In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Calcineurin aus Dictyostelium durch ungesättigte Fettsäuren wie Arachidonsäure, Linolsäure oder Ölsäure unabhängig von Ca2+/Calmodulin aktiviert wird. Die halbmaximale Aktivierung durch Arachidonsäure lag bei einer Konzentration zwischen 5 und 10 µM und damit deutlich unter der kritischen Micellenkonzentration. Dieser Befund zeigt, daß die Aktivierung durch freie Fettsäuren und nicht durch Micellen erfolgt. Politino und King konnten zeigen, daß Rinder Calcineurin durch Bindung an saure Phospholipide aktiviert wird (Politino und King, 1987). Dieser Effekt unterscheidet sich jedoch deutlich von den Befunden dieser Arbeit, da diese Phospholipide an Calcineurin B binden (Politino und King, 1990). Die Aktivierung von Calcineurin aus Dictyostelium ist unabhängig von Calcineurin B.
Die Stimulation der enzymatischen Aktivität ist spezifisch für ungesättigte Fettsäuren, da gesättigte Fettsäuren keinen Effekt zeigten. Die Doppelbindung muß zudem in einer cis-Konfiguration vorliegen, da Elaidinsäure (trans-Ölsäure) keine Auswirkung auf die Phosphataseaktivität hatte. Es konnte zudem gezeigt werden, daß für die Aktivierung von Calcineurin außerdem die negativ geladene Carboxy-Gruppe der freien Säure benötigt wird, da das Methylester Derivat der Arachidonsäure ebenfalls keinen Effekt auf die Aktivität hatte. Die Aktivierung von Calcineurin aus Dictyostelium durch cis-ungesättigte Fettsäuren erfolgte mit chemisch verschiedenen Substraten: zum einen mit dem chromogenen Substrat pNPP und zum anderen mit dem RII Phosphopeptid, welches einer Phosphorylierungsstelle innerhalb der RII Untereinheit der cAMP abhängigen Proteinkinase entspricht. Die Aktivierung von Calcineurin konnte durch Bindung der Fettsäuren an Albumin aufgehoben werden. Durch Ca2+/Calmodulin konnte die Phosphatase im Anschluß wieder stimuliert werden. Dies zeigt, daß die Aktivierung durch Fettsäuren reversibel ist und die Bindung nicht zu einer irreversiblen Störung des Enzyms führte.
Die Fettsäure-vermittelte Calcineurin Aktivierung könnte in vivo zur Regulation der Phosphatase beitragen. Damit stellt sich die Frage, welche strukturellen Komponenten die Bindung der Fettsäuren an Calcineurin A ermöglichen. Die warscheinlichsten Domänen sind die hydrophoben Bindestellen für Calcineurin B und Ca2+/Calmodulin. Die folgenden Daten schließen die Calcineurin B-Bindestelle aus: 1) Arachidonsäure aktiviert die Phosphatase sowohl
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in Abwesenheit (Abb. 4 A), als auch in Gegenwart von Calcineurin B (Abb. 4 B). Zudem ist die Bindung von Calcineurin B an die katalytische Untereinheit nahezu irreversibel (Stemmer und Klee, 1994) und kann nur in Anwesenheit von Harnstoff, SDS oder Guanidin Hydrochlorid aufgehoben werden (Klee et al., 1988). 2) Wenn Arachidonsäure die Bindung von Calcineurin B an Calcineurin A stören würde, könnte keine Stimulation der Phosphataseaktivität nach Zugabe von Calcineurin B mit dem RII Peptid als Substrat gemessen werden (Abb. 6).
