Botulismus bei Großkatzen

(1)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Botulismus bei Großkatzen –

Serologischer und molekularbiologischer Nachweis von C. botulinum und Botulinum-Neurotoxinen bei

Zoo- und Wildtieren

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Sibylle Garbe geb. Reinmuth Hamburg

Hannover 2018

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Michael Böer, Zoodirektor Zoo Osnabrück

Prof. Dr. med. vet. Dr. sc. agr. habil. Helge Böhnel PD Dr. med. vet. Frank Gessler

Institut für angewandte Biotechnologie der

Tropen e. V., Georg-August-Universität Göttingen

1.Gutachter: Prof. Dr. Michael Böer

2.Gutachter: Prof. Dr. Klaus Eulenberger

Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2018

In Zusammenarbeit mit dem Institut für angewandte Biotechnologie der Tropen e. V.

an der Georg-August-Universität Göttingen

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meiner Familie

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Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden auf folgender Tagung vorgestellt:

Tagung der Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“ der Deutschen Veteri

närmedizinischen Gesellschaft e. V. (DVG) - Vortrag 25.–27. Juni 2008, Braunschweig

S. REINMUTH, M. I. BÖER, H. BÖHNEL, F. GESSLER

Diagnose von Botulismus in der Zootiermedizin

(5)

v

Inhaltsverzeichnis

I Einleitung 1

II Literaturübersicht 3

1 Botulismus ... 3

1.1 Vorkommen ... 3

1.2 Pathogenese ... 20

1.2.1 Intoxikation ... 20

1.2.2 Infektion und Toxikoinfektion ... 21

1.3 Klinik ... 21

1.4 Diagnose ... 22

1.5 Therapie ... 24

1.6 Prophylaxe und Management ... 25

1.7 Immunität ... 25

2 Der Erreger ... 27

2.1 Taxonomie ... 27

2.2 Morphologie und Stoffwechselleistungen ... 29

2.3 Toxine ... 30

2.3.1 Botulinum-Neurotoxine (BoNTe) ... 30

2.3.2 Weitere Toxine ... 33

2.3.2.1 C2-Toxin ... 33

2.3.2.2 C3-Toxin ... 34

2.3.2.3 Clostridiolysin S ... 35

2.4 Nachweismethoden ... 35

2.4.1 Mäuse-Bioassay ... 35

2.4.2 Kulturelle Methoden ... 36

2.4.3 Immunchemische Methoden ... 37

2.4.4 Molekularbiologische Methoden ... 38

2.4.5 Endopeptidase-Assay ... 39

(6)

vi

III Testentwicklung: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

(ELISA) 41

1 Material und Methoden ... 41

1.1 Verwendete Antigene ... 41

1.2 Herstellung von Kulturüberstand ... 42

1.3 Herkunft und Aufbereitung der Seren ... 43

1.4 Auswahl der Mikrotiterplatten, Antigen- und Serumverdünnungen ... 44

1.5 Auswahl der Blockierungs-, Wasch- und Verdünnungspuffer ... 44

1.6 Vergleich verschiedener Antigenarten, Neurotoxin-Typen und Übertragbarkeit auf die relevanten Tierarten ... 46

1.7 Auswertung ... 46

1.8 Validierung ... 46

1.8.1 Messbereich ... 47

1.8.2 Reproduzierbarkeit ... 47

1.8.3 Kreuzreaktivität ... 47

1.8.4 Cut-off ... 47

1.8.5 Validierung an einem anderen Testsystem ... 48

2 Ergebnisse ... 49

2.1 Auswahl der Mikrotiterplatten, Antigen- und Serumverdünnungen ... 49

2.2 Auswahl der Blockierungs-, Wasch- und Verdünnungspuffer ... 50

2.3 Vergleich verschiedener Antigenarten, Neurotoxin-Typen und Übertragbarkeit auf die relevanten Tierarten ... 52

2.4 Optimiertes ELISA-Protokoll ... 53

2.5.3 Kreuzreaktivität ... 57

2.5.4 Cut-off ... 58

2.5.5 Validierung an einem anderen Testsystem ... 58

3 Diskussion ... 61

(7)

vii

IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain

Reaction (qPCR) 69

1.1 Herkunft der Bakterienstämme ... 70

1.2 Anzucht der Kulturen ... 72

1.3 Die Real-Time-PCR bei Kulturen ... 73

1.3.1 Vergleich der Extraktionsmethoden ... 73

1.3.2 Entwicklung des qPCR-Protokolls ... 74

1.3.2.1 Herstellung eines Agarosegels ... 76

1.3.2.2 Einstellen von Annealing-Temperatur und MgCl2- Konzentration ... 76

1.3.2.3 Primer und Sonden aus der Literatur ... 76

1.3.2.4 Primer- und Sondendesign ... 77

1.4 Die Real-Time-PCR bei verschiedenen Probenarten ... 79

1.4.1 Probenmaterial ... 79

1.4.2 Extraktion aus Boden-, Kot- und Fleischproben ... 80

1.4.2.1 Waschschritte vor der Extraktion, Limitierung der Probenmenge, Reduzierung der Templatemenge und Verdünnung des Templates ... 80

1.4.2.2 Vergleich der Extraktionsmethoden ... 81

1.4.3 Anpassung des qPCR-Protokolls an Extrakte aus Boden- und Kotproben ... 82

1.4.3.1 Zusatz von BSA 10 % ... 82

1.4.3.2 Einstellen der MgCl2-Konzentration ... 82

1.4.4 Übertragbarkeit auf die Zielprobenarten ... 83

1.4.4.1 Extraktion aus Großkatzenkot ... 83

1.4.4.2 Homogenisierung verschiedener Probensubstrate .... 83

1.4.4.3 Inkubation über Nacht ... 84

1.6.1 Kreuzreaktivität der Primer und Sonden ... 85

1.6.2 Nachweisgrenze ... 85

(8)

viii

2 Ergebnisse ... 87

2.1 Die Real-Time-PCR bei Kulturen ... 87

2.1.1 Vergleich der Extraktionsmethoden ... 87

2.1.2 Entwicklung des qPCR-Protokolls ... 89

2.1.2.1 Einstellen von Annealing-Temperatur und MgCl2- Konzentration ... 89

2.1.2.2 Primer und Sonden aus der Literatur ... 91

2.1.2.3 Primer- und Sondendesign ... 91

2.2 Die Real-Time-PCR bei verschiedenen Probenarten ... 92

2.2.1.1 Waschschritte vor der Extraktion, Limitierung der Probenmenge, Reduzierung der Templatemenge und Verdünnung des Templates ... 94

2.2.1.2 Vergleich der Extraktionsmethoden ... 94

2.2.2 Anpassung des qPCR-Protokolls an Extrakte aus Boden- und Kotproben ... 97

2.2.2.1 Zusatz von BSA 10 % ... 97

2.2.2.2 Einstellen der MgCl2-Konzentration ... 98

2.2.3 Übertragbarkeit auf die Zielprobenarten ... 100

2.2.3.1 Extraktion aus Großkatzenkot ... 100

2.2.3.2 Homogenisierung verschiedener Probensubstrate . . 101 2.2.3.3 Inkubation über Nacht ... 105

2.3 Optimiertes Protokoll für die Real-Time-PCR ... 106

2.3.1 Extraktion aus Kulturen ... 106

2.4.1 Kreuzreaktivität der Primer und Sonden ... 108

2.4.2 Nachweisgrenze ... 108

3 Diskussion ... 111

V Fallbeispiel Serengetipark 119

1 Serologische Untersuchungen (ELISA) ... 119

1.1 Material und Methoden ... 119

1.1.1 Situation des Tierbestandes im Serengetipark Hodenhagen bezüglich C. botulinum ... 119

(9)

ix

1.1.2 Art der Probanden ... 119

1.1.3 Haltung der Probanden ... 120

1.1.4 Impfstoffe und Impfung ... 120

1.1.5 Impf- und Blutentnahmeplan ... 121

1.1.6 Immobilisation ... 121

1.1.7 Blutentnahme, -aufbereitung und Untersuchung ... 121

1.1.8 Auswertung ... 121

1.2 Ergebnisse ... 122

1.3 Diskussion ... 128

2 Molekulargenetische Untersuchungen (qPCR) ... 135

2.1 Material und Methoden ... 135

2.1.1 Probennahme ... 135

2.1.2 Untersuchung und Auswertung der Umweltproben ... 137

2.1.3 Extraktion aus anderen Proben ... 137

2.2 Ergebnisse ... 138

2.3 Diskussion ... 138

VI Untersuchungen an weiteren Proben und Tierarten (mittels ELISA) 145

1.1 Herkunft der Seren ... 145

1.2 Blutentnahme und -aufbereitung ... 145

1.3 Anpassung des ELISA an Schweine ... 145

1.3.1 Protein A oder G ... 145

1.3.2 Impfversuch ... 146

1.3.3 Kontrollen im Vergleich ... 146

1.3.4 Screening der Hausschweinproben ... 146

1.4 Screening der Zoo- und Wildtierarten ... 146

2 Ergebnisse ... 147

2.1 Anpassung des ELISA an Schweine ... 147

2.1.1 Protein A oder G ... 147

2.1.2 Impfversuch ... 148

2.1.3 Kontrollen im Vergleich ... 150

(10)

x

2.1.4 Screening der Hausschweinproben ... 151

2.2 Screening der Zoo- und Wildtierseren ... 152

2.2.1 Primaten ... 153

2.2.2 Herbivoren ... 154

2.2.3 Carnivoren ... 155

2.2.3.1 Löwen ... 155

2.2.3.2 Tiger, Bären, Hauskatze ... 156

2.2.3.3 Leoparden und Canidae ... 160

2.2.4 Wildschweine ... 163

3 Diskussion ... 165

VII Zusammenführende Diskussion 173 VIII Schlussfolgerung 179 IX Zusammenfassung 183 X Summary 185 XI Literaturverzeichnis 187 XII Anhang 235

