Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zu 3g-Nanotechnologien als Basis für ein gezieltes Drug-Delivery-System
am Modell des Meerschweinchen-Innenohres
INAUGURAL–DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Melanie Wolf
Berlin
Hannover 2009
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Prof. Dr. Timo Stöver
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
der Medizinischen Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann Prof. Dr. Timo Stöver
2. Gutachter: Prof. Dr. Andrea Meyer-Lindenberg
Tag der mündlichen Prüfung: 11. November 2009
Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „Nanotechnology-based targeted drug-delivery“ – Projektes „NanoEar“ (Projektnummer NMP4-CT-2006-026556).
Meinen Eltern
Vortragskurzfassungen
Verzeichnis der im Text verwendeten wichtigsten Abkürzungen
1 EINLEITUNG ... 1
2 ZIELSETZUNG ... 5
3 LITERATURÜBERSICHT ... 6
3.1 Das auditorische System der Säugetiere... 6
3.1.1 Topographische Anatomie des Hörorganes ... 7
3.1.2 Physiologie des Hörvorganges ... 9
3.1.3 Audiometrische Untersuchungsmethoden ... 12
3.1.3.1 Allgemeines zu unterschiedlichen Hörprüfmethoden ... 12
3.1.3.2 Akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotenziale ... 13
3.2 Pathophysiologie von Hörminderung und Ertaubung ... 15
3.2.1 Allgemeines zur Einteilung von Hörschädigungen ... 15
3.2.2 Pathophysiologie sensorineuralen Hörverlustes ... 16
3.2.3 Das Cochlea-Implantat als Therapieoption bei sensorischer Hörstörung ... 18
3.3 Drug-Delivery-Systeme ... 20
3.3.1 Überblick über Substanzen zur Verbesserung der Nerven-Elektroden- Interaktion ... 20
3.3.2 Vergleich verschiedener Drug-Delivery-Systeme im Innenohr ... 21
3.3.3 Nanobiotechnologie ... 23
3.3.3.1 Allgemeines, Eigenschaften, Anwendungen in der Industrie ... 23
3.3.3.2 Einsatz in der Biomedizintechnik ... 24
3.3.3.3 Einsatz speziell in der Otologie ... 28
3.4 Konfokale Lasermikroskopie, Prinzip und Durchführung ... 30
4.1.1 Hyperverzweigte Polylysine ... 33
4.1.2 Lipidnanokapseln ... 34
4.1.3 Zelllinien ... 35
4.1.4 Versuchstiere ... 36
4.1.5 Tierhaltung ... 36
4.1.6 Versuchsgruppen ... 37
4.2 Methoden ... 38
4.2.1 Überblick über die In-vitro-Versuche ... 38
4.2.2 Zellkultivierung von L929-Mausfibroblasten... 38
4.2.3 Untersuchung zur Nanopartikelaufnahme in Zellen ... 40
4.2.3.1 Zelleinsaat und Inkubation ... 40
4.2.3.2 Fixierung und Phalloidinfärbung ... 40
4.2.3.3 Auswertung mittels Konfokaler Lasermikroskopie ... 41
4.2.4 Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme ... 42
4.2.4.1 Zelleinsaat und Inkubation ... 42
4.2.4.2 Fluoreszenzmessung ... 43
4.2.5 Untersuchung auf Zytotoxizität der Nanopartikel ... 44
4.2.5.1 Zelleinsaat und Inkubation ... 44
4.2.5.2 Neutralrotfärbung und photometrische Messung ... 45
4.2.6 Überblick über die In-vivo-Versuche... 45
4.2.7 Narkose, Vor- und Nachsorge der Tiere ... 46
4.2.8 Messung akustisch-evozierter Hirnstammpotenziale ... 47
4.2.9 Flüssigkeitsapplikation ins Innenohr via Cochleostomie ... 51
4.2.10 Gewinnung und Aufarbeitung der Cochleae ... 53
4.2.10.1 Transkardiale Perfusion ... 54
4.2.10.2 Felsenbeinentnahme und Gewinnung der Cochleae ... 54
4.2.10.3 Phalloidinfärbung ... 55
4.2.10.4 Präparation der Stria vascularis und Basilarmembran ... 55
4.2.11 Untersuchung der Nanopartikelaufnahme mittels Konfokaler Mikroskopie.... 57
5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche ... 60
5.1.1 Konfokalmikroskopische Auswertung der Nanopartikelaufnahme ... 60
5.1.2 Quantitative Bestimmung der Nanopartikelaufnahme ... 62
5.1.3 Ergebnisse der Vitalitätstests mit Neutralrot ... 65
5.2 Ergebnisse der In-vivo-Versuche ... 68
5.2.1 Allgemeines ... 68
5.2.2 Konfokalmikroskopische Auswertung der Nanopartikelaufnahme ... 69
5.2.3 Auswertung der AABR-Messungen ... 71
5.2.4 Auswertung der Zytocochleogramme ... 79
6 DISKUSSION ... 81
6.1 Auswahlkriterien der Nanopartikeltypen für diese Studie ... 82
6.2 Diskussion der in vitro angewendeten Methoden ... 84
6.3 Qualitative Bewertung der Nanopartikelaufnahme auf Zellebene ... 86
6.4 Quantitative Aussagen zur Nanopartikelaufnahme in Zellkultur ... 89
6.5 Auswirkungen der Nanopartikel auf die Zellviabilität auf Grundlage des Neutralrottests ... 91
6.6 Diskussion der in vivo angewendeten Methoden ... 93
6.7 Beurteilung der Vektorendetektion im Innenohr ... 94
6.8 Morphologische und funktionelle Effekte der Nanopartikelapplikation in der Cochlea ... 96
6.9 Bewertung der eigenen Studien und hieraus resultierende ... 99
Zukunftsperspektiven ... 99
6.10 Mögliche veterinärmedizinische Anwendungsgebiete ... 102
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 108
10 ANHANG ... 132
10.1 Herstellung von Lösungen und Medien ... 132
10.2 Lösungen, Reagenzien und Chemikalien ... 134
10.2.1 Lösungen und Reagenzien für die In-vitro-Versuche ... 134
10.2.2 Lösungen, Reagenzien und Chemikalien für die In-vivo-Versuche ... 135
10.3 Pharmaka ... 136
10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien ... 137
10.4.1 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien für die In-vitro-Versuche ... 137
10.4.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien für die In-vivo-Versuche ... 138
10.5 Geräte ... 140
10.5.1 Geräte für die In-vitro-Versuche ... 140
10.5.2 Geräte für die AABR-Messungen ... 141
10.5.3 Operationsbesteck und Geräte für die Durchführung der Operation ... 142
10.2.4 Geräte für die Aufarbeitung der Cochleae und Auswertung ... 143
DANKSAGUNG ... 145
Teile der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden bereits als Vorträge, Poster und publizierte Vortragskurzfassungen (Abstracts) auf Kongressen vorgestellt oder sind als Vortrag
akzeptiert:
WOLF, M., SCHEPER, V., STÖVER, T., SCHOLL, M., KADLECOVA, Z., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., PERRIER, T., LENARZ, T.
