Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee)
der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig
Experimentelle Untersuchungen zur Verbesserung der Entwicklungsfähigkeit geklonter Schweineembryonen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Dagmar Theda Sage
aus Wilhelmshaven
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. K.-H. Waldmann
Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2005
Meinen Eltern, meinem Bruder Ansgar
und Tobias
1. Einleitung _____________________________________________________1
2. Schrifttum_____________________________________________________4
2.1. Physiologische Grundlagen...4
2.1.1. Oogenese beim Säugetier ...4
2.1.2. Vorgänge bei der Befruchtung ...6
2.1.3. Embryonale Entwicklung des Schweins...8
2.1.4. Physiologische Beschaffenheit von Eileiter und Uterus beim Schwein ...11
2.2. Biotechnologische Grundlagen...14
2.2.1. In-vitro-Reifung porziner Oozyten ...14
2.2.2. In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen ...16
2.2.2.1. Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur ...18
2.2.2.2. Berücksichtigung des Energiestoffwechsels frühembryonaler Stadien während der In-vitro-Kultur ...20
2.2.3. Erstellung porziner parthenogenetischer Embryonen und deren Entwicklungspotential in vitro...25
2.3. Somatisches Klonen beim Schwein...29
2.3.1. Effizienz des Kerntransfers bei unterschiedlichen Spezies...29
2.3.2. Einflussfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers und die anschließende Entwicklung des Embryos...31
2.3.2.1. Zyklusstand der Oozyte und Art der Spenderzelle...31
2.3.2.2. Kerntransferverfahren ...32
2.3.2.3. Rolle des sogenannten „Nuclear Reprogramming“ in der frühen Embryonalentwicklung ...36
2.3.2.4. Qualität und Entwicklungspotential der erstellten Oozyten-Spenderzell- Komplexe...37
2.3.3. In-vitro-und In-vivo-Potential porziner Kerntransferembryonen...38
3. Material und Methoden _________________________________________45
3.1. Arbeitsmaterialien...46
3.1.1. Pipetten...46
3.1.2. Medien ...47
3.2. Spenderzellen für den Kerntransfer ...47
3.2.1. Gewinnung der Spenderzellen...47
3.2.2. Kultivierung und Wachstum ...48
3.2.3. Präparation für den Kerntransfer...48
3.3. Eizellen als Empfängerzellen für den Kerntransfer ...49
3.3.1. Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen ...49
3.3.2. In-vitro-Reifung ...50
3.3.3. Präparation für den Kerntransfer/Parthenogenese ...50
3.4. Kerntransfer ...51
3.4.1. Entkernen ...51
3.4.2. Transfer einer Kernspenderzelle...52
3.4.3. Fusion der Oozyten-Spenderzell-Komplexe ...52
3.4.4. Elektrische und chemische Aktivierung...56
3.5. Erstellung parthenogenetischer Embryonen ...57
3.6. In-vitro-Fertilisation mit aufgetautem Nebenhodenschwanzsperma ...57
3.6.1. Vorbereitung der Oozyten...57
3.6.2. Aufbereitung und Präparation der Spermien...57
3.6.3. In-vitro-Fertilisation ...58
3.7. In-vitro-Kultivierung...59
3.7.1. Allgemeine Kulturbedingungen ...59
3.7.2. Versuch 1: Veränderungen der umgebenden Kulturatmosphäre (Vergleich 20% vs. 5% Sauerstoff) ...59
3.7.3. Versuch 2: Modifizierung des Kulturmediums...60
3.8. Beurteilung der In-vitro-Entwicklung ...61
3.8.1. Blastozystenrate ...61
3.8.2. Qualität der Blastozysten ...61
3.8.2.1. Auszählung der Kerne mittels Hoechstfärbung...61
3.8.2.2. Bestimmung von Inner-Cell-Mass und Trophectoderm mittels Differentialfärbung...62
3.9. Beurteilung der In-vivo-Entwicklung...63
3.9.1. Möglichkeiten des Embryotransferzeitpunktes...63
3.9.1.1. Zygotenstadium ...63
3.9.1.2. 4- bis 8-Zellstadium...63
3.9.1.3. Blastozystenstadium ...64
3.9.2. Synchronisation der Empfängertiere...64
3.9.3. Embryotransfer von Kerntransferembryonen ...64
3.9.4. Aufrechterhaltung der Trächtigkeit...66
3.10. Statistische Auswertung ...66
4. Ergebnisse ___________________________________________________68 4.1. Vorversuch: Entwicklung parthenogenetisch erstellter Embryonen unter verminderter Sauerstoffspannung ...68
4.1.1. Blastozystenraten ...69
4.1.2. Durchschnittliche Kernzahlen ...69
4.2. Versuch 1: Veränderung der Sauerstoff-Konzentration während der In-vitro-Kultivierung...71
4.2.1. Entwicklung rekonstruierter Kerntransferkomplexe...71
4.2.2. Entwicklung der IVF-Embryonen...72
4.2.3. Entwicklung parthenogenetischer Embryonen...73
4.2.4. Verhältnis von Inner-Cell-Mass und Trophectoderm-Zellen...75
4.3. Versuch 2: Modifikation des Kulturmediums in vitro unter Berücksichtigung des Glucosestoffwechsels frühembryonaler Stadien ..77
4.3.1. Entwicklung rekonstruierter Kerntransembryonen ...77
4.3.2. Entwicklung der IVF-Embryonen...78
4.3.3. Entwicklung parthenogenetischer Embryonen...78
4.3.4. Verhältnis von Inner-Cell-Mass- und Trophectoderm-Zellen...80
4.4. In-vivo-Potential von Kerntransferembryonen nach Embryotransfer ...81
5. Diskussion ___________________________________________________83 5.1. Veränderte Sauerstoffatmosphäre während der In-vitro-Kultur von Kerntransfer-, IVF- und parthenogenetischen Embryonen ...83
5.2. Veränderung des Kulturmediums hinsichtlich des Energiestoffwechsels porziner Embryonen ...86
5.3. In-vivo-Potential auf Empfängertiere transferierter Embryonen nach zuvor erfolgter In-vitro-Kultivierung...90 6. Zusammenfassung ____________________________________________92 7. Summary ____________________________________________________96 8. Literaturverzeichnis___________________________________________100 9. Anhang: Zusammensetzung der Medien __________________________122 10. Abkürzungsverzeichnis________________________________________125 11. Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen________________________128
1. Einleitung
Seit der Geburt des weltweit ersten, aus adulten Zellen geklonten Schafes „Dolly“
(WILMUT et al. 1997), hat es auch bei anderen Spezies Bemühungen gegeben, das somatische Klonen zu etablieren und Anwendungsmodelle zu entwickeln. Bisher wurden bei Schaf (WILMUT et al. 1997), Rind (CIBELLI et al. 1998), Ziege (BAGUISI et al. 1999), Maus (WAKAYAMA et al. 1998), Schwein (POLEJAEVA et al. 2000; ONISHI et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000), Kaninchen (CHESNE et al. 2002), Katze (SHIN et al. 2003), Maultier (WOODS et al. 2003), Pferd (GALLI et al. 2003) und bei der Ratte (ZHOU et al. 2003) lebende geklonte Nachkommen geboren. Während bei den meisten der genannten Spezies die Entwicklungsraten geklonter Embryonen sehr gering sind (unter 3%), können beim Rind zwar Erfolgsraten von 15- 20% erreicht werden, jedoch kommt es besonders bei dieser Spezies häufig zu Geburten von abnormal großen Kälbern (sogenanntes Large Offspring Syndrome) (YOUNG et al. 1998). Beim Schwein sind die Geburtsraten geklonter Ferkel trotz etablierter Kerntransferprotokolle nach wie vor besonders gering (<1%) (NIEMANN u. RATH 2001; ONISHI 2002; BREM u.
KUHHOLZER 2002). Dies liegt hauptsächlich an Besonderheiten in der Reproduktionsphysiologie und frühembryonalen Entwicklung geklonter Embryonen („Nuclear Reprogramming“) (HAN et al. 2003). Zur Etablierung einer Trächtigkeit beim Schwein ist die Implantation von mindestens vier Embryonen notwendig (POLGE et al.
1966), was eine entsprechend hohe Anzahl (>100 Embryonen/Empfängertier) an entwicklungskompetenten Kerntransfer-Embryonen voraussetzt. Beim Schwein stellt zudem die Überwindung des 4-Zellblocks in der In-vitro-Kultur eine schwierig zu überwindende Barriere dar (BAVISTER 1988; BAVISTER 1995; YOUNG et al. 1998).
Das Schwein ist eine interessante Spezies für das Klonen durch somatischen Kerntransfer. Hierbei geht es nicht primär um die Erstellung genetisch identischer Individuen zur Verbreitung wertvoller Vererbungsmerkmale aus züchterischem Interesse, sondern aktuell besonders um die Erstellung transgener „Knockout“- Schweine für die Xenotransplantationsforschung (NIEMANN u. KUES 2003).
Mittlerweile liegen genetisch modifizierte (α-1,3-Gal-Knockout) Spenderzellen vor, die bereits erfolgreich zur Erstellung von Knockout-Ferkeln durch Kerntransfer eingesetzt
worden sind (DAI et al. 2002; LAI et al. 2002a; RAMSOONDAR et al. 2003; PHELPS et al. 2003). Am Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Mariensee wurde ein Kerntransferprotokoll zur Erstellung geklonter Schweine etabliert (HÖLKER 2003), mit dem die Produktion geklonter und transgener Schweine gelungen ist (HÖLKER 2003; PETERSEN 2004).