1 Ergänzungen zum Text ... 235

1.1 ad Testentwicklung ELISA ... 235

1.1.1 Ausgangsprotokoll des ELISA ... 235

1.1.2 Validierung: Ausführliche Cut-off-Werte ... 236

1.2 ad Testentwicklung qPCR ... 237

1.2.1 Vorversuche zur Extraktion aus Kot- und Bodenproben ... 237

1.2.2 Versuche ohne Auswirkungen auf das Protokoll ... 241

1.2.2.1 ad Die Real-Time-PCR bei Kulturen ... 241

1.2.2.2 ad Die Real-Time-PCR bei verschiedenen Probenarten ... 243

1.2.3 Primer- und Sondensequenzen ... 246

1.2.4 Ausführliche Ergebnisse der Primer- und Sondensets ... 248

1.2.5 ad Vergleich der Extraktionsmethoden bei Kulturen ... 249

1.2.6 ad Einstellen der MgCl2-Konzentration bei Kot- und Bodenproben ... 250

(11)

xi

1.2.7 Auswertung einer qPCR ... 251

1.3 ad Fallbeispiel Serengetipark ... 253

1.3.1 ad Art der Probanden ... 253

1.3.2 ad Impf- und Blutentnahmeplan ... 254

1.3.3 Hellabrunner Mischung ... 255

1.4 ad Untersuchungen an weiteren Proben und Tierarten ... 256

1.4.1 ad Anpassung des ELISA an Schweinebestände ... 256

1.4.2 ad Screening der Zoo- und Wildtierseren ... 260

2 Medien, Puffer und Lösungen ... 269

3 Geräte ... 272

XIII Danksagung 273

(12)

xii

Abkürzungsverzeichnis

ADP Adenosindiphosphat

Ag, Ag[K] Antigen, Antigenkonzentration

Ak Antikörper

BoNT Botulinum-Neurotoxin

BP Blutprobe

BSA bovine serum albumin, Rinderalbumin

C. botulinum Clostridium botulinum

CDC Centers for Disease Control and Prevention, USA CFU colony forming unit, koloniebildende Einheit Ct cycle threshold; Schwellenwert der Zyklenzahl DNA Desoxyribonucleic acid; Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat

EKH Europäisch Kurzhaar, Hauskatze ELISA enzyme-linked immunosorbent assay et al. et alii / et aliae; und andere

FAM 6-Carboxyfluorescein

FP Fastprep^®-24 Instrument

H2O dest. Aqua destillata; destilliertes Wasser

h hour; Stunde

HA Hämagglutinin

HC heavy chain; schwere Kette

IgA / IgG Immunglobulin A / Immunglobulin G

i.p. intraperitoneal

KCl Kaliumchlorid

kD Kilodalton

LC light chain; leichte Kette

LD letale Dosis

LD50 50 % letale Dosis

LOD limit of detection; Nachweisgrenze

MLD minimum lethal dose; minimale letale Dosis

MgCl2 Magnesiumchlorid

mM Millimolar

MW arithmetischer Mittelwert n.a. not available; nicht verfügbar

NTNH nicht-toxisches, nicht-hämagglutinierendes Protein

OD optische Dichte

(13)

xiii

PBS phosphate buffered saline; Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR polymerase chain reaction; Polymerase-Kettenreaktion

pH potentia hydrogenii

qPCR quantitative Real-Time-PCR RT-PCR Reverse-Transkriptions-PCR

s seconds; Sekunden

SD standard deviation; Standardabweichung

SNARE Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor

SP Serengetipark Hodenhagen

SPF spezifisch Pathogen-frei

SV Serumverdünnung

TAMRA Tetramethylrhodamine

TE Tris-EDTA

TMB 3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidin

v. a. vor allem

Vr (%) Variationskoeffizient (%) Wasser bidest. zweifach destilliertes Wasser 1,0 Tier männlichen Geschlechts 0,1 Tier weiblichen Geschlechts 0,0,1 Tier unbestimmten Geschlechts

+ + + stark positiv

+ + mittelgradig positiv

+ schwach positiv

(14)

(15)

1

I Einleitung

Berichte über Botulismus bei Zoo- und Wildtieren sind mit Ausnahme von Botulismus bei Vögeln und wirtschaftlich genutzten Tierarten nur spärlich vorhanden. Wegen des schwierigen Nachweises können Intoxikationen übersehen werden (LEWIS et. al., 1990; FOWLER, 2006).

In Fällen, wo Botulismus dennoch nachgewiesen wird, wird oft empfohlen, eine hö

here Inzidenz anzunehmen und Botulismus als Differentialdiagnose häufiger in Be

tracht zu ziehen. Möglicherweise würde C. botulinum dann viel häufiger als Causa bei

„ungeklärten“ Todesfällen im Zoo- und Wildtierbereich nachgewiesen werden, insbe

sondere wenn die Pathologie keine Aufklärung bringt (SMITH et al.,1985; LEWIS et al., 1990; LAUCKNER, 1985; WAGNER u. MANN, 1978; FOWLER, 2006).

Der Nachweis von Botulismus bei einem Löwen und zwei Tigern in einem norddeut

schen zoologischen Garten wurde zum Anlass genommen, die notwendigen Metho

den für praxistaugliche Untersuchungen im Zoo- und Wildtierbereich zu entwickeln und an einem Fallbeispiel zu überprüfen. Der kostenintensive und ethisch problema

tische Mäuse-Bioassay ist für umfangreiche Untersuchungen nur bedingt geeignet.

Als Alternative wurden ein tierartunabhängiger Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und eine quantitative Real-Time-PCR (qPCR) entwickelt.

Serologische Untersuchungen werden im Wildtierbereich als Indiz für die Exposition gegenüber einer bestimmten Krankheit benutzt (WOBESER, 1994). Trotz ihrer weiten Verbreitung handelt es sich bei den meisten Tests um nicht für die Wildtierarten ent

wickelte und validierte Methoden. Die Ergebnisse müssen entsprechend mit Vorsicht interpretiert werden (GARDNER et al., 1996; MURRAY et al., 1999).

Ein Problem bei ELISA-Untersuchungen im Zoo- und Wildtierbereich besteht häu

fig darin, dass es fast unmöglich ist, für jede Spezies spezifische Anti-Antikörper zu entwickeln. Basierend auf den Arbeiten von STÖBEL, SCHÖNBERG und STAAK (2002) wurde ein tierartunabhängiger ELISA für Antikörper gegen die Toxintypen A–D entwi

ckelt. Probanden der Tierarten Löwe (Panthera leo), Tiger (Panthera tigris tigris) und Leopard (Panthera pardus orientalis) wurden geimpft und ihr serologischer Status über einen Zeitraum von 14 Monaten verfolgt. Durch den Einsatz bei weiteren Tierar

ten – zuerst stellvertretend bei Wiederkäuern und Schweinen wegen der Verfügbar

keit von Seren mit bekanntem serologischen Status, dann bei möglichst vielen ver

schiedenen Zootierseren – sollte weiterhin festgestellt werden, ob die Methode das beabsichtige Potential besitzt, tierartübergreifend eingesetzt zu werden.

(16)

2 | I Einleitung

Für die Aufarbeitung epidemiologischer Zusammenhänge aus verschiedenen Blick

winkeln heraus wurde ergänzend eine quantitative Real-Time-PCR zum Nachweis des Toxingens und damit des Erregers entwickelt. Die Methode sollte in der Lage sein, Umweltproben verschiedenster Art untersuchen zu können und wurde stellver

tretend anhand von Bodenproben, Kot verschiedener Tierarten und Fleischproben erarbeitet und im konkreten Fallbeispiel eingesetzt.

