegriffen wurde, ist ein Einsatz in der Schweinezucht erst seit einigen Jahren durch starke Zunahmen der Erstbesamungsraten geprägt. Entsprechend ist der Bedarf an Spermaproben gestiegen und es stellt sich die Frage, ob durch Änderung der Ejakulataufbereitung und u. U. durch Modifizierung der Besamungstechnik eine ökonomischere Nutzung der Ejakulate realisiert werden kann.
Gleichzeitig werden derzeit neue biotechnologische Verfahren entwickelt, die die einzelnen Samenzellen oder die Populationen eines Ejakulates verändern. Diese Samenzellen sind entsprechend hochwertig und müssen maximal genutzt werden.
Als Beispiel hierzu ist die Erzeugung von Nachkommen mit vorbestimmten Geschlecht durch Einsatz flowzytometrisch gesexter Spermien zu nennen (JOHNSON 1991; JOHNSON 1997;
JOHNSON et al. 1999). Zudem ist bei Einsatz von Tiefgefriersperma die Ejakulatausbeute begrenzt und die Insemination mit gefrierkonservierten Eberspermien durch verringerte Befruchtungschancen gekennzeichnet (JOHNSON et al. 1981, 1982; WEITZE et al. 1989).
Beim Schwein werden gegenwärtig 2-5x109 Spermien pro Besamungsdosis verwendet, was im Vergleich zu anderen Tierarten relativ hoch ist und die Frage nach einer verbesserten Ejakulatausnutzung stellt.
Bei Rind, Pferd und Schaf konnten durch tief-intrauterine Besamungen auch mit niedrigen Spermiendosierungen bzw. gefrierkonservierten Spermien hohe Fertilisationsraten erzielt werden (SEIDEL et al. 1997; 1998; BUCHANAN et al. 1999; HAM et al. 2000). Beim Schwein liegen für diesen Versuchsansatz nur wenige Studien vor, die sich hauptsächlich mit der Deponierung von Tiefgefriersperma bzw. gesextem Sperma in der Nähe der uterotubalen Verbindung bzw. direkt in den Eileiter beschäftigen (POLGE et al. 1970; JOHNSON 1991).
Aufgrund der anatomischen Gegebenheiten der uterotubalen Verbindung ist eine unchirurgische Besamung in den Eileiter nicht realisierbar.
Im Rahmen der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, inwieweit die Spermienanzahl sowie das Volumen pro Besamungsdosis beim Schwein bei einer tief-intrauterinen Spermiendeponierung reduziert werden kann, ohne die Trächtigkeitsraten und Wurfgrößen wesentlich zu beeinträchtigen.
Die Aussagen dieser Untersuchungen sind als wesentliche Voraussetzung für die technische Entwicklung eines intrauterinen Besamungsverfahrens für Sauen zu sehen. Hierzu wurden bereits erste Ansätze realisiert (MARTINEZ et al. 2000).
2. Schrifttum
2.1. Anatomie der Geschlechtsorgane des weiblichen Schweines
Für die tief-intrauterine Besamung, die in der vorliegenden Arbeit chirurgisch erfolgte, sind wesentliche Kenntnisse der Anatomie des weiblichen Genitaltraktes erforderlich.
Die Ovarien des Schweines werden von der Bursa ovarica, die sich aus Mesosalpinx, Mesovar und Lig. ovarii zusammensetzt, umhüllt. Der Eileiter ist insgesamt etwa 19 bis 22 cm lang, stark geschlängelt und gliedert sich in drei Abschnitte. Dem Ovar zugewandt ist das trichterförmig ausgebildete Infundibulum tubae, das die während der Ovulation freigesetzten Oozyten auffängt. Das Infundibulum tubae geht in die Ampulle tubae über. Mit dem Isthmus tubae schließt sich ein längerer enger Abschnitt an, der in die Uterushornspitze mündet (NICKEL, SCHUMMER, SEIFERLE 1982).
Der Begriff „uterotubale Verbindung“ (UTV) bezeichnet den Bereich, in dem der Eileiter in die Uteruswand übergeht. Der Bereich umfaßt jeweils einen Zentimeter vom kaudalen Ende des Isthmus und vom kranialen Ende der Uterushornspitze (RIGBY u. GLOVER 1965;
RIGBY 1966). Auffällig an der UTV des Schweines sind die longitudinalen Schleimhautfalten, die als fingerförmige Fortsätze in das Uteruslumen einstrahlen. Durch diese Fortsätze und zahlreiche Sekundär- und Tertiärfalten werden taschenähnliche Divertikel gebildet (RIGBY u. GLOVER 1965; HAFEZ u. BLACK 1969).
Der uterotubalen Verbindung schließen sich die Uterushörner an. Beim Schwein gliedert sich der Uterus bicornis in einen relativ kurzen, buchtig erweiterten Uteruskörper (ca. 5 cm) mit sehr langen Hörnern. Die Uterushörner können bei pluriparen Tieren eine Länge bis zu 1,4 m erreichen. Die von den muskulösen Ligamenta lata uteri gehaltenen Hörner beschreiben dünndarmähnliche Windungen und liegen der seitlichen Bauchwand an, können aber auch die ventrale Bauchwand erreichen.
Auffallend ist die Zervix uteri gestaltet. Sie stellt einen knotigen, derben Strang dar, der eine Länge von ca. 15 bis 25 cm aufweist und den kranialen Schambeinkamm überragt. Es fehlt eine Portio vaginalis uteri wie auch eine deutliche Begrenzung des Ostium uteri internum. Der Zervixkanal wird nahezu vollkommen durch mehrere gegenüberstehende, alternierend angeordnete, polsterartige Erhebungen des Gewebes unter Mitwirkung einer kräftigen Ringmuskulatur verschlossen (NICKEL, SCHUMMER, SEIFERLE 1982). Diese Pulvini
cervicalis sind im mittleren Bereich der Zervix am höchsten und machen eine Passage mit Instrumenten im Metöstrus fast unmöglich.
2.2. Sexualzyklus des weiblichen Schweines
Der Zyklus dauert beim Schwein durchschnittlich 21 Tage und kann zwischen 18 - 24 Tagen (GUTHRIE et al. 1972; CLAUS u. MÜNSTER 1987) variieren. Er läßt sich in folgende 4 Phasen einteilen: 1. Lutealphase (Tag 3-11), 2. Lutealregressionsphase (Tag 12-17), 3.
Follikelphase (Tag 18-22/23) und 4. Ovulationsphase (Tag 22, 23 bzw. 1, 2) (ELLENDORF u. SMIDT 1984). Während der Lutealphase wird die Freisetzung von FSH und LH durch den negativen Feedback-Mechanismus des Progesterons auf den Hypothalamus und die Hypophyse gehemmt (REEVES 1987). Bei nicht einsetzender Trächtigkeit wird durch das fehlende embryonale Östrogensignal zur maternen Erkennung der Trächtigkeit (HUNTER 1977), PGF2α an Tag 12/13 vom Uterus freigesetzt, wodurch die Luteolyse ausgelöst wird (ELLENDORF u. SMIDT 1984; BUHR et al. 1986). WUTTKE et al. (1995) beschrieben den synergistischen Effekt von PGF2α und des Tumornekrosefaktors (TNF) während der Luteolyse. TNF wird von den Makrophagen gebildet, die während des luyteolytischen Vorgangs in die Corpora lutea einwandern. Ab Tag 13/14 fällt der Progesteronwert zunächst langsam ab, um dann schnell am Tag 15 - 17 den niedrigsten Wert zu erreichen. Hierdurch wird die Blockade auf die GnRH-Sekretion durch Progesteron aufgehoben. Es kommt zu einer gesteigerten Freisetzung von FSH und LH damit zum Follikelwachstum. FSH induziert die Granulosazellproliferation und damit u.a. einen Anstieg des Enzyms Aromatase. Dieses ist für die Transformation von Androgenen zu Östrogenen verantwortlich. Die Androgensynthese der Thekazellen wird durch LH induziert (FOXCROFT u. HUNTER 1985;
LIPNER 1988).
Während der Lutealphase befinden sich etwa 40 bis 50 Follikel mit einem Durchmesser von etwa 3 bis 6 mm an der Oberfläche der Ovarien. Zu diesem Zeitpunkt liegt ein physiologisches Gleichgewicht zwischen Proliferation und apoptotischem Zelltod (GUTHRIE et al. 1995) vor. RATKY et al. (1995) berichteten, daß die Rekrutierung der Follikel aus diesem Pool, die zur Ovulation kommen, am Tag 13 beginnt. Follikel, die zu diesem Zeitpunkt einen Durchmesser von 4 mm aufweisen, entwickeln sich weiter, während Follikel mit kleinerem Durchmesser atresieren. Zwischen Tag 14 und 19 wachsen die Follikel ca. 1 mm pro Tag. Durch den Östrogenanstieg in den wachsenden Follikeln werden die LH - Pulse und die FSH - Sekretion gehemmt (REEVES 1987). Am Tag 20 steigt Östrogen deutlich an und löst die Rauschesymptome aus. Verantwortlich für die Ovulation ist der 36 bis 40 Stunden zuvor auftretende LH-Peak, welcher über den positiven Feedback-Mechanismus ca.
8 bis 15 h nach maximaler Östrogenkonzentration einsetzt (VAN DE WIEL et al. 1981).
2.2.1. Östrusdauer
Beim Schwein wird der Rauschebeginn durch den Zeitpunkt definiert, zu dem der Aufsprung des Ebers von der Sau geduldet wird (WILLEMSE u. BOENDER 1967). Besonders olfaktorische sowie taktile Stimuli durch den Eber bewirken die Auslösung des sogenannten Duldungsreflexes, der durch ein typisches Verhalten der Sau, wie Immobilität, aufgekrümmter Rücken und Zittern der Ohren zum Ausdruck kommt (SIGNORET 1970). Die Auslösung des Duldungsreflexes kann auch durch Aufsitzen einer Person erfolgen und ist das hervorstechenste Rauschesymptom, das im ersten Drittel und gegen Ende der Rausche jedoch nur durch den Eber ausgelöst wird (ANDERSON u. EINARSSON 1980).