Mit der vorliegenden Arbeit sollten vor allem die geringen Entwicklungsraten verbessert werden, um die Effizienz des somatischen Klonens beim Schwein zu erhöhen, den Kerntransferprozess im Labor von der Übertragung auf die Empfängertiere zu entkoppeln und durch Selektion in der In-vitro-Kultur die Anzahl der zu übertragenden Embryonen zu reduzieren. Beim somatischen Kerntransfer wird in vitro gereiften Schweineoozyten, die sich in der Metaphase II befinden, die DNA entfernt (Enukleation). Im nächsten Schritt wird die Spenderzelle zwischen Oozytenmembran und Zona pellucida abgesetzt (Kerntransfer) und Oozyte und Spenderzelle werden durch einen elektrischen Impuls miteinander fusioniert; dadurch erhält die Oozyte eine neue diploide DNA. Die fusionierten Oozyten-Spenderzell-Komplexe werden danach elektrisch und chemisch aktiviert und entweder zu Untersuchungen des Entwicklungspotentials in vitro kultiviert oder unmittelbar als rekonstruierte Komplexe auf Empfängersauen übertragen.
Da die Arbeitsschritte der Enukleation, des Kerntransfers, der Fusion und Aktivierung im Labor in Mariensee bereits etabliert waren (HÖLKER 2003), lag der Schwerpunkt dieser Arbeit vor allem auf der Verbesserung der In-vitro-Kulturbedingungen. Nach der In-vitro- Kultur sollte eine Selektion entwicklungskompetenter Klonembryonen möglich werden, die im Anschluss an die Kultivierung auf Empfängertiere übertragen werden sollten, um so deren In-vivo-Potential zu überprüfen. Da die Erstellung von Kerntransfer- Embryonen sehr zeit- und arbeitsaufwändig ist, wurden zunächst als Modell mit parthenogenetischen und IVF- Embryonen verschiedene Versuchsansätze auf ihre Durchführbarkeit überprüft. Dies war aber nur in den Fällen möglich, wo sich der Versuchsaufbau nicht auf den speziellen Stoffwechsel geklonter Schweineembryonen bezog. Die darauffolgenden Versuche zur vergleichenden Untersuchung des
Entwicklungspotentials von Schweineembryonen unter verschiedenen Kulturbedingungen wurden mit Kerntransferembryonen, IVF-Embryonen und parthenogenetischen Embryonen durchgeführt, wobei IVF- und parthenogenetische Embryonen zur Kontrolle der Qualität der eingesetzten Oozyten dienten. Die Auswirkungen der veränderten Kulturbedingungen sollten anhand der Parameter Blastozystenrate und -qualität beurteilt werden. Die Blastozystenrate wurde anhand morphologischer Kriterien unter dem Lichtmikroskop sowie anhand von Kernzahlen nach Hoechstfärbung untersucht. Die Qualität der Blastozysten wurde zum Einen anhand der Gesamtzellzahl und zum Anderen anhand des Verhältnisses von Inner-Cell- Mass (ICM)-Zellen zur Gesamtzellzahl nach Differentialfärbung beurteilt. Im letzten Versuchsschritt wurde die In-vivo-Kompetenz der erstellten Klonembryonen untersucht.
Hierzu fanden Embryotransfers verschiedener Entwicklungsstadien auf synchronisierte Empfängersauen statt.
2. Schrifttum
2.1. Physiologische Grundlagen
2.1.1. Oogenese beim Säugetier
Die Gametogenese ist Voraussetzung für die weitere Fortpflanzungsfähigkeit des sich entwickelnden Individuums. Hierzu muss der Chromosomensatz der zukünftigen Keimzellen auf die Hälfte des von normalen somatischen Zellen reduziert werden, da sonst die Verschmelzung von Eizelle und Spermium zu einer Verdopplung der Chromosomenzahl bei jeder neuen Generation führen würde. Dies geschieht durch die Meiose (Reifeteilung), einer besonderen Form der Zellteilung.
Die Entwicklung weiblicher Keimzellen beginnt bereits in der frühen Gravidität. Die Primordialkeimzellen sind die Stammzellen der Geschlechtszellen, die von der Dottersackwand des Embryos über den Dottersackstiel in die Keimleiste einwandern, was hier zur Differenzierung in die Gonadenanlage führt und beim Schwein ungefähr am 18. Tag geschieht (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Die Primordialkeimzellen vermehren sich während dieser Wanderung und separieren sich nach der Teilung, wobei jede Tochterzelle von somatischen Begleitzellen umgeben ist, die sich später zu Follikelzellen differenzieren. Nach einer kurzen Vermehrungsperiode trennen sich die Keimzellen nach der Teilung nicht mehr vollständig, sondern bleiben über Interzellularbrücken miteinander verbunden und bilden so den sogenannten Keimballen.
Von diesem Stadium an, das beim Schwein um den 28. Tag erreicht wird, spricht man von Oogonien (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Die Mitosen der Oogonien sind zahlenmäßig begrenzt und laufen aufgrund der Verbindungen untereinander synchron ab (SCHNORR 1996).
Nach Abschluss der Teilungen treten die Keimzellen in die Prophase I der ersten Reifteteilung (Meiose I) ein und werden nun als primäre Oozyten bezeichnet. Beim Schwein erfolgt dies zwischen dem 40. und 48. Trächtigkeitstag (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Zu dem Zeitpunkt liegt ein Chromosomensatz vor, dessen DNA aufgrund der vorangegangenen DNA- Synthese verdoppelt ist, also tetraploid (4n) (WEHNER u.
GEHRING 1995). In den verschiedenen Stadien der Prophase I (Leptotän, Zygotän, Pachytän, Diplotän) kondensieren die Chromosomen und werden als zwei miteinander verbundene (Doppel-) Chromatiden sichtbar (ALBERTS et al. 1995). Die jeweils homologen Chromosomen der mütterlichen und väterlichen Kopie lagern sich aneinander und tauschen bei dieser Paarung Abschnitte untereinander aus („Crossing over“), was zur genetischen Neukombination führt (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Nach diesem letzten Stadium der Prophase I lösen sich die Interzellularbrücken und die Meiose der primären Oozyten wird in diesem Stadium des Diplotän arretiert (FULKA et al. 1972). Während der weiteren Embryonalentwicklung erfolgt also zwar die Entwicklung der Eizelle und der Follikel, die meiotischen Teilungen im Kern beginnen jedoch erst kurz vor der ersten Ovulation des Tieres.
Die Zahl der somatischen Zellen neben den Oozyten ist zunächst begrenzt. Sie vermehren sich aber nachdem die Oozyten die Prophase I beendet haben und umschließen diese dann, was zur Bildung von Primordialfollikeln führt, die durch Bindegewebszellen separiert werden (64. Tag beim Schwein) (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). Durch das Wachstum des Ovars und die Entstehung der Primordialfollikel wird so die Rinde des Ovars gestaltet, in der die Eizellen als primäre Oozyten über die gesamte fertile Lebenszeit gespeichert werden.
Beim Eintritt in die Pubertät des Tieres kommt es kurz vor der Ovulation unter Einfluss des LH-Peaks zur Wiederaufnahme der ersten Reifeteilung (HUNTER 1966). Der Kern der Eizelle tritt von der Prophase I in die Metaphase I ein, und die Chromosomen ordnen sich als Homologenpaare in der Äquatorialebene an. In der Anaphase I werden die homologen Chromosomen voneinander getrennt. Dadurch erhalten die Tochterzellen jeweils einen zufällig verteilten, haploiden Chromosomensatz, dessen Chromosomen aus zwei Chromatiden bestehen, die DNA liegt also verdoppelt vor (2n).
Als Tochterzellen entstehen einmal die Eizelle als sekundäre Oozyte und der viel kleinere Polkörper (SCHNORR 1996). Jetzt treten die Zellen in die zweite Reifeteilung (Meiose II) ein. In der Prophase II löst sich die Kernmembran auf und eine Spindel entsteht. In dieser Phase verharrt die sekundäre Oozyte, bis es zur Befruchtung durch
ein Spermium kommt. Nach dem Eindringen des Spermiums in die Eizelle erfolgt die Trennung der Chromatiden in der Anaphase II. Dadurch entsteht ein weiterer Polkörper und die Eizelle enthält jetzt (wie auch die Polkörper) einen haploiden Chromosomensatz (1n), der nun den weiblichen Vorkern bildet (RÜSSE u. SINOWATZ 1998) (zum Überblick über die Vorgänge bei der Meiose, siehe Abbildung 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Reifeteilung weiblicher Keimzellen (RÜSSE u.
SINOWATZ 1998)
2.1.2. Vorgänge bei der Befruchtung
Circa 30-45 Minuten nach der Ovulation erreichen die Eizellen den Übergang von der Eileiterampulle zum Isthmus, wo die Befruchtung stattfindet. Auf dem Weg zur Eizelle kommt es im weiblichen Genitaltrakt zu biochemischen Veränderungen am Spermium,
die als Kapazitation bezeichnet werden und bei denen sich unter anderem die Struktur der Plasmamembran ändert, was eine wichtige Voraussetzung für die anschließende Akrosomreaktion ist. Diese wird durch den Kontakt des Spermiums mit der Zona pellucida ausgelöst und bewirkt eine Freisetzung akrosomaler Enzyme, die ein Eindringen in die Zona ermöglichen. Nach dem Durchdringen der Zona pellucida lagert sich das Spermium mit der Längsfläche seines Kopfes parallel zur Eizellmembran an, wobei zunächst nur der postakrosomale Teil des Spermienkopfes in Kontakt mit den Mikrovilli der Eizelle tritt (SINOWATZ 1999). Man geht davon aus, dass das Spermium dabei an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor bindet. Dadurch aktiviert dieser Rezeptor die an ihn gebundene Phospholipase C (PLC), die wiederum Phosphatidylinositolbiphosphat aktiviert (SAUNDERS et al. 2002). Dadurch werden Mechanismen in Gang gesetzt, die zum Einstrom von extrazellulärem Calcium in die Eizelle führen. Auch wird Calcium aus den intrazellulären Speichern des Endoplasmatischen Retikulums freigesetzt (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998). Dieser enorme Anstieg der Ca++-Ionenkonzentration im Zytoplasma läuft in Oszillationen ab, die bis zu 70 Minuten nach dem ersten Kontakt des Spermiums mit der Oozyte anhalten können (PARRINGTON et al. 1996) (Abbildung 2).
