Biochemische und genetische Untersuchungen zu Calcineurin aus Dictyostelium

Biochemische und genetische Untersuchungen zu Calcineurin aus Dictyostelium

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

Universität Konstanz Fakultät für Biologie

Ursula Kessen

Konstanz, 2000

Dissertation der Universität Konstanz

Referenten: Priv. Doz. Dr. R. Mutzel Prof. Dr. R. Knippers

Datum der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2000 Prüfer: Prof. Dr. D. Malchow

Prof. Dr. W. Welte

Priv. Doz. Dr. M. Hahn

It is often said (especially in the writing of research proposals for grants, a process that tends to govern our lives) that cellular slime molds are a good model system. By this one presumably means that one can apply lessons learned using slime molds to our understanding of vertebrate develop-ment, and especially human development. To me this way of thinking has always been deeply troublesome. My fascination with the experimental analysis of slime molds is based on the idea that one wants to find out about slime molds! Slime molds are a model system for the study of slime molds.

John Tyler Bonner (1991)

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Kessen, U., Schaloske, R., Aichem, A., Mutzel, R., (1999), Ca2+/calmodulin-

independent activation of calcineurin from Dictyostelium by unsaturated long

chain fatty acids. J. Biol. Chem., 274: 37821-37826

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt einen neuen, alternativen Modus zur Aktivierung der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Protein-Phosphatase Calcineurin aus Dictyostelium discoideum.

Mit Hilfe von gereinigtem Calcineurin aus D. discoideum wurde eine reversible, Ca2+/Calmodulin-unabhängige Aktivierung durch die langkettigen, ungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure, Linolsäure und Ölsäure charakterisiert. Die Aktivierung durch die ungesättigten Fettsäuren lag in der gleichen Größenordnung wie diejenige durch Ca2+/Calmodulin. Die halbmaximale Stimulation von Calcineurin durch die Fettsäuren lag unterhalb der kritischen Micellenkonzentration im Bereich von 10 µM sowohl bei Verwendung von p-Nitrophenyl- Phosphat als auch von RII Phosphopeptid als Substrat. Die sättigende Konzentration lag bei 30 µM. Die gesättigten Fettsäuren Palmitinsäure und Arachidinsäure, die Elaidinsäure (trans- Ölsäure) und der Methylester der Arachidonsäure führten zu keiner Aktivierung von Calcineurin. Diese Befunde zeigten, daß für eine Aktivierung von Calcineurin durch Fettsäuren nicht nur der ungesättigte Charakter und eine cis-Isomerie in der Doppelbindung notwendig ist, sondern auch die freie Carboxylgruppe. Es wurde gezeigt, daß die Aktivierung durch Fettsäuren unabhängig von der regulatorischen Untereinheit Calcineurin B ist und daß die Aktivierung durch Ca2+/Calmodulin und Fettsäuren nicht additiv ist.

In Bindungsstudien mit immobilisiertem Calmodulin verhinderte Arachidonsäure zum einen die Bindung von Calcineurin A an Calmodulin, zum anderen konnte bereits an Calmodulin gebundenes Calcineurin A durch Arachidonsäure von der Calmodulin-Sepharose eluiert werden.

Die Fettsäuren scheinen somit die Aktivierung durch Ca2+/Calmodulin zu imitieren, indem sie ebenfalls an die Ca2+/Calmodulin-Bindestelle binden.

Rekombinantes humanes Calcineurin wurde im Gegensatz zu Dictyostelium Calcineurin nicht durch cis-ungesättigte Fettsäuren aktiviert. Ein Unterschied zwischen den beiden Calcineurin Präparaten besteht darin, daß es sich bei dem humanen Calcineurin um ein rekombinantes Protein handelt, das in E. coli exprimiert wurde. Ein weiterer Unterschied besteht in einem gegenüber humanem Calcineurin um 45 Aminosäuren verlängerten N-Terminus des Dictyostelium Proteins. Es wurde gezeigt, daß die Expression von Dictyostelium Calcineurin A aus E. coli nicht dessen Aktivierung durch Arachidonsäure beeinträchtigt und daß die N- terminale Extension von Dictyostelium Calcineurin A keinen Einfluß auf die Fettsäure- stimulierte Aktivität hat.

Weiterhin werden in dieser Arbeit Versuche zur Manipulation der Expression des Calcineurin A Gens in D. discoideum beschrieben. Dabei wurden unterschiedliche Strategien verfolgt.

Zum einen wurde sense und antisense RNA unter der Kontrolle des Discoidin Promotors und des contact sites A Promotors in Dictyostelium exprimiert. Im Fall des Discoidin Promotors konnte weder bei der sense Mutante eine Überproduktion von Calcineurin A, noch bei der antisense Mutante eine Verringerung der Calcineurin A Expression gegenüber dem Wildtyp festgestellt werden. Im Fall des contact sites A Promotors zeigten die Calcineurin A sense und die Calcineurin A antisense Mutanten eine gleich hohe Calcineurin A Expression, die im Vergleich zum Wildtyp sichtbar erhöht war.

Zum anderen wurde versucht, die Calcineurin A Expression durch Veränderung der extrazellulären Ca2+-Konzentration zu manipulieren. Dabei wurden differenzierende Zellen über unterschiedliche Zeiträume mit 3 mM, 30 mM, 60 mM Ca2+ oder 1 mM Ca2+ und 100 µM des Ca2+-ATPasen Inhibitors BHQ behandelt, oder mit 3 mM EGTA bzw. mit 10 mM BAPTA. Unter keiner dieser Bedingungen konnte jedoch eine veränderte Calcineurin A Expression beobachtet werden.

In einem dritten Ansatz wurde versucht, die Calcineurin Aktivität in vivo durch Überproduktion der autoinhibitorischen Domäne (AID) zu verringern. Phänotypisch zeigten die isolierten Mutanten keinen Unterschied zum Wildtyp. Bei diesen transformierten Zellinien konnte die mRNA für die AID nachgewiesen werden, nicht jedoch das AID Protein, welches vermutlich instabil war. Auch durch die Überexpression einer durch die Fusion an GFP stabilisierten AID konnte keine phänotypische Veränderung der Mutante gegenüber dem Wildtyp beobachtet werden. Mit dem gereinigtem GFP-AID-Fusionsprotein konnte in einem Phosphatasetest eine Hemmung der Calmodulin stimulierten Aktivität von 45% beobachtet werden. Die Basalaktivität lag bei ca. 38%. Dies legt den Schluß nahe, daß in vivo bereits eine geringe Calmodulin stimulierte Calcineurin Aktivität ausreicht, um einen normalen Phänotyp aufrecht zu erhalten.

Abkürzungen

AA AID BAPTA

BHQ

BSA CaM cAMP

cGMP

CKII CNA CNB DIF dNTP DPH DTT EDTA EGTA

FKBP FS GFP InsP3 InsP3-R InsP5

Arachidonsäure

autoinhibitorische Domäne 1,2-bis(2-aminophenoxy) ethan N,N,N´,N´-tetraacetat

2,5-di-(t-butyl)-1,4- hydrochinon

Rinderserumalbumin Calmodulin

3´5´ zyklisches Adenosin Monophosphat

3´5´ zyklisches Guanosin Monophosphat

Caseinkinase II Calcineurin A Calcineurin B

differentiation inducing factor Desoxyribonukleotide

1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrien Dithiothreitol

Ethylendinitrilotetraessigsäure Ethylendioxybis(ethylennitrilo) -tetraessigsäure

FK506 Bindeprotein Fettsäuren

green fluorescent protein Inositol-1,4,5-trisphosphat Inositol-1,4,5-trisphosphat -Rezeptor

Inositol-1,3,4,5,6- pentakisphosphat

IPTG

kb kDa LPC Ni-NTA ODx

PC PEI PKA PLA2 PLC pNPP PP2C PP5 RII

SDS TBS Tm tx

U U/min

Isopropyl-ß-D- thiogalactopyranosid kiloBasen

kiloDalton

Lysophosphatidylcholin Nickel-Nitriloessigsäure optische Dichte bei der Wellenlänge x nm Phosphatidylcholin Polyethylenimin Proteinkinase A Phospholipase A2 Phospholipase C

para-Nitrophenylphosphat Proteinphosphatase 2C Proteinphosphatase 5 regulatorische Untereinheit Typ II der cAMP-abhängigen Proteinkinase

Natriumdodecylsulfat Tris buffered saline Schmelztemperatur Entwicklungsstadium: x Stunden nach Entzug des Mediums

Units

Umdrehungen pro min

Inhalt

I Einleitung

Dictyostelium discoideum ...1

Signaltransduktion in D. discoideum ...4

Calcium...5

Calcium in Eukaryonten...5

Calcium in Dictyostelium ...6

Calcium-Bindeproteine...7

Calmodulin und Calmodulin-Bindeproteine ...9

Calcineurin...9

Struktur und Eigenschaften...9

Funktionen von Calcineurin ... 12

Calcineurin in Dictyostelium ... 14

Ziele dieser Arbeit ... 16

II Materialien und Methoden

Sonstige Materialien... 18

Antikörper... 18

Plasmide... 18

Oligonucleotide (Primer)... 19

Biologisches Material... 19

Bakterienstämme... 19

Dictyostelium discoideum ... 20

Medien... 20

Lösungen und Puffer ... 21

Puffer für zellbiologische Arbeiten... 21

Puffer für molekularbiologische Arbeiten ... 21

Puffer für biochemische Arbeiten... 22

Zellbiologische Methoden... 23

Anzucht von D. discoideum ... 23

Wachstum von D. discoideum auf Bakterien ... 23

Transformation von D. discoideum... 23

Entwicklungsreihen von D. discoideum ... 23

Fluoreszenzmikroskopie ... 24

Molekularbiologische Methoden... 24

Molekularbiologische Standardmethoden ... 24

Polymerasekettenreaktion (PCR) ... 24

Konstruktion der Vektoren... 25

RNA-Extraktion aus D. discoideum... 26

Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde ... 27

RNA Agarose Gelelektrophorese... 27

Northern blot ... 27

Biochemische Methoden... 28

Reinigung von überexprimiertem Calcineurin A aus Dictyostelium Zellen... 28

Reinigung von rekombinantem Calcineurin A aus E. coli... 28

Reinigung eines Fusionsproteins aus green fluorescent protein und der autoinhibitorischen Domäne von Calcineurin A (GFP- AID) aus E. coli ... 29

