2.3 Optimiertes Protokoll für die Real-Time-PCR
2.3.1 Extraktion aus Kulturen
1. Extraktion mittels NucleoSpin® Tissue Kit (Inkubationszeit 3 Stunden) 2. Real-Time-PCR:
Holding: 5 min bei 95 °C
35 Zyklen: 15 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C, 60 s bei 72 °C
Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes ist in Tabelle IV.8 dargestellt:
Tabelle IV.8: Zusammensetzung pro 25 μl PCR-Ansatz
Komponenten Menge
Template 5 μl
2x SuperHot PCR Master Mix (Bioron) 12,5 µl
Forward-Primer 0,3 μM
Reverse-Primer 0,3 μM
Sonde 0,2 μM
MgCl2 * 5,5 mM
Aqua dest. ad 25 µl
•Konzentration des Mastermixes entsprechend um 2,5 mM erhöhen (entspricht 0,625 µl ei
ner Ausgangslösung von 100 nmol / µl)
2.3.2 Extraktion aus Boden-, Kot- und Fleischproben
1. Homogenisation Einwaage:
Boden: 4 g Probe + 4 ml Wasser dest.
Kot und Fleisch: 3 g Probe + 6 ml Wasser dest.
Aufschluss im Fastprep®-24 Instrument in 15 ml-Röhrchen:
Boden: 6,5 m/s / 60 s Lysing Matrix A Kot: 6,5 m/s / 40 s Stahlkugeln
Fleisch: 6,5 m/s / 30 s Stahlkugeln 2. Waschen
40 mg abwiegen in 2 ml-Röhrchen
2 Ergebnisse | 107 a) 1 ml PBS-Puffer
b) c) 1 ml KCl 0,85 %
dazwischen zentrifugieren für 5 min bei 2 000 g
3. mit NucleoSpin® Tissue Kit-Protokoll fortfahren, Inkubation über Nacht 4. Real-Time-PCR:
Einstellungen für die qPCR:
Holding: 5 min bei 95 °C
40 Zyklen: 15 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C, 60 s bei 72 °C
Die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes ist in Tabelle IV.9 dargestellt:
Tabelle IV.9: Zusammensetzung pro 25 μl PCR-Ansatz
Komponenten Menge
Template 2,5 μl
2x SuperHot PCR Master Mix (Bioron) 12,5 µl
Forward-Primer 0,3 μM
Reverse-Primer 0,3 μM
Sonde 0,2 μM
MgCl2 * 10 mM
BSA 10 % 1 µl
Aqua dest. ad 25 µl
* Konzentration des Mastermixes entsprechend um 7 mM erhöhen (entspricht 1,75 µl einer Ausgangslösung von 100 nmol/µl)
108 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)
2.4 Validierung
2.4.1 Kreuzreaktivität der Primer und Sonden
Für Typ A wurden beim Primer- und Sondenset TQA1/ TQA2/ TQP alle A-Stämme mit guten Signalen und ohne Kreuzreaktionen im Gel und in der qPCR erkannt. Neun von zehn Stämmen erschienen mit einem frühen Signal in der qPCR, der Stamm 2341 etwas später. Das Primerset A1F / A1R / A1P reagierte in gleicher Weise, aber es kam beim D-Stamm 2301 und E-Stamm 2302 zu einer schwachen Kreuzreaktion im Gel. Beim Primerset A2F / A2R / A2P erschienen die Signale generell etwas später, der Stamm 2341 wurde nicht erkannt. Bereits im Gel kam es zu keiner Amplifikation.