Die Entwicklung der Methoden, ihr Einsatz im Fallbeispiel und schließlich bei weite

ren Tierarten werden der besseren Übersicht wegen zuerst gesondert betrachtet und am Ende zusammenführend diskutiert.

(17)

3

II Literaturübersicht 1 Botulismus

Botulismus entsteht durch die neurotropen Toxine von C. botulinum. Sie verursachen charakteristische Lähmungserscheinungen. Der Oberamtsarzt und Dichter JUSTINUS

KERNER beschrieb die seit über 1 000 Jahren bekannte Krankheit zwischen 1820 und 1822. Er wies nach, dass die verursachende Substanz in Würsten gebildet wird: Das führte zur Bezeichnung „Botulismus“ (Wurstvergiftung, lat. botulus = Wurst, Darm).

Der Erreger konnte 1897 erstmalig von VAN ERMENGEN isoliert werden (KERNER, 1820;

VAN ERMENGEN,1897; ROLLE u. MAYR, 1993).

1.1 Vorkommen

Die Erkrankung hat seit ihrer Erstbeschreibung einen Wandel erfahren: Zuerst primär als Einzelerkrankung beschrieben, gewinnt die Intoxikation zunehmend an Bedeu

tung durch seuchenhaft anmutende Verläufe in modernen Tierbeständen. Moderne Futterwerbungs- und Düngemethoden sowie Haltungssysteme fördern die Kontami

nation und den Eintrag in Futter, Stall und Weideflächen. Intoxikationen von mehre

ren Tieren, oft bis zu 50–100 % eines Bestandes, können die Folge sein (BÖHNEL, 1999; BÖHNEL u. GESSLER, 2010). Als Lebensmittelvergiftung bleibt Botulismus prä

sent. Vorwiegend mit traditionell zu Hause hergestelltem Essen assoziiert, bergen auch moderne zeitsparende Zubereitungsmethoden oder Lagerungsverfahren wie z. B. Vakuumverpackungen Risiken. Nicht zuletzt steht C. botulinum zur Zeit im Mittel

punkt als Kategorie A-Agens mit bioterroristischem Potential (KALB et al., 2015;

LECLAIR et al., 2013; JAIN et al., 2011; IIJIMA et al. 2014).

Botulismus rückt in Mitteleuropa in den letzten Jahren durch teils spektakuläre Ausbrüche bei Tieren erst langsam wieder ins Blickfeld von Tierärzten und Veteri

närämtern und hat aus Sicht der betroffenen praktizierenden Tierärzte ein nicht mehr akzeptables Level erreicht (BÖHNEL u. GESSLER, 2005). Botulismus wird inzwischen als „emerging disease“ klassifiziert. Fehlende Melde- und Anzeigepflicht bei Tieren sowie ein mangelhaftes Bewusstsein für die Problematik führen dazu, dass die Häu

figkeit des Auftretens unterschätzt und die Diagnose zu selten gestellt wird. Eine wei

tere Sensibilisierung von Tierärzten und Behörden ist nötig, um diesem entgegen zu wirken und Bekämpfungsstrategien weiter zu entwickeln (SKARIN et al., 2013;

ANNIBALLI et al., 2013 b).

Im Bereich der Zoo- und Wildtiermedizin werden seit langem v. a. Massenausbrü

che bei Wassergeflügel beschrieben (SAKAGUCHI,1979; HANNETT et al., 2011). Bei ei

nigen Tierarten ist Botulismus eine bekannte Krankheit, bei anderen sind v. a. einzel

(18)

4 | II Literaturübersicht

ne Fallberichte veröffentlicht worden. Carnivoren, insbesondere Aasfresser, werden häufig als besonders resistent beschrieben (OHISHI et al., 1979; KRIEK u. ODENDAAL, 1994). Dennoch wird auch bei diesen Tierarten von verschiedenen Erkrankungsfällen berichtet. Insgesamt vermuten verschiedene Autoren, dass die Inzidenz von Botulis

mus in zoologischen Beständen wahrscheinlich höher ist, als sie durch Fallberichte widergespiegelt wird (SMITH et al.,1985; LEWIS et al., 1990; WAGNER u. MANN, 1978).

GREENWOOD (1985) berichtet, dass milde Ataxien bei Löwen ziemlich oft von Dompteuren und Zootierärzten beobachtet werden und dann wahrscheinlich fehldia

gnostiziert werden. Unerkannte Botulismus-Fälle bei nicht domestizierten Carnivoren wären möglicherweise ziemlich häufig insbesondere unter unhygienischen Bedingun

gen. LINDSTRÖM et al. (2004) berichten, dass weniger schwer erkrankte Füchse häu

fig in einer sitzenden Position beobachtet werden. Solch eine Haltung werde gele

gentlich bei gesunden Füchsen gesehen und könnte ein Hinweis auf eine leichte Form von Typ-C-Botulismus sein.

Bei frei lebenden Carnivoren ist nur wenig bekannt über die Rolle der meisten Pa

thogene in der Populationsdynamik (MURRAY et al., 1999). Erkrankte oder an Krank

heiten verstorbene wilde Tiere werden selten aufgefunden. Das gilt insbesondere für große Carnivoren mit ihrer geringen Populationsdichte und versteckten Lebensweise.

Dennoch wäre es laut der Autoren naiv anzunehmen, dass solche Krankheiten keine Rolle in der Population spielen.

C. botulinum ist ein klassischer Bodenseuchenerreger. Zahlreiche extrazelluläre En

zyme befähigen ihn zur Zersetzung von verrottendem oder verwesendem Gewebe und zu einer saprophytischen, terrestrischen oder aquatischen Lebensweise. Seine Neurotoxine ermöglichen ihm teilweise selber zur Schaffung einer geeigneten Nähr

stoffgrundlage beizutragen. Zufällig kontaminierte Kadaver bieten Raum zu massiver Vermehrung. Unter geeigneten Umständen kommt es zur Toxinbildung und über Auf

nahme durch empfängliche Wirte schließlich zur klassischen oralen Intoxikation.

Durch serologische Untersuchungsmethoden lassen sich verschiedene Typen unter

scheiden. Die Typen A, B, E, F und G sind Bodenbakterien. Die Typen C und D sind offenbar primär an den Darm von Säugetieren und Vögeln gebunden, wurden aber auch im Meeresschlick und in Meerestieren gefunden. Auch hier erfolgt jedoch keine Übertragung direkt von Tier zu Tier, sondern nur über den Umweg über beispielswei

se Bodensubstrat. Es gibt Hinweise darauf, dass C. botulinum Typ E evtl. ein echt aquatisch lebender Organismus ist. (RADOSTITS et al., 1994; BÖHNEL, 1995; SEBAIHIA

et al., 2007; HUSS, 1980).

Unter ungünstigen Umweltbedingungen bildet das Bakterium Sporen. Diese kön

nen z. B. durch Aufnahme von Vögeln und wandernden Tieren weit verbreitet wer

den. Es wurde bisher davon ausgegangen, dass bestimmte Typen nur regionale Be

(19)

1 Botulismus | 5 deutung haben. Internationaler Reise- und Warenverkehr, Zugvögelbewegungen und selbst durch Stürme verbreitete Staubpartikel können potentiell zu einer weltweiten Ausbreitung führen. Eine strikte geographische Trennung der Typen lässt sich nicht mehr aufrechterhalten. Auch werden durch vermehrtes Interesse der Wissenschaft und verbesserte Nachweismethoden Typen in Gegenden gefunden, wo man diese bisher nicht vermutet hat (BÖHNEL, 1995).

Gemeinhin wird angenommen, dass C. botulinum ubiquitär vorhanden ist. Viele Li

teraturstellen weisen jedoch darauf hin, dass der Ausbruch von Botulismus in einer Population ganz wesentlich vom grundsätzlichen Vorkommen des Erregers in dem betreffenden Gebiet abhängt (DAHLENBORG et al., 2001; YAMAKAWA et al., 1992).

WOBESER et al. (1987) verglichen die Sporenkonzentrationen in zwei verschiedenen Feuchtgebieten. Im Gebiet, in dem C. botulinum enzootisch auftrat, lag die Sporen

konzentration mit 59,2 % der Bodenproben deutlich höher als mit 6,2 % in den Bo

denproben eines bisher nicht betroffenen Gebietes.