Bestimmung der Phosphataseaktivität von gereinigtem Calcineurin A ... 30

Herstellung von Extrakten aus D. discoideum Zellen... 30

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)... 31

Coomassie Färbungen ... 31

Western-blotting nach Kyhse-Andersen ... 31

Immunfärbung von Protein-Blots... 31

Affinitätsreinigung des Antiserums gegen rekombinantes Calcineurin A ... 32

Bindungsstudien von Calcineurin A an Calmodulin-Sepharose 4B ... 32

Bestimmung der kritischen Micellenkonzentration... 32

Ansetzen von Fettsäurelösungen ... 33

Proteinbestimmungen... 33

III Ergebnisse

Charakterisierung der Aktivierung von Dictyostelium Calcineurin ... 34

Dosis-Abhängigkeit der Calmodulin-stimulierten Calcineurin Aktivität... 34

Effekt von Arachidonsäure auf die Calcineurin Aktivität ... 35

Substratspezifität der Calcineurin Aktivierung durch Arachidonsäure ... 36

Effekte anderer cis-ungesättigter Fettsäuren auf die Calcineurin Aktivität... 38

Spezifität der Aktivierung durch ungesättigte Fettsäuren... 39

Reversibilität der Calcineurin Aktivierung durch Arachidonsäure.. 41

Untersuchung der Calcineurin Bindung an immobilisiertes Calmodulin in Anwesenheit von Arachidonsäure bzw. Arachidonsäure Methylester... 42

Ermittlung der kritischen Micellenkonzentration von Arachidonsäure ... 44

Effekt von Arachidonsäure auf die Aktivität von rekombinantem

humanem Calcineurin... 45 Untersuchungen zu Unterschieden zwischen rekombinantem

humanem Calcineurin und Calcineurin aus Dictyostelium... 46 Untersuchungen zur Aktivität von gereinigtem

rekombinantem Dictyostelium Calcineurin A... 46 Aktivität von gereinigtem rekombinantem Dictyostelium Calcineurin A mit deletiertem N-Terminus ... 48 Versuche zur Manipulation der Calcineurin Expression in Dictyostelium... 50

Versuche zur Verringerung der Calcineurin A Expression in

Dictyostelium mit Hilfe der antisense Mutagenese... 50 Expression von sense bzw. antisense RNA unter der Kontrolle des Discoidin Promotors... 50 Expression von sense bzw. antisense RNA unter der Kontrolle des contact sites A Promotors. ... 51 Manipulation der Calcineurin Expression durch Veränderung der

extrazellulären Calcium Konzentration... 53 Versuche zur Verringerung der Calcineurin Aktivität in vivo durch

Überproduktion der autoinhibitorischen Domäne ... 54 Versuche zur Verringerung der Calcineurin Aktivität durch

Überproduktion eines GFP-AID Fusionsproteins ... 56

IV Diskussion

Untersuchungen zur Aktivierung von Calcineurin durch ungesättigte

Fettsäuren... 59 Versuche zur Manipulation der Calcineurin Expression in

Dictyostelium ... 66

V Literatur

Einleitung

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I Einleitung

Dictyostelium discoideum

Im Jahre 1869 wurde der erste Vertreter der Dictyosteliden von Oskar Brefeld beschrieben (Brefeld, 1869). Er klassifizierte den Organismus, den er aus Pferdedung isolierte, als Dictyostelium mucoroides. Dictyostelium discoideum wurde 1933 in North Carolina von Kenneth B. Raper entdeckt und aufgrund seiner Morphologie (Schleimhülle, Sporen) taxonomisch den "zellulären Schleimpilzen" (Acrasiomyceten) zugeordnet (Raper, 1935).

Sussman und Sussman selektionierten 1967 aus dem Wildtypisolat NC-4 den Stamm AX-1, der infolge zweier unabhängiger Mutationen in der Lage ist, in axenischem Medium zu wachsen (Sussman und Sussman, 1967). Der in dieser Arbeit verwendete Stamm AX-2 wurde von Watts und Ashworth aus AX-1 Zellen gewonnen (Watts und Ashworth, 1970). Vergleichende Studien von 16S und 5S rRNA Sequenzen (Hori et al., 1980; McCarroll et al., 1983) und von Proteinsequenzen (Loomis und Smith, 1990) deuten darauf hin, daß sich die Dictyosteliden schon früh in der Stammesgeschichte, noch vor den Pflanzen und Pilzen, vom eukaryontischen Hauptzweig abgespalten haben.

D. discoideum durchläuft einen sehr interessanten Lebenszyklus (Abb. 1), der sich durch eine Trennung von Zellwachstum und Zelldifferenzierung auszeichnet (Übersichten in Bonner, 1967; Loomis, 1982; Mutzel, 1991). Während der Wachstumsphase leben die haploiden Amöben als einzellige Organismen im humushaltigen Waldboden bzw. in einer axenischen Kultur. Im natürlichen Habitat besteht ihre Nahrungsquelle aus Bodenbakterien, welche von ihnen phagozytiert werden. Versiegt das Nahrungsangebot, oder wird den Zellen unter Laborbedingungen das Wachstumsmedium entzogen, stellen die Zellen das Wachstum ein und die Differenzierung wird eingeleitet. Dabei geben die Amöben die einzellige Lebensweise zugunsten eines Zellverbandes auf.

Nach einer Hungerperiode von etwa 4 bis 5 Stunden beginnen einzelne Zellen spontan pulsartig zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP) auszuschütten. Umliegende Zellen empfangen das chemotaktische Signal und schütten ihrerseits wieder cAMP aus, so daß es zu einer Ausbreitung des Signals kommt.

Extrazelluläres cAMP wird schnell durch sekretierte Phosphodiesterasen abgebaut (Malchow et al., 1972) und somit eine Resensitivierung der Zellen ermöglicht. Die Zellen beginnen, sich chemotaktisch in Richtung der höheren cAMP-Konzentration zu orientieren und

Einleitung

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bewegen sich in langen Strömen auf das Aggregationszentrum zu. Adhäsionsproteine an der Zelloberfläche ermöglichen es den Zellen, Kontakte auszubilden (Gerisch, 1986) und sich zu einem Zellverband aus bis zu 105 Zellen (Gerisch et al., 1975) zusammenzuschließen.

Aus diesem Zellverband entsteht ein von einer Schleimhülle umgebenes Pseudoplasmodium, welches die Form einer kleinen Nacktschnecke (slug) besitzt. Im slug können bereits verschiedene Zelltypen unterschieden werden: im anterioren Bereich, sowie vereinzelt auch posterior (anterior like cells) befinden sich die Prästielzellen. Im posterioren Bereich sind die Präsporenzellen lokalisiert, welche etwa 80% der gesamten Zellpopulation ausmachen (Übersicht: in Gross, 1994). Der slug ist in der Lage, sich auf seinem Untergrund fortzubewegen und phototaktisch bzw. thermotaktisch einen günstigen Standort für die Kulmination zu erreichen. Diese Fortbewegung wird durch die Schleimhülle ermöglicht, welche nach dem Prinzip einer Planierraupe ein Widerlager für die sich bewegende Zellmasse darstellt (Bonner et al., 1950; Francis, 1964).

Während der Kulmination, die ca. 16 bis 19 h nach Hungerbeginn eintritt, wandern die Prästielzellen durch die Präsporenregion zur Fußscheibe und bilden den Stiel aus. Die Sporenzellen werden bei diesem Vorgang von den sich bildenden Stielzellen nach oben befördert. Nach etwa 24 h hat sich ein vollständiger Fruchtkörper gebildet. Dieser besteht aus abgestorbenen Stielzellen, die Zellulose eingelagert und eine pflanzenähnliche Vakuole ausgebildet haben (Loomis, 1982) und Sporenzellen, die in der Lage sind, extreme Umweltbedingungen zu überdauern. Unter günstigen Bedingungen keimen diese Sporen wieder aus, bilden eine Amöbe und schließen damit den Entwicklungszyklus.

D. discoideum eignet sich besonders zum Studium verschiedenster zellulärer Vorgänge, wie Signaltransduktion, Chemotaxis, Bewegung, Differenzierung und Musterbildung (Übersichten in Loomis, 1982; Gerisch, 1987; Williams, 1988). Aufgrund seiner exponierten Lage im stammesgeschichtlichen Stammbaum ist Dictyostelium auch für Evolutionsstudien ein interessanter Organismus. Dictyostelium ist mit einem relativ kleinen Genom von etwa 40 Megabasen (Firtel und Jacobson, 1977), die sich auf 7 Chromosomen verteilen (Robson und Williams, 1980), für molekularbiologische Manipulationen leicht zugänglich (Übersicht in Kuspa et al., 1995). Programme zur Bestimmung der Sequenz des Genoms und von exprimierten Genen sind im Gang (http://genome.imb-jena.de//dictyostelium/ und http://dicty.cmb.nwu.edu/dicty/dictyostelium_genomics.htm). Etablierte Methoden wie die Inaktivierung von Genen durch gene disruption, gene replacement oder durch Restriktionsenzym vermittelte Integration von Plasmiden (REMI), die partielle Verminderung der Proteinexpression durch Transkription von antisense mRNA oder die Überexpression eines Proteins sind Instrumente, die eine Untersuchung oben genannter Aspekte ermöglichen können.

