Calmodulin-Bindestelle
Dictyostelium
Abb. 19: Vergleich der Calmodulin-Bindestellen von Calcineurin aus D i c t y o s t e l i u m und humanem Calcineurin. Als Kriterien für die Ähnlichkeiten wurden folgende Eigenschaften der Aminosäuren zugrunde gelegt: negativ geladen, positiv geladen, unpolar oder polar ungeladen. (* = identische Aminosäuren; :
= homologe Austäusche)
Diskussion
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Humanes Calcineurin und Calcineurin aus dem Rinderhirn konnten in einem Komplex mit FKBP12 und FK506 kristallisiert werden (Griffith et al., 1995; Kissinger et al., 1995), jedoch konnten in beiden Arbeiten die Tertiärstrukturen der Calmodulin-Bindestellen nicht aufgeklärt werden. Daher ist es nicht möglich, die Ca2+/Calmodulin-Bindestelle von Calcineurin aus Dictyostelium anhand von Röntgenstrukturdaten zu modellieren, um einen Einblick in die Tertiärstruktur zu gewinnen.
Ca2+/Calmodulin stimuliert eine Vielzahl unterschiedlicher Enzyme (Cheung, 1980;
Klee und Vanaman, 1981), darunter auch die NAD Kinase aus der Erbse (Anderson und Cormier, 1978; Harmon et al., 1984), die cAMP Phosphodiesterase aus dem Rinderhirn (Teo et al., 1973; Wang und Desai, 1977) und die Ca2+-ATPase aus humanen Erythrozyten (Gopinath und Vincenzi, 1977; Jarrett und Penniston, 1978). Die cAMP Phosphodiesterase und die Ca2+-ATPase können durch Ölsäure aktiviert werden (Wolff und Brostrom, 1976; Niggli et al., 1981), die NAD Kinase hingegen nicht. W. Jarret markierte Calmodulin in Anwesenheit von Calcium mit 10-(1-Propionyloxysuccinimid)-2-trifluoromethylphenothiazin (POS-TP). Er konnte zeigen, daß dieses modifizierte Calmodulin noch in der Lage war, die cAMP Phosphodiesterase und die Ca2+-ATPase zu aktivieren, jedoch nicht mehr die NAD Kinase (Jarrett, 1986). Die unterschiedlichen Antworten einerseits der NAD Kinase und andererseits der cAMP Phosphodiesterase und Ca2+-ATPase deuten darauf hin, daß sie unterschiedliche Subdomänen in der Calmodulin-Bindestelle besitzen. Die unterschiedliche Sensitivität gegenüber Ölsäure könnte somit ebenfalls auf unterschiedliche Subdomänen zurückzuführen sein. Eine ähnliche Situation könnte auch bei humanem Calcineurin und Calcineurin aus Dictyostelium vorliegen und so den verschiedenartigen Effekt der Arachidonsäure auf beide Enzyme erklären.
Um die Bindung der Fettsäuren an die Ca2+/Calmodulin-Bindestelle weiter zu belegen sind gezielte Mutagenisierungen und Aminosäureaustäusche innerhalb der Ca2+/Calmodulin-Bindestelle geplant. Interessant wäre dabei insbesondere eine Mutation, bei der Ca2+/Calmodulin noch in der Lage ist Calcineurin zu aktivieren, die Fettsäure hingegen nicht mehr oder umgekehrt. So könnte die Bindung der Fettsäure auf einen bestimmten Bereich eingegrenzt werden. Weiterhin ist geplant, beide Untereinheiten von Calcineurin in Dictyostelium zu überexprimieren und das gereinigte, kristallisierte Holoenzym einer Röntgenstrukturanalyse in An- und Abwesenheit von Fettsäuren zu unterziehen.
Diskussion
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Versuche zur Manipulation der Calcineurin Expression in Dictyostelium
Um die phänotypischen Konsequenzen einer Reduzierung der Calcineurin Menge bzw.