Die Ergebnisse legen nahe, daß Ca2+/Calmodulin und cis-ungesättigte Fettsäuren über die gleiche Bindestelle und über einen ähnlichen Mechanismus den Effekt auf Calcineurin ausüben: 1) Arachidonsäure verhindert die Bindung von Calcineurin A an Calmodulin und verdrängt Calcineurin von immobilisiertem Calmodulin (Abb. 9); 2) die Aktivierung durch Fettsäuren und Ca2+/Calmodulin ist nicht additiv (Tabelle 1); 3) nicht nur die maximale Stimulation von Calcineurin durch Ca2+/Calmodulin mit dem RII Peptid als Substrat lag im gleichen Bereich wie die durch Arachidonsäure, sondern auch die teilweise Stimulation in Abwesenheit von Calcineurin B (Abb. 6); 4) die maximale Aktivierung durch cis-ungesättigte Fettsäuren und Ca2+/Calmodulin liegt in derselben Größenordnung (Abb. 4 und 6).
Obwohl die Daten stark für eine Kompetition von Ca2+/Calmodulin und Fettsäuren um die gleiche Bindungsstelle sprechen, kann in den Bindungsstudien nicht ausgeschlossen werden, daß Arachidonsäure an Ca2+/Calmodulin bindet. Die Bindung von Calcium an Calmodulin führt zu einer Freilegung hydrophober und saurer Aminosäuren an der Proteinoberfläche, die mit der basischen amphiphilen α-Helix des Zielproteins (Ikura, 1996) interagieren. Aus diesem Grunde könnten sowohl hydrophobe als auch ionische Interaktionen für die Bindung der Fettsäuren an die basische amphiphile α-Helix der Ca2+/Calmodulin-Bindestelle (James et al., 1995) notwendig sein. Demgemäß war nicht nur die Hydrophobizität der Lipide essentiell für die Aktivierung, sondern auch die negativ geladene Carboxyl-Gruppe. Der saure Charakter von Ca2+/Calmodulin läßt somit eine Interaktion mit sauren Lipiden unwahrscheinlich erscheinen.
Es wurden einige weitere Calmodulin bindende Proteine beschrieben, die durch langkettige Fettsäuren aktiviert werden. So wurde z.B. die Ca2+-ATPase aus humanen Erythrozyten durch Ölsäure und Linolsäure (Al-Jobore und Roufogalis, 1981; Niggli et al., 1981; Jarrett, 1986) und die zyklische Nucleotid Phosphodiesterase aus dem Rinderhirn durch Ölsäure aktiviert (Pichard und Cheung, 1977; Jarrett, 1986). Die zyklische Nucleotid Phosphodiesterase aus dem Schwein wurde sowohl von ungesättigten, als auch von gesättigten Fettsäuren stimuliert (Wolff und Brostrom, 1976). Die Myosin-leichte-Kette-Kinase aus dem Muskelmagen des Hühnchens wurde durch Arachidonsäure, aber nicht durch Arachidinsäure stimuliert (Tanaka und Hidaka, 1980). Die Aktivierung Ca2+/Calmodulin-abhängiger Enzyme durch die Bindung von Fettsäuren an ihre Ca2+/Calmodulin-Bindestellen könnte daher einen allgemeinen alternativen Regulationsmechanismus für Calmodulin-bindende Proteine darstellen.
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Bei zwei weiteren Serin/Threonin Phosphatasen konnte vor kurzem gezeigt werden, daß sie durch ungesättigte Fettsäuren aktiviert werden: die Phosphatasen vom Typ 5 (PP5) (Chen und Cohen, 1997; Skinner et al., 1997) und vom Typ 2C (PP2C) (Klumpp et al., 1998). In beiden Fällen erfolgt die Aktivierung bei Konzentrationen über 100 µM, die über der kritischen Micellenkonzentration liegen. Im Fall der PP5 wurde gezeigt, daß aus Fettsäuren bestehende Lipidvesikel die enzymatische Aktivität stimulieren, indem sie an eine aus 34 Aminosäuren bestehende, sogenannte TPR (tetratricopeptide repeat) Domäne binden. Bei der PP5 nimmt man an, daß die TPR Domäne wie ein Schild über dem aktiven Zentrum liegt. Die Bindung von Lipidvesikeln an die TPR Domäne hätte - gemäß dieser Vorstellung - eine Konformations-änderung zur Folge, die das aktive Zentrum freigibt und den Zugang von Substraten erlaubt (Chen und Cohen, 1997). Bei Calcineurin aus Dictyostelium konnte keine solche TPR Domäne identifiziert werden. Die Aktivierung von Calcineurin durch Bindung von cis-ungesättigten Fettsäuren an die Calmodulin-Bindestelle könnte jedoch einen ähnlichen Mechanismus darstellen: die C-terminale autoinhibitorische Domäne blockiert im Grundzustand das katalytische Zentrum. Die Bindung der Fettsäuren an die Ca2+/Calmodulin-Bindestelle könnte eine Konformationsänderung zur Folge haben, bei der die Hemmung durch die autoinhibitorische Domäne aufgehoben wird.