Bei den C-Primern konnte das beste Ergebnis mit dem Primerset C7F / C7R / C7P erzielt werden. Die Stämme 2145 und 2300 ergaben ein frühes Signal, der Stamm 2279 erschien etwas später. Bei den meisten anderen Primersets (C1F / C1R / C5P, C7F / C8R / C7P, CBC01 / CBC02 / C3P und CBC01 / CBC02 / C4P) ergaben sich bei den ersten beiden Stämmen ebenfalls verwertbare Kurven, aber beim Stamm 2279 kam es allenfalls zu einer schwachen Bande im Gel und teilweise im Gel zu Kreuzre aktionen mit dem G-Stamm 2270. Die Stämme 1030, 2257, 2256 und 2294 wurden in allen Fällen in der qPCR nicht und nur einmal mit sehr schwachen Banden im Gel erkannt. Bei den letzten Primersets waren die Ergebnisse unbefriedigend. Die meis
ten Reaktionen verliefen negativ oder es entwickelte sich erst sehr spät ein Signal, welches sich über den Background und den Threshold nicht erhob. Außerdem kam es auch hier zu Kreuzreaktionen mit dem G-Stamm 2270 im Gel.
Bei Typ E reagierte das Primer- und Sondenset TQE1 / 1605 / 1518T im Gel und in der qPCR einwandfrei. Es wurden sämtliche E-Stämme mit einem frühen Signal in der qPCR und einer starken Bande im Gel erkannt. Alle anderen Stämme blieben ne
gativ.
F1F / F1R / F1P reagierte mit allen F-Stämmen mit einem frühen Signal und einer deutlichen Bande im Gel. Außerdem kam es zu einer späteren Reaktion mit einer ebenfalls schwächeren Bande beim G-Stamm 2270.
2.4.2 Nachweisgrenze
Das LOD (Q0,95) lag durchschnittlich bei 103 Bakterien pro Template. Dieses ent
spricht derselben Bakterienmenge pro mg Probe. Bei Toxin A war die Nachweisgren
ze bei 0,95%iger Sicherheit 104 Bakterien / mg. Bei 103 Bakterien / mg wurden alle Proben erkannt, aber bei einer Probe fielen zwei Wiederholungen aus, also zwei von neun Wiederholungen (22,22 %).
2 Ergebnisse | 109 Bei Typ E und C lag die diagnostische Sensitivität bei 103 Bakterien / mg. Bei bei
den wurden bis zu dieser Konzentration alle Wiederholungen korrekt erkannt. Bei E wurden bei 102 Bakterien / mg zwar noch alle Proben positiv erkannt, aber nur vier von neun Wiederholungen waren nachweisbar. Bei 101 Bakterien / mg war nur eine Wiederholung einer Probe messbar. Bei Toxin C war dieses bereits bei 102 Bakteri
en / mg der Fall.
Toxin F erzielte die besten Werte. Die Sensitivität lag bei 102 Bakterien / mg. Bei 101 Bakterien / mg wurden noch zwei von drei Proben beziehungsweise vier von neun Wiederholungen richtig erkannt.
2.4.3 Messbereich
Der Messbereich entsprach im Wesentlichen den Angaben bei der Nachweisgrenze.
Die Zuverlässigkeit der quantitativen Bestimmung der qPCR nahm erwartungsgemäß mit sinkender Konzentration des Spikens ab. Extreme Abweichungen zwischen be
rechnetem und gemessenen Wert wurden aber nur im Bereich von 101 Bakterien / mg festgestellt. Dieses betraf nur wenige Wiederholungen. Grundsätzlich lässt sich sa
gen, dass bei den niedrigeren gespikten Konzentrationen es im Regelfall zu einem Signalausfall kommt bevor die Varianz unverhältnismäßig zunimmt.
Tabelle IV.10: Messbereich
Menge gespikter Kulturen (Bakterienzahl/mg)
105 104 103 102
MW Ct 28,36 32,09 36,47 38,61
SD Ct 0,15 0,26 1,15 1,06
Given concentration (c/r) 100 000 10 000 1 000 100
Calc. concentration MW c/r 137 967 10 493 635 144
SD c/r 13 980 1835 379 90
Vr % c/r 10,13 17,48 59,64 62,52
KI [127.220,5; 148.712,84] [9083,21; 11.903,68] [344,14; 926,75] [74,93; 213,57]
110 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)
2.4.4 Reproduzierbarkeit
Die größten Varianzen ergaben sich durch die Versuchsdurchführung an verschiede
nen Tagen. Der Einfluss durch verschiedene Experimentatoren war dagegen wesent
lich geringer. Tendenziell war die Streuung bei den Tigern geringer, obwohl das Pro
benmaterial inhomogener war.