Aktivität in Dictyostelium zu untersuchen, und um damit einen Einblick in die Funktion von Calcineurin bei Wachstum und Entwicklung der Zellen zu bekommen, wurde in verschiedenen Ansätzen versucht, die Calcineurin Menge bzw. dessen Aktivität zu manipulieren. Versuche mit antisense Mutagenese während meiner Diplomarbeit zeigten, daß die Phänotypen von Dictyostelium Zellinien, die antisense mRNA unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven Actin 6 Promotors exprimierten, sehr instabil waren und innerhalb kurzer Zeit revertierten (Kessen, 1995).
Um die genannten Effekte zu umgehen, wurde die antisense RNA zum einen unter der Kontrolle des induzierbaren Discoidin Promotors, zum anderen unter der Kontrolle des contact sites A Promotors exprimiert. Der erste Promotor würde es ermöglichen, eine große Zahl von Zellen zu züchten, die den antisense Vektor zwar enthalten, das antisense Transkript aber nicht exprimieren. Darauffolgend könnte durch Induktion des Promotors eine Verringerung der Proteinmenge ausgelöst werden. Der zweite Promotor wird endogen erst während der Differenzierung aktiviert (siehe Abb. 20).
Zelldichte (x106 Z/ml)
4 8 12 16 20 24
csA mRNA Discoidin mRNA CNA mRNA
2 4 6 8 10
Entwicklungszeit (h)
Abb. 20: Schematische Darstellung der mRNA Expression unter der Kontrolle des contact sites A (csA) und des Discoidin Promotors und der mRNA Expression von Calcineurin A in D i c t y o s t e l i u m .
Diskussion
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Die Expression von Calcineurin antisense bzw. sense RNA unter der Kontrolle des Discoidin Promoters hatte keinen Effekt auf die Calcineurin Menge. Zum Zeitpunkt der Probennahme war die Expression von Calcineurin sehr hoch. Dies lässt auf eine hohe Stabilität der Phosphatase und auf einen geringen Umsatz von Calcineurin zu diesem Zeitpunkt schließen.
Die Expression von Calcineurin antisense bzw. sense RNA unter der Kontrolle des contact sites A Promoters führte in beiden Fällen zu einer Erhöhung der Calcineurin Menge im Vergleich zum Wildtyp. Diese Erhöhung konnte auch nach cAMP Stimulation (20 nM alle 6 min über 5h hinweg), was zur Induktion des Promotors führt (Faix et al., 1992), beobachtet werden. R.
Gomer konnte den gleichen Effekt beobachten, nachdem er Zellen mit antisense Oligonucleotiden des smlA Gens transfiziert hatte. Anstatt die Menge des SmlA Proteins zu verringern, führten die antisense Oligonucleotide zu einer Erhöhung der Proteinexpression. R.
Gomer schlug als Erklärung vor, daß diese antisense Oligonucleotide möglicherweise einen Transkriptionskomplex geöffnet halten, was dann eine erhöhte Expression des Proteins zur Folge hätte (R. Gomer, Mitteilung in der Dictyostelium Newsgroup).
Da es durch die Expression von antisense RNA nicht möglich war, die Calcineurin Expression zu verringern, wurde versucht, diese über eine Veränderung der extrazellulären Ca2+-Konzentration zu manipulieren. Moniakis und Mitarbeiter versetzten eine wachsende AX-2 Zellkultur mit 80 mM CaClAX-2. Sie konnten zeigen, daß die mRNA-Menge für die CaAX-2+- Ca2+-ATPase PAT1 und die Konzentration des Proteins innerhalb von 3 h stark anstieg. Eine Behandlung der Zellen über 5 h hinweg mit 1, 10 oder 40 mM CaCl2 hatte den gleichen Effekt auf die patA Expression. Dieser CaCl2 induzierte Anstieg konnte - wie bereits in der Einleitung erwähnt - durch Cycloheximid und durch die Immunsuppressiva Cyclosporin A und FK506 gehemmt werden, was darauf hinweist, daß die patA Induktion von der Synthese eines oder mehrerer Proteine abhängig ist, und daß sie durch Calcineurin vermittelt wird (Moniakis et al., 1999). In dieser Arbeit wurde die extrazelluläre Ca2+-Konzentration auf bis zu 60 mM erhöht.
Weder die Erhöhung noch eine Verringerung der extrazellulären Ca2+-Konzentration mit Hilfe von EGTA über 1 h bzw. über 8 h hinweg hatten einen Effekt auf die Calcineurin Expression in Dictyostelium.