Abbildung 2: Intrazelluläre Ca2+-Oszillationen in befruchteten Oozyten bei der Ratte (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998)
Auf diese Weise wird unter anderem durch Ausschüttung der kortikalen Granula der Polyspermieblock ausgelöst (SINOWATZ 1999). Weiterhin wird über calciumabhängige Enzyme und Protein-Tyrosin-Phosphatasen der Zellzyklus aktiviert, was dann die Fortsetzung der zweiten meiotischen Reifeteilung ermöglicht (zum Überblick über die
Vorgänge bei der Befruchtung siehe Abbildung 3). In der Eizelle entstehen dann sowohl ein männlicher als auch ein weiblicher haploider Vorkern.
Abbildung 3: Überblick über den Mechanismus der Spermien-induzierten
Aktivierung bei der Säugetier-Oozyte (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998)
Beide Vorkerne bewegen sich anschließend aufeinander zu und verschmelzen miteinander. Da die DNA beider Vorkerne schon während der Dekondensation verdoppelt wurde, können sich die mütterlichen und väterlichen Chromosomen sogleich in der Äquatorialebene der Teilungsspindel anordnen und in die Prophase der ersten mitotischen Teilung übergehen (SINOWATZ 1999).
2.1.3. Embryonale Entwicklung des Schweins
Die ersten Furchungsteilungen der Zygote beginnen 14-16 h nach der Befruchtung und erfolgen im Eileiter. Wenn der Embryo nach ca. 46 h in den Uterus eintritt, hat er das 4-
bis 8-Zell-Stadium erreicht (HUNTER 1974). Von der Uterushornspitze werden die Embryonen nun durch den gesamten Uterus bis in das gegenüberliegende Horn transportiert. Bereits ab dem Ende des 3. Tages, spätestens jedoch bis zum 5. Tag ist das Stadium der Morula erreicht, wobei sich der Embryo immer noch innerhalb der Zona pellucida befindet. Ab dem 6. Tag bildet sich die Blastozyste, indem sich die Zellen zu Trophectoderm (TE)-Zellen und Zellen der inneren Zellmasse (sog. „Inner- Cell-Mass“= ICM) differenzieren und im Inneren des Embryos das Blastocoel entsteht (Abbildung 4). Der Anteil der Trophectoderm-Zellen ist immer deutlich höher als der der ICM-Zellen (PAPAIOANNOU u. EBERT 1988). Aus den Zellen des Trophectoderm bilden sich später die Fruchthüllen (Amnion- und Chorionepithel), während der Schweinefetus aus den Zellen der ICM hervorgeht; daher werden diese Anteile der Blastozyste auch als Trophoblast und Embryoblast bezeichnet.
Abbildung 4: Überblick zu den Furchungsteilungen beim Säuger (SCHNORR 1996)
Am 7. (6.-8.) Tag schlüpft die Blastozyste aus der Zona pellucida und nimmt an Größe zu, wobei die kugelige Form zunächst beibehalten wird. Um den 9. Tag der Gravidität beginnt die Gastrulation und erst an Tag 12 entsteht durch die Elongation ein länglicher Embryo; um diesen Zeitpunkt herum erfolgt auch die Erkennung der Trächtigkeit durch das Muttertier. Die Blastozysten sind noch maximal bis zum 15. Tag im Uterus frei beweglich und verteilen sich gleichmäßig in beiden Uterushörnern, erst danach ist der Embryo in seiner Lage fixiert und hat ausgeprägten Kontakt zum Uterusepithel (DZIUK 1985). Beim Schwein ist das Vorhandensein einer ausreichend großen Zahl vitaler Embryonen in beiden Hörnern Voraussetzung für die Aufrechterhaltung einer Gravidität (POLGE et al. 1966). Ein wesentlicher Grund hierfür liegt in der für die Erhaltung der Trächtigkeit benötigten Konzentration an Östradiol-17β, das in ausreichender Menge nur von mindestens vier lebensfähigen Embryonen produziert werden kann. Unter dem Einfluss des Östrogens wird die PGF2α-Ausschüttung des Endometriums nicht an das Ovar weitergeleitet, wo es bei einer nicht vorhandenen Trächtigkeit am Tag 14 eine Luteolyse der Gelbkörper herbeiführen würde. Durch die Rückbildung der Gelbkörper wird kein Progesteron mehr produziert, das die Trächtigkeit aufrechterhalten kann, und das Muttertier „rauscht um“, d.h. ein neuer Zyklus beginnt. Die Produktion von Östradiol-17β findet in der Blastozyste vom 10.-16. Tag statt. Innerhalb dieses Zeitraumes beginnt an Tag 12 auch die Implantation des Schweineembryos im Bereich der Uterushörner, bei der sich das Endometrium und der anliegende Trophoblast stark einfalten und auf diese Weise der Trophoblast in das Lumen ragende Endometriumspfropfen kappenartig umhüllt (RÜSSE 1999). Diese sogenannte „enge Apposition“ wird ab dem 14. Tag wieder flacher, die Verbindung zwischen Embryo und Endometrium bleibt jedoch bestehen und verstärkt sich beiderseits durch Ausbildung von Mikrovilli. Noch während der Implantation bilden sich die Amnionfalten um den Embryo und schließen ihn schließlich ein. Weiterhin wächst zur gleichen Zeit die Allantois als kleines Divertikel aus dem Endarm aus und füllt bis zum 25. Tag mit Ausnahme des dorsalen Bereiches fast das gesamte extraembryonale Coelom aus. Um den 12. Tag ist die Keimscheibe der ovoiden Blastozyste von Mesoderm unterlagert, das sich am 14. Tag in ein viszerales und ein parietales Blatt spaltet und dabei das intra- und extraembryonale Coelom entstehen lässt (RÜSSE 1999). Am 16. Tag ist die
Proliferation des Mesoderms bereits weit fortgeschritten, und es hat sich das erste Somitenpaar (als Anlage für die Urwirbel) und das Neuralrohr gebildet. Die weitere Entwicklung des Schweinefetus in der 3. Woche verläuft sehr rasch, die Länge nimmt von 4 mm am 17. Tag auf 16 mm am 24. Tag zu. In diesem Stadium sind die meisten Organsysteme bereits angelegt, so dass von einem frühen Schweinefetus gesprochen werden kann (RÜSSE 1999).
Die Gesamtdauer der Gravidität beträgt beim Schwein 114 Tage; die durchschnittliche Wurfgröße liegt bei 8-12 Ferkeln, wobei zu beachten ist, dass die pränatale Sterblichkeit zwischen 35 und 40% liegt und der höchste Anteil davon noch vor der Implantation beobachtet wird (POPE et al. 1972).
2.1.4. Physiologische Beschaffenheit von Eileiter und Uterus beim Schwein Der Eileiter ist ein enger, häutig- muskulöser Schlauch, der die Aufgabe hat, die ovulierten Eizellen aufzunehmen und sie dem Uterus zuzuleiten (VOLLMERHAUS u.
SCHUMMER 1995). Am Eileiter unterscheidet man sein eierstockseitiges, trichterförmig erweitertes Ende, das Infundibulum tubae uterinae, welches mit seinen Fimbrien innerhalb der Bursa ovarica liegt, und dem Ovar seine Öffnung zuwendet (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Die Bursa ovarica ist eine Art „Tasche“, die aus dem Mesovarium und Mesosalpinx (Aufhängeapparat von Eierstock und Eileiter) gebildet wird, und das Ovar kapuzenartig umhüllt; die weite Öffnung liegt ventral. Das Infundibulum führt in den erweiterten Anfangsteil, die Ampulle; der anschließende engere Isthmus ist viel länger, als es dem Abstand zwischen Eierstock und der Spitze des Uterushorns entspricht. Dieser Teil des Eileiters beschreibt auf dem Weg zahlreiche Windungen, bevor er in das Uterushorn einmündet. Eileiterampulle und Isthmus tubae uterinae weisen zusammen eine Länge von 19-22 cm auf (VOLLMERHAUS u.
SCHUMMER 1995).
Aufgrund der vielen unterschiedlichen Funktionen des Eileiters (Transport und Endreifung sowohl männlicher als auch weiblicher Eizellen, Ernährung und Transport der frühembryonalen Stadien) erfolgen zyklusabhängige Umbauvorgänge, um so optimale Stoffwechselbedingungen für die Embryonen zu schaffen (LIEBICH 1999).
Histologisch besteht die Wand des Eileiters aus Tunica mucosa mit Epithel und Lamina propria, Tunica muscularis, der Tela subserosa und der Tunica serosa (LIEBICH 1999).