Die physiologische Bedeutung der Aktivierung von Calcineurin durch ungesättigte Fettsäuren ist noch unklar. Es stehen bisher in Dictyostelium keine Daten über eine Freisetzung von Fettsäuren in das Cytosol zu Verfügung. Allerdings konnte in Inselzellen des Pankreas, die mit Glucose stimuliert wurden, ein Anstieg der Menge unveresterter Arachidonsäure gemessen werden. Umgerechnet auf das Volumen einer Zelle lag die Konzentration der Fettsäure in einem Bereich von 38 bis 75 µM (Wolf et al., 1991).
Unterweger und Schlatterer konnten zeigen, daß ein Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration für die chemotaktische Orientierung und Bewegung von Dictyostelium Zellen notwendig ist, da das "Klemmen" der cytosolischen Ca2+-Konzentration durch Einbringen von BAPTA in die Zellen eine Hemmung der Chemotaxis zur Folge hatte (Unterweger und Schlatterer, 1995). In Anwesenheit von EGTA im extrazellulären Medium waren Dictyostelium Zellen in der Lage, Pseudopodien auszubilden und zu migrieren, wenn auch mit einer langsameren Geschwindigkeit. Dies bedeutet, daß eine Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern für eine chemotaktische Antwort ausreicht (Unterweger und Schlatterer, 1995).
Polesky und O´Day berichteten, daß der Calcineurin Inhibitor Deltamethrin die Chemotaxis in Dictyostelium hemmt und schlugen daher Calcineurin als eine Komponente in der chemotaktischen Antwort vor (Polesky und O´Day, 1995). Vor kurzem zeigten Persechini und Cronk, daß die freie cytosolische Ca2+-Konzentration, die notwendig ist, um genügend Ca2+/Calmodulin zu bilden und damit hochaffine Ca2+/Calmodulin-Bindeproteine zu aktivieren, in einem Bereich von mehreren hundert nM liegt, unter der Vorraussetzung, daß die
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Kd für die Bindung von Ca2+/Calmodulin an die Calmodulin-Bindeproteine ≥ 2 nM ist (Persechini und Cronk, 1999). Die Kd für die Ca2+/Calmodulin-Bindung an Dictyostelium Calcineurin liegt im Bereich weniger nM (Winckler et al., 1991), die Aktivierung erfolgt jedoch erst bei höheren Konzentrationen (siehe Abb. 3). Bei niedrigen extrazellulären Ca2+-Konzentrationen im Bereich von 200 nM kann die freie cytosolische Ca2+-Konzentration nicht allein durch Öffnen der Ca2+-Kanäle in der Plasmamembran über diesen Wert hinaus ansteigen. Ein Ca2+-Einstrom kann unter diesen Bedingungen somit keine Aktivierung von Calcineurin ermöglichen. Dennoch sind Dictyostelium Zellen bei extrazellulären Ca2+-Konzentrationen von 200 nM in der Lage, chemotaktisch zu reagieren ((Malchow et al., 1982) und R. Schaloske, pers. Mitteilung). Eine weitere Untersuchung zeigte, daß Arachidonsäure eine Freisetzung aus intrazellulären Speichern hervorruft und damit einen kapazitativen Ca2+-Einstrom induziert (Schaloske und Malchow, 1997; Schaloske et al., 1998). Ein direkter Effekt von Arachidonsäure auf die Ca2+- oder H+-ATPase konnte ausgeschlossen werden (Schaloske et al., 1998). Der Mechanismus der Arachidonsäure-induzierten Ca2+-Freisetzung blieb unklar.