Einleitung

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Abb. 1: Darstellung des Lebenszyklus von D. discoideum. (1) Auskeimung der Sporen; (2) Wachstum vegetativer Zellen; (3) chemotaktische Reaktion auf cAMP (4) Aggregation; (5) first finger Stadium;

(6) wandernder slug; (7) Ausbildung eines mexican hat, Beginn der Kulmination; (8) Kulmination; (9) ausdifferenzierter Fruchtkörper.

Einleitung

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Signaltransduktion in D. discoideum

Bei einer Stimulation durch cAMP bindet der chemotaktische Lockstoff an spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfäche. Dadurch werden eine Reihe intrazellulärer Reaktionen ausgelöst (Van Haastert, 1995; Parent und Devreotes, 1996). Nach 3-5 s kommt es zu einer vorübergehenden Polymerisierung von G-Actin zu F-Actin, welches dann mit dem Cytoskelett assoziiert (McRobbie und Newell, 1983; Europe-Finner und Newell, 1986). Es kommt zu einer Freisetzung von Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3) mit einem Maximum nach 5 s (Europe- Finner und Newell, 1987). Nach cAMP-Stimulation konnte außerdem ein Anstieg der Konzentration von zyklischem GMP (cGMP) beobachtet werden, mit einem Maximum bei 10 s.

Dieser Botenstoff hat eine besondere Bedeutung bei der chemotaktischen Bewegung, indem er die Interaktion von Myosin mit dem Cytoskelett reguliert (Newell und Liu, 1992; Newell et al., 1995; van Haastert und Kuwayama, 1997) .

Nach 6-12 s beginnt ein Einstrom von Ca2+-Ionen über die Plasmamembran mit einem Maximum bei 30 s (Wick et al., 1978; Bumann et al., 1984), der von einem Ausstrom gefolgt wird. Durch die Abgabe von Protonen nach 30-40 s sinkt der extrazelluläre pH (Malchow et al., 1978). Zu diesem Zeitpunkt erfolgt zudem eine Änderung der Myosin II-Phosphorylierung und Lokalisation (Berlot et al., 1985; Liu et al., 1993; Liu und Newell, 1994). Die Weiterleitung des cAMP-Signals an die umliegenden Zellen erfolgt nach 90 s. Zu diesem Zeitpunkt erreicht die intrazelluläre cAMP-Konzentration einen Höhepunkt (Wurster et al., 1977; Devreotes, 1989).

Auf welche Weise das Signal in der Zelle beendet wird, ist unklar. Vaughan und Devreotes schlugen eine Phosphorylierung der cAMP-Rezeptoren vor, wodurch eine Autostimulation verhindert und die Zellen desensitiviert werden sollten (Vaughan und Devreotes, 1988). Diese Hypothese konnte von Kim und Mitarbeitern nicht bestätigt werden. Sie eliminierten die Phosphorylierungsstellen des cAMP-Rezeptors und konnten zeigen, daß diese Manipulation nicht die Adaption einiger Rezeptor-vermittelter Antworten wie z.B. die Aktivierung der Adenylyl- und Guanylyl-Zyklasen und die Actin Polymerisierung beeinträchtigte. Zudem waren die Rezeptoren ohne Phosphorylierungsstellen weiterhin in der Lage, Chemotaxis, Aggregation und Differenzierung zu vermitteln (Kim et al., 1997).

Bevor ausführlich die Rolle von Ca2+ als sekundärer Botenstoff in Dictyostelium beschrieben wird, wird im folgenden ein allgemeineres Kapitel über Ca2+ in Eukaryonten vorangestellt.

Einleitung

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Calcium

Calcium in Eukaryonten

Für eukaryontische (und prokaryontische) Zellen ist es aufgrund ihres phosphat- abhängigen Stoffwechsels wichtig, eine niedrige intrazelluläre Ca2+-Konzentration aufrecht zu erhalten, da freies Ca2+ mit Phosphaten Komplexe bildet, die in wässriger Lösung unlöslich sind. Die cytosolische Ca2+-Konzentration von Säugerzellen liegt im Ruhezustand bei ca. 10-7 M und damit deutlich unter der extrazellulären Ca2+-Konzentration von etwa 10-3 M. Durch die Öffnung von Ca2+-Kanälen in der Plasmamembran kann aufgrund dieses Gradienten leicht eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration herbeigeführt und somit ein second messenger - Signal ausgelöst werden.

Es gibt unterschiedliche Mechanismen durch die ein Ca2+-Einstrom über Ca2+- selektive Kanäle ausgelöst werden kann (Übersicht in: Tsien und Tsien, 1990): sekundäre Botenstoffe können an sogennante SMOC's (second messenger operated calcium channels) binden, VOC's (voltage operated channels) werden über elektrische Spannung reguliert.

Weitere Regulationsmechanismen sind die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor bei den ROC's (receptor operated channels), mechanische Einflüsse bei MOC's (mechanically operated channels) oder eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern bei den SOC's (store operated channels).

Im Lumen der Speicherorganellen besteht ebenfalls eine hohe Ca2+-Konzentration, so daß auch hier ein ausgeprägter Ca2+-Gradient über die Membran existiert. Bisher sind zwei C a 2 + -Kanäle untersucht worden, die einen Ca2 + -Strom über die Membran von Speicherorganellen ermöglichen. Zum einen der Ryanodin-Rezeptor, der mit Hilfe von Ryanodin, einem pflanzlichen Alkaloid, charakterisiert werden konnte. Es wird angenommen, daß in diesem Fall Ca2+ selbst ein physiologischer Ligand ist und nach Bindung die Ca2+- induzierte Ca2+-Freisetzung aus Speicherorganellen auslöst (Übersicht in: Ehrlich, 1995). Ein weiterer Ca2+-Kanal ist der InsP3-Rezeptor. Dieser Kanal kann durch eine Erhöhung der InsP3-Konzentration geöffnet werden, welche durch die Phospholipase C (PLC) vermittelt wird.

Auch eine Änderung des Phosphorylierungsstatus' des InsP3-Rezeptors kann indirekt zu einer Freisetzung von Ca2+ führen. Untersuchungen an Fibroblasten bzw. Zellen aus dem Rattenhirn zeigten, daß die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung eine Änderung der Affinität des Rezeptors zu dem Liganden zur Folge hat (Zhang et al., 1993; Cameron et al., 1995).

Einleitung

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Der Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran und die intrazellulären Speicherorganellen stehen miteinander in Verbindung. Der Füllungszustand der Ca2+-Speicher reguliert dabei den Ca2+-Einstrom. Für dieses Phänomen gibt es unterschiedliche Bezeichnungen. Putney beschrieb es als "kapazitativen Ca2+-Einstrom" (Übersicht in Putney, 1990; Fasolato et al., 1994; Berridge, 1995), Hoth und Penner als ICRAC (calcium release activated calcium current) (Hoth und Penner, 1992).

Ca2+-Ionen sind bedeutende intrazelluläre Botenstoffe eukaryontischer Zellen (Carafoli, 1987). Durch ihre Bindung an spezifische Proteine, die eine Konformationsänderung und damit eine Modulation der Aktivität des Proteins zur Folge hat, wirken sie als Effektoren, die eine Vielzahl zellulärer Prozesse regulieren (Übersicht in Berridge, 1993). Ca2+ wirkt als Signalgeber z.B. in der frühen Entwicklung bei der Gametogenese oder der Aktivierung der Proteinexpression im befruchteten Ei (Whitaker und Irvine, 1984; Eisen und Reynolds, 1985;

Turner et al., 1986), bei der Regulation der Proteinbiosynthese (Brostrom und Brostrom, 1990) und der Regulation der Zellteilung (Lu et al., 1992). In differenzierten Zellen ist Ca2+ unter anderem bei der Kontraktion von Skelettmuskeln, dem Aufbau von Cytoskelettkomponenten, bei der Zellbewegung, Sekretion von Neurotransmittern (Übersicht in Evered und Whelan, 1986), bei der Exocytose und bei der Modulation der Genexpression von Bedeutung (Burns et al., 1994; Dedhar et al., 1994).

Calcium in Dictyostelium

Auch in Dictyostelium spielt Ca2+ als Signalgeber eine wichtige Rolle (Übersicht in Newell et al., 1995). Die Stimulation mit cAMP hat einen Einstrom von Ca2+ über die Plasmamembran (Bumann et al., 1984) und damit eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+- Konzentration zur Folge. Dieser transiente intrazelluläre Ca2+-Anstieg konnte mit dem Ca2+- Indikator FURA-2 nachgewiesen werden (Schlatterer et al., 1994; Yumura et al., 1996).

Eine aktive Phospholipase A2 (PLA2) ist nötig für den cAMP-induzierten Ca2+- Einstrom, wie mit mehreren PLA2 Inhibitoren gezeigt wurde (Schaloske und Malchow, 1997).