Tabelle IV.11: Reproduzierbarkeit
Tiger Rind
Ct c / r Ct c / r
SD SD Vr % SD SD Vr %
Intraassay 0,45 1909 22,96 0,51 3080 25,48
Interassay verschiedene Tage 0,85 2837 40,25 0,9 4502 39,07
verschiedene Experimentatoren 0,05 1580 33,27 0,05 1175 9,94
3 Diskussion | 111
3 Diskussion
Viele frühere Untersuchungen zum Vorkommen von C. botulinum in der Umwelt oder in klinischem Untersuchungsmaterial basieren auf einem Anreicherungsschritt mit nachfolgendem Mäuse-Bioassay (SONNABEND et al., 1987; ORTIZ u. SMITH, 1994;
LÚQUEZ et al., 2005). Es wurden verschiedene Bestrebungen unternommen, den Mäuse-Bioassay durch andere Techniken wie ELISA (Nachweis des Toxins) oder PCR (Nachweis des Toxingens) zu ersetzen (ZECHMEISTER et al., 2005; THOMAS, 1991; CAMPBELL et al., 1993; WILLIAMSON et al., 1999). Inzwischen gibt es verschiede
ne Immunoassays, die dem ELISA verwandt sind, aber meist höhere Sensitivitäten erreichen, wie den auf in Gegenwart elektrischer Spannung lumineszierender Anti
körper basierenden „electrochemilumiscence immunoassay“ (ECL) oder sogenannte ALISSA (assay with a large immunosorbent surface area) -Techniken, die mit an be
stimmte Oberflächen wie Mikrokugeln gebundene Antikörper arbeiten (GRENDA et al., 2014; GESSLER et al., 2006). Antigen-Antikörper-basierte Methoden korrelieren häufig sehr gut mit den Ergebnissen des Mäuse-Bioassays und erreichen hohe Sensitivitä
ten, können ihn aber genauso wie neuere Ansätze wie Immuno-PCR oder Massen
spektrometrie-Methoden nicht vollständig ersetzen. Beim Nachweis aus komplexen biologischen Proben verändern sich Sensitivität und Spezifität drastisch (ZECHMEISTER
et al., 2005; THOMAS, 1991; GESSLER et al., 2005; GESSLER et al., 2006; WEINGART
et al., 2010; ČAPEK u. DICKERSON, 2010). Ein hohes Potential den Mäuse-Bioassay zu ersetzen besitzt der Endopeptidase-ELISA, da er nur biologisch aktives Toxin nach
weist und Sensitivitäten von 0,6 bis 4,5 ng/ml erreicht (GRENDA et al., 2014).
Über den Nachweis des Toxingens erhält man Informationen über die Gegenwart von C. botulinum auch in seiner Dauerform. Die Polymerase-Kettenreaktion ist inzwi
schen laut DIN CEN ISO/TS 17919:2014-03 für den Nachweis BoNT-produzierender Clostridien in Lebensmitteln, Futtermitteln und Umgebungsproben zugelassen. Die verschiedenen veröffentlichten molekularbiologischen Methoden weisen sehr unter
schiedliche Sensitivitäten auf. Nested-PCR-Formate wurden zur Erhöhung der Sensi
tivität entwickelt. Reverse-Transcription PCR legen den Schwerpunkt auf den Nach
weis aktiver Gene und damit lebender Zellen (LINDSTRÖM u. KORKEALA, 2006). Die Real-Time PCR ermöglicht bei Verwendung von Hybridisierungssonden eine Erhö
hung der Spezifität in einem sehr schnellen Testverfahren bei gleichzeitiger Quantifi
zierung der Probe. Außerdem ist die qPCR sensitiver als der konventionelle Ansatz (YOON et al., 2005; VIDAL et al., 2011; GRENDA et al., 2014). Für die Entwicklung einer solchen Methode mussten eigene Primer und Sonden entwickelt werden, da mit den getesteten Primern und Sonden aus der Literatur überwiegend nur unbefriedigende Ergebnisse erzielt werden konnten. Nur für Typ E konnten die Primer nach GETCHELL