Der aktivierende Effekt der ungesättigten Fettsäuren auf Calcineurin könnte jedoch bedeuten, daß Calcineurin bei der Ca2+-Freisetzung beteiligt ist.
Ein Modell für einen Signaltransduktionsweg, der in einer Ca2+-Freisetzung resultiert, würde die Bindung von cAMP an den Rezeptor, die anschließende Aktivierung der Phospholipase A2 und eine Freisetzung ungesättigter Fettsäuren beinhalten, welche dann Calcineurin aktivieren. Calcineurin könnte daraufhin die Freisetzung von Ca2+ auslösen, die für eine chemotaktische Antwort hinreichend ist (Unterweger und Schlatterer, 1995). Zusätzlich führt die Ca2+-Freisetzung, auch bei niedrigen extrazellulären Ca2+-Konzentrationen, zu einem kapazitativen Einstrom (Schaloske und Malchow, 1997). Diese Erhöhung der Ca2+-Konzentration hat eine erhöhte Ca2+-Konzentration von Ca2+/Calmodulin zur Folge, welche zu der alternativen Aktivierung von Calcineurin führt. Sobald die cytosolische Ca2+-Konzentration durch die Ca2+-ATPase Aktivität wieder den Basalwert erreicht hat, wird Calcineurin inaktiviert (Abb. 18).
Langkettige ungesättigte Fettsäuren hatten keinen Effekt auf gereinigtes rekombinantes humanes Calcineurin. Um den Unterschied zwischen rekombinantem humanem Calcineurin und Dictyostelium Calcineurin A in Bezug auf die Aktivierung durch Arachidonsäure zu untersuchen und um einen zusätzlichen Einblick in die Regulation von Calcineurin aus Dictyostelium zu gewinnen, wurde das Enzym rekombinant in E. coli exprimiert und gereinigt. Rekombinantes Dictyostelium Calcineurin A konnte sowohl durch Ca2+/Calmodulin als auch durch Arachidonsäure aktiviert werden. Dies bedeutet, daß in E. coli keine kovalenten Modifikationen am Enzym stattfinden, die eine Aktivierung verhindern würden. Somit ist auszuschließen, daß die Ursache für die fehlende Aktivierung des humanen Calcineurin durch Arachidonsäure in der heterologen Expression liegt. Allerdings könnten Modifikationen in Säugerzellen stattfinden, die
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weder von Dictyostelium noch von E. coli gemacht werden. Unter diesem Gesichtspunkt wäre eine Aktivierung von authentischem humanen Calcineurin durch ungesättigte Fettsäuren denkbar.
Abb.18: Hypothetisches Modell zur Regulation der Ca2 + -Homöostase durch Fettsäure-aktiviertes Calcineurin. Die Stimulation des cAMP-Rezeptors führt zu einer Protein abhängigen oder G-Protein unabhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Die PLA2 spaltet Phosphatidylcholin (PC) zu Lysophosphatidylcholin (LPC) und freien Fettsäuren (FS). Ungesättigte Fettsäuren aktivieren Calcineurin, welches eine Ca2+-Freisetzung aus den sauren Vesikeln auslöst. Diese Ca2+-Freisetzung ist für eine chemotaktische Antwort ausreichend und hat einen kapazitativen Ca2+-Einstrom zur Folge. Dadurch entsteht eine erhöhte Konzentration an Ca2+/Calmodulin. Ca2+/Calmodulin führt zur alternativen Aktivierung von Calcineurin. Erreicht die cytosolische Ca2+-Konzentration durch die Ca2+-ATPase Aktivität wieder den Basalwert, dissoziiert Calmodulin von der Phosphatase ab und Calcineurin wird inaktiviert. Die weißen Kreise stellen Ca2+- bzw. H+- Pumpen und Ca2+/H+-Austauscher dar. Ca2+-Kanäle werden durch dunkle Doppel-Ellipsen symbolisiert. Die Darstellung ist angelehnt an ein Modell von R. Schaloske (Schaloske, 1997).
