Homogenisierung verschiedener Probensubstrate . . 101

Den mechanischen Aspekt der Homogenisierung mit dem Fastprep^®-24 Instrument zeigt Abbildung IV.11 (von links nach rechts: Ausgangsmaterial, drei Homogenisie­

rungssequenzen (beim dritten Mal unter Zusatz von Wasser), nach Zentrifugation).

Die Zerkleinerung durch das Fastprep^®-24-Gerät war sehr effektiv: Die Bestandtei­

le wurden je nach Lysing Matrix zu einer ähnlichen Körnchengröße zerkleinert, ohne dass es zu einer Staubbildung kam. Zur vollständigen Homogenisierung wurde aller­

dings die Zugabe von Flüssigkeit benötigt, um eine Untermischung der verbleiben­

den großen Partikel zu erleichtern.

Fleisch

Ziegenkot

Heu

Maissilo

Abbildung IV.11: Homogenisierung mit dem Fastprep-System

102 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)

Bei der Homogenisierung von Fleisch stellte sich der Fettanteil als problematisch heraus, da er aufschwamm und nach der Zentrifugation teilweise mit dem Überstand verworfen wurde. Während sich beim Maissilo eine klare Flüssigkeit gewinnen ließ, wurden Ziegenkot und Heu zwar gut homogenisiert, aber die resultierende Flüssig­

keit enthielt insbesondere beim Ziegenkot noch viele trübende Bestandteile.

Homogenisierung von Boden, Kot und Fleisch

Im Folgenden werden geeignete Mengen für die Befüllung von 15 ml-Röhrchen be­

schrieben und die nötige Beschleunigung und Zeit, um die Probe in einen homoge­

nen Zustand zu überführen.

Boden

4 g Probe + kein Wasser: lehmig, im Fastprep®-24 Instrument nicht zu verarbeiten 4 g Probe + 2 ml H2O: Probe sofort gelöst, zähflüssig

4 g Probe + 4 ml H2O: Probe sofort gelöst, recht flüssig

Ein Gegenüberstellen von Beschleunigung und Zeit entfiel, da sich der feinkrumige Ackerboden sofort mit Wasser mischte. Das Mischungsverhältnis der Wahl war 4 g Probe mit 4 ml H2O.

Leopardenkot

3 g Probe + 3 ml H2O: nicht genug Flüssigkeit, um die Probe aufzunehmen 3 g Probe + 6 ml: gutes Verhältnis

Tabelle IV.6: Homogenisierung von Leopardenkot Lysing Matrix A Stahlkugeln

(x) = nahezu homogenisiert x = Übergang in den sierten Zustand

1 noch dickbreiig, teilw. mit chen

2 breiig, aber schon gut siert

3 flüssig, aber feine Fasern stopfen die Pipettenspitze

4 flüssig, aber Pipettieren nur mit abgeschnittener Spitze möglich

2 Ergebnisse | 103 Bei der Behandlung von Leopardenkot mit Stahlkugeln fiel auf, dass sich die Proben schon nach 10–20 s verflüssigten, aber selbst bei sehr langer Behandlung die Pipet­

tenspitze schnell verstopfte.

Fleisch

3 g Probe + 3 ml H2O: zu wenig Flüssigkeit, lässt sich auch kaum mit abgeschnittener Spitze pipettieren

3 g Probe + 6 ml H2O: gut flüssig

Bei der Verwendung von Lysing Matrix A waren bis zur max. Behandlungszeit zu etwa 90 % Flüssigkeit und 10 % sehnige Anteile vorhanden, sodass das Pipettieren teilweise erschwert war. Bei der Behandlung mit Stahlkugeln blieben generell größe­

re faserige, wolkenartige Bestandteile zurück.