Hyperverzweigte Polylysin-Nanopartikel und Lipidnanokapseln als neuartige drug-delivery Systeme sind im Innenohr nachweisbar
In: 79. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Bonn, 2008 (Poster)
WOLF, M., SCHEPER, V., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
Uptake and toxicity of Hyperbranched Polylysines and Lipid Nanocapsules as novel drug carriers in mouse fibroblasts
In: Leopoldina Symposium “Molecular Medicine of Sensory Systems”, Tübingen, 2008 (Poster)
WOLF, M., SCHEPER, V., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
Examination of Hyperbranched Polylysines and Lipid Nanocapsules as novel drug-delivery vehicles for inner ear treatment
In: European Conference for Clinical Nanomedicine, Basel, Schweiz, 2008 (Poster)
WOLF, M., SCHEPER, V., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
Nanosized drug carriers: Uptake and toxicity of Hyperbranched Polylysines and Lipid Nanocapsules in mouse fibroblasts
In: 45th Inner Ear Biology Workshop, Ferrara, Italien, 2008 (Poster)
WOLF, M., SCHEPER, V., DALTON, P., JOHNSTON, A., NEWMAN, T., LENARZ, T., STÖVER, T.
In vitro and in vivo toxicity studies on Block Copolymer Micelles: a novel nonviral vector for inner ear treatment
In: 32nd MidWinter Meeting of Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, Maryland, USA, 2009 (Poster)
Vektoren ins Innenohr
In: 80. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Rostock, 2009 (Poster, Broicher-Preis 1. Platz)
WOLF, M., SCHEPER, V., JOHNSTON, A., NEWMAN, T., PERRY, H., LENARZ, T., STÖVER, T.
Toxicity evaluation of nanoparticles (Block Copolymer Micelles) as novel nonviral vectors for inner ear treatment
In: European Conference for Clinical Nanomedicine, Basel, Schweiz, 2009 (Poster)
SCHEPER, V.1, WOLF, M.1, SCHOLL, M., KADLECOVA, Z., PERRIER, T., KLOK, H.-A., SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
1 these authors contributed equally to this work
Potential novel drug carriers for inner ear treatment: Primary research into Hyperbranched Polylysine and Lipid Nanocapsules
In: Nanomedicine (4) 2009, 623-635
Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern dargestellten Ergebnisse in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt.
AABR akustisch evozierte auditorische Hirnstamm-Potenziale, acoustically evoked auditory brainstem response
Abb. Abbildung
ABR auditorische Hirnstammpotenziale, auditory brainstem response AEP akustisch evozierte Potenziale, auditory evoked potentials
Ak Antikörper
ATP Adenosintriphosphat
BDNF Brain-derived neurotrophic factor bzw. beziehungsweise
ca. zirka
°C Grad Celsius
Ch channel, Kanal
CI Cochlea-Implantat
CLSM konfokale Laserrastermikroskopie (confocal laser scanning microscopy)
cm Zentimeter
CM cochleäres Mikrophonpotenzial DAPI 4’,6-Diamidino-2-phenylindol
d Tag (day)
dB Dezibel
DMEM Zellkulturmedium (Dulbecco´s modified eagle medium) DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) ECochG Elektrocochleographie
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat
EEG Elektroenzephalogramm
ERA Elektrische Reaktionsaudiometrie (electric response audiometry) et al. et alii (und andere)
etc. et cetera, und so weiter
EU Europäische Union
FBS Fetal Bovine Serum FGF Fibroblast Growth Factor FITC Fluoreszeinisothiocyanat
G Gauge
g Gramm
GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor
GFP grün fluoreszierendes Protein, green-fluorescent protein HBSS Hanks balanced salt solution
HP Hyperverzweigte Polylysine
Hz Hertz
i.m. intramuskulär
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
kHz Kiloherz
l Liter
LAVES Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
LNK Lipidnanokapseln
μ mikro (x 10-6)
μl Mikroliter
μV Mikrovolt
m milli (x 10-3)
M Molekulargewicht
MAEP Mittlere akustisch evozierte Potenziale MFH Magnetflüssigkeitshyperthermie
mg Milligramm
Min. Minuten
ml Milliliter
mol Stoffmenge =6,022137 × 10 Teilchen
Mrd. Milliarde
MRT Magnetresonanztomographie
ms Millisekunde
mV Millivolt
n nano (x 10-9)
NGF Nerve Growth Factor
nm Nanometer
NT-3 Neurotrophin-3
p Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen)
P Druck Pa Pascal
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PEG Polyethylenglykol
PFA Paraformaldehyd
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration
p.o. per os
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)
s Sekunde
SAEP Späte akustisch evozierte Potenziale SAP Summenaktionspotenzial
s.c. subkutan
SFAEP Sehr frühe akustisch evozierte Potenziale siRNA kleine inhibitorische Ribonukleinsäure,
small interfering ribonucleic acid SP Schalldruck (sound pressure)
SPL Schalldruckpegel (sound pressure level)
Tab. Tabelle
TRITC Tetramethylrhodaminisiothiocyanat Trk-B Tyrosinkinase-Rezeptor B
u. a. unter anderem
UV ultraviolett
V Volt
v. a. vor allem z. B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
1 Einleitung
In Deutschland und Europa stellt Schwerhörigkeit bis hin zur Ertaubung einen weit verbreiteten Krankheitskomplex dar.