Dictyostelium Calcineurin A enthält im C-terminalen Bereich eine vierfache Wiederholung eines Nonapeptids (Dammann et al., 1996), das sowohl eine mögliche CKII- als auch eine mögliche CaM-Kinase II-Phosporylierungsstelle und eine schwache Konsensus Sequenz für eine PKA-Phosphorylierungsstelle enthält und damit eine weitere Regulationsmöglichkeit darstellt (Pinna, 1990; Kennelly und Krebs, 1991). Von Kikkawa und Mitarbeitern konnte eine CKII in Dictyostelium identifiziert und partiell gereinigt werden
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(Kikkawa et al., 1992). Dunbar und Wheldrake charakterisierten biochemisch eine CaM-Kinase und Sampson eine PKA aus Dictyostelium (Sampson, 1977; Dunbar und Wheldrake, 1994).
Mutzel und Mitarbeiter klonierten und sequenzierten die regulatorische Untereinheit (Mutzel et al., 1987), Mann und Mitarbeiter die katalytische Untereinheit der PKA (Mann et al., 1992). E.
coli besitzt keine CKII, CaM-Kinase oder PKA (Blattner et al., 1997). Da rekombinantes, aus E.
coli gereiniges Dictyostelium Calcineurin A ebenfalls durch Arachidonsäure mit der gleichen Kinetik wie authentisches Calcineurin aktiviert wird, ist eine Phosphorylierung durch die 3 Kinasen zur Arachidonsäure vermittelten Aktivierung nicht notwendig. Es ist hingegen nicht auszuschließen, daß die Phosphorylierungsstellen dephosphoryliert vorliegen müssen. Eine Regulation der Sensitivität von Calcineurin gegenüber Arachidonsäure mittels CKII, CaM-Kinase II oder PKA ließe sich durch in vitro Phosphorylierung des Enzyms prüfen.
Ein Unterschied zwischen humanem Calcineurin und Calcineurin aus Dictyostelium besteht in einer N-terminalen Extension des letzteren von 45 Aminosäuren. Dieser Abschnitt enthält nur eine hydrophobe Aminosäure. Dies macht eine direkte Bindung von Fettsäuren unwahrscheinlich. Um jedoch einen möglichen Einfluß dieser Extension auf die Aktivierung durch Arachidonsäure zu testen, wurde Calcineurin mit deletiertem N-Terminus rekombinant in E. coli exprimiert und gereinigt. Es zeigte sich, daß das derart veränderte Calcineurin durch Arachidonsäure mit den gleichen Charakteristika wie das Wildtyp-Enzym aktiviert werden konnte und somit die N-terminale Extension keinen Einfluß auf die Aktivierung hat.
Mehrere Befunde deuteten darauf hin, daß Calmodulin und cis-ungesättigte Fettsäuren die gleiche Bindestelle zur Aktivierung von Calcineurin aus Dictyostelium benutzen. Ein Grund dafür, daß rekombinantes humanes Calcineurin nicht durch Arachidonsäure aktiviert wird, könnten Unterschiede in der Calmodulin-Bindestelle sein. Die Primärstrukturen dieser Calmodulin Bindedomänen besitzen nur eine geringe Homologie (O'Neil und DeGrado, 1990), jedoch bilden alle dieser Bindestellen eine basische amphiphile α-Helix. Auch die Bindestellen von humanem Calcineurin und Calcineurin aus Dictyostelium unterscheiden sich in ihrer Primärstruktur (Abb. 19).