Die Schleimhaut übernimmt für die Funktionen des Eileiters eine wichtige Rolle und bildet ein einschichtiges, meist hochprismatisches Epithel, das stellenweise mehrstufig sein kann. Das Epithel besteht aus Flimmerzellen, die zum Teil mit Kinozilien ausgestattet sind, sowie Drüsenzellen, die außer einem schwach sauren Schleim auch Proteine, Elektrolyte, Enzyme, Albumine, Zucker und Aminosäuren sezernieren (LIEBICH 1999). Beide Zellformen unterliegen deutlichen zyklischen Veränderungen, wobei die Drüsenzellen zur Zeit der Brunst die stärksten Sekretionserscheinungen zeigen (IRITANI et al. 1974). Weiterhin haben Untersuchungen ergeben, dass sowohl Oozyten-Eileiter- als auch Eileiter-Oozyten-Interaktionen auftreten und z.B. die De- Novo-Synthese verschiedener Proteine durch die Oviduktzellen veranlassen (BUHI et al. 1997). Da Keimzellen, Zygoten und frühe Teilungsstadien auf die Unterstützung durch Makromoleküle aus dem Eileitersekret angewiesen sind, zeigt das Eileiterepithel in Abhängigkeit vom Zyklusstand zeitlich und räumlich begrenzte, spezifische Gen- und Proteinexpressionsmuster (BUHI et al. 1997).
Wenn auch der Mechanismus noch nicht restlos geklärt ist, so haben doch Beobachtungen gezeigt, dass sich das Infundibulum aktiv am Auffangen der ovulierten Eizelle beteiligt. Gelangen die Eizellen in die entsprechend ausgestaltete, seröse Flüssigkeit enthaltende Bursa ovarica, werden sie durch den Eileitertrichter aufgesaugt;
der Weitertransport zum Uterus hin wird durch peristaltische Kontraktionen der Eileitermuskulatur, unterstützt vom Flimmerstrom des Epithels bewerkstelligt (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995). Der Uterus besteht beim Schwein hauptsächlich aus den dünndarmschlingenähnlich gewundenen, dickwandigen, sehr langen Uterushörnern; der Uteruskörper selbst misst nur etwa 5 cm und nimmt keine Embryonen auf. Das Lumen wird von der Uterusschleimhaut, dem Endometrium, ausgekleidet, das ein unterschiedlich hohes, zur Sekretion befähigtes, einschichtiges und stellenweise auch mehrschichtiges Epithel trägt. Auch hier finden sich Flimmerzellen mit Kinozilien und sezernierende Zellen mit Mikrovilli (LIEBICH 1999).
Die Lamina propria enthält zahlreiche verästelte tubulöse Einzeldrüsen, die im
Anschluss an die Brunst gesteigerte Aktivität zeigen und während der Trächtigkeit die sogenannte „Uterinmilch“ ausscheiden (VOLLMERHAUS u. SCHUMMER 1995).
Über das „innere Milieu“ (pH-Werte, Osmolarität der Sekrete) von Eileiter und Uterus beim Schwein ist nur wenig bekannt. Besonders problematisch ist hierbei, dass invasive und nicht-invasive Messverfahren das Milieu nicht physiologisch wiedergeben. Der pH- Wert innerhalb des Eileiters liegt beim Säugetier zwischen 7,2 (Affe) (MAAS et al. 1977) und 8,0 (Ratte) (BEN-YOSEF et al. 1996). Die Sauerstoffkonzentrationen im Genitaltrakt der Sau sind nicht bekannt, jedoch ist anzunehmen, dass hier ähnlich geringe Sauerstoffspannungen (1,5-8,7% O2) herrschen wie bei anderen Säugetieren, wie z.B. Rhesusaffe, Hamster und Kaninchen (FISCHER u. BAVISTER 1993).
Untersuchungen beim Schwein ergaben unterschiedliche Zusammensetzungen von Uterin- und Oviduktflüssigkeiten (IRITANI et al. 1974) (Tabelle 1), was auch die Tatsache erklärt, dass nur in den Uterus weitertransportierte Schweineembryonen das Potential zur Blastozystenentwicklung aufweisen, da hier im Gegensatz zum Ovidukt das entsprechende Milieu vorhanden ist (MURRAY, JR. et al. 1971).
Schweineembryonen sind zwar generell von ähnlichen Verhältnissen im Eileiter umgeben wie andere Säugetierembryonen, jedoch scheinen sie zu bestimmten Stadien jeweils spezielle Bedürfnisse zu haben, die unter In-vitro-Bedingungen schwierig nachzuvollziehen sind (PETTERS u. WELLS 1993). So wurde zum Beispiel festgestellt, dass die Glucosekonzentration im Eileiter mit ca. 0,59 mmol fast neunfach geringer als die Glucosekonzentration im Blutplasma ist, während die Lactatkonzentration im Eileiter mit ca. 5,71 mmol mehr als doppelt so hoch ist wie die Lactatkonzentration im Blut;
Unterschiede zwischen dem Bereich der Ampulle und dem Isthmus konnten nicht festgestellt werden (NICHOL et al. 1992). Weiterhin enthält Eileiterflüssigkeit neben anderen Wachstumsfaktoren insbesondere Insulin-like Growth Factor (IGF)-I und -II, die je nach Zyklusstand und Umweltbedingungen in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen (WISEMAN et al. 1992) und unter anderem auch von Theca interna- und Granulosa-Zellen sezerniert werden (KOLODZIEJCZYK et al. 2003).
Tabelle 1: Physiologische Zuammensetzung von porziner Eileiter-/Uterinflüssigkeit nach IRITANI et al. (1974) (*) und NICHOL et al. (1992) (**)
Eileiter Uterus
[mg/100 ml]* Östrus Diöstrus Östrus Diöstrus
Natrium* 314,80 - 255,10 -
Chlorid* 381,40 - 417,80 -
Calcium* 10,60 - 12,10 -
Kalium* 48,60 - 61,60 -
Magnesium* 0,60 - 0,70 -
Glutamin* [µmol/ml] 0 0,14 0,21 0,39
Lactat* 26,30 29,80 32,30 38,30 Glucose* 15,80 12,50 27,50 18,40
[mmol/l]**
Lactat** 5,71 - - -
Glucose** 0,59 - - -
2.2. Biotechnologische Grundlagen
2.2.1. In-vitro-Reifung porziner Oozyten
Für die In-vitro-Reifung werden häufig primäre Oozyten aus Ovarien geschlachteter präpubertaler Sauen verwendet, die sich in der arretierten Phase (Diplotän) der Meiose I befinden. Zwar besitzen die Oozyten postpubertaler Sauen eine höhere Entwicklungskompetenz als die präpubertaler Tiere (MARCHAL et al. 2001; HYUN et al.
2003b), jedoch stehen letztere aufgrund des Alters von Schlachtschweinen in ungleich größeren Mengen zur Verfügung. Hierzu werden die 2-8 mm großen Follikel mit einer Nadel punktiert, und dabei die Oozyten mit den sie umgebenden Kumuluszellen (=
Kumulus-Oozyten-Komplexe, KOK) und der Follikelflüssigkeit aspiriert (YOON et al.
2000). Oozyten aus kleineren Follikeln sind zur In-vitro-Reifung ungeeignet, da sie geringere Reifungsraten, Vorkernbildungsraten und Blastozytenraten aufweisen als
Oozyten aus großen Follikeln (Ø >3 mm) (YOON et al. 2000). Nach Selektion der geeigneten KOK (homogenes Zytoplasma der Eizelle, mindestens 2-3 intakte Lagen Kumuluszellen) erfolgt die Inkubation der KOK (meistens ~120) bei 38,5°C und 5% CO2 in Luft (HÖLKER 2003). Als Reifungsmedium hat sich North Carolina State University (NCSU) 37-Medium bewährt (PETTERS u. WELLS 1993; FUNAHASHI et al. 1997;
HÖLKER 2003), dem zunächst hCG, PMSG und zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zugesetzt wird. Nach 22 Stunden erfolgt ein Mediumwechsel in NCSU 37- Medium ohne die o.g. Zusätze für weitere 18 Stunden (HÖLKER 2003); durch die Zugabe von hCG, PMSG und cAMP in den ersten 22 Stunden der Reifung wird eine Synchronisation der Kern- und der zytoplasmatischen Reifung begünstigt (FUNAHASHI u. DAY 1993; FUNAHASHI et al. 1997; FAN et al. 2002). Der Zusatz von cAMP soll dabei die meiotische Arretierung in der Prophase aufrechterhalten; der Transport erfolgt über die Gap junctions zwischen Kumulus- und Eizelle (KUMAR u. GILULA 1996).
Durch einen optimalen cAMP-Spiegel in der Eizelle kann also ihre zytoplasmatische Reifung gewährleistet werden und durch den Entzug von cAMP während der letzten 18 Stunden der Reifung wird bei allen inkubierten Eizellen die meiotische Arretierung aufgehoben, sodass die Metaphase erreicht werden kann (FUNAHASHI et al. 1997;
FAN et al. 2002; SOMFAI et al. 2003). Die Hormonzugabe während der ersten 20 Stunden verbessert die Kumulusexpansion sowie die Bildung eines männlichen Vorkerns nach IVF (FUNAHASHI u. DAY 1993). Dem Reifungsmedium wird häufig außerdem Follikelflüssigkeit vom Schwein zugesetzt, was als Proteinquelle dient und durch seine antioxidative Rolle eine weitere Verbesserung der Reifung von Schweineoozyten bewirken kann (FUNAHASHI et al. 1997; ABEYDEERA et al. 1998;
TATEMOTO et al. 2004). Mithilfe o.g. Maßnahmen konnten Reifungsraten von 90%
erreicht werden. Gereifte Oozyten werden morphologisch anhand des ausgeschleusten Polkörpers sowie der nahegelegenen Metaphase II-Platte bewertet. Die Qualität der in vitro gereiften Schweineeizellen reicht dennoch zwar nicht an die der in vivo gereiften heran, jedoch sind Ferkel nach IVF und anschließendem Embryotransfer (MATTIOLI et al. 1989; KIKUCHI et al. 1999; YOSHIOKA et al. 2002), sowie mittlerweile von mehreren Arbeitsgruppen geklonte Schweine aus in vitro gereiften Oozyten erzeugt
worden (POLEJAEVA et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000; PARK et al. 2001a;
WALKER et al. 2002; HÖLKER 2003).