Ein Reaktionsprodukt der PLA2, nämlich langkettige Fettsäuren, setzen Ca2+ vorwiegend aus sauren Ca2+-Speichern frei (Schaloske et al., 1998). Schaloske und Mitarbeiter diskutierten (Schaloske et al., 1998), daß eine Freisetzung von Ca2+ zu einer Aktivierung einerseits der PLC und andererseits der InsP5-Phosphatase führen kann. Beide Enzyme aus Dictyostelium sind Ca2+-abhängig (Bominaar et al., 1994; Van Dijken et al., 1995) und haben eine Freisetzung von InsP3 zur Folge. InsP3 setzt daraufhin Ca2+ aus InsP3-sensitiven Speichern frei, was zu einem kapazitativen Ca2+-Einstrom führt. Der Einstrom wird von einer erhöhten Ca2+-Aufnahme in den InsP3-sensitiven Ca2+-Speicher angetrieben (Flaadt et al., 1993).

Einleitung

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Diacylglycerin ist das zweite Reaktionsprodukt, das neben InsP3 aus der PLC katalysierten Reaktion hervorgeht und kann zu einer Aktivierung der Proteinkinase C führen.

Ludérus und Mitarbeiter konnten in rohen Zellextrakten Proteinkinase C Aktivität messen, die von Phospholipiden und Ca2+ abhängig war (Ludérus et al., 1989).

Unterweger und Schlatterer konnten zeigen, daß ein transientes Ca2+-Signal bei der Chemotaxis für die Bewegung und Orientierung gebraucht wird (Unterweger und Schlatterer, 1995). Ca2+-Ionen sind auch an der Umorganisierung des Cytoskeletts beteiligt. Malchow und Mitarbeiter konnten zeigen, daß die Phosphorylierung der schweren Ketten von Myosin II, durch Ca2+ gehemmt wird (Malchow et al., 1981). Dadurch wird eine Dissoziation des Myosin II vom Cytoskelett verhindert. Neben der Chemotaxis werden durch Ca2+-Signale unter anderem Zellaggregation, Differenzierung und Morphogenese reguliert (Gross, 1994; Newell et al., 1995) Maeda und Maeda vermuteten, daß Ca2+ bei der Entwicklung von Prästielzellen beteiligt ist (Maeda und Maeda, 1973). Pinter und Gross hingegen schlossen aus ihren Ergebnissen, daß Ca2+ nicht für eine Zelltyp-spezifische Genexpression verantwortlich ist und sowohl in Präsporenzellen als auch in Prästielzellen von Bedeutung ist (Pinter und Gross, 1995).

Ca2+-Ionen haben einen Einfluss bei der Regulation der Genexpression (Blumberg et al., 1989; Schaap et al., 1996). Durch den differentiation inducing factor (DIF) wird die Expression stielzellspezifischer Gene induziert (Kay und Jermyn, 1983). Es konnte gezeigt werden, daß DIF eine langsame Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration bewirkt.

Diese Erhöhung der Ca2+-Konzentration, als auch die differenzielle Genexpression konnten mit Hilfe des Ca2+-ATPasen Inhibitors BHQ nachgeahmt werden (Schaap et al., 1996).

Calcium-Bindeproteine

Die prominentesten Ca2+-bindenden Strukturen in Ca2+-Bindeproteinen sind die sogenannten EF-Hands. Sie bestehen aus zwei zueinander senkrecht angeordneten α-Helices und einer Ca2+-bindenden interhelicalen Schleife. Ca2+-Bindeproteine mit regulatorischen Funktionen werden häufig als Ca2+-Sensoren, solche die eine Ca2+-Puffer oder -Transport Funktion haben und zur Ca2+-Homöostase beitragen, als Ca2+-Pufferproteine bezeichnet (da Silva und Reinach, 1991). Ca2+-Sensor Proteine besitzen in der Regel vier EF-Hand Motive.

Zu dieser Gruppe gehören z.B. Calmodulin, Calcineurin B (die regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 2B) und Caltractin, das bei der Mikrotubuli Organisation von Bedeutung ist.

Ebenfalls zu den Ca2+-Sensoren gehören mit zwei EF-Hand Motiven Troponin C und die Familie der S100 Proteine sowie mit einem EF-Hand Motiv die regulatorische Myosin leichte Kette (Übersicht in Persechini et al., 1989; Ikura, 1996). Diese Proteine sind ebenfalls in der Lage, ein Ca2+-Signal in der Zelle zu detektieren, und eine Reihe zellulärer Prozesse

Einleitung

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auszulösen.

Zu den Ca2+-Puffer Proteinen gehören unter anderem Parvalbumin, Calbindin, Calretinin, Calreticulin und Calsequestrin. Calsequestrin ist in Ca2+-sequestrierenden Vesikeln lokalisiert und in der Lage, Ca2+-Ionen mit geringer Affinität (Kd ≅ 1 mM) und einer hohen Kapazität zu binden ( 50 Ca2+-Ionen pro Molekül) (Carafoli und Penniston, 1985; Evered und Whelan, 1986). Calreticulin ist ebenfalls ein Ca2+-Puffer Protein mit hoher Kapazität und niedriger Affinität (Kd ≅ 2 mM; Bindekapazität > 25 mol Ca2+/mol Protein) (Übersicht in Krause und Michalak, 1997).

Weitere Ca2+-bindenden Strukturen sind die sogenannten C2-Domänen (Übersicht in Rizo und Südhof, 1998). Sie bestehen aus einem kompakten Stapel von zwei je viersträngigen ß- Faltblattstrukturen. Drei bzw. vier Schleifen, an denen auch die Ca2+-Bindung erfolgt, verbinden die ß-Faltblätter. Die meisten Proteine, die C2-Domänen enthalten, haben eine Funktion in der Signaltransduktion oder im Membrantransport. Die erste Kategorie umfaßt Proteine, die an der Bildung von Lipiden als second messenger beteiligt sind (z.B. die cytoplasmatische PLA2 (Clark et al., 1991), die PLC (Rhee et al., 1989) und die Phosphatidylinositol-3-Kinase (Hiles et al., 1992)) oder die bei der Proteinphosphorylierung (z.B die PKC (Coussens et al., 1986; Knopf et al., 1986)), der Aktivierung von GTPasen (z.B Ras-GAP (Trahey et al., 1988)) und im Ubiquitin Stoffwechsel (z.B Nedd4 (Plant et al., 1997)) von Bedeutung sind.

Die zweite Kategorie beinhaltet Synaptotagmine (Perin et al., 1990; Perin et al., 1991), Rabphilin-3 (Shirataki et al., 1993), Rim (Wang et al., 1997) und Munc13 (Brose et al., 1995).

In D. discoideum sind mehrere Ca2+-Bindeproteine identifiziert worden: Calfumirin 1 ist am Übergang von der Wachstumsphase zur Differenzierung beteiligt (Itoh et al., 1998);

DdCAD-1 ist ein Adhäsionsmolekül, welches an der Bildung von Zellkontakten beteiligt ist (Wong et al., 1996); CBP1 (Coukell et al., 1995), CBP2 (Andre et al., 1996) und CBP3 (Han und Kang, 1998) sind entwicklungsabhängig regulierte Proteine, deren Funktion im Zellgeschehen aber noch unklar ist. Verschiedene Cytoskelettproteine wie z.B α-Actinin (Witke et al., 1993) und Severin (Eichinger et al., 1991) binden ebenfalls Ca2+.

Eines der wichtigsten Ca2+-Bindeproteine in Dictyostelium ist Calmodulin (Jamieson und Frazier, 1983), welches eine Reihe von Enzymen beeinflussen kann. Daher wird im nächsten Kapitel näher darauf eingegangen.

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Calmodulin und Calmodulin-Bindeproteine

Calmodulin ist eines der wichtigsten Ca2+-Bindeproteine in eukaryontischen Zellen und an einer Vielzahl Ca2+-abhängiger Signaltransduktionswege beteiligt (Cohen und Klee, 1988).

Calmodulin ist ein hochkonserviertes, hitzestabiles und mit 16700 Dalton ein relativ kleines Molekül (Watterson et al., 1980). Seine hantelförmige Struktur beinhaltet zwei globuläre Domänen mit je zwei Ca2+-Bindestellen, die durch eine lange α-Helix voneinander getrennt sind. Die Ca2+-Bindestellen sind vom sogenannten EF-Hand Typ mit einem charakteristischen Helix-Loop-Helix Motiv (Kretsinger, 1980; Babu et al., 1988).

Die Bindung von Ca2+ führt zu einer Konformationsänderung, bei der saure und hydrophobe Bereiche an der Proteinoberfläche präsentiert werden. Dadurch wird eine Bindung an die Zielproteine ermöglicht (Übersicht in James et al., 1995). Obwohl alle Calmodulin Bindestellen aus einer positiv geladenen amphiphilen α-helicalen Struktur bestehen, besitzen sie nur eine geringe Sequenzhomologie (O'Neil und DeGrado, 1990).

Zu den Zielproteinen gehören Enzyme des Metabolismus zyklischer Nucleotide, wie die Phosphodiesterase und die Adenylat-Zyklase; Cytoskelettproteine wie MAP-2, Tau und Neuromodulin; die Ca2+/Calmodulin abhängigen Kinasen I und II; die NAD Kinase; die Ca2+-ATPase und Calcineurin (Übersicht in Klee und Vanaman, 1981; James et al., 1995).

Mit Hilfe der Calmodulin-Overlay-Technik (Winckler et al., 1991), wurden eine Reihe von Calmodulin-Bindeproteinen aus Dictyostelium nachgewiesen, von denen eines als ein Homolog zu dem ribosomalen Protein L19 aus Säugern (Sonnemann et al., 1991) und ein weiteres als Calcineurin identifiziert wurde (Dammann et al., 1996). Außerdem wurde eine Calmodulin-abhängige Proteinkinase (Dunbar und Wheldrake, 1994), eine Myosin schwere Kette Kinase (Maruta et al., 1983) und eine Calmodulin-bindende Isoform von Myosin (Zhu und Clarke, 1992) beschrieben sowie mehrere Calmodulin-Bindeproteine, deren Funktion noch nicht aufgeklärt werden konnte (Lydan und O´Day, 1993).