et al. (2006) genutzt werden. Die Primer nach KIMURA et al. (2001) für E waren in ih
112 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)
ren Ergebnissen schlechter als die erstgenannten. Die Duplex-PCR nach AKBULUT
et al. (2004) erzielte keinen Erfolg. Bei der Überprüfung der Primer und Sonden fielen die von AKBULUT durch einen suboptimalen GC-Gehalt und eine hohe Wahrschein
lichkeit von Hairpins und selbst-komplementären Strängen auf. Bei den Primern und Sonden von YOON et al. (2005) waren theoretisch keine Probleme zu erwarten, den
noch konnte hier keine Reaktion in der qPCR erzeugt werden. Aus Gründen der Nachweissicherheit und für eine höhere Sensitivität wurde darauf verzichtet, eine Multiplex-PCR anzustreben. FACH et al. (2009) stellten fest, dass das LOD um ein zehnfaches verbessert werden konnte, wenn sie statt der universellen Methode die Toxintyp-spezifischen qPCR-Ansätze verwendeten. Auch FLETCHER et al. (2008) be
obachteten Sensitivitätsverluste beim Multiplex-Ansatz. Das Primer- und Sondende
sign verlief entsprechend der Variabilität innerhalb der Toxintypen. Die Toxintypen für A, B und E weisen die geringsten Unterschiede auf (SMITH et al., 2005). Ein zuverläs
siges Primerset war für A dementsprechend gut generierbar: TQA1 / TQA2 / TQP. Als einzige Abweichung kam bei diesem Primerset das qPCR-Signal des Stammes 2341 etwas später. Dieser Stamm wurden generell von allen Primersets schlechter oder auch gar nicht erkannt. Bei der Kontrolle der Ausgangsextrakte im Anschluss an die Anzucht der Kulturen war hier eine schwächere Bande festzustellen, d. h. es war in diesem Extrakt vergleichsweise wenig DNA enthalten.
Beim Typ C waren nur wenige DNA-Anschnitte der Stämme geeignet für eine Ent
wicklung von Primern. Bei der Methodenentwicklung wurden zwar gute Ergebnisse erzielt, beim Test auf Kreuzreaktionen zeigte sich allerdings eine Abhängigkeit von den eingesetzten Stämmen. Die Stämme 2145 (C1), 2300 (C1) und 2279 (C) konnten ohne Schwierigkeiten erkannt werden, der Stamm 2279 entwickelte immer erst bei späteren Zyklen den typischen Kurvenverlauf. Auch dieser Stamm hatte bei Überprü
fung der DNA-Menge nach der Anzucht bereits eine schwächere Bande ergeben.
Die Reihenfolge der drei Stämme war immer dieselbe, auch bei Primersets, bei de
nen die Signale unterhalb des Threshold blieben. Die C2-Stämme 1030, 2257, 2256, und der Stamm 2294 blieben in der qPCR immer negativ oder unterhalb des Thres
holds. Im Gel konnten in seltenen Fällen schwache oder sehr schwache Banden er
zeugt werden. In Neutralisationsversuchen war der Stamm 2294 leicht positiv für B, aber auch für A bis G. Die erzielten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die BoNT/C-tragenden Stämme im Gegensatz zu den C2-Toxin produzierenden C2-Stämme gut erkannt wurden. Ob sich die Stämme 2279 als C1-Stamm und 2294 als C2-Stamm eingruppieren lassen werden, müssen spätere Untersuchungen zeigen. Bei einigen Primersets kam es zu Kreuzreaktionen mit dem G-Stamm 2270 im Gel. Das Set C7F / C7R / C7P erzielte die stärksten Signale und wies keine Kreuzreaktionen auf.