Tabelle IV.7: Homogenisierung von Fleisch

Lysing Matrix A Stahlkugeln

– = nicht homogenisiert (x) = nahezu homogenisiert x = Übergang in den sierten Zustand

1 Pipettieren möglich mit normaler Spitze, mit abgeschnittener ze aber einfacher

2 Pipettieren nur mit tener Spitze möglich

3 sehr flüssig, ganz feine Teilchen verstopfen evtl. die Pipette m/s s 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60

Eine repräsentative Auswahl von Kombinationen, die zu einer guten Homogenisie­

rung geführt hatten, wurde mit gespikten Proben wiederholt und in der qPCR unter­

sucht. Die Fleischproben ergaben dabei vor den Bodenproben und diese vor den Kotproben ein Signal.

Bei den Bodenproben erzielte die Kombination Lysing Matrix A: 6,5 m/s / 60 s das früheste Signal. Insgesamt stellte sich die Lysing Matrix A besser dar als die Behand­

lung mit Stahlkugeln. Bei den Stahlkugeln war eine kürzere Behandlung besser als eine längere Zeit. Die Beschleunigung spielte dagegen keine besondere Rolle. Bei der Lysing Matrix A ergaben höhere Beschleunigungen und längere Zeiten bessere Ergebnisse.

104 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)

Für die Kotproben war eine Behandlung mit Stahlkugeln vorteilhafter. Die Beschleu­

nigung machte dabei keinen Unterschied, das Signal war bei 4,0 m/s / 20 s und bei 6,5 m/s / 20 s fast gleich. Bei der Lysing Matrix A schienen längere Zeiten zu einer Si­

gnalverschlechterung zu führen, eine höhere Beschleunigung hatte dagegen weniger Einfluss. Bei der Kombination Kot Lysing Matrix A: 5,0 m/s / 60 s wurde kein Signal erzielt.

Bei der Fleischprobe konnten beide Lysing Matrices die Probe gut bearbeiten. Bei den Stahlkugeln schienen die genauen Einstellungen nicht so wichtig zu sein. Bei der Lysing Matrix A führt eine längere Bearbeitung zu einer Signalabschwächung. Die

Abbildung IV.12: Bodenprobe mit unterschiedlichen FastPrep24-Einstellungen

Abbildung IV.13: Kot- und Fleischprobe mit unterschiedlichen FastPrep24-Einstellungen

2 Ergebnisse | 105 Kombinationen Stahlkugeln 4,0 m/s / 60 s und 6,5 m/s / 30 s sowie Lysing Matrix A 6,5 m/s / 30 s führten zu fast gleichen Kurvenverläufen.

Insgesamt schienen für Fleisch und Kot Stahlkugeln geeigneter zu sein, da es bei der Verwendung von Lysing Matrix A zu Signalverzögerungen oder -ausfällen kam.

Verlängerte Einwirkzeiten mit Stahlkugeln bei Kot und Fleisch

Bei den Fleischproben waren die Kurvenverläufe bei 30 bzw. 60 s fast gleich. Bei den Löwenproben kam es zu einem wesentlich späteren Signal bei 60 s Bearbeitungszeit.

Daher und da eine ähnliche Tendenz auch bei Kot und Fleisch mit der Lysing Ma­

trix A beobachtet worden war, wurde bei der endgültigen Auswahl einer Kombination die kürzere Zeit bevorzugt. Da es bei den Kotproben auch bei 20 oder 30 s gelegent­

lich noch zu Verstopfungen der Pipettenspitzen kam, wurde schließlich eine Zeit von 40 s gewählt. Für alle folgenden Versuche wurden schließlich folgende Kombinatio­

nen verwendet:

Boden: Lysing Matrix A 6,5 m/s / 60 s Kot: Stahlkugeln 6,5 m/s / 40 s

Fleisch: Stahlkugeln 6,5 m/s / 30 s

2.2.3.3 Inkubation über Nacht

Eine verlängerte Inkubationszeit führte bei allen Probenarten dazu, dass das Signal wesentlich früher kam. Bei allen Folgeversuchen wurde daher über Nacht inkubiert.

Abbildung IV.14: Inkubation über Nacht

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