Mehrere Faktoren, wie die Stärke der Stimulation durch den Eber, Alter der Tiere, Genotyp, Streß und Länge des Intervalls zwischen Absetzen und Östrusbeginn beeinflussen die Rauschedauer (SOEDE u. KEMP 1997).
ANDERSON (1993) stellte fest, daß der erste erkennbare Östrus bei Jungsauen mit einer Dauer von 47 Stunden kürzer ausfiel, als bei Altsauen, die eine Rauschedauer von durchschnittlich 56 Stunden aufwiesen. WEITZE et al. (1994) konnten eine Beziehung der Rauschedauer zur Intervallänge zwischen Absetztermin und Östrusbeginn aufzeigen. Sauen, die früh nach dem Absetzen (innerhalb von 4 Tagen) in Rausche kamen, wiesen eine längere Rauschedauer (> 72 h) auf, als Sauen, die mehr als 6 Tage nach dem Absetzen erste Rauschesymptome zeigten. Auch ROJKITTIKHUN et al. (1992) sowie KEMP und SOEDE (1996) konnten in ihren Studien diesen Zusammenhang nachweisen.
STEVERINK et al. (1999) führten eine Studie auf 55 Farmen mit insgesamt 15186 Jungsauen und Sauen durch. Die Rauschedauer lag im Mittel bei 48,4 ± 1 Stunden und variierte zwischen 31 und 64 Stunden. Die Rauschedauer blieb innerhalb der jeweiligen Farm über einen Versuchszeitraum von 6 Monaten konstant und wies eine Wiederholbarkeit von 86 % auf. Jungsauen hatten mit 40,8 ± 1,1 Stunden eine kürzere Rauschedauer als Altsauen (48,5 ± 1,0 Stunden). Die Östrusdauer verkürzte sich von 56,0 ± 1,2 Stunden gegenüber 45,8 ± 1,2 Stunden, wenn das Intervall zwischen Absetzen und Rauschbeginn von 4 auf 6 Tage anstieg.
2.2.2. Ovulation
Die Ovulation erfolgt beim Schwein spontan ca. zwei Tage nach Östrusbeginn (DZUIK 1970). Erst durch Einsatz der Ultraschalldiagnostik wurde der Zeitpunkt exakter definiert und höhere individuelle Schwankungen gefunden. Die Ergebnisse ergaben insgesamt, daß die Ovulationen bei den meisten Sauen am Anfang des letzten Drittels der Rausche erfolgen (SOEDE et al. 1994; WEITZE et al. 1994; MBURU et al. 1995). Daher ist die Östrusdauer eines Tieres und nicht der Östrusbeginn als Indikator für den geeigneten Besamungszeitpunkt anzusehen. Die Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die von verschiedenen Autoren ermittelten durchschnittlichen Ovulationszeitpunkte in Stunden nach Östrusbeginn.
Die Ovulationsdauer wird mit 1 bis 6 Stunden angegeben (DU MESNIL DU BUISSON u.
SIGNORET 1970; SOEDE u. KEMP 1993). SOEDE et al. (1992) gaben einen Zeitraum von durchschnittlich 1 bis 3 Stunden an, der sich unter Streßbedingungen auf 5 Stunden verlängern konnte (SOEDE et al. 1997). Intensive Stimulation durch den Eber während des Proöstrus und der ersten Stunden des Östrus verkürzte die Ovulationsdauer (SIGNORET et al.
1972; HUNTER 1977).
Beim Schwein schwankt die Anzahl der zur Ovulation kommenden Oozyten zwischen 10 und 25 und ist von Alter, Wurfzahl, Rasse und Ernährung abhängig (GORDON 1997).
Unstimulierte Jungsauen wiesen im Mittel zwischen 12,7 (BOSTEDT, 1980) und 14,1 (BLICHFELD u. ALMID 1982) Ovulationen auf. WARNICK et al. (1951) fanden bei Jungsauen einen Anstieg von bis zu drei Ovulationen während des zweiten Zyklus und einen weiteren, moderaten Anstieg während des dritten Zyklus. Altsauen zeigten höhere Ovulationsraten von durchschnittlich 21,4 (HUGHES u. VARLEY 1980) und 16,8 (BOSTEDT 1980).
Tabelle 1: Ermittlung des Ovulationszeitpunktes (Stunden nach Östrusbeginn) bei Jung- und Altsauen
Zeitpunkt der Ovulation
xx ±± SD Zeitspanne (h) Behandlung Autor
Jungsauen
38 ± 10 23 – 48 NaCl-Infusion WEITZE et al. 1990
45 ± 5 39 – 48 Keine WEITZE et al. 1990
Altsauen
39 ± 12 20 – 64 Keine DALIN et al. 1995
ca. 43 17 – 70 KB einmalig NISSEN et al. 1997
37 ± 2 35 – 43 KB einmalig MBURU et al. 1995
48 ± 6 39 – 56 KB jeden Tag SOEDE et al. 1992
35 ± 8 10 – 58 KB einmalig SOEDE et al. 1995a
41 ± 8 22 – 58 KB ein- oder zweimal SOEDE et al. 1995
45 ± 13 15 – 85 KB WEITZE et al. 1994
KB = Künstliche Besamung
Tabelle nach SOEDE und KEMP (1997)
2.3. Besamungszeitpunkt
Um eine maximale Reproduktionsleistung beim Schwein zu erzielen, ist eine exakte Koordination von Insemination und Ovulationszeitpunkt (FLOWERS u. ESBENSHADE 1993) notwendig. Dieses Ziel ist erreicht, wenn durch das angewendete Besamungsregime konstant gewährleistet wird, daß vor der Ovulation eine ausreichende Menge an befruchtungsfähigen Spermatozoen im Eileiter vorhanden sind (DZIUK u. POLGE 1965). Die im Vergleich zum Rind lange Östrusdauer und die variablen Ovulationszeiten erschweren es allerdings, beim Schwein den optimalen Besamungszeitpunkt zu ermitteln. Zusätzlich ist die Östrusdauer sehr variabel und gibt nur retrospektiv Anhaltspunkte hinsichtlich des Ovulationszeitpunktes (SOEDE u. KEMP 1997).
Studien aus den sechziger Jahren ergaben, daß eine zu frühe oder zu späte Insemination während des Östrus zu einem Abfall der Fertilisationsraten (HANCOCK u. HOVELL 1961),
Abferkelraten sowie Wurfgrößen führten (WILLEMSE u. BOENDER 1966). Angaben über das optimale Besamungs-Ovulationsintervall für eine maximale Reproduktionsleistung variieren zwischen 6 und 18 Stunden (DZUIK 1970) bzw. 13 und 28 Stunden (HELMOND et al. 1986). DZUIK (1970) schlußfolgerte aus seinen Versuchen, daß der optimale Besamungszeitpunkt mit 12 Stunden vor der Ovulation anzusetzen ist, wobei gleichzeitig ein Intervall von 6 bis 18 Stunden nur einen geringen Effekt auf die Reproduktionsleistung ausüben dürfte. HUNTER (1967) studierte die Auswirkungen postovulatorischer Besamung auf die Fertilisationsrate und kam zu dem Ergebnis, daß die Oozyten noch bis zu 8 Stunden nach der Ovulation optimal befruchtet werden können und zumindest bis zum 4-Zell oder 8- Zellstadium eine normale Entwicklung durchlaufen. Allerdings sollten die Ergebnisse dieser frühen Arbeiten vorsichtig interpretiert werden, da der Ovulationszeitpunkt trotz Induktion mit hCG zwischen 35 Stunden und 48 Stunden nach hCG-Gabe variieren kann (POPE et al.
1988; BRÜSSOW et al. 1990; SOEDE u. KEMP 1993).
In neueren Studien konnte mit Hilfe der Ultraschalltechnik der Ovulationszeitpunkt exakt bestimmt und somit weite Inseminations-Ovulationsintervalle ausgetestet werden (WABERSKI et al. 1994; SOEDE et al. 1995a; NISSEN et al. 1997). Dadurch wurde es möglich, den Einfluß des Besamungszeitpunktes auf die Reproduktionsleistung zu bewerten.
Die Studien führten zu dem Ergebnis, daß Besamungen, die mit 3x109 Spermien pro Tier zwischen 0 und 24 Stunden vor der Ovulation durchgeführt wurden, zu optimalen Fertilisationsraten führten. NISSEN et al. (1997) erweiterten dieses Intervall auf 28 Stunden vor bis 4 Stunden nach der Ovulation bei Verwendung von 2x109 Spermien pro Besamung.
Wurde die Besamung mehr als 24 Stunden vor der Ovulation vorgenommen, war die Anzahl der befruchtungskompetenten Spermien am Ort der Befruchtung zu niedrig, um maximale Fertilisationsraten zu gewährleisten, was durch eine verminderte Anzahl an akzessorischen Spermien in der Zona pellucida nachzuweisen war (SOEDE et al. 1995a). Zudem stieg der prozentuelle Anteil an Sauen, die zu 100 % unbefruchtete oder nur zu einem geringen Prozentsatz befruchtete Oozyten aufwiesen, an. Größere Inseminations - Ovulationsabstände führten zu einer leicht verzögerten Embryonalentwicklung, die aber statistisch nicht abzusichern war. Auch nahm eine zeitliche Variabilität der Embryonenentwicklung zu (SOEDE et al. 1995 a,b; STEVERINK et al. 1997). Obwohl an Epithelzellen gebundene Spermatozoen vom Schwein bis zu 44 Stunden im unteren Isthmusbereich des Eileiters überleben können (SUAREZ et al. 1991), ist bisher nicht bekannt, warum die Fertilisationsraten absinken, wenn die Besamung früher als 24 Stunden vor der Ovulation vorgenommen wird (KEMP u. SOEDE 1997).