Für Typ E wurden alle E-Stämme zuverlässig erkannt und es gab keine Kreuzreaktio
nen. Das Set für Typ F arbeitete zuverlässig, war aber auch positiv für den
Typ-G-3 Diskussion | 113 Stamm 2270. Wegen der hohen genetischen Variabilität muss damit gerechnet wer
den, dass einzelne Stämme durch die Primer evtl. nicht erfasst werden (HILL et al., 2010). Hier konnte jedoch eine hohe Spezifität festgestellt werden. Bei dem nicht er
fassten C-Stamm 2294 handelt es sich vermutlich um einen C2-Stamm. Bei diesem und bei dem G-Stamm 2270 scheinen stammspezifische Besonderheiten vorzulie
gen, wie die Neutralisationsversuche beziehungsweise die mehrere Toxintypen über
greifenden Kreuzreaktionen andeuten. Kreuzreaktionen mit anderen Clostridien-Spe
zies konnten generell nicht festgestellt werden.
Während die Extraktion aus Kulturen keine besonderen Anpassungen erforderlich machte, erwies sich die Extraktion aus Boden und Kot sehr schwierig. Der Amplifika
tionserfolg vieler PCR-Methoden ist limitiert durch inhibierende Substanzen, niedrige Konzentrationen der Zielzellen oder -DNA und eine große Anzahl von Mikroorganis
men in komplexen biologischen Proben (DAHLENBORG et al., 2001). Über die direkte Interaktion mit der DNA oder Interferenz mit den Polymerasen können Stoffe die Re
aktion komplett zum Erliegen bringen oder die resultierenden Produktmengen erheb
lich reduzieren. Bekannte Inhibitoren sind Polysaccharide, Kollagene, Huminsäuren, Myo- und Hämoglobin, Lactoferrin und Immunglobuline aus Blut, Geweben und Bo
denproben. Bei der Extraktion verwendete Reagentien können die Reaktion ebenfalls stören (BESSETTI, 2007).
Bei dem zuerst verwendeten Probenset reichte die geringste Menge Einwaage be
reits aus, um die Amplifikation vollständig zum Erliegen zu bringen. Verschiedene Maßnahmen zur Verringerung der Hemmstoffe waren gleichzeitig nötig für eine er
folgreiche Reaktion. Insbesondere die Halbierung des Templates, das Waschen der Probe und der Zusatz von BSA 10 % verbesserten die Qualität der qPCR in solcher Weise, dass die gespikte DNA nachgewiesen werden konnte. Die Reduzierung der Templatemenge ist bei dem exponentiellen Verlauf einer PCR unproblematisch.
Während die Konzentration von Hemmstoffen in einen Bereich sinkt, der die Reakti
on nicht mehr stört, kommt es bezüglich der Ziel-DNA einfach zu einer Verschiebung sämtlicher Kurvenverläufe inklusive der Standardkurve nach hinten. Natürlich kann eine Einbuße bei der Sensitivität ebenso wie auch durch das Waschen nicht ganz vermieden werden. Bei den problematischen Kot- und Bodenproben 1 war eine Hal
bierung des Templates und eine Verdünnung von 1:10 nötig, um einen positiven Nachweis zu erhalten. Damit wäre die Nachweisgrenze theoretisch um ein Zwanzigs
tel geringer. Die Verdünnung konnte durch den Zusatz von BSA 10 % vermieden werden. BSA 10 % ist ein effizienter Hilfsstoff, um Hemmstoffe zu blockieren (AL -SOUD und RÅDSTRÖM, 2001). Beim Verdacht auf falsch negative Proben kann eine zusätzliche Verdünnung jedoch in Betracht gezogen werden. Bei der Weiterentwick
lung der Methode sollte eine interne Kontrolle statt der in dieser Arbeit verwendeten
114 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)
externen Kontrollen wegen der einzusparenden Zeit erwogen werden. Empfehlungen zur Standardisierung gibt die DIN EN ISO 22174:2005-05.
Beim Vergleich der Extraktionsmethoden fiel insgesamt auf, dass die einfacheren Methoden wie Kochen und die InstaGene™ Matrix sich teilweise überraschend gut im Vergleich mit den aufwändigeren Extraktionskits darstellten. Bei den Kits mag es durch die verschiedenen Aufreinigungsschritte, die oft mit einem Überführen der Pro
be z. B. auf einen Filter verbunden sind, zu DNA-Verlusten kommen. An den Wänden von Reaktionsgefäßen (GONZALEZ et al., 2007) oder auf Filtern kann DNA adsorbiert bleiben, welches die eluierte DNA-Menge senkt.