Im Juni 2005 wurde eine Umfrage zum Thema Hörprobleme auf Initiative des Forums
„Besser Hören“ in Zusammenarbeit mit dem Forschungsinstitut TNS-Emnid durchgeführt.
Bezogen auf die gesamte Einwohnerzahl der Bundesrepublik Deutschland kann man demnach von 17 bis 20 Millionen Menschen mit Hörproblemen ausgehen. Nach einer Studie (Befragung und Hörtest) des Deutschen Grünen Kreuzes e.V. leiden rund 15 Millionen Menschen davon unter einer deutlichen behandlungswürdigen Hörminderung. Auf Europa bezogen spricht die Universität Maastricht von 60 Millionen hörgeschädigten Menschen, während das britische Institute of Hearing Research sogar von 80 Millionen Betroffenen ausgeht. Den größten Teil der Hörschädigungen stellt der sensorineurale Hörverlust dar, der neben den erworbenen Ursachen, z. B. durch Infektionskrankheiten, Alkohol, Nikotin, ototoxische Medikamente oder durch Lärm, oft in einer angeborenen Genese begründet ist.
Nach Angaben des Deutschen Zentralregisters für kindliche Hörstörungen in Berlin ist das Hörvermögen von rund 80.000 Kindern so hochgradig gestört, dass sie spezielle Sonderschulen besuchen müssen.
Eine systemische Behandlung von Innenohrschwerhörigkeiten gestaltet sich sehr schwierig, da aufgrund der Blut-Cochlea-Barriere sehr hohe Medikamentendosen systemisch appliziert werden müssen, um nachweisbare Konzentrationsspiegel in der Perilymphe zu erzielen. Diese Therapieform ist nicht sehr effektiv und geht oft mit Nebenwirkungen und Belastungen des gesamten Organismus einher, so dass eine Durchführung nicht möglich oder effektiv ist.
Statt einer medikamentösen Behandlung der Hörstörung kommen bei gering- bis mittelgradigen Formen Hörgeräte zum Einsatz, die das Resthörvermögen optimal nutzen. Bei hochgradig schwerhörigen oder ertaubten Patienten stellt die Cochlea-Implantation inzwischen den Goldstandard dar, wobei diese elektronische Innenohrprothese beim sensorischen Hörverlust die mechano-elektrische Transduktion der Haarzellen übernimmt.
Hierbei wird eine Mehrkanalelektrode in das Innenohr eingeführt, um den Hörnerven elektrisch zu stimulieren. Voraussetzungen für eine erfolgreiche Implantation und anschließendes Sprachverständnis sind eine intakte zentrale Hörbahn und eine ausreichende Anzahl der für eine elektrische Stimulation zur Verfügung stehenden Spiralganglienzellen.
Eine primäre Schädigung der sensorischen Haarzellen geht allerdings aufgrund fehlender neurotropher und elektrischer Stimulation sekundär oft mit einer Spiralganglienzell- degeneration einher (INCESULU u. NADOL 1998; ALTSCHULER et al. 1999). Neben dem Verlust elektrisch stimulierbarer Neuronen haben auch implantationsabhängige Inflammationsprozesse und Bindegewebsproliferation einen negativen Einfluss auf die Nerven-Elektroden-Interaktion und damit auf den späteren Höreindruck.
Zur Unterdrückung der Entzündungsprozesse und Bindegewebsbildung in der Cochlea haben sich Glukokortikoide als therapeutisch wirksam herausgestellt (HIMENO et al. 2002;
TAKEMURA et al. 2004). Als Substanzen mit einem protektiven und teils sogar regenerativen Effekt auf Spiralganglienzellen wurden verschiedene neurotrophe Faktoren identifiziert, zu denen beispielsweise BDNF, GDNF, FGF oder NT-3 gehören (STAECKER et al. 1998; MARUYAMA et al. 2008). Aber auch die dem Cochlea-Implantat nachempfundene elektrische Stimulation selbst scheint einen protektiven Effekt auf die Spiralganglienzellen auszuüben und zum Aussprossen von Neuriten zu führen (LOUSTEAU 1987; HARTSHORN et al. 1991). Neben der getrennten Applikation scheint eine Kombination der protektiven Einzelfaktoren sogar eine kumulative Wirkungsweise zur Folge zu haben (HEGARTY et al. 1997; SCHEPER et al. 2009). Leider führt diese Lokaltherapie aber nicht zu einem Langzeiteffekt. GILLESPIE et al. (2003) konnten in einer Studie zeigen, dass nach Einstellen der BDNF-Gabe nicht nur die Zahl der überlebenden Neuronen wieder sinkt, sondern dass die Rate der neuronalen Degeneration im Verhältnis zum ertaubten, unbehandelten Ohr sogar signifikant zunimmt, was eine dauerhafte Therapie zwingend erforderlich macht.
Ein Teil der Forschung auf diesem Gebiet beschäftigt sich mit der Gentherapie, wobei Gene neurotropher Faktoren (YAGI et al. 2000; REJALI et al. 2007) oder Transkriptionsfaktoren (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005) in die betroffenen Zellen eingeschleust zu einer dauerhaften Protektion der Spiralganglienzellen bzw. über die Transdifferenzierung von Unterstützungszellen zu einer Haarzellregeneration führen können.
Untersucht wurde bereits die Möglichkeit des Gentransfers ins Innenohr über verschiedenste virale Vektoren (HAN et al. 1999; SUZUKI et al. 2003). Einerseits konnte eine protektive Wirkung auf Spiralganglienzellen nachgewiesen werden, andererseits ist der Gentransfer sehr unspezifisch, die Expression oft nur transient oder die Transfektionsrate zu gering.
Des Weiteren konnte eine Migration der viralen Vektoren zur Gegenseite beobachtet werden und sie können entzündliche und immunologische Reaktionen hervorrufen (KHO et al. 2000;
STOVER et al. 2000). Ein wesentlicher Nachteil viraler Vektoren ist nach wie vor die potenzielle Infektiosität und die daraus resultierenden ethischen Bedenken, die eine Virusverabreichung beim Menschen als Herausforderung erscheinen lassen.