2.2.2. In-vitro-Entwicklung von Schweineembryonen
Generell zeigen in vitro kultivierte Schweineembryonen nach Embryotransfer ein geringeres Entwicklungspotential als Embryonen, die zuvor aus dem Genitaltrakt gespült wurden, also in vivo produziert wurden (HYTTEL u. NIEMANN 1990). Obwohl nach In-vitro-Fertilisation (IVF) und anschließender Embryokultur bereits Blastozystenraten von bis zu 50% erreicht werden konnten (WANG u. DAY 2002), weisen in vitro entwickelte Embryonen eine schlechtere Qualität auf. Dies zeigt sich häufig sowohl in den geringeren Gesamtkernzahlen sowie im aberranten Verhältnis von ICM- zu TE-Zellen (MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002; KOO et al. 2004).
So liegen die Gesamtzellzahlen in vivo produzierter Schweineblastozysten von Tag 6 z.B. bei ca. 280 Zellen, während bei in vitro produzierten Blastozysten durchschnittlich nur ca. 40-50 Zellen erreicht werden (PAPAIOANNOU u. EBERT 1988; KOO et al.
2004).
Als Basismedien für die In-vitro-Kultivierung porziner Embryonen wurden vor allem Whitten´s Medium (WM) (WHITTEN u. BIGGERS 1968), Beltsville Embryo Culture Medium (BECM-3) (DOBRINSKY et al. 1996), NCSU 23-Medium (PETTERS u. REED 1991) und Porcine Zygote Medium (PZM) (YOSHIOKA et al. 2002) eingesetzt, wobei nur letzteres ein definiertes Medium ist, d.h. anstelle von BSA wurde Polyvinylalkohol (PVA) eingesetzt; BSA erlaubt aufgrund seiner biologischen Herkunft keine vollständige Standardisierung des Mediums (KANE 1983; BAVISTER 1995). Durch die Bestandteile Glucose und Glutamin als Energiequelle wird den Schweineembryonen eine In-vitro- Entwicklung bis zum Blastozystenstadium ermöglicht (PETTERS et al. 1990) (zum Überblick über die Kulturmedien siehe Tabelle 2).
Tabelle 2: Vergleich der Zusammensetzung porziner Kulturmedien WM, BECM-3, NCSU 23, PZM-3 und PZM-4
[mmol/l]
WM (1968)
NCSU-23 (1991)
BECM-3 (1996)
PZM-3 (2002)
PZM-4 (2002)
NaCl 68,49 108,73 94,59 108,00 108,00
KCl 4,78 4,78 6,00 10,00 10,00
CaCl2 - 1,70 1,70 - -
KH2PO4 1,19 1,19 - 0,35 0,35
MgSO4 x 7 H2O 1,19 1,19 1,19 0,40 0,40
NaHCO3 25,07 25,07 25,07 25,07 25,07
Glucose 5,56 5,55 5,56 - -
Glutamin - 1,00 1,00 1,00 1,00
Taurin - 7,00 - - -
Hypotaurin - 5,00 - 5,00 5,00
Na- Lactat 25,20 - 23,00 - -
Na- Pyruvat 0,33 - 0,33 0,20 0,20
Calcium(Lactat)2 -
BME - - 20,00 20,00 20,00
MEM - - 10,00 10,00 10,00
BSA [mg/ml] 4,00 4,00 12,00 3,00 -
PVA [mg/ml] - - - - 3,00
[mOsm] - ~297 ~290 ~288 ~288
Vom Vierzellstadium beginnt beim Schwein die Synthese embryonaler RNA, was bedeutet, dass das embryonale Genom aktiviert wird (MADDOX-HYTTEL et al. 2001).
Dieser tiefgreifende Prozess scheint unter In-vitro-Bedingungen häufig unzureichend abzulaufen, was den sogenannten „Vierzellblock“, einen Entwicklungsstop in vitro kultivierter Schweineembryonen (BAVISTER 1988; BAVISTER 1995) im Vierzellstadium zur Folge hat. Dies kann durch Zugabe der Aminosäuren Taurin und Hypotaurin zum Kulturmedium überwunden werden (PETTERS u. REED 1991), sodass heute durchschnittliche Blastozystenraten von 25-40% erzielt werden können.
2.2.2.1. Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur
Neben dem Medium sind jedoch auch andere Komponenten der Kulturbedingungen für die Embryonalentwicklung entscheidend, insbesondere die umgebende Atmosphäre der Kultur. Bisher wurden unterschiedliche Ergebnisse mit verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen erreicht; man unterscheidet dabei hauptsächlich die Kultivierung unter 5% CO2 in Luft, d.h. ~20% O2, von der Kultivierung in reduzierter Sauerstoffatmosphäre in 5% CO2, 5% O2 und 90% N2. Einige Gruppen berichten von einer verbesserten Entwicklung porziner Embryonen unter verringerter Sauerstoffkonzentration, und zwar sowohl hinsichtlich der Blastozystenrate als auch bezüglich der Kernzahlen (MACHATY et al. 2001; YOSHIOKA et al. 2002; KITAGAWA et al. 2004), andere Autoren fanden nur eine verbesserte Blastozystenqualität (KIKUCHI et al. 2002; IM et al. 2004).
Der Sauerstoffgehalt in der In-vitro-Kultur wurde aufgrund der Erkenntnis, dass im Genitaltrakt der Sau die Sauerstoffspannung niedriger als in der Luft ist, reduziert. Die Sauerstoffkonzentration im Uterus ist noch geringer als im Eileiter (FISCHER u.
BAVISTER 1993). Vermutlich ist diese geringe Sauerstoffkonzentration dafür verantwortlich, dass beim porzinen Embryo, der den Uterus kurz vor dem Stadium der kompaktierten Morula erreicht, eine Umstellung der ATP-Produktion von der oxidativen Phosphorylierung zur Glykolyse erfolgt (KRISHER et al. 2000). Dies wird in der In-vitro- Kultur unter der verminderten Sauerstoffspannung nachvollzogen und unterstützt (MACHATY et al. 2001; IM et al. 2004). Außerdem ist bekannt, dass unphysiologisch hohe Sauerstoffkonzentrationen die Bildung von Sauerstoffradikalen (sogenannte
„reactive oxygen species“, ROS) zur Folge haben, welche wiederum die DNA fragmentieren, sowie Lipide und Proteine oxidativ schädigen können (KITAGAWA et al.
2004). Weiterhin wird angenommen, dass das Redox-Potential früher Entwicklungsstadien beim Schweineembryo hauptsächlich vom NAD+/NADH-Verhältnis abhängt und der geringere Sauerstoffgehalt den embryonalen Metabolismus und dessen Redox-Potential positiv beeinflusst, sodass diese leichter im Gleichgewicht gehalten werden können (MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002).
KIKUCHI et al. (2002) erreichten mit der höheren Sauerstoffkonzentration (20% O2) verbesserte Blastozystenraten; bei anderen Arbeitsgruppen waren hingegen keine signifikanten Unterschiede zwischen 5% und 20% Sauerstoffgehalt in der Kulturatmosphäre erkennbar (MACHATY et al. 1998; BING et al. 2003). Diese Differenzen in den Ergebnissen werden entweder auf die inhomogenen Oozytenquellen zurückgeführt oder mit der individuellen Kompetenz der Embryonen, Sauerstoffradikale zu tolerieren, erklärt.
Die In-vitro-Kulturbedingungen können auch die Genexpression bei Embryonen vom Schwein und anderen Spezies beeinflussen. So untersuchten WRENZYCKI et al.
(2001) die Expression entwicklungsspezifischer Gene bei Rinderembryonen und stellten Unterschiede zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen fest. Allerdings waren diese Unterschiede bei den in vitro produzierten Embryonen, die in „Synthetic Oviduct Fluid“ (SOF) unter 5% Sauerstoff kultiviert wurden, deutlich weniger ausgeprägt, wie die Unterschiede zwischen In-vivo-Embryonen und solchen, die in vitro in „Tissue Culture Medium“ (TCM) unter 20% Sauerstoff kultiviert worden waren. Eine weitere Arbeitsgruppe untersuchte die Länge des vierten Zellzyklus (Übergang vom 8- zum 16-Zeller und den Übertritt von der maternalen zur embryonalen Expression) bei in vitro produzierten Rinderembryonen (LEQUARRE et al. 2003) und stellte fest, dass die Blastozystenrate bei Embryonen mit längerem (~43,5 Stunden) Zellzyklus deutlich niedriger war, als die der Embryonen mit relativ kurzem vierten Zellzyklus (~8,9 Stunden). Ein Anstieg der Sauerstoffkonzentration von 5% auf 20% erhöhte den Anteil der Embryonen mit verlängertem Zellzyklus. Es wird daher vermutet, dass die Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Kultur die Dauer der Umstellung von maternaler zu embryonaler Genexpression beeinflussen kann. Beim Kaninchenembryo wurde unter 5% Sauerstoff in der Kulturatmosphäre eine erhöhte Transkription von
„rabCyP18“-mRNA festgestellt, einem Protein, das vermutlich gegen oxidativen Stress wirkt (SANTOS et al. 2000). Bei in vitro produzierten Schweineembryonen wurde unter 20% Sauerstoffgehalt im Vergleich zu 5% Sauerstoff eine erhöhte Expression von HSC70 festgestellt (BERNARDINI et al. 2004). Dieses Protein gehört einer Stress-
Protein-Familie an, die an den Reaktionen des Embryos gegen oxidativen Stress beteiligt sind.