Fast alle Säugetiere und Vögel können durch C. botulinum-Toxine erkranken, die Empfindlichkeit ist jedoch unterschiedlich und wird durch die Applikationsart beein

flusst (HUNTER u. POXTON, 2002; LAMANNA, 1959). Die verschiedenen C. botulinum- Typen besitzen eine gewisse Affinität zu bestimmten Substraten und Spezies, wie folgende Tabelle darstellt:

(20)

Tabelle II.1: C. botulinum-Intoxikationen (modifiziert nach: SONNENSCHEIN, 1980; BÖHNEL u. GESSLER, 2010) Neurotoxin-Typ Intoxikationsquelle vorwiegend betroffene Spezies BoNT/A pflanzliche Nahrungsmittel, Fleisch, Fisch, Wunden? Hühner, Menschen, Nerze BoNT/B Fleisch und Fleischerzeugnisse (meist vom

Schwein), Wunden Pferde, Rinder, Menschen, Hühner

BoNT/C Lucilia-Larven, Sumpf-, Faulschlamm, Pflanzen Vögel, speziell Wasservogelarten

verdorbenes Futter, Kadaver Rinder, Hunde, Nerze, Frettchen, Füchse, Pferde, Schweine

BoNT/D Kadaver Rinder, Wasservogelarten

BoNT/E Fisch und Fischerzeugnisse Fische, Vögel, Menschen

BoNT/F Leberpastete, Fisch Menschen

BoNT/G Menschen?

Carnivoren

Viele Fleisch- und Aasfresser wie Hund, Katze und auch Schweine gelten als relativ wenig empfänglich gegenüber Intoxikationen durch C. botulinum (STEINMAN et al., 2007; SEIFERT, 1996; LIU et al., 2015).

Botulismus wird beim Hund dennoch relativ häufig beschrieben. Wie resistent Hun

de gegen C. botulinum tatsächlich sind, wird letztlich von den Autoren unterschiedlich beurteilt. Zum einen besteht die Meinung, dass es relativ selten zu Vergiftungen kommt in Anbetracht der Tatsache, dass in der Hundemeutenhaltung, v. a. in Eng

land, häufig rohes Fleisch verfüttert wird (MARLOW u. SMART, 1982). Außerdem wur

den Hunde in Laborexperimenten als resistent eingestuft (GRAHAM u. ERIKSEN, 1922;

LEGROUX u. LEVADITI, 1947 und PRÉVOT u. BRYGOO, 1953, zit. nach DARKE et al., 1976). Darüber hinaus würde einem Großteil der Fallberichte von Botulismus, insbe

sondere in der frühen Literatur, der Labornachweis fehlen. Es würde sich dabei statt

dessen oft um Polyradiculoneuritis handeln (BARSANTI et. al., 1978).

Zum anderen wird die Auffassung vertreten, dass Hunde empfindlicher gegen Bo

tulinum-Toxine sind, als allgemein angenommen wird und dass man eher davon aus

gehen müsste, dass viele nicht näher differenzierte Fälle von Paraplegie auf Botulis

mus zurückzuführen seien (CHENNELLS, 1989; DARKE et al., 1976). Daher müsste Botulismus bei Lähmungserscheinungen beim Hund als eine Differentialdiagnose mit herangezogen werden (BLAKEMORE et al., 1977).

(21)

1 Botulismus | 7 Erkrankungen sind meist mit dem Verzehr von rohem Futterfleisch assoziiert. In an

deren Fällen hatten die Tiere Zugang zu Kadavern, besonders gehäuft zu Geflügel

kadavern.

Beim Hund kommt v. a. C. botulinum Typ C vor (DARKE et al., 1976; BLAKEMORE

et al., 1977; MARLOW u. SMART, 1982; WALLACE u. MC DOWELL, 1986; BARSANTI et al., 1978; FARROW et al., 1983; RICHMOND et al., 1978; BRUCHIM et al., 2006; VAN NES u.

VAN DER MOST VAN SPIJK, 1986). Bei zwei Fällen im Senegal wurde Typ D nachgewie

sen und einmal gelang die Isolierung von C. botulinum Typ A aus der Leber eines verstorbenen Hundes (DOUTRE, 1982, 1983; BARSANTI et al., 1978).

Es handelt sich im Regelfall um Intoxikationen. Experimentell wurde eine intestina

le Kolonisation bei acht bis elf Tage alten Welpen durchgeführt. Diese zeigten jedoch keine Symptome (BARSANTI, 2006). Im Anschluss an eine Erkrankung konnten bei ei

nem sechs Monate alten Hund nach 114 Tagen immer noch C. botulinum und Toxin im Kot nachgewiesen werden, woraus geschlossen wurde, dass eine Kolonisation des Magen-Darm-Traktes stattgefunden hat (FARROW et al., 1983).

Natürlicher Botulismus bei Katzen wurde bisher nur einmal in einer Katzenkolonie beschrieben, an die ein Pelikankadaver verfüttert wurde (ELAD et al., 2004). Im Ma

geninhalt eines der obduzierten Tiere und im Pelikankadaver konnte C. botulinum Typ C und im letzteren auch das Toxin nachgewiesen werden. Dabei war auffällig, dass eine Verdünnung von 1:1000 nötig war für eine erfolgreiche Neutralisation. Die früher festgestellte relative orale Resistenz von Katzen (PRÉVOT u. SILLIOC, 1955, zit.

nach ELAD et al., 2004) würde nach Meinung der Autoren bestätigt werden durch die viel kürzere Rekonvaleszenzzeit einer überlebenden Katze von nur drei Tagen ge

genüber einer mittleren Zeitspanne von drei bis vier Wochen bei Hunden. CRITCHLEY

(1991) berichtet von der Vergiftung zweier Jugendlicher durch Joghurt. Ihre Katze, die auch damit gefüttert wurde, blieb gesund.

Bei Hund und Katze wird außerdem eine generalisierte autonome Neuropathie be

schrieben, die mit degenerativen Veränderungen in den autonomen Ganglien, in der grauen Substanz des Rückenmarks und in verschiedenen sympathischen Axonen einhergeht, die sogenannte feline oder canine Dysautonomie (früher Key-Gaskell- Syndrom). Klinisch treten v. a. Apathie, Anorexie, Erbrechen, Mydriasis, verminderte Tränenproduktion, Bradykardie und herabgesetzter Analreflex auf. Paresen und pro

priozeptive Defizite können vorhanden sein. Die Speiseröhre ist hypomotil, Blase und Kolon sind geweitet. Die Prognose ist im Allgemeinen schlecht, ein Teil der Patienten kann sich jedoch mit künstlicher Ernährung nach mehrmonatiger Therapie erholen (NOLTE u. EICKHOFF, 2003). Epidemiologische Studien beim Hund haben gezeigt, dass junge Hunde im Frühling und Hunde, die überwiegend außerhalb des Hauses in

(22)

ländlicher Umgebung leben, ein höheres Erkrankungsrisiko besitzen (FAISSLER et al., 2007). Die Erkrankung wurde bei Katzen hauptsächlich in Großbritannien beobach

tet, kommt aber auch in anderen Staaten, v. a. in Europa, vor (TIPOLD, 2003). Für Hunde wurde eine regional höhere Inzidenz in den USA festgestellt (FAISSLER et al., 2007). Die Ätiologie ist weitgehend ungeklärt. NUNN et al. (2004) bringen die Dysau

tonomie der Katzen mit C. botulinum Typ C in Zusammenhang. Bei Ausbruch der Krankheit in einer Katzenkolonie wurde das Toxin in sieben von acht Katzen und im Trockenfutter nachgewiesen. Die Kontrolltiere und ihr Futter waren negativ. Es wird eine frühere Exposition beider Gruppen vermutet, da Immunglobulin A (IgA) im Kot nachgewiesen wurden. Dabei waren die IgA-Titer gegen die Neurotoxine und Ober

flächenantigene von C. botulinum bei den erkrankten Tieren 14 Wochen nach dem Ausbruch im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant erhöht. Es besteht eine Ähn

lichkeit mit der Grass Sickness der Pferde (TIPOLD, 2003).

Über Botulismus bei freilebenden Carnivoren wird sehr wenig berichtet. Bei den Taxa Canidae und Ursidae konnten Antikörper gegen Botulinum-Neurotoxine nachgewie

sen werden, speziell bei Kojoten (Canis latrans) und amerikanischen Schwarzbären (Ursus americanus) (MURRAY et al., 1999; RUPPANNER et al., 1982).

OHISHI et al. (1979) berichten über die natürliche Resistenz bei Aasfressern und wiesen Antikörper gegen die Toxintypen A bis F bei Kojoten nach (Canis latrans). 25 der getesteten 110 Proben waren positiv (23 %). Bei Wanderratten (Rattus norvegi

cus) konnten bei zwei von zwölf Proben Antikörper gegen die Typen B bzw. C gefun

den werden (17 %). Dem gegenüber stehen 80 durchgehend negative Proben folgen

der Spezies: Graufuchs (Urocyon cineroagenteus), Waschbär (Procyon lotor), Streifenskunk (Mephitis mephitis), Rotluchs (Lynx rufus), Südopossum (Didelphis marsupialis), Bisamratte (Ondotra zebethica), Wildschwein (Sus scrofa), Haushund (Canis lupus familiaris), Hauskatze (Felis silvestris catus) und Kalifornischer Eselha

se (Lepus californicus). Die Autoren gehen davon aus, dass es bei nicht zu den Ne

krophagen zählenden Spezies zu keiner Antikörperbildung kommt, da die tödliche Toxinmenge unterhalb der Dosis liegt, die für das Auslösen einer Immunantwort nötig ist. Überlebende Tiere würden im Allgemeinen keine Immunität besitzen. Nachweise Antikörper-positiver Tiere anderer Spezies wären möglicherweise durch eine Exposi

tion im frühen Lebensalter zu erklären: Bei neugeborenen Mäusen konnten SUGIYAMA

und MILLS (1978) eine Toxiko-Infektion mit Toxinproduktion ohne klinische Symptome hervorrufen. Möglicherweise sind Säugetiere und Vögel auch temporäre Träger des Erregers mit keinen oder nur geringen klinischen Erscheinungen (OHISHI et al., 1979).