Auf dem Gebiet der Drug-Delivery-Systeme zählen einfache Mikrokatheter, osmotische Pumpen oder Kombinationen mit der CI-Elektrode zu den technisch umsetzbaren Möglichkeiten, die allerdings immer noch zeitlich begrenzt und nicht zielgerichtet applizieren und das Risiko der Entzündung und reaktiver Bindegewebsbildung tragen (CARVALHO u.
LALWANI 1999; PAASCHE et al. 2003). Die zellbasierte Therapie auf Grundlage von Fibroblasten oder mesenchymalen Stammzellen stellt ein weiteres Entwicklungsfeld für den Wirkstofftransport dar (LI et al. 2004; NAKAGAWA u. ITO 2005). Abgeschlossene Studien über die Dauer der Produktion von neurotrophen Faktoren, mögliche Migration oder Proliferation der Zellen und immunologische Reaktionen stehen aber noch aus.
Eine interessante Alternative zum viralen Wirkstofftransport stellen nonvirale Vektoren dar, wobei vor allem Liposomen im Zentrum der Untersuchungen standen. Für Liposomen als Drug-Delivery-System spricht sicher ihre gute Biokompatibilität, allerdings ist der Wirkstofftransport nicht zielgerichtet und die Effizienz des Transfers ist unzureichend (WAREING et al. 1999; STAECKER et al. 2001). Aktuelle Entwicklungen basieren nun darauf, nonvirale Vektoren im nanoskaligen Maßstab zu entwickeln, die chemisch synthetisiert werden und unterschiedlichste Grundgerüste aufweisen können. Nanopartikel dieser Art sind im Gegensatz zu viralen Vektoren nicht infektiös, sicher und kostengünstig in großen Mengen herstellbar. Grundstruktur dieser Partikel der ersten Generation (1g) ist eine biokompatible Matrix, die durch diverse Oberflächenmodifikationen weiterentwickelt werden kann. Die angepasste Morphologie des Partikels und die Addition spezifischer Oberflächenrezeptoren ermöglichen eine zielgerichtete Infiltration bestimmter Zelltypen, die Permeation durch die geschlossene Rundfenstermembran oder sogar die Penetration des Zellnucleus, so dass eine zweite Generation (2g) entsteht. Zusätzliche Fluoreszenzmarkierung macht die Vehikel im Gewebe verfolgbar, wo sie biogene Arzneistoffe (z. B. neurotrophe Faktoren, Plasmide, Gene) gezielt transportieren und zeitlich kontrolliert und biologisch
effektiv freisetzen. Dieses Endprodukt stellt letztendlich einen Nanopartikel der dritten Generation dar (3g), der alle Anforderungen auf sich vereint.
Vor diesem hochkomplizierten Prozess des Drug-Delivery stehen allerdings Grundlagenstudien zur Biokompatibilität, Verfolgbarkeit und Infiltrationsvermögen der Partikel im Vordergrund. Auch wenn verschiedene Nanopartikel bereits in anderen Organsystemen getestet wurden und einige auch in der Cochlea visualisiert (BALA et al.
2004; TAMURA et al. 2005) und sogar protektive Effekte nachgewiesen werden konnten (ZHU et al. 2005; JIANG et al. 2007), so fehlt doch die Basisuntersuchung zu Eigenschaften der Grundstruktur, bevor eine Oberflächenmodifikation und Wirkstofftransport erfolgen kann.
Die hier durchgeführten Untersuchungen stellen die Grundlagenstudie für zwei unterschiedliche Nanopartikeltypen, Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln, dar, wobei in vitro und in vivo die Bioverträglichkeit, Verfolgbarkeit und die Fähigkeit der Partikel getestet wurden, unterschiedliche Zelltypen zu infiltrieren. Erst wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, sind weitergehende Studien zur Oberflächenmodifikation, zum Wirkstofftransport, -freisetzung und zum biologischen Effekt sinnvoll.
Letztendlich würde die Fähigkeit der Partikel, mit gebundenen Substanzen die intakte Rundfenstermembran zu durchdringen, eine völlig neuartige und risikoärmere Behandlungs- strategie für gering- bis mittelgradig hörgeschädigte Patienten darstellen. Andererseits kann die Kombination eines Cochlea-Implantats mit einem Nanopartikelreservoir die Möglichkeit eröffnen, dauerhaft protektiv oder regenerativ auf die verschiedenen cochleären Zelltypen einzuwirken. Die auf diese Weise verbesserte Nerven-Elektroden-Interaktion bringt eine deutlich gesteigerte Funktionalität des Cochlea-Implantats mit sich, was für den Patienten ein besseres Sprachverständnis und damit eine gesteigerte Lebensqualität bedeuten würde.
2 Zielsetzung
Sollen multikfunktionale Nanopartikel, in diesem Falle Hyperverzweigte Polylysine und Lipidnanokapseln, Wirkstoffe gezielt zu spezifischen Zelltypen im Innenohr transportieren und dort zeitlich kontrolliert freisetzen, so ist zunächst eine genaue toxikologische Untersuchung der nicht modifizierten Grundstrukturen nötig.
Dies erfolgt zunächst über In-vitro-Studien:
Untersuchung der Visualisierungsmöglichkeiten fluoreszenzmarkierter Nanopartikel in Zellkultur über Konfokalmikroskopische Untersuchung
Quantifizierung der Nanopartikelaufnahme in die Zellen über zuvor kalibrierte Fluoreszenzmessungen
Evaluierung möglicher Toxizität der untersuchten Nanopartkel auf die Fibroblasten über Vitalitätstest mit NeutralrotIm Falle positiver In-vitro-Ergebnisse, werden die beiden nanoskaligen Strukturen in vivo am Modell des Meerschweincheninnenohres auf morphologische oder funktionelle Effekte über verschiedene Zeiträume untersucht:
Konfokalmikroskopische Untersuchung der Nanopartikelverteilung im Innenohr und Aufnahme in die unterschiedlichen Zelltypen
Elektrophysiologische Untersuchung möglicher funktioneller Beeinträchtigungen in Form von Hörverlust durch die Nanopartikelapplikation ins Innenohr
Untersuchung des Einflusses der Nanopartikel auf die Haarzellen des Innenohres über die Erstellung von ZytocochleogrammenDie Ergebnisse dieser Arbeit über die Biokompatibilität der untersuchten Nanopartikeltypen stellen die Grundlage für die Entwicklung nonviraler Vektoren der dritten Generation (3g) dar, die durch Assoziation mit Wirkstoffen und den gezielten Zelltransport nach zusätzlicher Oberflächenmodifizierung entstehen.