Bei postovulatorischer Besamung bis zu 16 Stunden nach der Ovulation sind hingegen ausreichend große Mengen an befruchtungskompetenten Spermatozoen am Ort der Befruchtung vorhanden. Selbst bei Sauen mit schlechten Fertilisationsergebnissen von 53 % ist die Anzahl akzessorischer Spermien hoch (SOEDE et al. 1995a). Akzessorische Spermien repräsentieren eine Population von Spermatozoen, die in der Lage sind, die verschiedenen Barrieren des weiblichen Genitale zu überwinden und zum Zeitpunkt der Fertilisation in die äußere Schicht der Zona pellucida einzudringen (WEITZE et al. 1988; SAACKE et al. 1994).
Das Vorhandensein dieser akzessorischen Spermien wird generell als ein Parameter für die Befruchtungschance angesehen, wenn auch beim Schwein zeitliche Komponenten die Zahl akzessorischer Spermien mitbestimmen (HANCOCK 1961; RATH et al. 1989). Bei postovulatorischer Besamung ist daher nicht der Mangel an befruchtungskompetenten Spermien Ursache für reduzierte Fertilisationsraten, sondern der Alterungsprozeß der Oozyten, der 8 bis 12 Stunden nach der Ovulation einsetzt (HUNTER 1967, 1994; HUNTER u. DZIUK 1968). Die bereits zitierten Arbeiten von WABERSKI et al. (1994), SOEDE et al.
(1995a) und NISSEN et al. (1997) weisen darauf hin, daß der Alterungsprozeß bereits innerhalb weniger Stunden nach der Ovulation beginnt. Der postovulatorische Alterungsprozeß der Oozyten führt u.a. zu einer verzögerten bzw. reduzierten Exozytose der kortikalen Granula (HUNTER 1991). Somit ist eine effektive Ausbildung des Polyspermieblocks nicht mehr gewährleistet, was zu einer polyspermen Befruchtung führen kann. Die hieraus resultierende genetische Imbalance führt zu einem frühen Absterben der Embryonen (YOSHIDA et al. 1993). Gleichzeitg ist im peri- und postovulatorischem Zeitraum der Transport von Spermien in Richtung Eileiter (Isthmus-Ampulla-Übergang) beschleunigt und quantitativ erhöht, so daß die Gefahr besteht, daß übermäßig viele befruchtungskompetente Spermatozoen die Oozyten erreichen. Diese Situation kann ebenfalls für eine erhöhte Polyspermierate verantwortlich sein (HUNTER 1991).
2.3.1. Besamungsmanagement und Besamungsfrequenz
In der Schweineproduktion wird intensiv versucht, durch Maßnahmen im Herdenmanagement eine gewisse genetische Konstanz in den Sauenherden zu erreichen. Dennoch besteht eine erhebliche Variabilität in der Rauschedauer und somit auch in der Vorhersage des Ovulationszeitpunktes.
Eine Möglichkeit diesen Schwankungen entgegen zu wirken, besteht in einer Erhöhung der Besamungsfrequenz. Dadurch soll gewährleistet werden, daß zumindest eine der durchgeführten Inseminationen zu einem optimalen Intervall zur Ovulation erfolgt. Aus
mehreren Studien ist bekannt, inwieweit eine Erhöhung der Besamungsfrequenz die Trächtigkeitsraten als auch die Wurfgrößen beeinflußt.
Zweifach-Belegungen ergaben bessere Ergebnisse hinsichtlich Konzeptionsraten und Wurfgrößen als Einfach-Belegungen (FLOWERS u. ALHUSEN, 1992). REED (1982) beobachtete in einer Feldstudie an mehreren Sauenherden, daß die Reproduktionsleistung anstieg, wenn Sauen dreimal gepaart wurden. Auch TILTON und COLE (1982) berichteten über einen Anstieg der Wurfgröße, wenn Sauen dreimal anstatt zweimal belegt wurden. Dabei machte es keinen Unterschied, ob die Sauen am ersten Tag oder zweiten Tag der Rausche zweimal belegt wurden.
FLOWERS und ESBENSHADE (1993) stellten heraus, daß der Einfluß der Besamungsfrequenz von der Rauschedauer abhängig ist. Bei Jungsauen, die nur einen Tag Rausche zeigten, hatte eine zweimalige Belegung keinen positiven Einfluß im Vergleich zu einer einmaligen Belegung. Mit einer verkürzten Rauschedauer sinkt auch die Variabilität des Ovulationszeitpunktes. Daraus resultiert, daß bei einer einzigen Belegung, unabhängig vom Besamungszeitpunkt, eine maximale Reproduktionsleistung erzielt werden kann. Erst bei einer Rauschedauer von zwei Tagen stiegen Abferkelrate und Wurfgröße mit einer zweiten Belegung an. Bei einer Erhöhung der Frequenz von zwei auf vier Belegungen blieb die Abferkelrate konstant, während die Anzahl lebend geborener Ferkel positiv beeinflußt wurde (FLOWERS u. ESBENSHADE 1993).
In Studien von STEVERINK et al. (1999) resultierte bei Sauen eine zweifache Inseminierung in einer um 4,3 % höheren Abferkelrate. Bei Jungsauen stieg die Abferkelrate sogar um 7 % bei einer zweiten Besamung an.
XUE et al. (1998b) hingegen fanden, daß eine dreimalige Belegung im Vergleich zur zweimaliger oder einmaliger Belegung bei Sauen keine Erhöhung hinsichtlich der Abferkelrate sowie Wurfgröße bewirkt, was frühere Ergebnisse bestätigte (DEWEY et al.
1995; ROZEBOOM et al. 1997; XUE et al. 1998a). Zudem fanden XUE et al. (1998b) bei Sauen nur geringe Unterschiede in der Abferkelrate und Wurfgröße bei einmaliger Belegung im Vergleich zu zweimaliger Belegung, was mit Ergebnissen aus anderen Studien übereinstimmt (GOONERATNE et al. 1989; XUE et al. 1998a). Bei Jungsauen hingegen wurde durch eine zweimalige Belegung eine höhere Wurfgröße als mit einer einmaligen Belegung erzielt (XUE et al. 1998b). Die Autoren kamen zu dem Schluß, daß eine zweite Belegung bei Jungsauen notwendig sein kann, um die Wurfgröße zu optimieren. Es ist aber nicht notwendig, Sauen und Jungsauen dreimal während eines Östrus zu belegen.
2.4. Zyklusinduktion bei präpuberalen Jungsauen
Bei präpuberalen Jungsauen kann der Östrus zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch eine Behandlung mit exogenen Gonadotropinen (PMSG, „Pregnant Mare Serum Gonadotropin“
und hCG, „human Chorionic Gonadotropin“) bzw. GnRH („Gonadotropin Releasing Hormone“), das endogene Gonadotropine freisetzt, induziert werden (SCHILLING et al.
1971, KRUFF 1982; BRÜSSOW u. RATKY 1992).
Zur genauen Terminierung des Ovulationszeitpunktes wird bei Jungsauen hCG 72 bis 80 Stunden bzw. bei Altsauen 56 bis 72 Stunden nach einer PMSG - Gabe appliziert (HOLTZ 1996). Angaben über den Zeitpunkt der Ovulation nach hCG-Behandlung variierten im Mittel zwischen 39 bis 44 Stunden (SOEDE u. KEMP 1993; POPE et al. 1988; BRITT 1987;
DZIUK u. BAKER 1962; SIGNORET et al. 1972), wobei einzelne Tiere auch erst nach mehr als 49 Stunden nach hCG-Gabe ovulierten (SOEDE u. KEMP 1993). Bei Jungsauen induzierten BRÜSSOW und RATKY (1992) die Ovulation mit GnRH nach Östrussynchronisation mit Regumate® und PMSG. Das mittlere Intervall zwischen GnRH- Gabe und dem Abschluß der Ovulation betrug rund 41 Stunden (BRÜSSOW et al. 1990).
Im Alter von 3 bis 4 Monaten scheint bereits die volle Reaktionsfähigkeit des Schweineovars auf exogene Gonadotropine vorhanden zu sein. Ovulationen konnten schon zu diesem Zeitpunkt durch Applikation von ca. 1000 I.E. PMSG, kombiniert mit 500 bis 1000 I.E. hCG ausgelöst werden (DZIUK u. GEHLBACH 1966). Allerdings wurde bei dieser frühen Stimulation der Ovartätigkeit keine fortlaufende zyklische Aktivität eingeleitet. SCHILLING und CERNE (1973) fanden, daß das optimale Alter für die Induktion der vollständigen Geschlechtsreife, d.h. der Beginn zyklischer Ovaraktivität, durch exogene Gonadotropine zwischen 5 und 6 Monaten liegt. Allerdings wurde erst mit sechs Monaten eine maximale Stimulationswirkung auf die Größenzunahme des Uterus ausgeübt, die für eine normale Embryonenentwicklung notwendig ist. Eine Studie von RAMPACEK et al. (1976) ergab, daß nach Induktion des Zyklus bei präpuberalen Tieren unterschiedlicher Alterklassen (155 Tage bis 185 Tage alte Tiere), die Trächtigkeitsraten mit dem Alter anstiegen. Die Autoren schlußfolgerten, daß präpuberale Jungsauen erst ab einem bestimmten Alter eine ausreichende Gelbkörpertätigkeit nach Zyklusinduktion entwickeln, um eine bestehende Trächtigkeit aufrecht zu erhalten.