Schaap und Mitarbeiter konnten mit Zellinien, die das Ca2+-sensitive Photoprotein Apoaequorin exprimieren, zeigen, daß bei einer 8 stündigen Inkubation der Zellen mit 100 µM BHQ in Anwesenheit von 1 mM CaCl2 die intrazelluläre Ca2+-Konzentration von 60 nM auf etwa 225 nM ansteigt. (Bei 100 µM BHQ werden die IP3-sensitiven Ca2+-Speicher vollständig, und die Ca2+-speichernden sauren Vesikel zu 50% gehemmt (Flaadt et al., 1993; Rooney et al., 1994).) Die Autoren zeigten außerdem, daß die Zugabe von 1 mM des pH unabhängigen Ca2+-Chelators BAPTA eine deutliche Verringerung der intrazellulären Ca2+-Konzentration auf einen Wert von etwa 10 nM zur Folge hatte (Schaap et al., 1996). In dieser Arbeit wurde dem extrazellulären Medium 100 µM BHQ und 1 mM CaCl2 oder 10 mM BAPTA zugesetzt. Auch
Diskussion
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durch diese Zugaben konnte keine Veränderung der Calcineurin Expression beobachtet werden.
Die Expression von Calcineurin aus Dictyostelium wird somit nicht über eine Erhöhung bzw.
Verringerung der Ca2+-Konzentration reguliert.
In einem weiteren Ansatz wurde versucht, die Aktivität des Enzyms in vivo zu vermindern. Zu diesem Zweck wurde der Autoregulationsmechanismus von Calcineurin ausgenutzt. Sagoo und Mitarbeiter exprimierten in E. coli Zellen ein 97 Aminosäuren langes Fragment des C-Terminus von humanem Calcineurin und reinigten es. Sie konnten zeigen, daß diese große autoinhibitorische Domäne Calcineurin in vitro 8-mal stärker hemmte als ein 25 Aminosäuren langes autoinhibitorisches Peptid, welches für die Interaktion mit dem katalytischen Zentrum verantwortlich ist (Sagoo et al., 1996). Aus diesem Grunde wurde eine aus 148 Aminosäuren bestehende autoinhibitorische Domäne des Dictyostelium Calcineurin in Dictyostelium Zellen überexprimiert. Dadurch sollte die Aktivität des Enzyms durch Bindung an das katalytische Zentrum verringert werden. Dieses Peptid entspricht der humanen autoinhibitorischen Domäne, ist jedoch 51 Aminosäuren größer, da es die oben genannten möglichen Phosphorylierungsstellen und die C-terminale Extension enthält. Bei Dictyostelium Zellen, die mit dem Vektor pDNeoII AID, der die cDNA für diese autoinhibitorische Domäne enthielt, transformiert worden waren, konnte gegenüber dem Wildtyp kein abweichender Phänotyp beobachtet werden. Es zeigte sich, daß Dictyostelium Zellen zwar das mRNA Transkript exprimierten, das zugehörige Polypeptid jedoch nicht mit Hilfe eines Western blots identifiziert werden konnte. In E. coli Zellen konnte die autoinhibitorische Domäne exprimiert und das Peptid mit Hilfe eines Calcineurin Antikörpers detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
Es konnte so gezeigt werden, daß die Domäne vom Antikörper erkannt wird, das Polypeptid in den transformierten Dictyostelium Zellen hingegen instabil war.
Um diesen Effekt zu umgehen, wurde ein Fusionsprotein bestehend aus dem green fluorescent protein (GFP) und der 148 Aminosäuren großen autoinhibitorischen Domäne von Dictyostelium Calcineurin hergestellt. Bei diesem in dieser Weise stabilisierten Fusionsprotein konnte durch Fluoreszenzmikroskopie eine Expression in vivo und eine Verteilung des Proteins über die ganze Zelle beobachtet werden. Allerdings hatte die Überexpression des GFP-AID-Fusionsproteins keine Abweichungen in bezug auf den Phänotyp zur Folge (Daten nicht gezeigt). Aus E. coli wurde ein rekombinantes GFP-AID-Fusionsprotein gereinigt, welches in einem Western blot durch Calcineurin Antikörper erkannt wurde. In einem Phosphatasetest mit gereinigtem Dictyostelium Calcineurin A wurde gezeigt, daß die Calmodulin stimulierte Aktivität durch Zusatz von 2 µM des Fusionsproteins um etwa 45% gehemmt wurde. Die Basalaktivität lag bei ca. 38% der Calmodulin stimulierten Aktivität. Dies legt den Schluß nahe, daß in vivo eine geringe Calmodulin stimulierte Calcineurin Aktivität ausreicht, um die Aufrechterhaltung eines normalen Phänotyps zu gewährleisten oder daß das Fusionsprotein in vivo nicht bindet.