3 Literaturübersicht
3.1 Das auditorische System der Säugetiere
Das Ohr (Auris, Organum vestibulocochleare) ist ein Doppelsinnesorgan und dient als Hörorgan der Wahrnehmung von Schall und als Gleichgewichtsorgan dem Dreh- und Lagesinn.
Anatomisch und funktionell lässt sich das Ohr bei Säugetieren in drei Abschnitte untergliedern: das äußere Ohr (Auris externa), das Mittelohr (Auris media) und das Innenohr (Auris interna). Während das Gleichgewichtsorgan allein im Innenohr liegt, sind die dem Hören dienenden Strukuren in allen Abschnitten des Ohres zu finden (NICKEL et al. 2003).
Im Folgenden soll das Hörorgan (Abb. 1) näher erläutert werden.
Abb. 1: Übersicht über das Hör- und Gleichgewichtsorgan des Menschen (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007)
3.1.1 Topographische Anatomie des Hörorganes
Das äußere Ohr besitzt bei landlebenden Säugetieren eine Ohrmuschel (Auricula), deren Grundlage von einem elastischen Muschelknorpel (Cartilago auriculae) gebildet wird. An ihrer Basis geht die Ohrmuschel in den äußeren Gehörgang (Meatus acusticus externus) mit seinem zuerst knorpeligen und nach medial knöchernen Anteil über, der am spangenförmigen Paukenring (Anulus tympanicus) endet, in den das Trommelfell (Membrana tympani) eingespannt ist (SEIFERLE 1992).
An das Trommelfell schließt sich die knöcherne, luftgefüllte Paukenhöhle (Cavum tympani) des Mittelohres an, in der sich die der Schallleitung dienende Gehörknöchelchenkette (Ossicula auditus) befindet. Die Ossikelkette, bestehend aus Hammer (Malleus), Amboss (Incus) und Steigbügel (Stapes) und stellt eine bewegliche Verbindung zwischen dem Trommelfell und dem Ovalen Fenster (Fenestra vestibuli) dar, wobei der Hammerschaft (Manubrium mallei) am Umbo membranae tympani mit dem Trommelfell fest verwachsen ist und der Steigbügel mit seiner Fußplatte (Basis stapedis) an das Ovale Fenster grenzt. Die Ohrtrompete (Tuba auditiva, Eustachische Röhre) stellt eine Verbindung zum Rachenraum her und dient dem Druckausgleich und Sekretabfluss.
Das Innenohr selbst als statoakustisches Doppelsinnesorgan besteht aus einem knöchernen Labyrinth (Labyrinthus osseus), in welches das häutige Labyrinth (Labyrinthus membranaceus) eingelassen ist. Das häutige Labyrinth besteht aus zwei miteinander in Verbindung stehenden funktionellen Teilen. Es enthält die Sinnesrezeptoren des Gleichgewichtsorgans (Vestibularapparat) in Vorhof (Vestibulum) und Bogengängen (Canales semicirculares ossei) sowie die des Gehörorgans in der sich rostroventral anschließenden Hörschnecke (Cochlea). Zwischen knöchernem und häutigem Labyrinth befindet sich ein perilymphatischer Raum (Spatium perilymphaticum), der sowohl über den Aquaeductus vestibuli als auch über den Aquaeductus cochleae (Ductus perilymphaticus) mit dem Cavum leptomeningicum der Schädelhöhle in Verbindung steht und so einen Flüssigkeitsaustausch mit dem Liquor cerebrospinalis ermöglicht. Das häutige Labyrinth selbst ist mit visköser Endolymphe gefüllt.
Die Hörschnecke (Cochlea) windet sich um die konusförmige Schneckenspindel (Modiolus) und weist beim Menschen ungefähr 2,75 und beim Meerschweinchen 3,5 bis nahezu 4 sich verjüngende Windungen auf (NADOL 1988). Im Gegensatz zur anatomischen Beschaffenheit
des Menschen liegt die Cochlea des Meerschweinchens fast frei im Mittelohr vor und wird durch eine dünne Knochenwandung von diesem abgegrenzt. Vom Modiolus springt eine ebenfalls spiralförmig verlaufende, dünne Knochenlamelle (Lamina spiralis ossea) in den Schneckengang vor und teilt den Schneckenkanal (Canalis spiralis) in die oberhalb gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) und die unterhalb gelegene Paukentreppe (Scala tympani). Die Scala vestibuli entspringt am Ovalen Fenster und geht an der Schneckenspitze (Cupula cochleae) im Schneckenloch (Helicotrema) in die Scala tympani über, die schließlich am Runden Fenster (Fenestra cochleae) endet, das beim Meerschweinchen eine ungefähr 1,18 mm2 große Membran darstellt (GHIZ et al. 2001). Diese kommunizierenden Scalen sind perilymphatisch gefüllt, wobei das Gesamtvolumen etwa 15,94 µl (SHINOMORI et al. 2001) beträgt. Der zwischen den beiden Räumen liegende Schlauch des häutigen Labyrinthes (Ductus cochlearis, Scala media) wird durch die Reißnersche Membran (Membrana vestibularis) von der Scala vestibuli und durch die Basilarmembran (Lamina basilaris) von der Scala tympani getrennt (Abb. 2). Die Basilarmembran als Sitz des Cortischen Organs weist beim Menschen eine Länge von durchschnittlich 35 mm und beim Meerschweinchen eine Länge von 16,4 ± 1,4 mm (V. LINSS et al. 2007) auf. Nach lateral wird die Scala media von der Stria vascularis begrenzt, einem vielschichtigen, gut vaskularisierten Epithel, welches der Versorgung der Strukturen mit kaliumreicher Endolymphe dient, wobei das Volumen dieses Raumes etwa 4,69 µl beträgt (SHINOMORI et al. 2001).