Unabhängig vom Behandlungsschema unterliegen die Ovulationsergebnisse einer individuellen Variation, die von der Reaktionsbereitschaft der einzelnen Tiere beeinflußt
wird. Trotz Gabe vergleichbarer Hormondosierungen kann die Ovulationsrate sehr unterschiedlich sein (WALLENHORST 1996).
2.5. Spermientransport im weiblichen Genitale
2.5.1. Allgemein
Ein erfolgreicher Spermientransport im weiblichen Genitale resultiert in einer ausreichenden Anzahl an befruchtungskompetenten Spermatozoen am Ort der Befruchtung vor der Ovulation, so daß die Oozyte vor dem Einsetzen physiologischer Alterungsprozesse vom Spermium penetriert und erfolgreich befruchtet wird.
Der Spermientransport ist ein komplexer Prozeß, der von zahlreichen Faktoren beeinflußt wird. Neben den Spermatozoen selbst zählen hierzu das Paarungsverhalten, der Seminalplasmaanteil und dessen Zusammensetzung, der weibliche Reproduktionstrakt an sich (Muskulatur, Sekrete, Eigenschaften von Epitheloberflächen), Produkte, die durch die Ovulation freigesetzt werden und letztendlich immunogene Elemente des weiblichen Reproduktionstraktes. Zusätzlich zu diesen primären Faktoren wird der Spermientransport vom endokrinen und neuralen System des weiblichen Tieres moduliert (DROBNIS u.
OVERSTREET 1992).
Die eigentliche Bewegung der Spermien in Richtung Eileiter beruht auf einer Kombination von aktivem und passiven Transport. VIRING (1981) beschrieb erstmals den transuterinen Transport von Spermien beim Schwein, der eine koordinierte Myometriumkontraktion von der Zervix in Richtung Eileiter und umgekehrt erfordert. ZEROBIN (1968) untersuchte das Kontraktionsverhalten des Uterus während verschiedener Zyklusphasen. Er fand heraus, daß am zweiten Tag des Östrus die Kontraktionswellen überwiegend in Richtung Eileiter verliefen, während zum Beginn und zum Ende des Östrus sich die Richtung der Kontraktionswellen in Richtung Zervix änderte. Die Kontraktionssteigerungen wurden möglicherweise durch den mechanischen Effekt des inseminierten Flüssigkeitsvolumens, sowie durch die zervikale Stimulation beim Paarungsakt bzw. bei der künstlichen Besamung hervorgerufen (BOWER 1974; EINARSSON 1980). Auch HOANG-VU (1987) geht davon aus, daß die mechanische Reizung von Zervix und Uterus durch den Besamungskatheter bzw.
größere Flüssigkeitsvolumina einen eindeutig stimulierenden Einfluß auf die Myometriummuskulatur hat.
Es ist bekannt, daß Progesteron und Östrogen die Spontanmotilität des Uterus beim Schwein steigern (CLAUS et al. 1989). Östrogene, wie u.a. im Seminalplasma enthalten sind, induzieren die Synthese und Freisetzung von Prostaglandin-F2α im Endometrium (PAKRASI et al. 1983), wodurch eine Frequenzsteigerung der Kontraktionswellen am Uterus ausgelöst wird (CLAUS et al. 1990).
Weiterhin wird der Einfluß neuraler Reflexbögen und damit die Freisetzung von Oxytocin auf den Spermientransport diskutiert. Bei Schaf und Rind konnte durch mechanische Stimulierung des Genitaltraktes eine Oxytocin-Freisetzung über den Ferguson-Reflex erreicht werden (SCHAMS et al. 1982). Es war hingegen nicht möglich, bei diesen Spezies den Reflex nach der Paarung zu beobachten (SCHAMS et al. 1982; GILBERT et al. 1991), während beim Schwein eine paarungsinduzierte Oxytocinfreisetzung nachgewiesen werden konnte (CLAUS u. SCHAMS 1990). Der funktionelle Zusammenhang konnte bisher noch nicht geklärt werden (DROBNIS u. OVERTSTREET 1992).
Die hohe Uteruskontraktilität während des Östrus wird als Hauptmechanismus für den initialen, schnellen Transport der Spermien in Richtung Eileiter angesehen (BOWER 1974).
Innerhalb weniger Minuten nach der Insemination sind Spermien im Eileiter nachweisbar (BAKER u. DEGEN 1972; VIRING et al. 1980). Obwohl dieses, als „schneller Spermientransport“ bezeichnete Geschehen, kontrovers diskutiert wird, wurde er bei verschiedenen Spezies wie Rind, Schaf, Kaninchen, Schwein und verschiedenen Nagetieren (DROBNIS u. OVERSTREET 1992) nachgewiesen. Während man zunächst der Ansicht war, daß diese Spermien an der Befruchtung beteiligt sind, hat man später jedoch festgestellt, daß dies zumindest beim Kaninchen nicht der Fall ist (OVERSTREET 1983; OVERSTREET u.
COOPER 1978), da diese Spermien fast immer von geringer Vitalität waren, geschädigte Membranen aufwiesen und den wesentlichen Vorgang der Kapazitation nicht vollzogen hatten. Ein großer Anteil dieser Spermien wird zügig via Eileiter noch vor der Ovulation in die Bauchhöhle transportiert (OVERSTREET u. COOPER 1978). OVERSTREET (1983) vermutete, daß diese schnell transportierten Spermien als lokale Signalübermittler fungieren und die folgende, langsame Phase des Spermientransportes beeinflussen.
Dem schnellen Spermientransport schließt sich beim Schwein eine langsame, andauernde Phase des Spermientransportes an. Die uterotubale Verbindung ist dabei als Barriere anzusehen, an der sich die Spermien zunächst ansammeln. Diese Ansammlung erfolgt über mehrere Stunden hinweg mit der Ausbildung eines Spermienreservoirs im Bereich des unteren Eileiteristhmusabschnitts (siehe Kapitel 2.5.2.2). Erst zum periovulatorischen
Zeitpunkt findet eine Wanderung selektierter Spermien aus dem Spermienreservoir in Richtung Eileiterampulle, dem Ort der Befruchtung, statt (OVERSTREET 1983; HUNTER 1984; ITO et al. 1991; MBURU et al. 1996).
Der Zeitraum, in dem sich eine ausreichende Menge an befruchtungskompetenten Spermien im Bereich der uterotubalen Verbindung und im kaudalen Isthmusbereich etabliert, scheint je nach Spezies unterschiedlich lang zu sein. STEVERINK et al. (1998) vermuteten, daß beim Schwein in einigen Fällen schon innerhalb von 30 Minuten nach der Inseminierung eine ausreichende Anzahl von Spermien vorhanden ist, um eine Fertilisation zu ermöglichen.
HUNTER (1981) zeigte, daß beim Schwein schon innerhalb von 30 Minuten 50 % der Oozyten befruchtet sind und innerhalb von 1 bis 2 Stunden ausreichend Spermien im kaudalen Isthmus vorhanden sind, um eine 100 %-ige Fertilisation zu gewährleisten. Findet beim Schwein die Besamung oder die Bedeckung zum Zeitpunkt der Ovulation statt, ist die Transportgeschwindigkeit, sowie die Anzahl transportierter Spermien in die Eileiter erhöht (HUNTER 1981). Bei Pferd und Rind dauert es nach der Bedeckung 4 bzw. 6 bis 8 Stunden (SCOTT u. OVERSTREET 1999), bis sich eine ausreichend große Population befruchtungskompetenter Spermien im Eileiter angereichert hat.
2.5.2. Selektion befruchtungskompetenter Spermien während der Passage durch den weiblichen Genitaltrakt
Je nach Deponierung des Ejakulates während des Coitus wird zwischen intravaginalen und intrauterinen „Besamern“ unterschieden (HUNTER 1988).
Das Ejakulat wird entweder im kranialen Bereich der Vagina wie bei Schaf, Rind, Ziege, Kamel, Kaninchen und Primaten, oder wie bei Pferd und Schwein in den distalen Uterusabschnitt abgesetzt. Je nach Spezies existieren verschiedene Barrieren im weiblichen Genitaltrakt, die für die weitere Selektion befruchtungskompetenter Spermien verantwortlich sind. Hierzu gehören z.B. der Zervix-Mucus-Komplex bei Rind und Schaf (MULLINS u.
SAACKE 1989, MITCHELL et al. 1985) sowie die uterotubale Verbindung (UTV) und der Eileiteristhmus (KRZANOWSKA 1974). Nach neueren Studien stellt die Zona pellucida eine weitere, vielleicht sogar die wichtigste Barriere für vitale, aber morphologisch abweichende Spermatozoen dar (HOWARD et al. 1993).
2.5.2.1. Selektive Funktionen der Zervix bei Spezies mit intravaginaler Ejakulatdeponierung
KATZ et al. (1989) stellten beim Menschen die Bedeutung der Zervikalschleimes als Barriere für Spermatozoen heraus. Die Konsistenz dieses Hydrogels unterliegt hormonellen Einflüssen und verändert sich je nach Zyklusstand. Unter Östrogendominanz wird der Zervikalschleim wässriger, dünnflüssiger und enthält parallel ausgerichtete makromolekulare Fibrillen, die Micellen bilden. Diese sind kurz vor, sowie zum Zeitpunkt der Ovulation für motile Spermien passierbar. Beim Rind fungiert die Zervix als Selektionsmechanismus gegenüber morphologisch veränderten Spermien (KARABINUS u. SAACKE 1987, MITCHELL et al.
1985).
Für die Einwanderung bzw. die vorübergehende Ansiedlung der Spermien in den Zervikalkrypten und -falten ist die Motilität der Spermatozoen entscheidend (HAWK 1987).