Calcineurin

Struktur und Eigenschaften

Calcineurin wurde erstmals aus dem Rinderhirn isoliert (Wang und Desai, 1977; Klee und Krinks, 1978). In diesem Gewebe ist es mit einem Anteil von 0.5% der gesamten löslichen Proteine das vorherrschende Calmodulin-Bindeprotein. Da Calcineurin Calmodulin mit hoher

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Affinität bindet, wurde zuerst angenommen, daß es die Konzentration von freiem Calmodulin reguliert. Stewart und Mitarbeiter jedoch identifizierten Calcineurin als eine Ca2+- und Calmodulin-abhängige, Serin/Threonin spezifische Phosphatase (Stewart et al., 1982). Diese Ergebnisse waren unerwartet, da lange Zeit angenommen wurde, Dephosphorylierungsprozesse seien konstitutiv und würden keiner Regulation unterliegen (Guerini, 1997). Nach einer Klassifikation von Ingebritsen und Cohen wird Calcineurin als eine Proteinphosphatase vom Typ 2B bezeichnet (Ingebritsen und Cohen, 1983).

Das Säugerenzym ist ein Heterodimer, welches aus zwei Untereinheiten besteht: aus einer katalytischen von 60 kDa (Calcineurin A) und einer regulatorischen von 19 kDa (Calcineurin B). Beide Untereinheiten sind so fest aneinander gebunden, daß sie nur unter denaturierenden Bedingungen dissoziieren (Klee et al., 1988). Die katalytische Untereinheit ist in mehrere Domänen unterteilt. N-Terminal liegt die katalytische Domäne, die etwa 2/3 des Proteins ausmacht. C-terminal ist die Calcineurin B- und die Calmodulin-Bindestelle sowie die autoinhibitorische Domäne lokalisiert (Abb. 2).

Die katalytische Kernregion von etwa 250 Aminosäuren besitzt zu derjenigen der Proteinphosphatasen 1 und 2A eine Sequenzidentität von 40 bis 45% (Guerini und Klee, 1989;

Kincaid et al., 1990), was auf eine gemeinsame Abstammung der katalytischen Untereinheiten schließen läßt. Im aktiven Zentrum konnte ein für alkalische und saure Phosphatasen typisches Zn2+/Fe2+-bindendes Motiv identifiziert werden (Vincent und Averill, 1990). Die Calcineurin B Bindedomäne ist mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität zwischen Säuger, Pilzen und Dictyostelium sehr stark konserviert (Übersicht in Kincaid, 1993). Die Calmodulin Bindedomäne ist nur schwach konserviert (Kincaid, 1993), bildet aber in ihrer Sekundärstruktur eine für Ca2+/Calmodulin-Bindestellen typische basische amphiphile α-Helix (Kincaid et al., 1988). Röntgenstrukturanalysen zeigten, daß die autoinhibitorische Domäne in Abwesenheit von Ca2+/Calmodulin an der katalytischen Domäne lokalisiert ist und dadurch den Zugang von Substraten zu dem aktiven Zentrum blockiert (Kissinger et al., 1995). Durch die Bindung von C a 2 + /Calmodulin erfährt Calcineurin eine Konformationsänderung, bei der die autoinhibitorische Domäne verlagert und das Enzym somit aktiviert wird. Eine proteolytische Abspaltung der autoinhibitorische Domäne führt zu einer dauerhaften Aktivierung von Calcineurin. Bei diesem proteolysierten Enzym ist zwar noch eine Bindung von Ca2+/Calmodulin, jedoch keine Regulation mehr möglich (Manalan und Klee, 1983; Kincaid et al., 1986).

Politino und King konnten zeigen, daß Calcineurin durch die Assoziation mit Micellen, die aus sauren Phospholipiden bestehen, aktiviert wird (Politino und King, 1990). Diese Aktivierung erfolgt über die regulatorische Untereinheit von Calcineurin, Calcineurin B (Politino und King, 1991).

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CKII katalytische Region regulatorische Region

katalytische Domäne CNB CaM AID

C-Terminus

Dictyostelium

Säuger, Hefe, Drosophila

Domänenstruktur von Calcineurin A

N-Terminus

Abb. 2: Domänenstruktur des Calcineurin A Homologs aus Dictyostelium im Vergleich zu Hefe, Drosophila und Säuger. CNB = Calcineurin B-Bindestelle; CaM = Ca²⁺/Calmodulin-Bindestelle;

AID = autoinhibitorische Domäne; CKII = Konsensussequenzen für Caseinkinase II und Calmodulin-anhängige Kinase II Phosphorylierungsstellen und schwache Konsensussequenzen für Proteinkinase A Phosphorylierungs- stellen.

Humanes Calcineurin B ist ein hochaffines Ca2+-Bindeprotein vom EF-Hand Typ mit zwei N-terminalen (1 und 2) und zwei C-terminalen Ca2+-Bindestellen (3 und 4) (Klee et al., 1979). Feng und Stemmer (Feng und Stemmer, 1999). konnten zeigen, daß die N-terminalen Bindestellen eine geringere Affinität für Ca2+ besitzen als die C-terminalen. Mutationen in den Ca2+-Bindestellen 1 oder 2 von Calcineurin B hatten ein geringeres stöchiometrisches Bindungsverhältnis von Calcineurin B zu Calcineurin A und eine geringere Phosphopeptid- Phosphatase Aktivität zur Folge im Vergleich zum Holoenzym mit Wildtyp Calcineurin B oder mit Calcineurin B, das Mutationen in den Ca2+-Bindestellen 3 und 4 enthielt. Die Bindung von Ca2+ an die Bindestellen 1 und 2 variiert in vivo wahrscheinlich mit der Ca2+-Konzentration und ist möglicherweise für eine dynamische Modulation der Enzym-Funktion zuständig.

Dagegen ist die Ca2+-Bindung an die Bindestellen 3 und 4 schon bei Konzentrationen unter 10-7 M gesättigt und für die Struktur der Phosphatase verantwortlich (Feng und Stemmer, 1999).

Calcineurin B wird N-terminal myristoyliert (Aitken et al., 1982). Diese kovalente Modifikation hat weder einen Einfluß auf die Ca2+-Bindung, die Enzymaktivität noch auf eine Assoziation von Calcineurin an Membranen, jedoch konnte eine erhöhte Thermo- und damit eine erhöhte Strukturstabilität beobachtet werden (Kennedy et al., 1996).

Die Phosphataseaktivität von Calcineurin ist über Calmodulin und Calcineurin B in zweifacher Hinsicht Ca2+-abhängig. Ca2+ bindet hoch kooperativ an Calmodulin (Hill Koeffizient von 2.8-3). Durch die Bindung des Ca2+/Calmodulin-Komplexes wird die autoinhibitorische Domäne von der Substratbindestelle entfernt und die Vmax erhöht, ohne den

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Km Wert zu beeinflussen. Die Bindung von Ca2+ an Calcineurin B erhöht die Substrataffinität der Phosphatase (Erniedrigung des Km Werts), ohne die Vmax zu verändern (Stemmer und Klee, 1994).

Calcineurin ist insensitiv gegenüber den Phosphatase Inhibitorproteinen I und II (Übersichten in Shenolikar, 1994; Cohen et al., 1996). Gegenüber Okadainsäure und Microcystin ist Calcineurin weniger sensitiv als die Proteinphosphatasen vom Typ 2A. Die Calmodulin-stimulierte Phosphataseaktivität von Calcineurin kann durch Calmodulin Antagonisten, wie z.B. Trifluoperazin und Melittin gehemmt werden (Übersicht in Cohen, 1989). In vivo wird Calcineurin durch die Immunsuppressiva FK506 und Cyclosporin A inhibiert. FK506 und Cyclosporin A binden dabei an die intrazellulären Rezeptormoleküle FK506-Bindeprotein (FKBP) bzw. Cyclophilin und hemmen die Calcineurin Aktivität somit indirekt (Liu et al., 1991).

Funktionen von Calcineurin

Die am besten charakterisierte Funktion von Calcineurin ist die Ca2+-abhängige Regulation der Transkription des Interleukin II (IL-2) Gens im Zusammenhang mit der T- Zellaktivierung. Die Stimulierung des T-Zellrezeptors bewirkt u.a. eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und damit einhergehend eine Aktivierung von Calcineurin durch Ca2+/Calmodulin. Der Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T-cells) besteht aus einer cytoplasmatischen und einer im Kern lokalisierten Untereinheit. Wird die cytoplasmatische Komponente des NF-AT von Calcineurin dephosphoryliert, wird der Faktor in den Kern importiert. Im Zellkern binden beide Untereinheiten von NF-AT an Enhancer Regionen des IL-2 Gens (McCaffrey et al., 1993) und aktivieren die Transkription (Übersicht in Crabtree und Clipstone, 1994).

Auch in Saccharomyces cerevisiae spielt Calcineurin eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression. Calcineurin ist dabei unter anderem bei der Adaptation an hohe Salzkonzentrationen (Nakamura et al., 1993) und an der Pheromon Antwort (Cyert und Thorner, 1992) beteiligt. Hefezellen, bei denen die Gene für Calcineurin A oder B ausgeschaltet sind, können nicht den von dem Paarungspheromon α-Faktor induzierten Arrest der Zellen in der G1-Phase aufheben. Für einen Wiedereintritt in den Zellzyklus ist eine Desensibilisierung des Systems nötig, bei der unter anderem Calcineurin beteiligt ist.

Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß die Induktion von Genen, deren Produkte bei den oben angeführten Vorgängen von Bedeutung sind, Ca2+-abhängig über eine Interaktion von Calcineurin mit dem Transkriptionsfaktor Tcn1p (bzw. Crz1p) reguliert wird (Matheos et al., 1997; Stathopoulos und Cyert, 1997; Stathopoulos-Gerontides et al., 1999). Calcineurin ist in

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Hefezellen außerdem an der Ca2+-Sequestrierung, der Zytokinese und der Sporulation beteiligt (Yoshida et al., 1994; Tanida et al., 1995).

Bei Aspergillus nidulans ist Calcineurin beim Zellwachstum und bei der Zellteilung von Bedeutung. Wird das Gen für Calcineurin A ausgeschaltet, wird bei den Zellen der Übergang von der G1-Phase zur S-Phase des Zellzyklus blockiert (Rasmussen et al., 1994). Unter- suchungen über die Wachstumsfaktor stimulierte DNA Synthese von 3T3 Fibroblasten mit Hilfe von Cyclosporin A und FK506 führten zu der Vermutung, daß Calcineurin in diesen Zellen ebenfalls den Übergang von der G1- zur S-Phase reguliert (Tomono et al., 1996).

In den Neuronen des Hippocampus führt die Aktivierung von Calcineurin zu einer Hemmung der Freisetzung der Neurotransmitter Glutamat und γ-Aminobuttersäure (GABA) (Stelzer, 1992; Nichols et al., 1994). Weiterhin ist Calcineurin an der Desensitivierung der postsynaptischen, N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptoren beteiligt (Lieberman und Mody, 1994). Aufgrund der komplexen Regulation der NMDA-Rezeptoren wurde eine mögliche Beteiligung von Calcineurin an Lern- und Erinnerungsprozessen vorgeschlagen (Bear und Malenka, 1994; Masuy et al., 1998; Winder et al., 1998; Kato et al., 1999). Es wurde gezeigt, daß Calcineurin in Neuronen sowohl die Expression des InsP3-Rezeptors Typ 1 (Genazzini et al., 1999), als auch die Expression der Isoform 4CII der Ca2 + -ATPase 4 aus der Plasmamembran kontrolliert (Guerini et al., 2000). Calcineurin ist darüberhinaus an der Regulierung des Neuritenwachstums (Chang et al., 1995) und an der synaptischen Plastizität beteiligt (Übersicht in: Yakel, 1997) und scheint eine Rolle bei der Alzheimer'schen Krankheit zu spielen (Übersicht in: Kincaid, 1995).

Calcineurin regulierte Prozesse wurden auch bei der Apoptose vermutet. Der Transkriptionsfaktor Nur77 wird für die T-Zell-Rezeptor (TCR) vermittelte Apoptose in Hybridoma Zellen und warscheinlich auch in Thymocyten benötigt. Es wurde gezeigt, daß Cyclosporin A die TCR-vermittelte Aktivierung von Nur77 hemmt, indem es die DNA Bindeaktivität des Transkriptionsfaktors blockiert (Yazdanbakhsh et al., 1995).

Asai und Mitarbeiter exprimierten in Nervenzellen konstitutiv aktives Calcineurin in hoher Menge. Dabei beobachteten sie eine verstärkte Induktion von Cytochrom C/Caspase-3- vermittelter Apoptose. Dieser Effekt konnte durch die Calcineurin Inhibitoren Cyclosporin und FK506 reduziert werden (Asai et al., 1999).

Bei der Exocytose scheint Calcineurin von allgemeinerer Bedeutung zu sein. Es hemmt die Hormonfreisetzung aus den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse (Renström et al., 1996) und aus Zellen der Hypophysen-Tumorzellinie AtT20 (Antoni et al., 1995). Eine Aktivierung der Exocytose durch Calcineurin konnte bei Mastzellen (Hultsch et al., 1990), neutrophilen Granulozyten (Forrest et al., 1991) und bei Paramecium (Momayezi et al., 1987) beobachtet werden.

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An Neuronen konnte gezeigt werden, daß Calcineurin bei der Endocytose von synaptischen Vesikeln eine wesentliche Rolle spielt. Bei einem durch synaptische Aktivität ausgelösten Ca2+-Einstrom wird Calcineurin aktiviert und dephosphoryliert daraufhin Dynamin 1. Dadurch wird die GTPase Aktivität von Dynamin vermindert und das Recycling von synaptischen Vesikeln stimuliert (Liu et al., 1994).

Unabhängig von der katalytischen Aktivität bindet Calcineurin Ca2+-abhängig an Dynamin 1 und wird auf diese Weise mit dem endocytotischen Proteinkomplex verbunden.

Wird die Interaktion zwischen Dynamin 1 und Calcineurin unterbrochen, so wird die Clathrin vermittelte Endocytose gehemmt (Lai et al., 1999).

Über das FK506 Bindeprotein FKBP12 wird eine Interaktion von Calcineurin mit dem Ryanodin-Rezeptor (Jayaraman et al., 1992; Timerman et al., 1993; Brillantes et al., 1994) und dem InsP3-Rezeptor (Cameron et al., 1995; Cameron et al., 1997) vermittelt. Ein weiteres Bindeprotein für Calcineurin ist AKAP79 (A kinase anchoring protein), das in Neuronen identifiziert wurde. AKAP79 bindet auch an die cAMP-abhängige Proteinkinase und an die Proteinkinase C (Klauck et al., 1996; Faux et al., 1999). Durch die Bindung zwischen Calcineurin und AKAP79 wird Calcineurin an die Plasmamembran transloziert und die Enzymaktivität der Phosphatase inhibiert (Coghlan et al., 1995).

Als ein weiteres Calcineurin Bindeprotein wurde das Protein Cain (Calcineurin inhibitor protein) identifiziert. Es konnte gezeigt werden, daß Cain in vitro und in vivo an Calcineurin bindet, was zu einer nicht kompetitiven Hemmung der Phosphataseaktivität führt (Lai et al., 1998).

Calcineurin in Dictyostelium

Calcineurin A, für das es in Dictyostelium nur ein Gen gibt, wurde von Dammann und Mitarbeitern kloniert und molekularbiologisch charakterisiert (Dammann et al., 1996). Das Enzym besitzt eine hohe Homologie auf Aminosäureebene zu Calcineurin A anderer Organismen wie z.B. Neurospora crassa (66%), Säugern (64%), Saccharomyces cerevisiae (61%) und Drosophila melanogaster (59%). Die katalytische Region, die autoinhibitorische Domäne und die Calcineurin B-Bindestelle sind hoch konserviert. Im Gegensatz zum Säugerenzym besitzt Calcineurin A aus Dictyostelium Extensionen am N- und C-Terminus.

Innerhalb der C-terminalen Extension befinden sich eine Konsensussequenz für Caseinkinase II (CKII) und für die Calmodulin-abhängige Kinase II (CaM-Kinase II) Phosphorylierungsstellen und einer schwachen Konsensussequenz für Proteinkinase A (PKA), die jeweils viermals wiederholt werden (Abb. 2). Calcineurin B wird zur Zeit in unserer Arbeitsgruppe von A.

Aichem bearbeitet.

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Die Expression von Calcineurin A ist entwicklungsabhängig reguliert. Zu Beginn der Differenzierung nimmt die Expression von Calcineurin im Vergleich zur vegetativen Phase ab.

Dieser Abfall wird gefolgt von einem Anstieg während der Aggregatbildung. Zu diesem Zeitpunkt beginnt auch die Differenzierung in Prästiel- und Präsporenzellen. Horn und Gross beobachteten, daß die Calcineurin Hemmstoffe Cyclosporin A und FK506 die Differenzierung beeinflussen (Horn und Gross, 1996). Die Hemmstoffe wurden in einem in vitro Differenzierungstest in Anwesenheit von cAMP zugesetzt. Bei Wildtypzellen wurde dadurch die Stielzellbildung, bei der sporogenen Mutante V12 die Sporenbildung gehemmt. Beide Hemmstoffe reduzierten die Expression von Prästiel- und Präsporen- spezifischen mRNA Transkripten in beiden Zelltypen. Calcineurin hat daher möglicherweise Einfluß auf die frühe Differenzierung, nicht jedoch auf die Reifung der zwei Zelltypen in Stiel- bzw. Sporenzellen.

Hellstern und Mitarbeiter etablierten die Reinigung von Dictyostelium Calcineurin A, das durch ein bakterielles Expressionssystem gewonnen wurde und von Calcineurin A aus überexprimierenden Dictyostelium Zellen (Hellstern et al., 1997). Beide Proteine wurden biochemisch charakterisiert. Zudem wurde ein neuer Hemmstoff für Calcineurin identifiziert, nämlich Phenylarsenoxid (PAO). Die halbmaximale Hemmung lag zwischen 4 und 8 µM (Hellstern et al., 1997). PAO wurde bislang im allgemeinen als Tyrosinphosphatasen Inhibitor eingesetzt. Der Hemmstoff imitiert die Bildung von Disulfidbrücken, indem es benachbarte Sulfhydrylgruppen quervernetzt. Dieser Befund führte zu der Hypothese, daß Calcineurin in vivo durch Redoxprozesse reguliert werden könnte (Bogumil et al., 2000).

Während des Wachstums und der Entwicklung reagieren Dictyostelium Zellen auf millimolare Konzentrationen von extrazellulärem Ca2+ unter anderem mit einer erhöhten Expression der Ca2+-ATPase PAT1 (Moniakis et al., 1999). Moniakis und Mitarbeiter konnten weiterhin zeigen, daß Calcineurin an diesem Prozess beteiligt ist: Der Zusatz von Cycloheximid, Cyclosporin A oder FK506 hemmte die Ca2+-induzierte Induktion des patA Gens. Diese Induktion hängt somit von der Synthese eines oder mehrerer Proteine ab und wird durch Calcineurin vermittelt.