Das Cortische Organ (Organum spirale), welches das akustische Rezeptorenfeld aus Haarsinneszellen und die sie in ihrer Lage haltenden Stützzellen beinhaltet, befindet sich auf der Basilarmembran (Lamina basilaris), die zwischen einer knöchernen Leiste am Modiolus (Lamina spiralis ossea) und dem Ligamentum spirale lokalisiert ist (Abb. 2). Zu Pfeilerzellen umgewandelte Stützzellen bilden den Cortischen Tunnel, auf dessen axialer Seite sich eine Reihe innerer Haarzellen befindet, während peripher drei bis maximal fünf Reihen äußere Haarzellen vorhanden sind. Jede Haarzelle besitzt an ihrem apikalen Ende Sinneshärchen (Stereovilli), die in die Scala media hineinragen und im Fall der äußeren Haarzellen festen Kontakt mit der sie bedeckenden Tektorialmembran (Membrana tectoria) haben, während die der inneren Haarzellen frei in die Endolymphe ragen (HOTH u. LENARZ 1997). Die Ansatzstelle für die Tektorialmembran stellt der obere Rand (Labium limbi vestibulare) des Limbus spiralis osseae dar, der das Cortische Organ modiolusseitig begrenzt. Im Gegensatz
zu den inneren Haarzellen, die nur passiv auf Schalldruckwellen reagieren, sind äußere Haarzellen durch ihr Aktomyosinskelett aktiv zur Kontraktion befähigt (ZENNER 1986).
Abb. 2: Bau des Cortischen Organs als akustisches Rezeptorenfeld im Innenohr (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007)
3.1.2 Physiologie des Hörvorganges
Das Hörorgan reagiert auf adäquate akustische Reize in Form von Schallwellen, die sich von einem schwingenden Körper (Schallquelle) ausgehend als Druck- bzw. Dichteschwankungen in elastischen Medien (Gase, Flüssigkeiten, Festkörper) ausbreiten. Physikalisch werden Schallwellen sowohl durch die Amplitude (Schalldruck = Lautstärke) als auch durch die Frequenz (= Tonhöhe) der Druckschwankungen näher definiert (ENGELHARDT u. BREVES 2000). Zur besseren Handhabung verwendet man daher den Schalldruckpegel (sound pressure level = SPL), der in Dezibel (dB) angegeben wird und bei dem der Schalldruck Px in einer logarithmischen Beziehung zu einem festgelegten Bezugsschalldruck P0 angegeben wird (ENGELHARDT u. BREVES 2000). Damit ergibt sich für das menschliche Ohr eine verarbeitungsfähige Schallintensität, von 0 bis 120 dB SPL.
Wirbeltiere zeigen artspezifisch sehr unterschiedliche frequenzbezogene Hörbereiche, wobei die für den Menschen wahrnehmbaren Töne ein Spektrum von 20 bis 20.000 Hz umfassen
(LEHNHARDT u. LASZIG 2001). Bei den ursprünglich nachtjagenden Carnivoren ist die Hörfähigkeit besser ausgeprägt, was nicht nur das in den Ultraschallbereich reichende Frequenzmaximum (bis 60 kHz) betrifft, sondern auch die Sensitivität des Hörvermögens, so dass die Hörschwellenkurve der Katze zwischen 1 und 10 kHz fast 20 dB niedriger ist als beim Menschen. Spitzenreiter in der Ultraschallwahrnehmung sind Fledermäuse und Delphine, die Frequenzen bis zu 200 kHz wahrnehmen (PENZLIN 1991). Dahingegen sind einige Vögel (z. B. Tauben) auch in der Lage, Infraschall von weniger als 1 Hz wahrzunehmen (SCHMIDT-NIELSEN 1999). Meerschweinchen hören in einem Frequenz- bereich von 50 Hz bis 50 kHz (FAY 1988).
Der Hörvorgang kann als Ablauf dreier aufeinander folgender Ereignisse beschrieben werden:
Schallantransport (Konduktion) durch Luft oder Flüssigkeiten
Transformation (Transduktion) der mechanischen Schallenergie in neurale Aktivität
Reizfortleitung (Transmission) entlang der zentralen Hörbahn zur Verarbeitung und Wahrnehmung von Qualität und Intensität des Schalls
Der Luftschall wird von der Ohrmuschel aufgefangen und durch den äußeren Gehörgang zum Trommelfell geleitet, das von den Schallwellen in Schwingung versetzt wird (1. Impedanzwandlung). Der Hammer ist in das Trommelfell eingelassen und überträgt dessen Schwingungen über den Amboss und den Steigbügel, der mit seiner Fußplatte am Ovalen Fenster befestigt ist, auf das flüssigkeitsgefüllte Innenohr (2. Impedanzwandlung).
Aufgrund der unterschiedlichen Impedanzen von Luft und Flüssigkeit würden etwa 98% der akustischen Schallenergie beim Aufprall von Luftschwingungen auf die Innenohrflüssigkeit durch Reflexion verloren gehen, was allerdings durch das Schalldruckverstärkersystem des Mittelohres weitgehend ausgeglichen wird. Unterschiedliche Hebelarmlängen der Gehörknöchelchen und das Oberflächenverhältnis zwischen Trommelfell und Steigbügelplatte definieren die artspezifischen Übertragungseigenschaften (PLATH 1981).
Die Auslenkung des Ovalen Fensters durch die Steigbügelplatte bewirkt eine Volumenverschiebung der nicht kompressiblen Perilymphe, so dass eine frequenz- und intensitätsabhängige Wanderwelle entsteht, die in der Scala vestibuli entlang der Windungen der Cochlea über das Helicotrema und in der Scala tympani zurück zum runden Fenster läuft.
Folgende Eigenschaften bewirken dabei eine Frequenzdispersion oder auch Ortstonotopie
(LEONHARDT 1990): Zum Einen nimmt der Durchmesser des knöchernen Kanals zum Apex hin ab, während die Basilarmembran an der Basis um mehr als das tausendfache steifer ist als apikal. Zum Anderen nimmt die Breite der Basilarmembran von ca. 0,04 mm an der Basis auf 0,5 mm an der Schneckenspitze zu, so dass die Amplitude der Wanderwelle bis zu einer Stelle maximaler Auslenkung anwächst und dann rasch zusammenbricht. Dabei haben Schwingungen hoher Frequenz ihr Amplitudenmaximum in Steigbügelnähe, wohingegen niederfrequente Töne in der Nähe des Helicotremas abgeleitet werden (ALLEN 1980). Durch die Auslenkung der Basilarmembran und der Verschiebung der Tektorialmembran bzw. der Endolymphe kommen Scherkräfte zur Wirkung, die die Stereovilli tangential verschieben und den adäquaten Reiz für die Haarzellen darstellen.