Eine zusammenfassende Übersicht über vergleichende Untersuchungen zum Entwicklungspotential porziner Embryonen bei 5% und 20% Sauerstoffgehalt in der Kulturatmosphäre zeigt Tabelle 4.
2.2.2.2. Berücksichtigung des Energiestoffwechsels frühembryonaler Stadien während der In-vitro-Kultur
Aufgrund der unterschiedlich langen Passagedauer durch den weiblichen Genitaltrakt und den zu den jeweiligen Zeitpunkten vorhandenen fortgeschrittenen Teilungsstadien sind hinsichtlich des Energiestoffwechsels tierartspezifische Unterschiede zu beachten (zum Überblick siehe Tabelle 3). Einen generellen Überblick über die Lokalisation der jeweiligen Stadien beim Säugetier gibt Abbildung 5.
Tabelle 3: Chronologischer Ablauf der frühen Embryonalentwicklung bei landwirtschaftlichen Nutztieren (nach NIEMANN u. MEINECKE 1993)
Eintritt in den Uterus Spezies Erste
Teilg.
[Std.]
Zweite Teilg.
[Std.] Zeit-
pkt. Stadium
Morula [Tag]
Blasto -zyste
[Tag]
Verlust der Zona
pell.
[Tag]
Implant.
-beginn
[Tag]
Rind 20-24 32-36 72- 84
8-16- Zeller
5/6 7/8 9-11 22
Schaf/
Ziege
16-18 28-30 66- 72
8-16- Zeller
4/5 5/6 7-8 15
Schwein 14-16 20-24 46- 48
4-Zeller 3/4 5 6 13
Pferd 24 30-36 140- 144
Blasto- zyste
6 8 8 37
Schrittum21
20% Sauerstoff.
Autor Herkunft der
Embryonen
Kultur- dauer
Kultur- medium
Sauerstoff- Konzentr.
Teilungs- rate
Blastozysten- rate
Ø-Kernzahl der Blastozysten
5% 97,4% 50,0% 20,0
MACHATY et al.
(1998)
In vivo (Zygoten, 2-Zeller)
4 Tage NCSU 23
20% 97,4% 55,3% 24,1
5% - 75,8% 45,7
MACHATY et al.
(2001)
IVF (Morulastadien)
6 Tage NCSU 23
20% - 63,4% 37,9
5% 76,1% 52,2% 52,1
NCSU 23
20% 76,6% 59,6% 54,9
5% 68,1% 65,9% 92,4
YOSHIOKA et al. (2002)
In vivo (Zygoten)
6 Tage
PZM-3
20% 74,5% 61,7% 77,9
5% 89,4% 49,6% 44,1
BING et al.
(2003)
Parthenogenese 7 Tage NCSU 37
20% 88,2% 45,9% 39,2
5% 77,5% 13,5% 36,7
Parthenogenese 6 Tage NCSU 23
20% 72,8% 12,9% 23,2
5% 71,5% 12,3% 19,4
NCSU 23
20% 70,9% 7,2% 12,2
5% 70,9% 17,8% 21,9
IM et al. (2004)
Kerntransfer 6 Tage
PZM-3
20% 75,1% 18,8% 20,9
Schrittum
unter 5% bzw. 20% Sauerstoff.
Autor Herkunft der
Embryonen
Kultur- dauer
Kultur- medium
Sauerstoff- Konzentr.
Teilungs- rate
Blastozysten- rate
Ø-Kernzahl der Blastozysten
5% 70,6% 36,3% 42,1
KITAGAWA et al. (2004)
IVF 7 Tage NCSU 23
20% 65,6% 22,5% 37,6
8-10% 66,5% 20,0% 43,9
KARJA et al.
(2004)
IVF 6 Tage NCSU 37
20% 61,7% 15,3% 36,4
5% - 84,0% -
BERNARDINI et al. (2004)
In vivo (2-/4-Zeller)
6 Tage BECM-3
20% - 73,0% -
Beim Schweineembryo steigt die Verstoffwechselung von Glucose vom Zygoten- zum Blastozystenstadium stetig an, wobei der Metabolismus bis zum 8-Zellstadium auf einem niedrigen Level stattfindet, im Stadium der kompaktierten Morula aber stark (um das 300fache) erhöht ist (FLOOD u. WIEBOLD 1988). Dies ist mit einem stark erhöhten Energiebedarf zu erklären, der damit einher geht, dass sich ab dem 8-Zellstadium sogenannte „tight junctions“ zwischen den Zellen bilden, was die Differenzierung in ICM- und TE-Zellen beginnen lässt. Auch für die Bildung und Expansion des Blastocoels sind große Energiemengen erforderlich (FLOOD u. WIEBOLD 1988).
Hierbei ist zu beachten, dass bis zum Vierzellstadium der Pentosephosphatweg noch mehr als 5% des Glucosemetabolismus einnimmt, während vom 8-Zell- bis zum Blastozystenstadium nur noch ~1% der Glucose über diesen Weg umgewandelt wird, der größte Anteil der Metabolisierung also über die Glycolyse stattfindet (FLOOD u.
WIEBOLD 1988).
Mehrere Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass der Ersatz von Glucose durch Lactat und Pyruvat bei der In-vitro-Kultur von IVF- (FLOOD u. WIEBOLD 1988; KIKUCHI et al.
2002; YOSHIOKA et al. 2002) und NT-Embryonen (LEE et al. 2003b) einen positiven Effekt auf das Entwicklungspotential haben kann.
Es wird vermutet, dass Glucose, die zwar ein wichtiger Energielieferant während der Blastozystenbildung ist, in der ganz frühembryonalen Phase mit einer Retardierung der Entwicklung verbunden ist (LEE et al. 2003b). Weiterhin wird beim Glucoseabbau, als Nebenprodukt der Glykolyse, Methylglyoxal freigesetzt (ANKRAH u. PPIAH-OPONG 1999), was die Inaktivierung der intrazellulären Glutathion-Peroxidase und daraufhin eine steigende Konzentration freier Sauerstoffradikale zur Folge hat (PARK et al. 2003).
Auf diese indirekte Weise kann die Glucosezugabe in sehr frühen Entwicklungsstadien eine oxidative Belastung für die Genomaktivierung (Beginn im späten Vierzellstadium (MADDOX-HYTTEL et al. 2001) bedeuten, was letztlich zum Vierzellblock führen kann (MEDVEDEV et al. 2004). Die Umwandlung von Methylglyoxal erfolgt durch Glyoxalase I (INOUE et al. 1998), die in so frühen Stadien jedoch erst minimal aktiv ist (MEDVEDEV et al. 2004). Als Begründung für die Verwendung von Pyruvat und Lactat als „Ersatz“-
Energiesubstrate werden die antioxidativen Fähigkeiten von Pyruvat und seine Funktion in der mitochondrialen Atmung, sowie die embryotrophe Rolle von Lactat durch die Erhöhung der Pyruvataufnahme und -verstoffwechselung genannt (LANE u. GARDNER 2000).
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Ovulation, Befruchtung und Furchung beim Säuger (SCHNORR 1996)
In Anlehnung an Milieuveränderungen, die der Embryo bei Übertritt vom Eileiter in den Uterus erfährt (s.o.), wurden zweiphasige Kultursysteme entwickelt. Dabei wird nach 48 bzw. 72 Stunden ein Mediumwechsel durchgeführt. Untersuchungen der Stoffwechselaktivität (Glucose-, Pyruvat-, Lactat-Aufnahme etc.) haben ergeben, dass die Zusammensetzung des In-vitro-Kulturmediums sowohl die Intensität der Substrataufnahme, als auch die Wahl der metabolischen Reaktionswege beeinflussen kann (SWAIN et al. 2001; GANDHI et al. 2001). Der Austausch von Pyruvat und Lactat
gegen Glucose während der ersten 2-3 Tage der In-vitro-Kultur, gefolgt von weiteren 4 Tagen mit Glucose kann die präimplantative Entwicklung porziner IVF-Embryonen verbessern (KIM et al. 2004; MEDVEDEV et al. 2004) und nach Embryotransfer konnten Ferkel produziert werden (KIKUCHI et al. 2002).
2.2.3. Erstellung porziner parthenogenetischer Embryonen und deren Entwicklungspotential in vitro
Parthenogenese ist definiert als Reproduktion ohne genetische Beteiligung einer Spermienzelle. Im Gegensatz zu einigen Amphibien und Fischen kommt die parthenogenetische Entwicklung bei Säugern nicht vor (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Untersuchungen haben ergeben, dass nicht nur ein diploider Chromosomensatz, sondern sowohl ein maternales als auch ein paternales Genom für den ungestörten Ablauf einer Embryonalentwicklung erforderlich ist; diese Erkenntnisse haben zur Entwicklung der sogenannten Imprinting-Theorie geführt (SURANI et al. 1984; BARTON et al. 1984; MONK 1987; NIEMANN u. MEINECKE 1993).
Um eine parthenogenetische Entwicklung artifiziell auszulösen, ist die Aktivierung der Oozyte erforderlich, die normalerweise durch das Spermium induziert wird (s.o.). Bei Säugeroozyten kann eine parthenogenetische Entwicklung durch eine Vielzahl physiologischer und chemischer Stimuli, wie Calciumionophor, elektrischen Impuls, osmotischer Schock, Ethanol oder abrupte Temperaturveränderung sowie auch durch Fusion zweier Eizellen induziert werden (PRATHER et al. 1991; NUSSBAUM u.