In Calcineurin A überproduzierenden Dictyostelium Zellen ist die Calmodulin-abhängige
Diskussion
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Phosphataseaktivität in rohen Extraken eine der Hauptaktivitäten (Hellstern, 1997). Diese Überexpression hatte jedoch keinen veränderten Phänotyp zur Folge (Dammann, 1994). In diesen Mutanten wurde jedoch nur die katalytische Untereinheit und nicht zusätzlich die regulatorische Untereinheit Calcineurin B überexprimiert. Da humanes Calcineurin B für die Affinität des Holoenzyms zum spezifischen Substrat entscheidend ist (Feng und Stemmer, 1999), wäre ein auffallender Phänotyp vermutlich erst bei der Coexpression beider Untereinheiten zu beobachten.
Es gibt verschiedene Anhaltspunkte dafür, daß Calcineurin an Zellzyklusvorgängen beteiligt ist. MAT a-Hefezellen von Saccharomyces cerevisiae mit deletierten Calcineurin A oder Calcineurin B sind zwar noch lebensfähig, können aber nach einer Arretierung in der G1-Phase nicht wieder in den Zellzyklus eintreten (Cyert und Thorner, 1992). Calcineurin A Deletionsmutanten von Aspergillus nidulans sind ebenfalls in der G1-Phase des Zellzyklus arretiert (Rasmussen et al., 1994). In T-Lymphozyten verhindern die immunsupprimierenden Calcineurin Inhibitoren Cyclosporin A und FK506 die Aktivierung von NF-AT und damit letztendlich auch die Zellproliferation (Schreiber und Crabtree, 1992). Über eine Beteiligung von Calcineurin im Zellzyklus von Dictyostelium ist bisher nichts bekannt, jedoch deuten mehrere Befunde darauf hin, daß Calcineurin während des Wachstums vom Dictyostelium Zellen essentiell ist: 1) In vegetativen Zellen ist die Calcineurin Expression sehr hoch. 2) Es konnten keine Dictyostelium Mutanten mit einem deletierten Calcineurin A Gen isoliert werden (Dammann, 1994; Kessen, 1995), M. Lydan, persönl. Mitteilung). 3) Bei antisense Mutanten unter der Kontrolle des Actin-6 Promotors wurden einhergehend mit einer reduzierten Calcineurin Expression verlängerte Generationszeiten im Vergleich zum Wildtyp beobachtet (Kessen, 1995). Die antisense Mutagenese bewirkte zudem eine starke Gegenselektion und damit eine schnelle Reversion des Phänotyps.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß vermutlich aufgrund der essentiellen Bedeutung von Calcineurin im Zellgeschehen von Dictyostelium eine Ausschaltung oder Verringerung der Phosphatase-Aktivität in vivo z.B. durch knock out oder antisense Mutagenese keine geeigneten Mittel sind, um mögliche Funktionen von Calcineurin zu studieren. In zukünftigen Experimenten soll daher versucht werden, über einen biochemischen Ansatz Substrate von Calcineurin zu identifizieren. Gereinigtes Calcineurin A und B und Ca2+/Calmodulin wird dabei an ein geeignetes Säulenmaterial gebunden. Da alle drei Komponenten für eine spezifische Substratbindung notwendig sind, sollte es möglich sein, an diesen Komplex Substrate aus einem Dictyostelium Extrakt zu binden und diese über eine Proteinsequenzierung zu identifizieren.
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selective inhibition of calcium ionophore induced polymorphonuclear leucocyte degranulation.
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