Zur Schalltransformation im Bereich des Amplitudenmaximums kommt es anschließend im Bereich des Cortischen Organs, wo mechanische in elektrische Energie umgewandelt wird (PICKLES u. COREY 1992). Durch Ablenkung der Stereovilli der Haarzellen und Dehnung der feinen Spitzenfäden (Tip-Links), werden Ionenkanäle der apikalen Haarzellmembran geöffnet. Es kommt zu einem Einstrom von K+-Ionen aus der Endolymphe und damit zu einer Depolarisation der Zelle, was weiterhin den Einstrom von Ca2+-Ionen aus der Perilymphe bewirkt. Schließlich werden an der Haarzellbasis exzitatorische Neurotransmitter in den synaptischen Spalt freigesetzt, was zum Aufbau eines postsynaptischen Generatorpotenzials führt (ABBAS 1988). Für die Übermittlung der Sinnesinformationen sind der Innervation entsprechend überwiegend die inneren Haarzellen zuständig. Die äußeren Haarzellen besitzen neben der Fähigkeit zur mechano-elektrischen Transduktion auch motorische Eigenschaften durch ihr Aktinfilamentskelett. Auf Beschallung reagieren sie mit einer Kontraktion (elektro- mechanische Transduktion), die den Abstand zwischen Basilar- und Tektorialmembran verkürzt, was wiederum die Amplitude der Welle verstärkt und benachbarte Basilarmembranabschnitte dämpft. Als cochleäre Vorverstärker ermöglichen sie so den inneren Haarzellen auch bei sehr schwachen akustischen Reizen sensorisch wirksam zu werden und steigern somit erheblich das Frequenzauflösungsvermögen und die Empfindlichkeit des Gehörs.
Die Aktionspotenziale der afferenten Fasern der Spiralganglienzellen werden über den Hörnerven weitergeleitet und erreichen letztendlich über die Anteile der zentralen Hörbahn die Hörrinde (ENGELHARDT u. BREVES 2000).
3.1.3 Audiometrische Untersuchungsmethoden
3.1.3.1 Allgemeines zu unterschiedlichen Hörprüfmethoden
Im Falle einer Hörstörung dienen audiometrische Untersuchungen der Überprüfung des Hörvermögens und der Ermittlung von Art, Ort und Ausmaß der Schädigung. Dabei kommen subjektive Tests zur Anwendung, die eine Befragung der Patienten nach der subjektiven Einschätzung der bewussten auditorischen Wahrnehmung beinhalten. Im Gegensatz zu diesen psychoakustischen Verfahren ermöglichen objektive Hörprüfmethoden eine Beurteilung des Hörvermögens durch Registrierung auditorisch korrelierter physikalisch messbarer Parameter.
Diese objektiven Testmethoden kommen bei nicht kooperativen Patienten (Kleinkinder, Menschen mit geistiger Behinderung oder psychogener Hörstörung) und bei Tieren zum Einsatz. Neben der Reflexaudiometrie, den otoakustischen Emissionen und der Impedanz- audiometrie hat sich die elektrische Reaktionsaudiometrie (= electric response audiometry, ERA) zum wichtigsten Verfahren entwickelt und soll hier als angewandte objektive Testmethode näher erläutert werden (HOTH u. LENARZ 1994). Aufgrund einer nicht einheitlichen Nomenklatur in diesem Bereich, wird die Bezeichnung „auditory brainstem response (ABR)“ häufig synonym verwendet (LEHNHARDT u. LASZIG 2001).
Die ERA als nichtinvasive Untersuchungsmethode dient der Diagnostik von Schädigungen der gesamten Hörbahn von der Cochlea bis hin zum auditorischen Cortex. Die durch akustische Reize entlang der Hörbahn auftretenden Aktionspotenziale werden als akustisch evozierte Potenziale (AEP) abgeleitet und erlauben neben einer Aussage über Art und Ausmaß der Hörschädigung in Kombination mit der Impedanzaudiometrie auch eine genaue Lokalisation der Störung vom peripheren Hörorgan bis zur neuralen Verarbeitung. Über Elektroden lassen sich durch akustische Reize hervorgerufene elektrische Potenziale von allen Stufen der Hörbahn ableiten. Dabei wird die gesamte elektrische Aktivität des Gehirns registriert, die auf periphere Stimulation, afferente Erregungsleitung und zentrale neuronale Verschaltung basiert. Die unter periodischer akustischer Reizeinwirkung entstehenden elektrischen Potenzialschwankungen der Hörbahn lassen sich durch computergestützte Mittelungstechnik (Averaging) von der überlagerten reizunabhängigen spontanen EEG- Aktivität trennen. So heben sich akustisch evozierte Potenziale (AEP) ab und können als Wellenverlauf im Spannungsdiagramm in Relation zur Zeit dargestellt werden. Da die AEP in örtlich-zeitlicher Reihenfolge entlang der Hörbahn von den Haarzellen in der Cochlea bis zur
Hörrinde entstehen, spiegeln einzelne Wellen Teilfunktionen des Hörvorgangs wieder und können bestimmten anatomischen Strukturen topologisch zugeordnet werden. Bezug nehmend auf ihre Latenzzeit, was dem zeitlichen Auftreten im Abstand zum auslösenden Reiz entspricht, werden die AEP in sehr frühe (SFAEP), frühe (FAEP), mittlere (MAEP), späte (SAEP) und sehr späte Potenziale (SSAEP) eingeteilt. Die Wellen lassen sich zusätzlich spezifischen Regionen der Hörbahn als neuronalen Generatoren zuordnen, wobei die Ursprungsgebiete der Generatoren bei Tieren mit denen des Menschen übereinstimmen.
Wellen, die innerhalb der ersten 10 ms nach akustischer Stimulation auftreten, werden als FAEP oder Hirnstammpotenziale bezeichnet. Sie entstammen der Cochlea, dem Hörnerv und dem Hirnstamm und dienen der Differenzierung von Hörstörungen des Mittelohres, des Innenohres und der neuralen Hörbahn. Da die erfassten Reaktionen von Pharmaka und Bewusstsein nahezu unbeeinflusst sind, ermöglichen sie ein Hörschwellenscreening bei Neugeborenen, Kleinkindern oder auch Tieren im Schlaf, in Sedierung oder im narkotisierten Zustand.