PRATHER 1995; WANG et al. 1998; GRUPEN et al. 1999). Hierbei sollte die Abfolge der physiologischen Vorgänge simuliert und eingehalten werden. In der Regel werden hierzu gereifte Oozyten entkumuliert, durch einen elektrischen Impuls aktiviert, dem anschließend noch eine chemische Aktivierung folgen kann (JILEK et al. 2001;
GRUPEN et al. 2002; BING et al. 2003). Weiterhin muss die Ausschleusung des zweiten Polkörpers verhindert werden, damit die Eizelle ihren diploiden Chromosomensatz behält (KAUFMAN u. SACHS 1976). Dies kann durch chemische Substanzen, die die Struktur der Spindel stören, sodass es zwar zur Entstehung von zwei Chromosomensätzen kommt, nicht aber zur Zellteilung (z.B. Cytochalasin B, 6-
Dimethylaminopurin), gewährleistet werden. Auf diese Weise kann auch beim Schwein eine parthenogenetische Entwicklung herbeigeführt werden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KURE-BAYASHI et al. 2000). Derartige Embryonen können sich nach Embryotransfer auf synchronisierte Empfängertiere bis zum 30. Trächtigkeitstag entwickeln, zeigen aber ein deutlich reduziertes Körpergewicht (ZHU et al. 2003) oder schwere Missbildungen und Abnormalitäten und die Trächtigkeit wird abgebrochen (KURE-BAYASHI et al. 2000).
Die Erstellung parthenogenetischer Schweineembryonen kann in Kernstransferversuchen eine wichtige Rolle haben, da auch die durch Kerntransfer erstellten Spenderzell-Oozyten-Komplexe aktiviert werden müssen, um eine geregelte Entwicklung durchlaufen zu können (KOO et al. 2000). Parthenogenetische Embryonen lassen sich mit geringem Arbeits- und Zeitaufwand in großer Anzahl erzeugen, und werden deshalb bei Kerntransferversuchen oft als Kontrollgruppen zur Bewertung Qualität der Oozyten, Kultur- und Aktivierungskonditionen eingesetzt (BETTHAUSER et al. 2000). Daher haben sich in den letzten Jahren viele Arbeitsgruppen mit unterschiedlichen Möglichkeiten zur Optimierung der parthenogenetischen Entwicklung beschäftigt. Da physiologisch bei der Befruchtung die intrazytoplasmatischen Ca2+- Oszillationen eine zentrale Rolle einnehmen (BEN-YOSEF u. SHALGI 1998), führen die meisten Aktivierungsprotokolle zur einer intrazytoplasmatischen Ca2+-Erhöhung, die die Befruchtung durch ein Spermium simulieren soll (zum Überblick über die Entwicklungsraten parthenogenetischer Schweineembryonen siehe HÖLKER (2003)).
Als physikalischer Reiz wirkt ein elektrischer Gleichstrom-Impuls auf die Eizelle, der eine Öffnung von Membranporen in der Eizelle induziert (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982; PRATHER et al. 1989). In Medien mit hohen Ca2+-Konzentrationen ermöglichen diese Poren einen Ca2+-Influx, der die Aktivierung von Oozyten verschiedener Spezies bewirkt (TARKOWSKI et al. 1970; PRATHER et al. 1989). Des weiteren vermutet man, dass durch den elektrischen Impuls aus den intrazellulären Speichern Calcium freigesetzt wird, was zu einer Erhöhung des Calciumspiegels in Schweineoozyten führt (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982; MACHATY et al. 1999). Eine Hitzebehandlung
(KOMAR 1973) kann ebenso wie ein Kälteschock (CHANG 1954; LONGO 1975) artifiziell eine Eizelle aktivieren, nach der eine Entwicklung bis zum Blastozystenstadium möglich ist. Als Erklärung werden im Falle der Temperaturerhöhung Strukturveränderungen der Zellmembran vermutet (WHITTINGHAM 1980), während beim Kälteschock eine Umorganisation der Meiosespindel zur Aggregation der Chromosomen führt, die sich anschließend in einem neuen Kern reorganisieren (LONGO 1974).
Unter chemischen Reizen versteht man den Einsatz von Ca2+-Ionophor A23187, Ethanol oder Thimerosal, die über unterschiedliche Mechanismen eine Aktivierung ermöglichen. A23187 transportiert intrazellulär Ca2+-Ionen über Membrankompartimente in das Zytoplasma und löst so die Ausschleusung kortikaler Granula und des zweiten Polkörpers sowie eine weitere Entwicklung aus (KLINE u.
KLINE 1992; WANG et al. 1998; WANG et al. 1999). Thimerosal mobilisiert die Ausschüttung von intrazellulärem Calcium, indem es an Rezeptoren Sulfhydrylgruppen oxidiert (SWANN 1991). Jedoch kann hierbei die meiotische Spindel zerstört werden, wenn die Wirkung von Thimerosal nicht nach ~10 Minuten von seinem Antagonisten Dithiolthreitol wieder aufgehoben wird (MACHATY et al. 1997; TAO et al. 2000). Ethanol stimuliert als zeitlich begrenzter Medienzusatz die Bildung von Inositol-3-phosphat (IP3), was ebenfalls durch Ca+-Freisetzung aus den Speichern zu einer präimplantativen Entwicklung führt (CUTHBERTSON 1983; NAGAI 1987).
Für biochemische Reize werden Enzyme oder andere Triggersubstanzen verwendet, die über die Aktivierung von Reaktionskaskaden entsprechende Mechanismen in Gang setzen. So stimuliert z.B. die Injektion von Guanosintriphospat (GTP) in Schweineoozyten intrazelluläre G-Proteine, in deren Folge die Phospholipase C (PLC) stimuliert wird, die Synthese von IP3 zu katalysieren (MACHATY et al. 1995).
MACHATY et al. (2000) und SAUNDERS et al. (2002) konnten aus Eberejakulaten den sogenannten „Cytosolic Sperm Factor” (CSF) isolieren. Eine Injektion von CSF in Schweineoozyten führte zu ähnlichen Verhältnissen wie bei einer physiologischen Aktivierung mit einer Induktion der Ca2+-Freisetzung, wiederholten Ca2+-Oszillationen,
Exozytose kortikaler Granula, Wiederaufnahme der Meiose und Bildung von Vorkernen.
Nicht alle biochemischen Substanzen zielen bei der artifiziellen Aktivierung direkt auf die Freisetzung von Calcium ab. Es besteht auch die Möglichkeit, über die Steuerung des Zellzyklus eine Aktivierung zu stimulieren. Die Steuerung des Zellzyklus der Oozyte erfolgt über den „Maturation Promoting Factor“ (MPF), der aus einer Cyclin-abhängigen Kinase (CdK) und dem regulatorischen Cyclin besteht. Nur bei einer kontinuierlichen Produktion von Cyclin ist ein hoher Plasmaspiegel an aktivem MPF gewährleistet.
Dieser erlaubt den Übergang aus der G2-Phase in die mitotische M-Phase; dabei sinkt die MPF-Konzentration, und die Eizelle gelangt in die Interphase (ALBERTS et al.
1995). Proteinsyntheseinhibitoren wie Cycloheximide und Puromycin hemmen die Synthese von Cyclin und führen so zu einem Abfall des MPF-Spiegels. Die Cycloheximide und Puromycin aktivieren zwar Eizellen von Mensch und Maus (SIRACUSA et al. 1978), nicht jedoch solche von Rind und Schwein (NUSSBAUM u.
PRATHER 1995). Ein zusätzlicher elektrischer (NUSSBAUM u. PRATHER 1995;
TANAKA u. KANAGAWA 1997; MARTINEZ DIAZ et al. 2002) oder chemischer (PRESICCE u. YANG 1994) Stimulus zur Erhöhung der intrazytoplasmatischen Ca2+- Konzentration ist jedoch wirksamer als die Aktivierung durch biochemische Reize allein.
Wird die sogenannte „Mitogen-activated-protein“-Kinase (MAPK), die die Fortsetzung der zweiten Reifeteilung steuert (KUBELKA et al. 2002; LE BEUX et al. 2003), gehemmt, werden die Oozyten aktiviert (ITO et al. 2003). Eine Substanz zur Hemmung allgemeiner Proteinkinasen ist z.B. 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP) (FULKA, JR. et al.
1991; JILEK et al. 2001). Außerdem gibt es noch spezielle Inhibitoren der CdK, wie Roscovitine und Butyrolactone, die durch die spezifische Hemmung ebenfalls eine Aktivierung hervorrufen (LE BEUX et al. 2003; BING et al. 2003). Auch hier ergab eine Kombination aus Ca2+-Ionophor und 6-DMAP (ROH u. HWANG 2002; BOQUEST et al.
2002) bzw. Elektrostimulation (GRUPEN et al. 2002; HÖLKER 2003) und 6-DMAP bessere Ergebnisse als die chemische oder elektrische Stimulation allein.
Es ist allerdings anzumerken, dass die Ergebnisse unterschiedlicher Arbeitsgruppen nur bedingt miteinander vergleichbar sind, da diese auch durch die Quelle und Qualität der
Eizellen, der gewählten Aktivierungsmethode und dem In-vitro-Kulturmedium beeinflusst werden. Durch die stetige Verbesserung der Kulturbedingungen können mittlerweile hohe parthenogenetische Blastozystenraten (z.B. 49,6% (Tag 6); 46,0%
und 68,0% (Tag 7)) erreicht werden (NGUYEN et al. 2003; ZHU et al. 2003; BING et al.