Bei der Auswertung von 47 Serumproben von wildlebenden Goldschakalen (Canis aureus syriacus), Wölfen (Canis lupus) und Rotfüchsen (Vulpes vulpes) durch STEINMAN et al. (2007) wurden positive Titer nur bei den Goldschakalen gefunden.

(23)

1 Botulismus | 9 29 % der Tiere hatten gegen Toxin C und 9 % gegen Toxin D detektierbare Antikör

per. Alle für Toxin-D-Antikörper positiven Tiere stammten dabei aus derselben Ge

gend. Die negativen Ergebnisse von Wolf und Rotfuchs lägen möglicherweise in der geringen Anzahl der Proben oder in unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten be

gründet. Bei den Goldschakalen wäre es auch denkbar, dass sie den Erreger reakti

onslos beherbergen können, wie es OHISHI et al. (1979) als Möglichkeit in Betracht gezogen haben.

Beim Fuchs ist das Auftreten von Botulismus nachgewiesen. Mit Hilfe des Tierver

suchs wurde das Toxin in den Lebern von Fuchs und Wiesel gefunden (SCHNEIDA

WIND u. BOCH, 1988, S. 372). Füchse werden als relativ resistent angegeben (OHISHI

u. SAKAGUCHI, 1980). DINTER und KULL (1951) stellten bei Blau- und Silberfüchsen bei großen Mengen peroral verabreichter toxischer Typ C-Kultur keinerlei Reaktion fest.

Auf verschiedenen Pelztierfarmen in Finnland erkrankten dennoch während eines Ausbruchs mit C. botulinum Typ C über 52 000 Füchse und Nerze, über 44 000 Tiere starben (LINDSTRÖM et al., 2004). In der Literatur gibt es nur wenige Fallberichte bei Füchsen aus Pelztierzuchten im Vergleich zur Situation bei den Nerzen. Angaben über die orale Toxizität bei Füchsen gegenüber Typ C schwanken zwischen 10³ bis über 10⁸ minimalen letalen Dosen (MLD, i.p. Injektion in der Maus) pro Tier. Einige überlebten die orale Aufnahme von 10⁷MLD BoNT/C. Die geringe Todesrate bei den Nerzen während des oben beschriebenen Ausbruchs wird auf die bei diesen Tieren in Finnland vorgeschriebene Impfung gegenüber Typ C im Alter von zwei Monaten zurück geführt. Dazu passt, dass die adulten Tiere eine wesentlich höhere Todesrate aufwiesen. Offensichtlich waren bei diesen Tieren die Antikörper-Spiegel zwischen

zeitlich gesunken. Auffällig war eine unterschiedliche Empfänglichkeit zwischen den beiden Spezies Polarfuchs (Alopex lagopus) und Rotfuchs (Vulpes vulpes) bezie

hungsweise ihrer in der Pelztierzucht verwendeten Varianten. Die Abarten des Polar

fuchses waren beträchtlich schwerer betroffen. Beide Fuchsarten unterscheiden sich in ihren Ernährungsgewohnheiten dahingehend, dass Polarfüchse häufig gefrorenes Futter, Rotfüchse meist verdorbenes Aas zu sich nehmen. Es mag sich daher eine unterschiedliche Resistenz gegenüber Botulinum-Toxinen entwickelt haben. Die Fak

toren, die zu dem Ausbruch geführt haben, konnten nicht mit Sicherheit bestimmt werden. Die Kontamination einer oder mehrerer Rohkomponenten bei der Futtermit

telherstellung in der betroffenen Fabrik erschien am wahrscheinlichsten. Bei einer der Komponenten handelte es sich um Geflügelabfälle.

Musteliden, insbesondere der Nerz, sind hochgradig gefährdet durch Botulis

mus-Intoxikationen, die meist während der Sommermonate auftreten. Sie sind über

wiegend auf BoNT/C zurückzuführen (MATTHES, 1985). Für Nerze wird neben der ho

hen Empfindlichkeit gegen den Toxintyp C eine moderate Empfänglichkeit gegen die Typen A und B angegeben (RYLAND u. GORHAM 1978). Nach Untersuchungen von

(24)

DINTER und KULL (1955 b) war der Nerz bei peroraler Verabreichung 400mal empfind

licher für Typ C als für Typ A.

Große Ausbrüche mit vielen Tausend Tieren sind insbesondere für Norwegen (GUSTAVSEN et al., 1969), Schweden (DINTER u. KULL, 1955 a) und Finnland (LINDSTRÖM et al., 2004), aber auch für Kanada (PHANEUF et al., 1972) beschrieben.

Die Intoxikationsquelle während eines Ausbruchs ist im Regelfall eine einzelne, viele Pelztierfarmen beliefernde Futtermittelfabrik (GUSTAVSEN et al., 1969; LINDSTRÖM

et al., 2004). Selbst moderne, gut ausgestattete Betriebe mit geschultem Personal können keine vollständige Garantie gegen Botulismus gewährleisten (GUSTAVSEN

et al., 1969). Neben der Futtermittelqualität werden weitere Einflussfaktoren beschrie

ben, die einen Ausbruch evtl. erst ermöglichen. DINTER und KULL (1955 a, b) haben aus ihren Untersuchungen geschlossen, dass auch unter natürlichen Bedingungen eine Keimvermehrung im Verdauungskanal möglich ist, durch die eine ursprünglich niedrige Toxinmenge zu einer tödlichen Dosis ansteigen kann. Außerdem beschrei

ben LOFTSGÅRD et al. (1970) einen kumulativen Effekt durch wiederholte Verabrei

chung des kontaminierten Futters, der zu einem Überschreiten des toxischen Schwellenwertes führen kann.

Bei fleischfressenden Zootieren sind nur einzelne Fallberichte bekannt. Sechs Zir

kuslöwen in England wiesen nach Fütterung verdorbenen Hühnerfleisches die klassi

schen Botulismus-Symptome auf (GREENWOOD, 1985). Es konnte Toxin C im Serum einiger Tiere mittels Mäuse-Bioassay nachgewiesen werden. Das Serum des verstor

benen Löwen enthielt 50–80 LD/ml. Die anderen benötigten ca. 22 Tage zur Rekon

valeszenz. Ein Männchen war erst nach 41 Tagen wieder in der Lage, sich selbst

ständig zu erheben und benötigte weitere drei Monate zur vollständigen Genesung.

Antiserum war in diesem Fall erst nach elf Tagen verfügbar.

Zwei schwarze Jaguare und ein Nasenbär, die dasselbe Futter erhalten hatten, er

krankten nicht. GREENWOOD (1985) zieht in Betracht, dass das Überleben der Löwen zum Teil in einer angeborenen oder erworbenen Resistenz begründet liegen könnte ähnlich der von Aasfressern. Er verweist dabei auf das vollständige Fehlen einer Pa

ralyse der Atemmuskulatur.

WILLIAMS et al. (2011) berichten von gleichzeitiger Barbituratvergiftung und Botulis

mus bei einer Gruppe in Gefangenschaft lebender Tiger (Panthera tigris). Drei Tiere entwickelten vier Tage nach Verfütterung eines offenbar an Kolik verendeten Pferdes (ohne Euthanasie) gleichzeitig folgende Symptome: abdominale Beschwerden, pro

gressive Ataxie, Festliegen, narkoseähnlicher Schlaf abwechselnd mit wachen Pha

sen mit Orientierungslosigkeit und ataktischen Bewegungen. Das dominante Männ

chen erkrankte am schwersten und verstarb nach vorübergehender Besserung. Die Pathologie ergab einen Megaösophagus mit Anschoppung von faulendem Gras,

(25)

1 Botulismus | 11 ebensolches Material und Wasser in Pharynx und Trachea und eine schwere Aspira

tionsbronchopneumonie. In Koloninhalt und Lebergewebe konnten Barbiturate nach

gewiesen werden. Der Ösophagus- und Coloninhalt war positiv für BoNT/C. Die Se

rumproben der Tiere waren sowohl für Barbiturate als auch Botulinum-Toxine negativ.