Immotile Spermien werden durch die kontinuierliche Schleimproduktion der Zervikaldrüsen retrograd ausgeschieden (DROBNIS u. OVERSTREET 1992). Durch die Konsistenz und eine bestimmte makromolekulare Anordnung des Zervikalschleimes werden Scherkräfte bei der Spermienwanderung auf den Spermienkopf ausgeübt und Substanzen, wie z.B.
Dekapazitationsfaktoren, die aus dem Seminalplasma stammen, entfernt (KATZ et al. 1989).
Bei Spezies mit intravaginaler Ejakulatdeponierung wird in der Zervix durch die oben beschriebenen Mechanismen ein zahlenmäßig negativer Spermiengradient in Richtung Eileiter aufgebaut. HUNTER (1988) spricht von einer Reduktion der Spermien um einen Faktor von mindestens zwei Zehnerpotenzen während der Zervixpassage.
DOBROWOLSKI und HAFEZ (1970) konnten beim Rind eine Stunde bzw. 24 Stunden nach der Schlachtung nur 13,4 % bzw. 0,9 % der inseminierten Spermien aus dem Uterus wiedergewinnen. Der größte Anteil der Spermien wurde in der Vagina gefunden. Von den aus dem Genitale insgesamt zurückgespülten Spermien wurden weniger als 1 % in der uterotubalen Verbindung (UTV) gefunden.
Bei Rind, Schaf und Ziege wurde in den 60- und 70-iger Jahren die Zervix als Hauptspeicherort für die Spermatozoen angesehen (MATTNER 1966, 1968), von wo aus die Spermien kontinuierlich in den Uterus abwandern konnten. Beim Schaf ist die Anzahl der Spermien, die sich innerhalb von zwei Stunden nach Bedeckung bzw. Besamung im kaudalen Bereich der Zervix ansiedeln, positiv mit der Spermienzahl korreliert, die sich ca. 22 bis 24 Stunden später zum Zeitpunkt der Ovulation im Eileiter befindet (HAWK u. CONLEY 1975).
HUNTER (1998) hingegen versteht die Zervix des Rindes nur im quantitativem Sinn als Spermienreservoir und nicht als ein funktionelles Reservoir. Der Autor sieht im kaudalen Abschnitt des Eileiteristhmus das funktionelle Reservoir für die Spermien über den Zeitraum von der Besamung bis zur Ovulation (HUNTER 1998, HUNTER et al. 1991).
2.5.2.2. Spermienselektion in der uterotubalen Verbindung und dem kaudalen Isthmusabschnitt
Im Gegensatz zu den Spezies mit intravaginaler Spermiendeponierung, fungiert bei Spezies mit intrauteriner Spermadeponierung, wie beim Schwein, die uterotubale Verbindung als Hauptselektionsbarriere für die Spermatozoen und ergänzt die Selektion während der Uteruspassage (YANAGIMACHI 1994).
Trotz der niedrigeren Konzentration von Spermatozoen im Ejakulat von „Uterusbesamern“ im Vergleich zu „Scheidenbesamern“, ist der Aufbau eines Spermiengradienten von entscheidener Bedeutung. An der UTV wird die Anzahl der befruchtungskompetenten Spermien reguliert, um eine polysperme Befruchtung der Eizellen zu vermeiden (HUNTER u.
NICHOL 1986). Beim Schwein werden bei der natürlichen Paarung Spermien in einer Konzentration von 1 bis 2x108 Spermien pro ml bei einem durchschnittlichen Ejakulatvolumen von ca. 200 ml im distalen Uterusabschnitt abgesetzt (HUNTER 1995b), von denen aber nur wenige Tausend den Eileiter erreichen (MBURU et al. 1996). Beim Hamster vermögen nur 0,001 % der 108 bis 109 im Uterus befindlichen Spermatozoen sich erfolgreich im Eileiter anzusiedeln (SMITH et al. 1987).
Beim Schwein dienen die longitudinalen Schleimhautfalten und taschenähnlichen Divertikel der UTV sowie das enge Lumen des Isthmus während des Östrus schon an sich als mechanische Barriere für die Spermatozoen (HUNTER et al. 1987). Visköse, proteinhaltige Sekrete im Isthmuslumen scheinen zusätzlich den Transport der Spermatozoen zu regulieren, indem diese das ohnehin enge Isthmuslumen während des präovulatorischen Zeitraumes zusetzen (SUAREZ et al. 1991).
Wird die Kapazität der UTV, einen effektiven Spermiengradienten aufzubauen, durch experimentelle Eingriffe überschritten, resultiert hieraus die Chance zu polyspermer Befruchtung. Dieses konnte beim Schwein durch Deponierung der Spermiensuspension direkt in den Eileiter, Reduzierung des während des präovulatorischen Zeitraumes physiologischen Ödems durch lokale Mikroinjektion von Progesteron und die damit einhergehende Erhöhung
der Durchlässigkeit der UTV für Spermien, sowie durch Resektion eines großen Anteils des Isthmus demonstriert werden (HUNTER u. LÉGLISE 1971; HUNTER 1988).
DU MESNIL DU BUISSON und DAUZIER (1957) bezeichneten den unteren Abschnitt des Isthmus als “Spermienreservoir” mit Depotfunktion. Dieses Depot ist dafür verantwortlich, daß während des Östrus ausreichend befruchtungskompetente Spermien am Ort der Befruchtung (Isthmus-Ampulla-Übergang) zur Verfügung stehen, sobald die Oozyten ovulieren. Vergleichbare Spermienreservoirs werden beim Kaninchen, Schaf, Rind, Hamster, Maus und Meerschweinchen beschrieben (MBURU 1997).
Beim Schwein baut sich während der lang andauernden Phase des präovulatorischen Östrus ein Spermienreservoir in den uterotubalen Verbindung (UTV) und im unteren Teil des Isthmus auf (VIRING et al. 1980; HUNTER 1981, 1984), wobei die Spermien ihre intakte Ultrastruktur behalten (MBURU 1997). Die Anzahl der Spermien bleibt beim Schwein über einen Zeitraum von 6 bis 24 Stunden konstant und nimmt innerhalb der nächsten zwei Tage graduell ab (FIRST et al. 1968; POLGE 1978; VIRING u. EINARSSON 1981).
Während der präovulatorischen Phase bis zum Zeitpunkt der Ovulation ist die Temperatur im unteren Isthmusabschnitt erniedrigt (HUNTER u. NICHOL 1986). Hinzu kommen ein reduzierter 02-Partialdruck sowie ein modifiziertes vaskuläres System in diesem Bereich.
Diese Gegebenheiten könnten für eine herabgesetzte Motilität und somit Erhalt der Energiereserven der Spermien während der präovulatorischen Phase fungieren. Parallelen zwischen der physiologischen Funktion des unteren Isthmusabschnittes als temporärem Speicherort für Spermien und der Situation im Nebenhodenschwanz, in der die Spermien über einen deutlich längeren Zeitraum gespeichert werden, sind offensichtlich (HUNTER 1984).
Versuche von POLLARD et al. (1991) führten zu der Annahme, daß die UTV und der untere Isthmusabschnitt des Eileiters die Spermien nicht nur speichert, sondern deren Vitalität und Befruchtungskompetenz bis zum Zeitpunkt der Ovulation aufrecht erhält. Die Spermien sind in dem Reservoir über eine Zeitspanne von 24 bis 42 Stunden (Schwein), 24 bis 48 Stunden (Rind und Schaf) und 140 Stunden (Pferd) befruchtungskompetent (HUNTER 1988).
MBURU et al. (1996) konnten zeigen, daß sich Eberspermien während des präovulatorischen Zeitraumes in ganz bestimmten Regionen der UTV und des Eileiteristhmus ansiedeln. Es konnte noch nicht geklärt werden, ob die Besiedlung dieser Regionen zufällig erfolgte oder ein bestimmter Mechanismus zugrunde lag. Auffällig war, daß nur Spermatozoen, die während des präovulatorischen Zeitraumes engen Kontakt zu den apikalen Zilien der Epithelzellen der UTV und dem kaudalen Isthmusabschnitt hatten, intakte Membranen über
diesen Zeitraum hinweg aufwiesen und als befruchtungskompetent anzusehen waren (siehe Abbildung 3). SUAREZ et al. (1991) beobachteten bei In-vitro-Versuchen mit Eileiterepithelzellen, daß eine selektive Bindung von Eberspermatozoen nur an intakte, zilientragende Epithelzellen erfolgt. An Epithelzellen mit einem apikalen Mikrovillisaum hingegen banden keine Spermatozoen. FAZELI et al. (1999) konnten in einer In-vitro-Studie mit Eileiterepithelzellkulturen vom Schwein nachweisen, daß nur unkapazitierte Spermatozoen an Isthmus- bzw. Ampullaepithelzellen binden, wobei der genaue Mechanismus noch nicht geklärt werden konnte.
SMITH und YANAGIMACHI (1990) konnten auch beim Hamster zeigen, daß eine Bindung der Spermatozoen an das Eileiterepithel die Überlebensrate der Spermien im Eileiter erhöhte.
Spermatozoen hingegen, die sich in Gruppen in einer koagulierten Masse im Eileiterlumen befanden, wiesen geschädigte Plasmamembranen auf (MBURU et al. 1997). Diese intraluminalen Inhalte wurden wahrscheinlich durch muskuläre Kontraktionen bzw.
Zilienbewegung (BLANDAU u. GADDUM-ROSSE 1974) entlang des Eileiters transportiert und waren nicht an der Fertilisation beteiligt (MBURU et al. 1997).
Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Präparates der uterotubalen Verbindung kurz vor der Ovulation (aus Hunter et al. 1987)
Abbildung 2: Uterotubale Verbindung nach der Ovulation (Elektronenmikroskopische Aufnahme aus Hunter et al. 1987)
Abbildung 3: Eberspermium mit intaktem Akrosom im kaudalen Isthmusabschnitt kurz vor der Ovulation. Der Spermienkopf befindet sich in engem Kontakt zu den Zilien und Sekreten (Elektronenmikroskopische Aufnahme nach Hunter 1994)
2.5.3. Spermieneliminierung aus dem weiblichen Genitaltrakt
Seminalplasma und Spermien insbesondere solche mit verkürzter Lebensdauer, wie z.B. nach Gefrierkonservierung (PURSEL et al. 1978) werden schnell aus dem Uterus eliminiert (FIRST et al. 1968; VIRING u. EINARSSON 1981), wobei verschiedene Mechanismen diskutiert werden.
Der Samenrückfluß via Zervix und Vagina nach der Bedeckung bzw. künstlichen Besamung macht einen Großteil des Spermien- und Volumenverlustes aus. Schon knapp zwei Stunden nach natürlicher Bedeckung befindet sich im Uteruslumen nur noch leicht schaumige Flüssigkeit (LOVELL u. GETTY 1968). Das gelatinöse Material des Bulbourethraldrüsensekrets, das gegen Ende der Ejakulation bei der natürlichen Paarung vom Eber in der Zervix abgesetzt wird, verhindert einen sofortigen retrograden Samenverlust via Zervix. LOVELL und GETTY (1968) konnten das Bulbourethraldrüsensekret noch bis knapp zwei Stunden nach der Paarung im Zervixbereich nachweisen. Allerdings ist das Bulbourethraldrüsensekret nicht spermienfreundlich, so daß die retrograd fließenden Spermien nicht für die Befruchtung zur Verfügung stehen.
Durch den Rückfluß werden innerhalb der ersten zwei Stunden nach Bedeckung bis zu 30 % der Spermienmenge ausgeschieden (VIRING u. EINARSSON 1981). STEVERINK et al.
(1998) ermittelten Rückflußraten von durchschnittlich 70 % des eingesetzten Besamungsvolumens (80 ml) und 25 % der verwendeten Spermien innerhalb von zweieinhalb Stunden nach intrazervikaler Besamung. Obwohl die retrograd ausgeschiedenen Flüssigkeitsmengen zwischen den einzelnen Sauen stark variierte, bestand eine enge Korrelation zwischen ausgeschiedenem Volumen und der sich darin befindlichen Spermienzahl, so daß das Rückflußvolumen als ein Maß für den Spermienverlust angesehen werden kann.
Weitere Spermienverluste entstehen durch Adhäsion der Spermien an zilientragende Uterusepithelzellen und Einwanderung in die Uterindrüsen. Schon innerhalb von 30 Minuten nach Besamung beginnt eine Einwanderung von phagozytierenden Zellen (polymorphkernige Leukozyten) in das Uteruslumen (LOVELL u. GETTY 1968). Makrophagen sind nach 9 bis 10 Stunden nach Bedeckung im Lumen nachweisbar (HADJISAVAS et al. 1994). 27 Stunden nach der Bedeckung sind im Endometrium zahlreiche in Degeneration befindliche Leukozyten und nur noch vereinzelt Spermien nachweisbar (LOVELL u. GETTY 1968).
A m p u l l a
I s t h m u s
U t e r u s
Z e r v i x
V a g i n a
I n t e r a k t i o n e n m i t d e r O o z y t e n o b e r f l ä c h e
K a p a z i t a t i o n n i c h t v o l l z o g e n
B i n d u n g a n E p i t h e l z e l l e n K o a g u l a t i o n i n d e m i n t r a l u m i n a l e n S c h l e i m S e l e k t i o n i m I s t h m u s
S e l e k t i o n i n d e r
u t e r o t u b a l e n V e r b i n d u n g
R e t r o g r a d e m u s k u l ä r e A k t i v i t ä t
A g g l u t i n a t i o n P h a g o z y t o s e d u r c h L e u k o z y t e n
A d h ä s i o n a m E n d o m e t r i u m V e r d ü n n u n g d u r c h
U t e r u s f l ü s s i g k e i t
R ü c k f l u ß v o n S p e r m i e n u n d F l ü s s i g k e i t
U T V
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Spermienverluste im weiblichen Genitaltrakt während ihrer Passage zum Ort der Befruchtung (Isthmus-Ampulla- Übergang)
(modifiziert nach HUNTER 1995a)
2.5.4. Terminierung der Spermienfreisetzung aus dem Spermienreservoir
Erst zum Zeitpunkt der Ovulation steigen die Spermatozoen aus dem Bereich der UTV und dem kaudalen Isthmussegment in Richtung Ampulle auf. Die Anzahl der aus dem unteren Isthmusbereich freigesetzten Spermatozoen steht im festen Verhältnis zu den zur Ovulation kommenden Oozyten (HUNTER 1995), wobei verschiedene Regulationsmechanismen diskutiert werden.
Zum Zeitpunkt der Ovulation reduziert sich der Östradiolspiegel und die Progesteronkonzentration nimmt zu. Hierdurch reduziert sich u.a. das Ödem im Isthmusbereich. Auch der Tonus im Eileiter wird herabgesetzt (HUNTER 1995a). Zudem besitzt das Isthmusepithel LH-Rezeptoren, die unter Einfluß von Östradiol verstärkt synthetisiert werden. LH bewirkt besonders zum periovulatorischen Zeitpunkt eine Relaxierung des Isthmus (GAWRONSKA et al. 1999).
Während der präovulatorischen Phase setzen visköse, proteinhaltige Sekrete pfropfartig das Isthmuslumen zu. Ob die Spermatozoen mechanisch durch die hochvisköse Konsistenz dieser Sekrete im kaudalen Isthmus während dieser Phase arretiert werden (SUAREZ u. DAI 1992) oder der Kontakt zu den Epithelzellen dafür verantwortlich ist, ist noch nicht mit letzter Sicherheit geklärt (HUNTER 1995a). Zum Zeitpunkt der Ovulation verringert sich die Viskosität vermutlich durch eine vermehrte Flüssigkeitstranssudation in das Isthmuslumen. In Verbindung mit einem weiteren Isthmuslumen erfolgt periovulatorisch ein quantitativ erhöhter Spermientransport in Richtung Eileiterampulle (HUNTER 1995a).
Studien beim Kaninchen haben ergeben, daß hohe extrazelluläre Kaliumkonzentrationen im Isthmus, die Motilität der Spermatozoen stark herabsetzt, während Pyruvat das Gegenteil bewirkt (BURKMAN et al. 1984). Beim Schwein unterscheiden sich während der präovulatorischen Phase die Laktat- und Pyrutvatkonzentration der luminalen Flüssigkeit im Isthmus- und Ampullenabschnitt des Eileiters. Nach der Ovulation sind diese Konzentrationsunterschiede nur noch gering ausgeprägt oder gar nicht mehr vorhanden (NICHOL et al. 1992). Die modifizierte chemische Zusammensetzung der intraluminalen Eileiterflüssigkeit zum periovulatorischen Zeitpunkt scheint einen wesentlichen Einfluß auf die Aktivierung der Spermatozoen zu haben (HUNTER 1995a).
Als weiterer wichtiger Faktor ist der Temperaturgradient im Eileiterlumen zu erwähnen. Bei Sauen nach der Paarung ist die luminale Temperatur des kaudalen Isthmusabschnittes vor der Ovulation um 0,75 C° niedriger als im kranialen Ampullenabschnitt. Dieser Temperaturunterschied ist zum Zeitpunkt der Ovulation und danach ausgeglichen (HUNTER u. NICHOL 1986). Obwohl es sich um geringe Temperaturunterschiede handelt, können die Spermatozoen dadurch direkt betroffen sein. Durch Veränderungen der Proteinstruktur kann insbesondere die Aktivität und Konfiguration des Flagellums beeinflußt werden (HUNTER 1995a).
Als weiteren Mechanismus diskutierte HUNTER (1996) den Einfluß von molekularen Substanzen aus den Kumulus-Oozyten-Komplexen, die eine Reorientierung der
Spermatozoen in Richtung eines molekularen Gradienten innerhalb der Kumuluszellen der Oozyte bewirken. Auch ITO et al. (1991) schlußfolgerten aus Versuchen am Kaninchen, daß Produkte der Ovulation (Follikelflüssigkeit, Oozyten, Kumulus-Oozyten-Komplexe) direkten Einfluß auf den Spermientransport im Eileiter haben.
HUNTER et al. (1983) führten die periovulatorischen Kontraktionen des Eileiters, die den Spermientransport in Richtung Isthmus-Ampulla-Abschnitt unterstützt, auf vom Ovar stammende Steroide und Prostaglandine zurück, die über das lokale Counter-Current- Blutgefäßsystem direkt auf den Eileiter wirken. Der genaue Mechanismus, wie sich die Spermatozoen, die innig mit dem apikalem Bereich der Epithelzellen der UTV bzw. des Isthmus verbunden sind, zum Zeitpunkt der Ovulation lösen, ist bisher noch nicht hinreichend geklärt. Plasmamembranveränderungen während der Kapazitation und die daraus resultierende Hypermotilität der Spermien scheinen wichtige Faktoren zu sein (CALVETE et al. 1997).
2.6. Die Kapazitation
CHANG und AUSTIN beschrieben erstmals 1951 unabhängig voneinander die wesentliche Bedeutung der Kapazitation von Spermatozoen. Unter Kapazitation versteht man physiologische und biochemische Veränderungen der Spermien, die notwendig sind um diese auf eine Befruchtung vorzubereiten. Damit einher gehen Veränderungen in der intrazellularen Ionenkonzentration, im Metabolismus, dem Adenylatzyklase-System, in der Nukleusstruktur, am Akrosom sowie an der Plasmamembran der Spermatozoen. Auch das Bewegungsmuster der Spermien ändert sich von einer kontinuierlichen Vorwärtsbewegung in eine hyperaktive Motilitätsform. Diese hyperaktive Motilität ist elementar für den Aufstieg der Spermien aus dem unteren Isthmusabschnitt zum Isthmus-Ampulla-Übergang und letztendlich für die Penetration der Oozyte (YANAGIMACHI 1994).