2003). Während die Teilungsraten parthenogenetischer Embryonen mit denen von Kerntransfer-Embryonen durchaus vergleichbar sind (~70-90%), liegen die Blastozystenraten parthenogenetischer Embryonen mit ~20-45% deutlich über dem von geklonten Embryonen (KOO et al. 2000; PARK et al. 2001b; ZHU et al. 2002; GRUPEN et al. 2002). Verglichen mit Embryonen, die mittels IVF erstellt wurden, ist die durchschnittliche Kernzahl der Blastozysten bei parthenogenetischen Embryonen geringer (WANG et al. 1998; KOO et al. 2000). Dieser Unterschied beruht vermutlich u.a. auf dem Fehlen des paternalen Genoms (Imprinting-Theorie, s.o.) oder auch dem möglicherweise haploid gebliebenen Chromosomensatz. Daher können parthenogenetische Embryonen zwar in Versuchen eingesetzt, die gewonnenen Erkenntnisse lassen sich jedoch nur in beschränktem Maße auf Kerntransferembryonen bzw. -versuche übertragen.
2.3. Somatisches Klonen beim Schwein
2.3.1. Effizienz des Kerntransfers bei unterschiedlichen Spezies
Bis heute ist das Klonen durch somatischen Kerntransfer bei zehn Säugetierspezies gelungen (WILMUT et al. 1997; WAKAYAMA et al. 1998; CIBELLI et al. 1998; BAGUISI et al. 1999; BETTHAUSER et al. 2000; ONISHI et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000;
CHESNE et al. 2002; SHIN et al. 2003; ZHOU et al. 2003; WOODS et al. 2003; GALLI et al. 2003). Allerdings wird mit 15-20% lebensfähigen Nachkommen pro übertragenem Embryo nur beim Rind eine höhere Entwicklungsrate erreicht. Bei allen anderen Spezies liegt die Geburtenrate zwischen <1-8% (zur Übersicht: Tabelle 5). Die vergleichsweise hohen Erfolgsraten beim Rind werden unter anderem darauf zurückgeführt, dass die In-vitro-Verfahren und -Protokolle intensiver erforscht und damit ausgereifter sind (DINNYES et al. 2002).
Tabelle 5: Erfolgsraten bisher geklonter Spezies (KUES u. NIEMANN 2004)
Spezies Anzahl der Nachkommen/
Anzahl übertragener
Embryonen
Weltweit geschätze
Anzahl lebender Klontiere (circa)
Erstes gelungenes Experiment
Kaninchen <1% 6 CHESNE et al. (2002)
Katze <1% 1 SHIN et al. (2003)
Maultier ~1% 1 WOODS et al. (2003)
Maus <2% ~300 WAKAYAMA et al. (1998)
Pferd ~1% 1 GALLI et al. (2003)
Ratte ~2% 4 ZHOU et al. (2003)
Rind 15-20% ~3000 CIBELLI et al. (1998)
Schaf 5-8% ~400 CAMPBELL et al. (1996)
Schwein <1% ~250 BETTHAUSER et al. (2000);
ONISHI et al. (2000);
POLEJAEVA et al. (2000)
Ziege 3% ~400 BAGUISI et al. (1999)
Im Gegensatz dazu liegen die Entwicklungsraten beim Klonen von Schweinen mit <1%
sehr niedrig. Dies liegt unter anderem an der besonderen Reproduktionsbiologie des Schweins, da zum Zeitpunkt der Erkennung der Gravidität durch das Muttertier (Tag 10- 14) mindestens vier lebensfähige Embryonen vorhanden sein müssen (s. Kap. 2.1.3.).
Während nach Übertragung von durch somatischen Kerntransfer erstellten Embryonen auf Empfängertiere beim Schaf bereits erstmals 1997 die Geburt geklonter Nachkommen berichtet wurde (WILMUT et al. 1997), wurde die Geburt der ersten geklonten Ferkel erst im Jahre 2000 publiziert (POLEJAEVA et al. 2000; BETTHAUSER et al. 2000; ONISHI et al. 2000). Seither wurden die Klon- und Kulturtechniken beim Schwein verbessert, und von verschiedenen Arbeitsgruppen sind wiederholt geklonte, teilweise sogar mehrfach transgene Schweine nach Kerntransfer produziert worden (PARK et al. 2001a; LAI et al. 2002a; HÖLKER 2003; RAMSOONDAR et al. 2003;
PHELPS et al. 2003; PETERSEN 2004). Auch von kommerzieller Seite (InfigenINC) gibt es Bemühungen, die Effizienz des Klonens beim Schwein zu erhöhen. In Abhängigkeit von der Art der Kernspenderzellen ergaben sich folgende initiale Trächtigkeits- und Abferkelraten: Single-Allel-k.o. Miniaturschwein: 14% und 7%, Doppel-Allel-k.o.
Miniaturschwein: 17% und 7%, adulte Zellen Hausschwein: 67% und 60% sowie fetale Zellen Hausschwein: 20% und 20% (FORSBERG 2005).
2.3.2. Einflussfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers und die anschließende Entwicklung des Embryos
2.3.2.1. Zyklusstand der Oozyte und Art der Spenderzelle
Das Zytoplasma der Empfängeroozyte ist entscheidend für das „Nuclear Reprogramming“ (hierzu siehe auch Kap. 2.3.2.3.) des übertragenen Zellkerns, wobei der Zellzyklus von Empfänger- und Spenderzelle soweit synchronisiert sein sollten, dass DNA-Schäden vermieden werden (HU et al. 2003). Um Zytofragmentationen durch Chromosomenabnormalitäten oder Polyploidien nach Kerntransfer zu vermeiden, ist außerdem die vollständige Entfernung der gesamten Oozyten-DNA erforderlich (LIU et al. 2002). Dies erfolgt nach Erreichen des Metaphase II-Stadiums, in welchem die Oozyte bereits einen Polkörper ausgeschleust hat, und die Metaphasenplatte in dieser Phase solange verharrt, bis ein Spermium die Fortsetzung der zweiten Reifteteilung induziert (RÜSSE u. SINOWATZ 1998). In diesem Stadium ist das Zytoplasma der Oozyte in der Lage, diploide Spenderzellkerne in der G1/G0-Phase noch vor der ersten Furchungsteilung zur DNA-Replikation anzuregen (CAMPBELL et al. 1993). Wird bei der Aktivierung des Komplexes eine Ausschleusung der vermeintlich diploiden DNA als Polkörper verhindert, kann eine Normoploidie bei Kerntransferkomplexen aufrechterhalten werden.
Als Spenderzellen können unterschiedliche Zelltypen fungieren, wobei zwischen embryonalen (Blastomeren, ICM-Zellen) und fetalen/adulten somatischen Zellen (z.B.
Kumuluszellen) unterschieden werden muss (MIYOSHI et al. 2000; UHM et al. 2000).
Beim Klonen mit somatischen Zellen werden an den Ablauf des „Nuclear Reprogramming“ erhöhte Anforderungen gestellt. Aufgrund ihrer einfachen Gewinnung
und Verfügbarkeit und der Möglichkeit der Kryokonservierung werden besonders adulte und fetale Fibroblasten im Kerntransfer eingesetzt, wobei letztere meist mit einer höheren embryonalen Entwicklungsrate verbunden sind (WILMUT et al. 1997; KATO et al. 2000; LUCAS-HAHN et al. 2002; LEE et al. 2003a). Um beim Kerntransfer einen Oozyten-Fibroblasten-Komplex zu erhalten, der einen diploiden Chromosomensatz enthält, muss sich die Spenderzelle im G0-/G1-Stadium befinden. Zum Überblick über die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus siehe (HÖLKER 2003). Der Zellzyklus kann mittels Kontaktinhibition, Serumreduktion oder chemische Substanzen (z.B.
Mimosin) synchronisiert werden (KUES et al. 2002; VACKOVA et al. 2003).
Untersuchungen haben ergeben, dass kleinere Fibroblasten zu einem höheren Anteil in der G1-/G0-Phase sind als die größeren Fibroblasten (BOQUEST et al. 1999; TAO et al. 1999).
2.3.2.2. Kerntransferverfahren
Wenn der somatische Kerntransfer nach der „klassischen“ Methode, d.h. mit Einsatz von Mikromanipulatoren durchgeführt wird, werden der gereiften Oozyte mittels einer spitzen Enukleationspipette sowohl der erste Polkörper als auch die DNA in Form der Metaphase II-Platte entfernt (zum Überblick: PRATHER et al. (1999)). Hierbei kommt es immer auch zu einem unterschiedlich großen Verlust von Ooplasma, der nach Möglichkeit so gering wie möglich sein sollte. Neben maternaler mRNA, die während der Oozytenreifung gebildet und gespeichert worden ist (MADDOX-HYTTEL et al.
2005), enthält das Zytoplasma der Eizelle außerdem noch maternale Proteine, die während der initialen Zellteilungen die Spindel bilden; eine Entfernung dieser Bausteine bei der Enukleation könnte mit ein Grund für die Ineffizienz des Kerntransfers sein (GURDON et al. 2003). Während der Enukleation kann es zur Schädigung der Oozyte durch UV-Licht kommen, wenn die Oozyte dieser Strahlung nach Hoechstfärbung zur Enukleationskontrolle kurzfristig ausgesetzt werden. Weitere Belastungen für die Oozyte entstehen durch die Injektion des Karyoplasten in den perivitellinen Raum, den ersten elektrischen Impuls zur Fusion und letztendlich durch den zweiten Impuls zur Aktivierung der fusionierten Komplexe (Abbildung 6).