Wiederkäuer

Unter den Pflanzenfressern sind Rinder am häufigsten betroffen, gefolgt von Schafen und Ziegen. Es handelt sich dabei meist um C- und D-Intoxikationen (MAGWEDERE

et al., 2012; BEHRENS et al., 2001). Botulismus in der Rinderhaltung ist ein weltweites, mit großen ökonomischen Schäden verbundenes Problem. Einzelfälle und Massen

ausbrüche sind für Europa, Nord- und Südamerika, Australien und Israel beschrieben (STEINMAN et al., 2006). Botulismus bei Schafen ist v. a. in Australien und Südafrika ein Problem (SMITH U. SUGIYAMA, 1988, S. 137).

In den mittleren Breitengraden erfolgen Intoxikationen klassischerweise durch Ka

daverteile, z. B. durch unbemerkte Kontamination von Silage mit kleinen Tieren. In der Regel erkranken mehrere Tiere gleichzeitig (RADOSTITS et al., 1994). In der Rin

der- und Schafhaltung werden zahlreiche Fälle auf Zugang zu oder Verwendung von Geflügeleinstreu zurück geführt (PAYNE et al., 2011). C. botulinum Typ B benötigt da

gegen pflanzliches Protein für Wachstum und Toxinbildung. Dementsprechend wer

den bei Typ-B-Ausbrüchen mögliche Quellen bei den Futterkomponenten mit viel pflanzlichem Protein wie Biertreber, Sojabohnen und -silage, Alfalfa-Silage, verfau

lendem Gemüse und verdorbener Roggen-Silage gesucht (BRUCKSTEIN u. TROMP, 2001).

In tropischen Regionen kann es durch natürliche Phosphormangelzustände des Bodens zu Osteosarkophagie und damit einhergehend zu schwerwiegenden Ausbrü

chen kommen. Die Tiere versuchen instinktiv ihr Phosphordefizit durch das Benagen von Knochen und Kadavern zu decken und können so das Toxin aufnehmen. Die Supplementierung mit Phosphor und massive Impfungen machen eine Viehhaltung unter Umständen erst möglich. Auch der mehrjährige Anbau von Reis in feucht-tropi

schen Gebieten verursacht eine starke Phosphorverarmung des Bodens und wirkt sich bei nachfolgender Weidenutzung auf die Viehhaltung aus. Durch Überstockung kommt es zu einem absoluten Futtermangel und einem relativen Mineralstoffmangel der Futtergräser. In Westafrika wird beschrieben, dass es durch Kadaver in Wasser

stellen zu Typ C- und D-Intoxikationen über das Brunnenwasser kommen kann (BÖHNEL, 1995; BIGALKE, 2012).

BÖHNEL, SCHWAGERICK und GESSLER berichten über ein seit 1999 bei Rindern auftre

tendes multifaktorielles Krankheitsbild, dem sogenannten chronischen oder viszera

(26)

len Botulismus, mit Parallelen zum Säuglingsbotulismus oder zur Equine Grass Sick

ness, bei denen eine Dysbiose des Magen-Darm-Traktes eine zentrale Rolle spielt (BÖHNEL et al., 2001; SCHWAGERICK u. BÖHNEL, 2001; BÖHNEL et al., 2003). Neben neuromotorischen Beeinträchtigungen werden ein schlechter Habitus, Ataxie, Ent

zündungen an Klauen und Gelenken, reduzierte Milchleistung, erhöhte Abgangsrate und Aborte beschrieben (ENGELS, 2012; BÖHNEL et al., 2013). Der chronische Botulis

mus wird kontrovers diskutiert (SCHWAGERICK, 2010; SEYBOLDT et al., 2015).

Bei den exotischeren Wiederkäuern sind nur wenige Fallberichte verfügbar. FOWLER

(1998) vermutet, dass aufgrund der schwierigen Diagnose Fälle einfach übersehen werden und schätzt Kameliden als empfänglich ein.

Einige wenige Fälle unter Altweltkameliden sind bekannt (WERNERY u. KAADEN,

2002). PROVOST et al. (1975, zit. nach GARLT et al., 1979) beschreiben einen größe

ren, verlustreichen Ausbruch bei Dromedaren im Tschad mit Typ C nach Aufnahme von durch ein mazeriertes Ziegenfell verunreinigtes Brunnenwasser.

Bei den Zoo- und Wildtieren erachten SCHNEIDAWIND und BOCH (1988, S. 372) das Auftreten von Botulismus bei Rot-, Dam-, Gams-, und Muffelwild als wahrscheinlich.

Beim Wild werde Typ C nachgewiesen. Über einen Ausbruch unter Alpensteinbö

cken in einem Wildgehege in Deutschland berichtet BÖHNEL (2005). Nach Anbruch eines neuen Ballen Silage verendete kurze Zeit später das erste Tier, wenige Tage danach ein zweites. Bei letzterem wurde freies Toxin der Typengruppe ABE im Pan

seninhalt nachgewiesen. Die Silage stand für eine Probennahme nicht mehr zur Ver

fügung. Bei der Beprobung weiterer, gesunder Tiere im Gehege konnten bei drei Steinböcken und einem Stück Damwild sowohl ABE als auch CD-Toxin bzw. einmal der Erreger in den Fäzes nachgewiesen werden. Bei zwei Tieren handelte es sich um freies Toxin fünf Wochen nach dem Ausbruch. Es muss also zu einer Toxinbil dung im lebenden Tier nach der Aufnahme subklinischer Mengen gekommen sein.

Bei 45 toten Dickhornschafen (Ovis canadensis) in Kalifornien wurde eine Intoxika

tion mit C. botulinum angenommen. Die Todesfälle standen in Verbindung mit künstli

chen Staubecken. Es wurde Typ C nachgewiesen (SWIFT et al., 2000).

Bei drei adulten arabischen Oryx-Antilopen (Oryx leucoryx) in einem Wiederauswil

derungsprojekt im Oman wurde Botulismus als Todesursache in Betracht gezogen (STANLEY-PRICE, 1989, zit. nach FLAMAND, 1999).

Bei Kameliden ist eine Dysautonomie ähnlich der anderer Spezies beschrieben (MIDDLETON et al., 2006; LEWIS et al., 2009).

(27)

1 Botulismus | 13 Equiden

Der klassische Botulismus bei Equiden wird durch die Ingestion von Toxin aus dem Futter ausgelöst. Neben typischen Quellen, z. B. mit Kadavern kleiner Säugetiere kontaminierter oder schon bei der Herstellung nasser Silage, werden auch faulendes Gras bei niedergetrampelten Grasbüscheln, bei Rennpferden luftdicht abgepackte Al

falfa-Heulage oder Braugerste beschrieben. Selten kommt es zu einer Intoxikation über eine geschlossene Wunde (RADOSTITS et al., 1994).

Beim Shaker Foal Syndrome beim Fohlen handelt es sich dagegen um eine Toxi

ko-Infektion des zwei bis acht Wochen alten Fohlens. Die Erkrankung ist seit den 1960er Jahren bekannt und kommt hauptsächlich in den USA, Australien und Groß

britannien vor. Durch die sich erst aufbauende Darmflora beim jungen Fohlen ermög

licht der Mangel an konkurrierenden Keimen eine Besiedlung und Vermehrung von C. botulinum mit Toxinbildung. Bei intensiv-medizinischer Betreuung überleben bis über 96 % der Fohlen (WILKINS u. PALMER, 2003).

Beim Pferd ist Botulismus in der Regel mit Typ B, selten mit A oder C assoziiert (RADOSTITS et al., 1994; WILKINS u. PALMER, 2003). Pferde sind sehr empfindlich ge

genüber allen Toxintypen (BÖHNEL, 1995).

Die Equine Grass Sickness bzw. Equine Dysautonomie kommt bei Pferden, Po

nies, selten bei Eseln, Maultieren und exotischen Equiden vor (RADOSTITS et al., 1994; TAMARIN, 1962). Unter Zootieren sind Fälle bei Zebras (E. quagga burchellii und E. quagga chapmani), einem Przewalskipferd sowie einem Esel beschrieben (ASHTON et al., 1977; WALES et al., 2001). Es kommt zu einer Zerstörung der Neuro

nen des autonomen, enterischen und somatischen Nervensystems. Die Krankheit kommt in ganz Großbritannien und Norwegen, Schweden, Dänemark, Frankreich, Deutschland und der Schweiz vor. Eine ähnliche Erkrankung namens „Mal seco“ wird in Patagonien (Argentinien), Chile und auf den Falklandinseln beschrieben (UZAL und ROBLES, 1993; DIVERS u. DE LAHUNTA, 2007). Die Ätiologie ist noch weitgehend unge

klärt. Neben anderen Ursachen wird auch eine Beteiligung von C. botulinum bzw. sei

nes Toxins diskutiert. Gegenüber Kontrolltieren zeigten erkrankte Tiere signifikant höhere IgG-Titer gegenüber C. botulinum Typ C. Der Erreger und das Toxin konnten ebenfalls bei den kranken Tieren wesentlich häufiger nachgewiesen werden. In je

dem Fall handelt es sich offenbar um ein multifaktorielles Geschehen (HUNTER et al., 1999; Hunter u. Poxton, 2001).