Dennoch führte die technisch bedingte höhere Verdünnung des Eluats bei der Kochmethode zu einer geringeren Sensitivität. Die InstaGene™ Matrix bewegte sich meist im Mittelfeld. Bei Verdünnungsversuchen fiel auf, dass sich der Ct-Wert bei die
ser kaum veränderte. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Methode eine hö
here Menge an Hemmstoffen mit auswusch. Ihr hemmender Einfluss könnte durch die Verdünnung verringert worden sein, sodass der Nachteil der niedrigeren Konzen
tration des Templates zum Teil wieder aufgehoben wurde. Die zu entwickelnde Ex
traktionsmethode soll für sehr verschiedene Substrate, neben anderen v. a. Boden, Fleisch und Kot von Säugern und Vögeln mit sehr unterschiedlicher Beschaffenheit, geeignet sein. Mit dem Auftreten von unerwarteten Begleitstoffen muss daher ge
rechnet werden. Weiterhin ist bei einem sehr unreinen Extrakt auch mit vermehrten unspezifischen Reaktionen zu rechnen. So ist grundsätzlich einer aufwändigeren Me
thode der Vorzug zu geben. Die Fastprep®-Reaktionen lagen insgesamt eher im hin
teren Mittelfeld. Auffällig war, dass die Kurven der Doppelbestimmungen der Fleisch
proben ungewöhnlich weit auseinander lagen. Der Grund dafür könnte in der Art des Probenmaterials selbst liegen: Die genaue Menge einzuwiegen war beim Fleisch deutlich schwieriger als bei den anderen Probenmaterialien. Außerdem ließ sich der fettige Anteil der Probe nur schwer pipettieren beim Überführen und Waschen.
Insgesamt schnitten die aufwändigeren Kits am besten ab. Der DNeasy® Blood &
Tissue Kit fiel heraus, da er sich bei zusätzlicher Verdünnung massiv verschlechter
te. Der PSP® Spin Stool DNA Kit erbrachte gegenüber den bisherigen Methoden kei
nen weiteren Vorteil.
Letztlich bewährte sich das NucleoSpin® Tissue. Ebenfalls sehr gut, teilweise so
gar bei Umweltproben besser, schnitt der AquaPure™ Genomic DNA Kit ab. Es wur
de dennoch dem NucleoSpin® Tissue der Vorzug gegeben, da der AquaPure™ Ge
nomic DNA Kit bei der Extraktion aus Kulturen sehr schlechte Ergebnisse erbracht hatte. Evtl. war der Kit mit der Extraktion hoher Mengen Kulturflüssigkeit überfordert.
Auffällig war, dass bei der Anpassung an die Extraktion aus Kot- und Bodenproben sehr hohe MgCl2-Konzentrationen nötig waren. Hohe Konzentrationen von Ca2+-Io
nen können kompetitiv Mg2+-Ionen verdrängen und damit die Enzymaktivität der Poly
3 Diskussion | 115 merase herabsetzen. Komplexbildner wie Gerbsäuren binden Mg2+-Ionen. In beiden Fällen stehen diese für die Reaktion nicht mehr zur Verfügung. Entscheidend für eine positive Reaktion war weiterhin die Verdünnung des Templates. Insbesondere für Huminsäuren gilt, dass sie bereits in sehr geringen Konzentrationen die Reaktion durch Interaktion mit der Template-DNA und der Polymerase zum Erliegen bringen können (IJZERMAN et al., 1997; SUTLOVIC et al., 2005, 2008). Erwartungsgemäß konn
te der Zusatz von BSA einen Großteil der negativen Effekte abfangen.