Calcineurin wird außerdem eine Beteiligung an der chemotaktischen Antwort auf cAMP zugeschrieben. In Gegenwart des Calcineurin Inhibitors Deltamethrin wurde eine Hemmung der Chemotaxis beobachtet (Polesky und O´Day, 1995).

Bislang konnten durch homologe Rekombination keine Dictyostelium Mutanten mit ausgeschaltetem Calcineurin A Gen isoliert werden (Dammann, 1994; Kessen, 1995). Lydan und Mitarbeiter identifizierten mit Hilfe von Southern blots eine Calcineurin knock out Mutante (Lydan et al., 1995). Western blot Analysen mit Antikörpern gegen Dictyostelium Calcineurin A zeigten jedoch nach wie vor eine Expression von Calcineurin in dieser Mutante (M. Lydan, persönl. Mitteilung).

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Um die Calcineurin Expression in vivo zu manipulieren, wurde im Rahmen meiner Diplomarbeit bereits antisense mRNA für Calcineurin A unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Actin Promotors exprimiert (Kessen, 1995). Bei den gewonnenen Mutanten konnte über 6 Wochen hinweg ein verringerter Calcineurin Gehalt um ca. 85% in den Zellen festgestellt werden, der mit stark verlängerten Generationszeiten einherging (36-48h) verglichen mit dem Wildtyp (8h). Je länger die Zellen kultiviert wurden, desto mehr nahm jedoch die Reversionshäufigkeit zu. Die Zellen begannen mit kürzeren Generationszeiten zu wachsen, bis sie die des Wildtyps erreicht hatten. Zu diesem Zeitpunkt zeigten die antisense Mutanten wieder eine Calcineurin Expression, die der des Wildtyps entsprach. Die antisense Expression schien eine starke Gegenselektion und damit einhergehend eine schnelle Reversion des Phänotyps zu bewirken. Diese Beobachtungen ließen darauf schließen, daß Calcineurin während der Wachstumsphase essentiell und eine Ausschaltung von Calcineurin letal ist.

Ziele dieser Arbeit

D. discoideum muß in seiner natürlichen Umgebung unter Umständen mit extremen Umweltbedingungen zurechtkommen. So kann beispielsweise die extrazelluläre Ca2+- Konzentration sehr gering sein. Dictyostelium ist auch unter diesen Bedingungen zur Chemotaxis fähig (Malchow et al., 1982; Unterweger und Schlatterer, 1995). Da ein intrazellulärer Anstieg der Ca2+-Konzentration für die Chemotaxis auf cAMP essentiell (Unterweger und Schlatterer, 1995) und Calcineurin an der chemotaktischen Antwort beteiligt ist (Polesky und O´Day, 1995), müssen Mechanismen existieren, die zur Unterstützung der Ca2+- Signale dienen, um Calcineurin zu aktivieren. Kandidaten für einen sekundären Botenstoff stellen ungesättigte Fettsäuren dar, da sie bei der cAMP-Signaltransduktion eine Rolle spielen (Schaloske und Malchow, 1997; Schaloske et al., 1998). Bei zwei anderen Serin/Threonin Phosphatasen (PP5, PP2C) konnte gezeigt werden, daß sie durch ungesättigte Fettsäuren aktiviert werden (Chen und Cohen, 1997; Skinner et al., 1997; Klumpp et al., 1998). Unter Berücksichtigung der genannten Befunde war es ein Ziel dieser Arbeit, eine alternativen Modus zur Aktivierung von Calcineurin zu charakterisieren.

Über die Bedeutung von Calcineurin in Dictyostelium ist bisher wenig bekannt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand somit darin, mehr Aufschlüsse über seine Funktion zu erhalten, indem die Expression bzw. die Aktivität des Proteins manipuliert werden sollte. Dazu wurden in dieser Arbeit verschiedene Strategien eingeschlagen. Durch die Expression von sense und antisense mRNA und durch Veränderung der extrazellulären Ca2+-Konzentration sollte die Expression von Calcineurin A manipuliert und durch Überexpression der autoinhibitorischen Domäne die Aktivität in vivo reduziert werden.

Materialien und Methoden

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II Materialien und Methoden

Chemikalien

Ampicillin Sigma (München)

Arachidonsäure (freie Säure) Fluka (Buchs, Schweiz) Arachidonsäure-Methylester ICN (Eschwege)

Bactopepton Oxoid (Wesel)

Bactotrypton Gibco (Karlsruhe)

Biomol Green Reagent Biomol (Hamburg)

Calcineurin (human, rekombinant) Biomol (Hamburg)

Calmodulin (Rinderhirn) Alexis (San Diego, Ca., USA) Calmodulin-Sepharose 4B Pharmacia (Freiburg)

Coomassie Brilliant Blue R 250 Serva (Heidelberg)

CSPD Roche (Mannheim)

DIG DNA Labeling Kit Roche (Mannheim)

DMPC Sigma (München)

DPH (1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrien) Fluka (Buchs, Schweiz)

Elaidinsäure Fluka (Buchs, Schweiz)

Expand High Fidelity PCR System Roche (Mannheim)

Folsäure Sigma (München)

Geneticin (G418) Calbiochem (Bad Soden)

Hefeextrakt (für 2YT Medium) Gibco (Karlsruhe) Hefeextrakt (für axenisches Medium) Oxoid (Wesel)

Heringssperma DNA Roche (Mannheim)

IPTG Roth (Karlsruhe)

Linolsäure ICT (Bad Homburg)

Magermilchpulver (Freema Reform) Fink GmbH (Herrenberg)

Maltose Merck (Darmstadt)

Molekulargewichtsstandard LMW Pharmacia (Freiburg) Molekulargewichtsstandard SDS-7B Sigma (München)

Ni-NTA Agarose Qiagen (Hilden)

NZ-Amine A (Caseinhydrolysat) Interorgana (Köln)

Ölsäure ICN (Eschwege)

Polyethylenimin (PEI) Fluka (Buchs, Schweiz) p-Nitrophenylphosphat Merck (Darmstadt)

Materialien und Methoden

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Palmitinsäure Sigma (München)

Phosphat Standard Biomol (Hamburg)

RII Phosphopeptid Biomol (Hamburg)

Rinderserumalbumin (Fettsäure frei) ICN (Eschwege) Rinderserumalbumin Fraktion V Roth (Karlsruhe)

Rotiblock Roth (Karlsruhe)

Vitamin B12 Sigma (München)

Enzyme für die Molekularbiologie wurden bei MBI Fermentas (St.Leon-Rot) bezogen.

Gereinigtes Calcineurin B aus rekombinierten E. coli wurde freundlicherweise von Annette Aichem zur Verfügung gestellt.

Sonstige Materialien

Röntgenfilme Fuji RX Allmedt (Essen)

Protran Nitrozellulose (BA 85, 0.45 µM) Schleicher und Schüll (Dassel) Nytran Nitrozellulose (NY 13N, 0.45 µM) Schleicher und Schüll (Dassel)

Glasfaserfilter Millipore (Eschborn)

Dialysemembran (Spectra/Por 6 MWCO 3500)

Spectrum Medical Industries (L.A., USA)

HA- Filter Millipore (Eschborn)

Antikörper

Peroxidase gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen IgG wurde von Dianova (Hamburg) bezogen.

Der Antikörper gegen rekombinantes Dictyostelium Calcineurin A ist bei (Winckler et al., 1991) beschrieben.

Plasmide

pQE30 Qiagen (Hilden)

pDNeoII (Witke et al., 1987)

pDNeogfp (Rauchenberger et al., 1997)

pDcsA (Faix et al., 1995)

Materialien und Methoden

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pVEII (Blusch et al., 1992)

pDNeoII AB42.2 (Dammann, 1994)

pUC18/Sma/CN 1.Ori. diese Arbeit

pUC18/Sma/CN 2.Ori. diese Arbeit

pQE30 CNA ∆ ATG diese Arbeit

pQE30 CNA ∆ N-Terminus diese Arbeit

pQE30 GFP-AID diese Arbeit

pDNeoII AID diese Arbeit

pDNeogfp AID diese Arbeit

pDcsA CNA sense diese Arbeit

pDcsA CNA antisense diese Arbeit

pVEII CNA sense diese Arbeit

pVEII CNA antisense diese Arbeit

Oliogonucleotide (Primer)

Die Oligonucleotide wurden von MWG Biotech (Ebersberg) bezogen.