Es erkranken in der Regel nur Tiere in guter körperlicher Verfassung und fast aus

schließlich Tiere, die auf der Weide stehen. Die Fälle häufen sich meist auf bestimm

ten Weiden und in den Sommermonaten (DIVERS u. DE LAHUNTA, 2007). In zwei Fäl

len konnte in frischem grünem Grasschnitt und Bodenproben Botulinum-Toxin nachgewiesen werden (BÖHNEL et al., 2003).

(28)

Klinisch werden gestörtes Allgemeinbefinden, Somnolenz, Inappetenz, Tachykardie und verschiedene schwere Koliksymptome wie Reflux, fehlende Darmgeräusche usw. festgestellt. Evtl. tritt Fieber und bilaterale Ptosis auf. Weiterhin kommt es zu er

höhtem Muskeltonus, Schwitzen, Speicheln und einer Körperhaltung ähnlich einer Bergziege mit unter den Körper gestellten Gliedmaßen. Bei subakuter und chroni

scher Verlaufsform entwickeln sich die Symptome langsamer und ein Gewichtsver

lust bis zur Kachexie und ein stark geschürztes Abdomen treten mehr in den Vorder

grund (DIVERS u. DE LAHUNTA, 2007).

Schweine

Es gibt nur wenige dokumentierte Fälle von Botulismus bei Schweinen. Diese wur

den mehrheitlich von Typ C, einmal von Typ B verursacht (MAGWEDERE et al., 2012;

BEIERS u. SIMMONS, 1967, zit. nach LIU et al., 2015; DOUTRE, 1967; SMITH u.

SUGIYAMA, 1988, S. 138 f.). Schweine sind sehr resistent gegen C. botulinum (CAMERON, 1924; SMITH u.SUGIYAMA, 1988, S. 138 f.). Es wird relativ häufig über des

sen Nachweis bei gesunden Schlachtschweinen mit teilweise sehr hohen Prävalen

zen berichtet: Schweden 62 %, Typ B (DAHLENBORG et al., 2001), Japan 80 %, Typ C (YAMAKAWA et al., 1992), Deutschland 24 %, Typ B, C und E (KLARMANN, 1989), Finn

land 3 %, Typ B (nur indoor-Haltung) (MYLLYKOSKI et al., 2006). SMITH et al. (1971, zit.

nach LIU et al., 2015) stellten fest, dass selbst bei intravenöser Applikation sehr hohe Dosen für das Auslösen einer Muskelschwäche nötig sind. Es bestehe allenfalls eine moderate Empfänglichkeit gegenüber BoNT/B: Die LD von Schweinen betrug 180 LD(Maus) / kg im Unterschied zu 6 000 LD(Maus) / pro kg bei BoNT/A. Bei Injek

tionsversuchen in den M. masseter konnte dementsprechend kein messbarer Effekt bei der Applikation von BoNT/A festgestellt werden, während es bei BoNT/B zur Re

duktion der elektrischen Aktivität und der Funktion des Muskels kam (LIU et al., 2015).

Elefanten

Es liegen nur zwei Berichte über Botulismus bei Elefanten vor (ELZE, 1962; GARLT

et al., 1979). In beiden Fällen erkrankten je zwei Tiere in einer Herde indischer Ele

fanten, die benachbart aufgestallt waren und Zugang zu demselben Futter hatten.

Pathologie und Bakteriologie sowie Nachweis anderer giftiger Substanzen führten zu keinen pathognonomischen Befunden (ELZE, 1962). Bei GARLT et al. erbrachte die Pathologie unspezifische Hinweise auf ein toxisches Geschehen: Hyperämien und Blutungen, teils mit Nekrosen v. a. im Magen-Darm-Trakt und Gehirn, standen im Vordergrund. Bei ELZE erholte sich ein Tier innerhalb von zwei Tagen nach Verabrei

(29)

1 Botulismus | 15 chung von Antiserum Typ A und B zunehmend. Aufgrund der beobachteten Sympto

me und des erfolgreichen Einsatzes des Antiserums wurde trotz negativem Toxintest die Diagnose Botulismus gestellt. Bei GARLT et al. verstarben beide Tiere innerhalb eines Tages. Hier konnte aus Leber, Mageninhalt und Blutkoagula Botulinum-Toxin im Mäuseversuch nachgewiesen werden.

FOWLER (2006) schließt daraus, dass Elefanten empfindlich gegen Botulinum-Toxin sind und zieht in Betracht, dass weitere Erkrankungen aufgrund der schwierigen klini

schen Diagnose übersehen werden könnten.

Affen

Verschiedentlich wird von Botulismus bei Affen berichtet (SMART et al., 1980; SMITH

et al.,1985). Meist sind viele Tiere betroffen bis zum Versterben ganzer Gruppen. In der Regel verläuft die Intoxikation perakut und tödlich. In sehr vielen Fällen gelang der Toxinnachweis für Typ C nicht nur aus Organen oder Magen-Darm-Inhalt, son

dern auch aus Serum und Futter.

Die Ursachen der jeweiligen Ausbrüche konnten nicht immer festgestellt werden.

Wo gelungen, waren verdorbenes Futter, insbesondere tierischer Herkunft, und Zu

gang zu den Kadavern an Botulismus verstorbener Wildvögel für den Ausbruch ver

antwortlich (LEWIS et al., 1990; PETIT, 1991). BITTAR et al. (2014) konnten C. botulinum in den Fäzes einer Gruppe von westlichen Flachlandgorillas (Gorilla gorilla gorilla) nachweisen.

Meeressäuger

Botulismus ist bei frei lebenden Robben eine verbreitete Erkrankung (KINNE, 1985).

WAGNER und MANN (1978) berichten über sieben Fälle „ungeklärter Todesursache“

bei kalifornischen Seelöwen (Zalophus californianus) im Kansas City Swope Park Zoo in den Jahren 1968 und 1969. Bei den letzten beiden Tieren konnte C. botulinum als Auslöser nachgewiesen werden (Typ unbekannt). Die Autoren betonen, dass Bo

tulismus bei Fällen von Dysphagie gefolgt von „plötzlichem“ Versterben als Differenti

aldiagnose in Betracht gezogen werden sollte, insbesondere wenn die Pathologie keinen Hinweis auf die Todesursache erbringt.

„Ungeklärte Todesfälle“ bei Robben in zoologischen Institutionen kommen immer wieder vor. Ohne irgendwelche Krankheitszeichen gehen die Tiere plötzlich ein, die Sektion kann die Todesursache nicht klären (WOLINSKI u. LANDOWSKI, 1962). Bei der Untersuchung von zwölf Todesfällen zwischen 1956 und 1961 in den polnischen zoo

logischen Gärten Warszawa, Wroclaw, Lodz und Katowice halten die Autoren fest, dass es teilweise nur vier- bis fünfmal im Jahr zum Wasseraustausch kommt und be

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sonders in der Sommerzeit die nicht aufgefressenen Futterfische schnell der Zerset

zung anheimfallen. Sie machen diesen Umstand für einen Teil der Erkrankungen, oft des Magen-Darm-Traktes, verantwortlich. Bei drei Tieren der Studie konnte die To

desursache nicht bestimmt werden. Bei einem jungen Seelöwenbullen im Zoo Wroclaw erfolgte der Tod plötzlich ohne irgendwelche Krankheitsanzeichen und ohne signifikante Sektionsbefunde. Bei einem Paar Seelöwen im Zoo von Katowice gingen die Tiere in einem Abstand von drei Stunden ein. Möglicherweise sei eine Flucht in einen benachbarten Vogelteich, dessen Wasser nur ein- bis zweimal im Jahr ge

wechselt wird, ursächlich beteiligt. Sie verbrachten in dem Teich drei Tage und wa

ren am Tag nach der Rücküberführung plötzlich verendet, ebenfalls ohne aufschluss

reiche Obduktionsbefunde.

In Kopenhagen wurden 44 Obduktionsbefunde von Robben (Pinnipedia) im Zeit

raum von 1952 bis 1961 ausgewertet. Die Tiere stammten mehrheitlich aus dem Ko

penhagener Zoo, aber auch von Zirkussen und anderen Zoos. Auch hier beschreibt der Autor, dass in vielen Fällen keine klinischen Informationen verfügbar waren, da die Tiere plötzlich und ohne vorherige klinische Symptome verstarben, und die Sekti

on zur Aufklärung nicht beitragen konnte (LARSEN, 1962).

Andere beobachtete Symptome bei gelegentlichen Todesfällen sind außer bei pe

rakutem Verlauf Anorexie, Paralyse und Diarrhoe (ROSAS et al., 2001).