Um die Kapazitation als progressiven Destabilisierungsprozeß einzuleiten, der für eine spätere koordinierte Akrosomenreaktion Bedingung ist, müssen Substanzen, die der Plasmamembran der Spermien aufliegen bzw. zum Teil in diese integriert sind, entfernt oder umgewandelt werden (HUNTER u. GREVE 1998; YANAGIMACHI 1994). Dabei handelt es sich um sogenannte Dekapazitationsfaktoren (FRASER et al. 1990), Kaltrin, 15-, 16- und 23-kDa Glykoproteine sowie Spermadhäsine, die alle aus dem Seminalplasma stammen, sowie ein akrosomstabilisierendes 125- bis 259 kDa Protein, das aus dem Nebenhoden stammt (YANAGIMACHI 1994). Die Gruppe der Spermadhäsine stellt einen Großteil der Proteine im Seminalplasma. Nach der Ejakulation sind die Spermienköpfe jeweils mit 12 bis 60
Millionen Molekülen Spermadhäsinen der Gruppen AQN-1, PSP-I, AQN-3, AWN-1 und AWN-2 überzogen. Während der In-vitro-Kapazitation reduziert sich die Molekülanzahl auf etwa 5 bis 6 Millionen pro Spermium (DOSTÀLOVÀ et al. 1994). Den einzelnen Untergruppen der Spermadhäsine werden verschiedene Funktionen zugeschrieben. Sie sollen als Dekapazitationsfaktoren sowie akrosomstabilisierend wirken und auch als Zona-pellucida bindende Moleküle fungieren. CALVETE et al. (1997) konnten in ihrer Studie 18 bis 26 Stunden nach Insemination das Spermadhäsin AWN-1 immunohistologisch nicht mehr in der UTV sowie im kaudalen Isthmusabschnitt mittels monoklonaler Antikörper nachweisen. Sie schlußfolgerten, daß ein Teil der Spermadhäsine auf dem Weg vom Uterus bis zum unteren Isthmusabschnitt von den Spermienmembranen entweder passiv oder durch Interaktion der Spermien mit dem Epithel des weiblichen Genitale von den Spermien entfernt wurden.
OKABE et al. (1986) identifizierten mit dem monoklonalem Antikörper TSC4 bei Mäusen ein Antigen in der Plasmamembran von Nebenhodenschwanzspermien, das auch durch wiederholtes Waschen der Spermien nicht entfernt werden konnte. Mit dem Eindringen der Spermien in den perivitellinen Raum der Oozyte, war das Antigen nicht mehr nachweisbar.
Dieses Antigen ist durch den Vorgang der Kapazitation entweder vollständig entfernt oder verändert bzw. maskiert worden. VOGLMAYR und SAWYER (1986) inkubierten ejakulierte Spermien vom Schaf in Uterusflüssigkeit und konnten drei verschiedene Glykoproteine (65, 41 und 24 kDa) identifizieren, die von den Spermien abgegeben wurden. Gleichzeitig absorbierten die Spermien ein 16 kDa Glykoprotein. Bei Inkubation der Spermien mit Eileiterflüssigkeit, wurden jedoch 97-kDa und 41-kDa Glykoproteine aus der Membran freigesetzt. Wurden die Spermien aber zuerst der Uterusflüssigkeit und daraufhin der Eileiterflüssigkeit ausgesetzt, absorbierten sie hingegen verschiedene Glykoproteine (13-190 kDa).
Wo genau der Vorgang der Kapazitation im weiblichen Genitale beginnt und endet ist speziesabhängig. Bei Spezies mit intrauteriner Ejakulatdeponierung scheinen die Spermatozoen überwiegend, wenn nicht sogar ausschließlich, im unteren Isthmusabschnitt zu kapazitieren (YANAGIMACHI 1994; CALVETE et al. 1997). Bei Spezies mit intravaginaler Spermiendeponierung scheint die Kapazitation der Spermien schon mit der Zervixpassage zu beginnen (KATZ et al. 1989). BEDFORD (1967) berichtete, daß der Vorgang der Kapazitation bei Spermien vom Kaninchen am effektivsten erfolgte, wenn sie den Uterus sowie den Eileiter passiert hatten. Jedoch können Spermien auch im Uterus vollständig kapazitieren ohne bis zum Eileiter aufsteigen zu müssen (BRACKETT u. SERVER 1970) bzw. auch ohne Uteruskontakt ausschließlich im Eileiter kapazitieren (BEDFORD 1969).
HUNTER und HALL (1974) und HUNTER (1990) demonstrierten, daß für die Kapazitation von Eberspermien der Uterus nicht benötigt wird. KAWAKAMI et al. (1998) konnten in ihrer Studie zeigen, daß beim Hund die Kapazitation der Spermien z.B. durch die Eileiterflüssigkeit eingeleitet wird. Die Kapazitation ist auch in vitro mit verschiedenen Medien induzierbar.
Eine funktionelle Bedeutung haben BSA, HCO3-
und Ca2+ (VISCONTI et al. 1998).
Kapazitierte Spermien sind membraninstabil und kurzlebig (BEDFORD 1970), so daß dieser Prozeß mit der Ovulation synchronisiert sein muß. HUNTER (1995) geht davon aus, daß der vollständige Ablauf der Kapazitation nicht von der Verweildauer der Spermien im unteren Isthmusabschnitt abhängt, sondern ein ovulationsbezogenes Ereignis ist.
Beim Schwein verlassen die Spermien über einen längeren Zeitraum, der sich über zwei oder mehr Tage hinweg ziehen kann, nach und nach den kaudalen Isthmusbereich (HUNTER 1991). Nach der Ovulation sind die Kumuluszellen der Oozyten in etwa 2 bis 3 Stunden vollständig abgelöst. Somit ist es sinnvoll, daß die Spermatozoen zu unterschiedlichen Zeitpunkten den Vorgang der Kapazitation beenden (HARRISON 1997). Tatsächlich konnten HARKEMA et al. (1998) in In-vitro-Versuchen zwei Subpopulationen von Spermatozoen identifizieren, die unter identischen Kapazitationsbedingungen unterschiedlich schnell reagierten. Es wurde hervorgehoben, daß die ‚langsamere‘ Subpopulation wahrscheinlich den Hauptanteil in der In-vivo-Befruchtung stellt. Bis zur vollständigen Kapazitation vergehen beim Schwein ca. 3 Stunden (HUNTER 1995a), beim Rind 4 bis 6 Stunden und beim Menschen etwa 7 Stunden (LONG et al. 1994).
HARRISON (1997) folgerte, daß der Vorgang der Kapazitation als ein spezifischer, initiierbarer und kontrollierbarer Prozeß zu sehen ist, in dem Bikarbonat eine Schlüsselfunktion spielt. Der Einstrom von Bikarbonat in das Spermium führt zu einer Stimulation der Adenylatzyklase. Daraus geht cAMP als second-messenger hervor, das die Proteinkinase-A aktiviert und gleichzeitig die Phosphotyrosin-Phosphatase hemmt. Die Proteinkinase-A aktiviert die Protein-Tyrosin-Kinase, was letztendlich zur Kapazitation führt (VISCONTI et al. 1998).
2.7. Einfluß des Seminalplasmas
Es ist bekannt, daß das Seminalplasma im Eberejakulat mit dem weiblichen Reproduktionstrakt interagiert und die Befruchtungschancen beeinflußt. Dem Seminalplasma wird eine regulierende Funktion zugeschrieben, die essentiellen Befruchtungsschritte, wie die Freisetzung von Oozyten, den Spermientransport und die Kapazitation der Spermatozoen, zeitlich zu optimieren (WEITZE et al. 1990; WABERSKI 1996). Der Effekt soll auf der additiven Wirkung einer niedermolekuaren Peptidfraktion (1-10 kDa) und zu einem geringen Anteil auf Östrogenen im Seminalplasma beruhen (WABERSKI 1996).
WABERSKI (1996) stellte fest, daß eine Vorverlegung des Ovulationszeitpunktes durch Applikation von Seminalplasma nur deutlich bei Sauen ausgeprägt war, die ein langes Intervall zwischen Östrusbeginn und spontaner Ovulation aufwiesen und das Seminalplasma frühzeitig im Östrus appliziert wurde. Der Effekt der Vorverlegung des Ovulationszeitpunktes beruht auf einer Verkürzung des Intervalls zwischen LH-Anstieg und Ovulation. Der Zeitpunkt des LH-Anstiegs wurde durch die Applikation von Seminalplasma nicht beeinflußt (WABERSKI et al. 1997). SOEDE et al. (1998) konnte bei Sauen, bei denen die Ovulation mit 750 I.E. hCG induziert wurde, keine Vorverlegung des Ovulationszeitpunktes beobachten.
Die Autoren merkten aber an, daß die Zusammensetzung des Seminalplasmas eberabhängig ist.
Dem Seminalplasma wird ein positiver Effekt auf die Menge befruchtungskompetenter Spermatozoen im Eileiter zugerechnet, was vermutlich auf eine Steigerung des Spermientransportes zurückzuführen ist. VIRING und EINARSSON (1980) diskutierten eine relaxierende Wirkung des Seminalplasmas auf das Isthmussegment des Eileiters, was einen erleichterten Aufstieg der Spermien zum Ort der Befruchtung gewährleisten würde.