Verschiedene Versuche, die Sensitivität zu verbessern, brachten teilweise nicht die theoretisch zu erwartenden Ergebnisse. Ein Aufschluss in KCl brachte bei verschie
denen Versuchen erstaunlich gute Ergebnisse, obwohl KCl bekanntermaßen die PCR hemmen kann. Die eingesetzte Konzentration von 0,85 % scheint nützlich, aber nicht zu hoch gewesen zu sein (BESSETTI, 2007). Eine Lyse ausschließlich durch die thermische Einwirkung während der PCR-Zyklen führte ebenfalls zu guten Ct-Wer
ten. FRANCIOSA et al. (1996) erreichten auch gute Ergebnisse unter Beschränkung ei
nes Aufschlusses mit Hitze und Ultraschall. Sie stellten jedoch fest , dass bei einer zu hohen Sporenkonzentration die Amplifikation versagte und führten es zurück auf stö
rende Sporen-Trümmerteile oder eine zu hohe Konzentration von Ca2+-Ionen aus dem Sporencortex, die mit den für die Polymerase nötigen Mg2+-Ionen konkurrieren.
Bei einer wiederholten mechanischen Bearbeitung muss mit einer vermehrten DNA-Degradation gerechnet werden. Dennoch konnte ein solcher Effekt bei zusätzlichen Bearbeitungsgängen mit dem Fastprep®-24 Instrument nicht beobachtet werden. Es kam stattdessen zu dem erwünschten Effekt zunehmenden Aufschlusses der Spo
ren. FLETCHER et al. (2008) beobachteten auch keine negativen Effekte. Bei ihren Un
tersuchungen stellte sich die Extraktion mit dem Fastprep®-24 Instrument und Lyso
zym am effektivsten dar. Trotz der günstigen Ergebnisse der verschiedenen Ansätze konnten sie sich nicht gegenüber den kommerziellen Extraktionsmethoden durchset
zen. Die meisten Versuche wurden mit der Kochmethode als Vergleichsmethode durchgeführt. Gegebenenfalls kann eine weitere Sensitivitätssteigerung erreicht wer
den, indem die hier beschriebenen Ansätze mit der ausgewählten kommerziellen Me
thode kombiniert werden. Der Test anderer Polymerasen, die sich in ihrer Empfind
lichkeit gegenüber hemmenden Einflüssen stark unterscheiden können, führte eher zu deutlich schlechteren Ergebnissen.
Weitergehende Maßnahmen, um inhibitorische Effekte zu vermeiden, sollten zu
nehmend auf die Art der Probe zugeschnitten sein. Die Zusammensetzung der Diät nimmt großen Einfluss auf die Extraktionsergebnisse von Kotproben. Insbesondere der Anteil an pflanzlichem Material und die enthaltene Feuchtigkeit entscheiden über die Menge an Inhibitoren und Mikroorgansimen, die in den Extraktionsprozess einge
tragen werden. Die Präsenz von PCR-Inhibitoren variiert auch zwischen Individuen.
Die hier beschriebene Methode soll für viele verschiedene Probentypen geeignet
116 | IV Testentwicklung quantitative Real-Time-Polymerase Chain Reaction (qPCR)
sein. Diese unterscheiden sich jedoch in Art und Zusammensetzung erheblich. Für eine weitere Effektivitätssteigerung der Extraktionsmethode muss sie an den jeweili
gen Probentyp angepasst werden. Neben den beschriebenen allgemeinen Maßnah
men gibt es für einzelne Substanzen verschiedene spezifische Strategien. In vielen Fällen sind die Möglichkeiten, eine Probe auf ihre enthaltenen Inhibitoren hin zu ana
lysieren, jedoch begrenzt (MC ORIST et al., 2002; SCHRADER et al., 2012).
Das Fastprep®-24 Instrument bzw. der Fast DNA® SPIN Kit for Soil konnte sich als Extraktionsverfahren gegenüber den anderen Methoden nicht durchsetzen. Unver
zichtbar war das Fastprep®-24 Instrument allerdings bei der Homogenisierung der sehr unterschiedlich strukturierten Proben. Der Raubtierkot bestand zum Teil aus nur grob zerkleinerten Knochenstückchen, Stroh, Haut und Haaren mit sehr wenig bin
zichtbar war das Fastprep®-24 Instrument allerdings bei der Homogenisierung der sehr unterschiedlich strukturierten Proben. Der Raubtierkot bestand zum Teil aus nur grob zerkleinerten Knochenstückchen, Stroh, Haut und Haaren mit sehr wenig bin