Botulismus als Causa zumindest einiger dieser Fälle kann aufgrund dieser Litera

turangaben in Betracht gezogen werden.

Vögel

Botulismus ist die zur Zeit wichtigste Erkrankung bei Wassergeflügel und Watvögeln (ROCKE, 2006). Die regionale Bedeutung ist teilweise erheblich (WORRALL, 1987). In bestimmten Gebieten sind Massensterben von zehntausenden Tieren, teilweise aber auch mit Millionen toter Vögel, regelmäßig wiederkehrende Ereignisse (ROCKE u.

FRIEND, 1999; HOLDEN, 1997). Die Auswirkungen auf die Populationen von Wildvö

geln sind nicht gut bekannt. Die Bestände von sich zuverlässig reproduzierbaren Ar

ten mögen sich rasch erholen, gefährdete Vogelarten wären evtl. nicht genug belast

bar. Jeder Kontinent außer der Antarktis ist betroffen. In Amerika und Australien wurde bereits 1934 die sogenannte Western Duck Sickness beschrieben. Auf dem Nordamerikanischen Kontinent sind außerdem schon früh viele Ausbrüche mit Mas

sensterben beschrieben, z. B. am Utah Great Salt Lake oder in der Elfros Region (HOLDEN, 1997; ROCKE, 2006). Aber auch in verschiedenen europäischen Ländern wie Dänemark, England, Schweden, den Niederlanden, Spanien und Italien kam es zu bedeutenden Ausbrüchen. Nicht zuletzt aus Russland, Japan, Brasilien und Süd

afrika ist Botulismus bei Wildgeflügel als verlustreiche Erkrankung bekannt (LÜTHGEN,

(31)

1 Botulismus | 17 1972; ROCKE, 2006; ANZA et al., 2014). In Deutschland sind ebenfalls diverse Ausbrü

che beschrieben, insbesondere bei Wassergeflügel auf Gewässern von Großstädten oder bei Möwen (GÖLTENBOTH u. KLÖS, 1983; LÜTHGEN, 1972; WORRALL, 1987;

SCHNEIDAWIND u. BOCH, 1988, S. 342 f.).

Bei der klassischen Intoxikationskette in Feuchtgebieten kann es bei Hitzewellen in den Sommermonaten, insbesondere in Flachwassergebieten, zu einer Sauerstoffver

armung des Gewässergrundes und bestimmter Wasserschichten kommen (LÜTHGEN

1972; HOLDEN 1997; FRANCIOSA et al., 1996). Ist zersetzbares Material vorhanden und sind die Umweltbedingungen für C. botulinum günstig sowie Sporen vorhanden kann es zur Keimung und Toxinbildung kommen. V. a. gründelnde Vogelarten neh

men das Toxin auf und verenden. Fliegenmaden sind gegen das Toxin unempfindlich und es kann in ihnen sogar zur Toxinvermehrung kommen (SMITH et al., 1985;

DINTER u. KULL, 1954; CAMBRE, 1999). Sie wirken wie ein Katalysator bei einem Aus

bruch, da in der Folge auch Maden fressende Vogelarten betroffen sind und schließ

lich ein artenübergreifendes und sich selbst unterhaltendes Massensterben beginnt.

Auch im Winter sind Ausbrüche beschrieben, werden jedoch meist auf eine Vorge

schichte mit Toxinbildung im Sommer zurückgeführt (ROCKE u. FRIEND, 1999; ROCKE,

2006).

Viele Faktoren, die einen Ausbruch beeinflussen, sind bekannt. Dennoch besteht über die einzelnen Abhängigkeiten, Abläufe und ihre Beeinflussbarkeit noch viel Un

klarheit. Förderliche Faktoren sind neben der unabdingbaren Sporenpräsenz in Bo

den und Invertebraten die Verfügbarkeit zersetzbaren organischen Materials, be

stimmte Temperatur-, Salzgehalt- und pH-Verhältnisse, eingeleitete Pestizide und Abwässer, Algenverseuchung sowie Ursachen für initial tote Vögel wie Hochspan

nungsleitungen und Hagelstürme (HOLDEN, 1997; ROCKE u. FRIEND, 1999; ROCKE,

2006).

Bei Möwen wird die Nähe zu Müllkippen und damit der Zugang zu beispielsweise sich unter Luftabschluss in Plastiktüten zersetzenden Haushaltsabfällen neben der Ernährung vom Fischfang als Intoxikationsquelle beschrieben (WORRALL, 1987).

Das Fressverhalten mit Gründeln und der Ernährung mit Maden und anderen In

vertebraten oder Abfällen scheint bei Wildvögeln die Hauptdeterminante bei der Fra

ge zu sein, welche Vogelarten betroffen sind. Entsprechend wird v. a. von Ausbrü

chen bei Stockenten und anderen Wildenten, Schwänen, Pelikanen, Watvögeln, Möwen und anderem Wassergeflügel berichtet (LÜTHGEN, 1972; FRANCIOSA et al., 1996; ROCKE u. FRIEND 1999). Aber auch unter wildlebenden Fasanen, Rebhühnern, Wachteln, Bussarden, Sperbern, Weihen und Eulen sind Botulismus-Fälle bekannt.

Diese stehen meist im Zusammenhang mit Massensterben bei Wassergeflügel bei Warmwetter-Perioden (SCHNEIDAWIND u. BOCH, 1988, S. 342, S. 369).

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Bei in Gefangenschaft lebenden Vögeln sind Ausbrüche insbesondere in Fasanerien, Zoos und in der Hühnerhaltung bekannt. Bei den beiden ersteren kam es durch kon

taminierte Fliegenmaden als Futterquelle zu Ausbrüchen. Eine Gehegegestaltung mit niedrigem buschigem Bewuchs, der Kadaver verdecken kann, scheint förderlich zu sein (SHAVE, 1970; SMITH et al., 1975). Viele Ausbrüche in zoologischen Gärten sind auf eingeflogene, erkrankte Wildvögel zurückzuführen. Die Gestaltung der Futterrati

on ist ebenfalls wesentlich: Die Analyse nach einem Ausbruch zeigt häufig die Ver

wendung von gehacktem Fleisch (SMITH et al., 1985; GÖLTENBOTH u. KLÖS, 1983).

Auch beim Wirtschaftsgeflügel handelt es sich um eine andere Ätiologie als bei Wild

vögeln. Während jahrelang angenommen wurde, dass C. botulinum in Hühnerbestän

den allgemein verbreitet ist, konnten HARDY und KALDHUSDAL (2013) zeigen, dass Ausbrüche eher auf einen Eintrag von außen zurückgeführt werden müssen. Die ge

nauen Vektoren sind dabei noch nicht bekannt. Bei Massenbodenhaltung kann es durch Koprophagie zu einer Anreicherung von C. botulinum im Darm mit nachfolgen

der Toxinbildung in den Caeca kommen (MIYAZAKI u. SAKAGUCHI, 1978; HYUN u.

SAKAGUCHI, 1989).

Allgemein werden Vögel als sehr sensitiv gegenüber Botulinum-Toxinen beschrie

ben. Sie sind besonders gefährdet, da viele sich von Insekten, Fliegenlarven, toten Invertebraten und in Gefangenschaft z. B. von gehacktem Fleisch ernähren, die ebenso wie Gewässergründe kontaminiert sein können (FRANCIOSA et al., 1996;

ROCKE u. FRIEND, 1999).

Es kommen v. a. Typ C bei Wassergeflügel, Typ E sporadisch v. a. bei Fischfres

senden Arten wie Möwen und Seetauchern und Typ A und C bei Hühnern vor. Fasa

ne sind für Typ C und evtl. E empfänglich, auch Typ A war im Experiment toxisch (SHAVE, 1970; ROCKE u. FRIEND, 1999; ROCKE, 2006). In den letzten Jahren sind Aus

brüche vermehrt auf Typ-C/D-Mosaikstämme zurückzuführen. Eine Klade eng ver

wandter Stämme scheint sich evtl. in Europa von Spanien bis Skandinavien verbrei

tet zu haben. Die Letalität bei den Mosaikstämmen ist höher als bei Typ C, insbesondere für Vögel (ANZA et al., 2014; HARDY u. KALDHUSDAL 2013; TAKEDA et al., 2005).

Fische

C. botulinum kommt in aquatischen Lebensräumen und als Kommensale im Verdau

ungstrakt und in den Kiemen bei Fischen weltweit verbreitet vor. Die Prävalenz ist dabei von der Spezies und Region abhängig und teilweise sehr hoch mit beispiels

weise 90 % von Proben in Dänemark. Die Empfindlichkeit gegenüber oral aufgenom

menem Toxin wird unterschiedlich angegeben und ist typabhängig. Forellen schei

nen relativ resistent zu sein, Goldfische (Carassius auratus) und Zebrafische (Danio