WABERSKI et al. (1996) und SOARES (1995) ermittelten eine höhere Anzahl akzessorischer Spermien nach der Applikation von Seminalplasma. Die Autoren konnten jedoch hinsichtlich der Befruchtungsrate bei Verwendung suboptimaler Spermienzahlen (0,5 und 0,3 Milliarden pro Besamungsdosis) keinen statistisch nachweisbaren Unterschied darstellen.
Auf einen weiteren regulierenden Mechanismus des Seminalplasmas weisen die Autoren HOANG-VU (1987), CLAUS et al. (1988) und CLAUS (1990) hin. Die Östrogene im Inseminat bewirken eine endometriale Prostaglandinfreisetzung und somit eine erhöhte Uteruskontraktilität. Seminalöstrogene scheinen somit den Spermientransport zu steigern und werden als wichtige regulative Teile der Fertilisation gesehen.
Seminalplasma übt auch eine direkte Wirkung auf die Spermatozoen selbst aus. Durch spezifische, aktivierende (forward motility protein, FMP) und hemmende Substanzen (Spermienmotilitätshemmstoff, SPMI) wird deren Motilität beeinflußt (ACOTT u. HOSKINS 1978, IWAMOTO et al. 1992). Auch der Vorgang der Kapazitation wird durch die im Seminalplasma enthaltenen Dekapazitationsfaktoren entscheidend beeinflußt.
Seminalplasma übt einerseits eine immunsuppressive Wirkung (KOCH u. ELLENDORF 1985; STANEK et al. 1985) andererseits aber auch eine immunstimulierende Wirkung auf den weiblichen Genitaltrakt aus (HADJISAVAS et al. 1994, ENGELHARDT et al. 1997).
Immunsuppressive Seminalplasmabestandteile mit Molekulargewichten zwischen 100 und 110 kDa wurden im Ebersamen ermittelt (BOUVET et al. 1987). Nach STANEK et al. (1985) richtet sich die immunsuppressive Wirkung hauptsächlich gegen B-Lymphozyten.
Spermatozoen besitzen antigene Eigenschaften und fungieren als chemotaktische Mediatoren, die über eine Komplementaktivierung zu einer Migration von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) führen (TROEDSSON et al. 1995). Die Zugabe von 20 bis 30 ml Seminalplasma zu einer Besamungsportion hingegen reduziert die spermieninduzierte Einwanderung von PMN in das Uteruslumen (ROZEBOOM et al. 1999). ENGELHARDT et al. (1997) fanden hingegen einen massiven Anstieg von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen im Endometrium von Jungsauen nach Seminalplasmaapplikation. LESHIN et al. (1998) konnte in In-vitro-Versuchen einen immunstimulierenden Effekt der Seminalproteine PSP-I und PSP-II auf T- und B-Lymphozyten nachweisen. Es ist denkbar, daß bestimmte Seminalplasmaproteine, die Proliferation von Lymphozyten anregen, die dann mit immunsupressiven Substanzen interagieren bzw. diese synthetisieren. Eventuell schützen diese Substanzen die Spermatozoen, Zygoten bzw. Embryonen vor einer immunologischen Abwehrreaktion durch das weibliche Genitale (LESHIN et al. 1998).
2.8. Spermiendosierung und Besamungsvolumen
Bei der natürlichen Paarung gelangen etwa 50 bis 60x109 Spermien und ein Volumen von 200 bis 300 ml in den Genitaltrakt der Sau.
In den ersten Jahren der instrumentellen Sameneinführung, wurden beim Schwein pro Besamungsdosis 40x109 Samenzellen eingesetzt (RIGBY 1966; FIRST et al. 1968). Durch die Entwicklung neuer Verdünner und besseren Verfahren zur Beurteilung der Ejakulatqualität werden heutzutage pro Besamungsdosis zwischen 2,0 und 3,5x109 Spermien
bei einem Volumen von 80 bis 100 ml in den meisten Ländern verwendet (COLENBRANDER 1991).
Hinsichtlich der minimalen Spermienzahl variieren die Angaben, jedoch muß diese offensichtlich im bestimmten Verhältnis zum Volumen stehen. Wird das Volumen bei steigenden Spermienzahlen konstant gehalten, erhöht sich sowohl die Anzahl befruchteter Oozyten als auch die Konzeptionsrate (STRATMAN et al. 1959; PAREDIS 1962).
HANCOCK und HOWELL (1961) führten beim Schwein intrauterine Besamungsversuche mit verschiedenen Spermiendosierungen durch. Sie besamten mit zwei unterschiedlichen Volumina (20 ml und 120 ml) und mit je drei unterschiedlichen Spermiendosierungen (10, 1 und 0,1x109 Spermien). Die Besamungen von 10 und 1x109 Spermien in einem Besamungsvolumen von 20 ml ergaben Befruchtungsraten von 78,5 % bzw. 83,5 %. Bei Verwendung von 10 und 1x109 Spermien in einem Volumen von 120 ml fielen die Befruchtungssraten auf 41,5 % bzw. 44,2 % signifikant ab. Bei Einsatz von 0,1x109 Spermien bei einem Volumen von 20 bzw. 120 ml sanken die Fertilisationsraten sogar auf 24,6 %. Die Autoren schlußfolgerten, daß Volumina von 20 ml bei intrauteriner Deponierung ausreichen, um normale Fertilisationsraten zu erzielen. HANCOCK und HOWELL (1961) fanden in ihren eigenen sowie anderen Studien (STRATMAN u. SELF 1960), daß durch eine intrauterine Spermiendeponierung trotz reduzierter Spermiendosierung durchaus gute Befruchtungsraten erreicht werden können.
BAKER et al. (1968) testeten bei Jungsauen verschiedene Besamungsvolumina (20, 100 oder 200 ml) und unterschiedliche Spermienzahlen (1, 5 und 10x109 Spermatozoen) mittels intrazervikaler Insemination. In allen drei Spermiendosierungsgruppen, die mit einem Volumen von 20 ml besamt wurden, erzielten sie keine Befruchtung. Wurde das Intervall zwischen Insemination und Rückspülung der Embryonen aus den Eileitern in dieser Gruppe von 12 auf 16 Stunden verlängert, stieg die Anzahl befruchteter Oozyten auf 30,4 % an. Die Autoren kamen zu dem Ergebnis, daß maximale Fertilisationraten zu erwarten sind, wenn 5 oder 10x109 Spermatozoen in einem Volumen von 100 ml intrazervikal inseminiert werden.
Es bestand eine positive Korrelation zwischen der inseminierten Spermienkonzentration und der Anzahl aus dem Genitaltrakt zurückgewonnener Spermien. Für den Routineeinsatz sahen die Autoren ein Besamungsvolumen von mindestens 100 ml als erforderlich an, um einen ausreichenden Spermientransport zur uterotubalen Verbindung zu gewährleisten.
ALANKO (1974) fand ausreichende Befruchtungsraten bei Besamung von 2-2,5x109 Spermien bei einem Volumen von 150 ml. Wurden weniger Spermien inseminiert, sank die Befruchtungsrate ab. Gleichzeitig erhöhte sich der Anteil abnormal geteilter Embryonen.
Die Spermienzahl im Eileiter ist positiv mit der inseminierten Spermienzahl bzw. mit dem uterotubalen Reservoir korreliert (MORTON u. GLOVER, 1974; LARSSON u. LARRSON 1986). RIGBY (1966) schlußfolgerte aus eigenen Versuchen, daß es möglich sein sollte, Sauen mit weniger als 2x109 Spermatozoen pro Besamungsdosis zu besamen, solange eine ausreichende Anzahl von Spermien in der uterotubalen Verbindung angereichert werden kann.
LEFEBVRE und SUAREZ (1996) stellten in einer In-vitro-Studie heraus, daß die Anzahl der pro mm2 Isthmusepithel gebundenen Spermatozoen von der eingesetzten Konzentration der Samenzellen abhängig ist. Isthmusepithelzellen vom Rind wurden mit 1x105 und 1x106 motilen Spermatozoen über einen Zeitraum von 15 bis 20 Minuten inkubiert, wobei sich 30 bzw. 600 Spermatozoen an eine Fläche von 0,1 mm2 Epithelzellen anhefteten.
STEVERINK et al. (1997) fanden keine Unterschiede in den Fertilisationsraten und der Anzahl akzessorischer Spermien, wenn die Sauen einmalig mit 1, 3 oder 6x109 Spermien 12 bis 24 Stunden vor der Ovulation besamt wurden. Allerdings stieg der Anteil an Embryonen guter Qualität mit Erhöhung der Spermiendosierung in allen Inseminations-Ovulations- Intervall-Gruppen (0-12 h, 12-24 h, 24-36 h) an. Die Autoren erzielten in diesem Versuch mit den unterschiedlichen Spermiendosierungen nur geringe, nicht signifikante Unterschiede in den Fertilisationsraten und der Anzahl akzessorischer Spermien. Diese Ergebnisse deuteten daraufhin, daß eine effektive Ausbildung eines Spermienreservoirs in der uterotubalen Verbindung auch bei Besamung von nur 1x109 Spermien erfolgt.
WABERSKI et al. (1996) erzielten trotz niedriger Spermiendosierung (0,5x109 Spermien) überraschend hohe Ferilisationsraten (80,5 %) bei einem mittleren Inseminations-Ovulations- Intervall von 12 Stunden. Auch bei einem mittleren Inseminations-Ovulations-Intervall von 20 Stunden wurden noch Fertilisationsraten von 78,4 % erreicht. Die Autoren führten dies auf optimale Bedingungen zurück, wie z.B. Wintersaison, enger Eberkontakt, erfahrene Handhabung der Tiere, optimale Östruserkennung und beste Samenqualität. Weitere Reduzierungen der Spermienzahl auf 0,3x109 führten allerdings zu einem Abfall der Fertilisationsraten auf 60 %. Der Abfall manifestierte sich aber nicht in einem höheren Anteil