AID FW 5'- CGC GGA TCC AAA TCA TTC TCT CCC TCT AGA -3'

AID FW 3 5'- CGC GGA TCC CCA TGA AAT CAT TCT CTC CCT CTA G -3'

AID REV 5'- CCG GAA TTC TTA TTT AGC AAC TTC AGT TTG G -3'

CNA*N-term. FW 5'- CGG GGA TCC ACA TTG AAA CCA CCA CAA CC -3'

CNA REV 5'- CCC AAG CTT TAG CAA CTT CAG TTT GGG -3'

CNA*ATG FW Neu 5'- CGG GGA TCC AGT ACT AAT AAT AAT AAA GCA CC -3'

GFP-AID FWD 5'- CGG GGT ACC GCT TGC ATG CCC ATG AGT AAA GG -3'

GFP-AID REV 5'- CCC AAG CTT TTA TTT AGC AAC TTC AGT TTG GGT TG -3'

Biologisches Material

Bakterienstämme

Stamm Genotyp Bezugsquelle

E. coli sure e14-(McrA-) ∆(mcrCB-hsd SMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]c

Stratagene (La Jolla, USA)

Materialien und Methoden

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XL-1-blue F´:Tn10 proA+B+ lacIq ∆ (lacZ) M15/recA1 endA1 gyrA96(Nalr) thi hsdR17 (rk-mk+) supE44 relA1 lac

New England Biolabs (Schwalbach)

M15 Lac- Ara- Gal- Mtl- F- Qiagen (Hilden)

Dictyostelium discoideum

AX-2 Laborstamm

E 1 Calcineurin A überproduzierender AX-2 Stamm (Hellstern, 1997)

Medien

Flüssigmedien Festmedien

Axenisches Medium 14.3 g Bactopepton, 7.15 g Hefeextrakt, 18.0 g Maltose, 0.486 g KH2PO4,

1.28 g Na2HPO4 x 12 H2O, 5.0 µg / l Vitamin B12, 200 µg / l Folsäure, ad 1 l Aqua bidest., pH 6.7

NZA-Medium 1% NZ-Amine-A (w/v), 0.5% Hefeextrakt (w/v), 0.5% NaCl (w/v)

2 Y T

1.6% Bactotrypton (w/v), 1% Hefeextrakt (w/v), 0.5% NaCl (w/v)

Nähragarplatten für E. coli B/r 20 g Agar, 0.5 g Glucose, 0.5 g Bactopepton, + 1 l SP-Puffer

LB-Platten 10 g Bactotrypton 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl, 10 g Agar, +1 l Aqua bidest.

Materialien und Methoden

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Lösungen und Puffer

Puffer für zellbiologische Arbeiten

Soerensen-Phosphat-Puffer (SP) 13 mM KH2PO4,

4 mM Na2HPO4 x 12 H2O, + 1 l Aqua bidest., pH 6.0

Puffer für molekularbiologische Arbeiten

Blocklösung

10% Magermilchpulver (w/v) in:

100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl,

0.3% Tween 20 (v/v), pH 7.5

Detektionspuffer 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5

High-SDS Puffer

7% SDS (w/v),

50% deionisiertes Formamid (v/v), 5 x SSC,

2% Blocklösung (v/v), 50 mM Na-Phosphat, pH 7.0, 0.1% N-Lauroylsarcosin (v/v)

RNA-Farbmarker 50% Saccharose (w/v), 0.25% Bromphenolblau (w/v), in DMPC behandeltem H2O

10 x RNA-Gelpuffer 200 mM MOPS, 50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA, pH 8.0

RNA-Laufpuffer 20 mM MOPS 5 mM Na-Acetat, 1 mM EDTA, pH 7.0

RNA-Probenpuffer 50% Formamid (v/v), 6% Formaldehyd 37% (v/v), in 1 x RNA-Gelpuffer, pH 8.0

Waschpuffer 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl,

0.3% Tween 20 (v/v), pH 7.5

20 x SSC 3 M NaCl,

0.3 M Na-Citrat, pH 7.0

Materialien und Methoden

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Puffer für biochemische Arbeiten

2 x SDS-Probenpuffer 150 mM Tris-HCl, pH 6.8 0.0015% Bromphenolblau (w/v), 15% Glycerin (v/v),

3% SDS (w/v),

1% β-Mercaptoethanol (v/v),

Elektrophoresepuffer 30.3 g Tris-HCl,

144 g Glycin, 10 g SDS, + 1 l Aqua bidest.

T B S

10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl,

0.05% NP-40 (v/v), pH 7.4

Coomassie-Färbelösung

0.05% Coomassie Brilliant Blue R250 (w/v),

25% Isopropanol, 10% Essigsäure

Coomassie-Entfärbelösung

20% Methanol, 10% Essigsäure

Ni-NTA Lysepuffer 50 mM NaPO4 300 mM NaCl,

10 mM Imidazol, pH 8.0

Ni-NTA Waschpuffer 50 mM NaPO4,

300 mM NaCl,

30 mM Imidazol, pH 8.0

Ni-NTA Elutionspuffer 50 mM NaPO4,

300 mM NaCl,

250 mM Imidazol, pH 8.0

Dialysepuffer A 50 mM Tris-HCl 300 mM NaCl, pH 7.8

French Press Puffer

50 mM NaPO4, 300 mM NaCl, pH 8.0

Harnstoff Lysepuffer 8 M Harnstoff,

100 mM NaPO4, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0

Harnstoff Waschpuffer 8 M Harnstoff,

100 mM NaPO4, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Imidazol, pH 8.0

Harnstoff Elutionspuffer 8 M Harnstoff,

100 mM NaPO4, 10 mM Tris-HCl,

250 mM Imidazol, pH 8.0

Dialysepuffer 1 4 M Harnstoff,

100 mM Tris-HCl, pH 7.5

Dialysepuffer 2 2 M Harnstoff,

100 mM Tris-HCl, pH 7.5

Testpuffer A 50 mM Tris-HCl, 0.5 mM MnCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, pH 7.8

Testpuffer B 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2, 6 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 8.0

S t o p l ö s u n g 1 M Na2CO3, 20 mM EDTA, 2 mM EGTA, pH 8.0

Ca2+-Puffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, pH 7.8

Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM EGTA, 0.5 mM DTT, pH 7.8

Materialien und Methoden

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Zellbiologische Methoden

Anzucht von D. discoideum

Aus Sporen wurde eine Vorkultur in axenischem Medium bei 23°C und unter konstantem Schütteln mit 150 U/min angezüchtet. Bei einer Zelldichte von ca. 5 x 106 Zellen/ml wurde daraus die Hauptkultur angeimpft, die bis zu einer Zelldichte von 5-7 x 106 Zellen/ml gehalten wurde. Die Zelldichten wurden mit einer Neubauer Zählkammer ermittelt.

Wachstum von D. discoideum auf Bakterien

Auf einer Nähragarplatte wurde 500 µl einer dichten Zellsuspension von E. coli B/r in SP-Puffer gleichmäßig ausplattiert. Nach dem Antrocknen wurden Dictyostelium Zellen auf dem Bakterienrasen ausgebracht und die Platte bei 23°C im Dunkeln inkubiert.

Transformation von D. discoideum

Dictyostelium Zellen wurden mit Hilfe des kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) nach einer Methode von (Boussif et al., 1995) transformiert. Zellen, die auf eine Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml gewachsen waren, wurden zweimal in kaltem, sterilem SP-Puffer gewaschen und auf eine Dichte von 1.5 x 106 Zellen/ml eingestellt. Parallel wurden 5 µg DNA und 6 µl 0.0045% PEI in H2O mit je 50 µl 150 mM NaCl gemischt und ca. 10 min bei RT inkubiert. Danach wurde das PEI/NaCl-Gemisch langsam und tropfenweise zum DNA/NaCl- Gemisch gegeben und die Lösung weitere 10 min bei RT inkubiert. Zur Transformation wurde 1 ml der gewaschenen Zellen auf eine Petrischale pipettiert und das DNA/PEI/NaCl Gemisch den Zellen zugesetzt. Nach 3.5 stündiger Inkubation bei 27°C wurden 12 ml axenisches Medium zugegeben und die Zellen 20 h bei 23°C im Dunkeln inkubiert. Dann wurde das Medium abgenommen und durch axenisches Medium mit 20 µg/ml G418 ersetzt.

Entwicklungsreihen von D. discoideum

Eine Hauptkultur wurde zweimal mit SP-Puffer gewaschen und auf eine Zelldichte von 2 x 107 Zellen/ml eingestellt. Für jeden Entwicklungszeitpunkt wurde je 1 ml Zellsuspension auf einen mit SP-Puffer angefeuchteten Millipore HA-Filter, der auf zwei Glasfaserfiltern lag,

Materialien und Methoden

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aufgetragen. Nachdem sich die Zellen abgesetzt hatten, wurde der Puffer abgenommen und die Zellen im Dunkeln bei 23°C inkubiert. Bei den entsprechenden Entwicklungszeiten wurden die Zellen mit SP-Puffer von den Filtern abgespült und abzentrifugiert. Das Sediment wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C eingefroren.

Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzaufnahmen wurden an einem Zeiss Axiovert T100, mit einer AttoArc 100 W Quecksilberdampflampe vorgenommen. Die Anregung erfolgte mit einem Standard FITC-Filterset. Aufnahme und Digitalisierung der Bilder wurde wie bei (Schaloske et al., 1998) beschrieben durchgeführt.

Molekularbiologische Methoden

Molekularbiologische Standardmethoden

Enzymatische Behandlung von DNA wie Restriktionsverdau, Dephosphorylierung von 5´-Enden linearisierter Plasmid DNA, und Ligierung von DNA Fragmenten sowie Ethanol- fällungen, DNA Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von Plasmid DNA über einen Cäsium- chloridgradienten, DNA-Konzentrationsbestimmungen und Transformation von E. coli durch Elektroporation wurden nach Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989) durchgeführt.

Isolierung von Plasmid DNA erfolgte mit dem Concert Rapid Plasmid Miniprep Kit (Gibco, Karlsruhe). Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurden mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) durchgeführt.

Polymerasekettenreaktion (PCR)

Mit der Polymerasekettenreaktion wurden DNA-Fragmente amplifiziert und gegebenen- falls Restriktionsschnittstellen eingeführt. Der Reaktionsansatz setzte sich standardmäßig aus folgenden Komponenten zusammen:

2 µl DNA Template (10 ng) 1 µl Vorwärts Primer (100 pmol) 1 µl Rückwärts Primer (100 pmol)

2 µl dNTP Gemisch (je desoxy-Nucleotid 4 µM)

10 µl Puffer II (Expand High Fidelity PCR System, Roche)