Als Methode der objektiven Hörschwellenmessung wurde für diese Arbeit die Ableitung der akustisch evozierten auditorischen Hirnstammpotenziale (acoustically evoked auditory brainstem response, AABR) angewendet und im weiteren Verlauf auch näher erläutert.
3.1.3.2 Akustisch evozierte auditorische Hirnstammpotenziale
Die objektive Beurteilung der Hörschwelle erfolgt in der Hirnstammaudiometrie mit der Erfassung der FAEPs, die sich als ein Komplex von 5 bis 7 Wellen darstellen (JEWETT 1970). Jewett beschrieb erstmals die Möglichkeit, über Kopfelektroden die Reaktionen des Gehirns auf einen Reiz im auditorischen System zu registrieren. Auf ihn geht auch die Bezeichnung der einzelnen Wellen zurück (I-V), deren topologische Zuordnung aufgrund zahlreicher tierexperimenteller Untersuchungen sehr gut möglich ist und mit denen des Menschen weitestgehend übereinstimmt. Da es sich bei den FAEPs um überlagerte Summenaktionspotenziale verschiedener Kerngebiete handelt, kann eine getrennte Zuordnung zu einzelnen Potenzialgeneratoren der Hörbahn nicht eindeutig getroffen werden.
STÖHR et al. (1989) aber auch HOTH und LENARZ (1994) ordnen die Welle I den cochleären Strukturen wie dem Spiralganglion und dem N. cochlearis zu. Mit der Welle II tritt der Hörnerv aus dem inneren Gehörgang aus und in den Hirnstamm ein, während die
Welle III den Nucleus cochlearis repräsentiert. Die Welle IV wird von der ipsilateralen oberen Olive und dem Lemniscus lateralis generiert, wohingegen die Welle V von der kontralateralen oberen Olive und Lemniscus lateralis stammt. Die späten Wellen VI und VII sind nur inkonstant nachweisbar, besitzen ihren Ursprung aber der Hörbahn entsprechend zwischen Zwischenhirn und primärem auditorischen Cortex. Zur Bestimmung der akustischen Hörschwelle beim Meerschweinchen wird die Welle III herangezogen. Von diagnostischer Bedeutung innerhalb der FAEPs sind die Latenzen der einzelnen Wellen, die eng mit den Stimulusintensitäten korreliert sind und sich umgekehrt proportional zu ihnen verhalten. Hohe Reizpegel führen zu kurzen Latenzen und umgekehrt.
Für die Interpretation der abgeleiteten Potenziale ist es außerdem wichtig, den verwendeten Stimulus anhand einzelner Reizparameter wie Reizstärke, Polarität und Frequenz näher zu beschreiben.
Die Reizstärke wird wie bereits beschrieben (siehe 2.1.2) in dB SPL angegeben und hat den größten Einfluss auf die FAEPs. Wie in Abb. 3 ersichtlich, nehmen die Amplituden mit zunehmender Reizstärke zu, während sich die Latenzen verkürzen.
Abb. 3: Beispiel für eine frequenzspezifische AABR-Messung (1, 4, 8, 16, 32 und 40 kHz) am Tag 0 am linken Ohr eines normal hörenden Meerschweinchens. Mit zunehmender Reizstärke nehmen die Amplituden zu, während die Latenzen sich verkürzen (Ch1 = linkes Ohr, St = stimulierte Frequenz)
(Quelle: Gemittelter Graph aus dem Software-Programm HughPhonics)
3.2 Pathophysiologie von Hörminderung und Ertaubung
3.2.1 Allgemeines zur Einteilung von HörschädigungenDer Krankheitskomplex der Hörminderung und Taubheit gewinnt in Deutschland zunehmend an Bedeutung. Wie in Abbildung 4 dargestellt, lassen sich dabei Schallleitungs- und Schallempfindungsschwerhörigkeiten in Abhängigkeit von der Lokalisation der Störung unterscheiden. Im Falle der Schallleitungsschwerhörigkeit handelt es sich um eine konduktive Hörstörung, deren Ursache im Außen- oder Mittelohr zu finden ist. Die Ursache der Schallempfindungsschwerhörigkeit (sensorineuraler Hörverlust) ist dahingegen cochleär oder retrocochleär bedingt, wobei die Sinneszellen selbst (sensorisch), der Hörnerv (neural) oder das Zentrale Nervensystem (zentral) betroffen sein können (HOTH u. LENARZ 1994).
Abb. 4: Übersicht über die Klassifizierung von Hörminderungen
Bei einer konduktiven Hörstörung wird weniger Schallenergie über die Gehörknöchelchen- kette auf die Cochlea mit ihren Sinneszellen übertragen. Es kommt zu einer Dämpfung des wirksamen Schalldrucks und damit zu einer Verschlechterung des Hörvermögens bei intaktem Innenohr. Ursächlich kommt für die Schallleitungsschwerhörigkeit eine Versteifung, Dämpfung oder Blockierung des konduktiven Systems in Frage, so dass beispielsweise eine übermäßige Ansammlung von Cerumen, Fremdkörper oder Gewebsproliferationen im äußeren Gehörgang die Schallwellen daran hindern können, das Trommelfell zu erreichen.
Trommelfellrupturen, Mittelohrentzündungen, Tumoren, Otosklerose oder bei der Katze besonders häufig auftretende Mittelohrpolypen können ebenfalls zu einem konduktiven Hörverlust führen (VENKER-VAN HAAGEN 2006).
Hirnstamm, Cortex Hörnerv
Innenohr
Schallempfindungsschwerhörigkeit cochleär
sensorisch
retrocochleär
neural zentral Äußeres Ohr Mittelohr
Schallleitungsschwerhörigkeit
konduktiv
Hirnstamm, Cortex Hörnerv
Innenohr
Schallempfindungsschwerhörigkeit cochleär
sensorisch
retrocochleär
neural zentral Äußeres Ohr Mittelohr
Schallleitungsschwerhörigkeit
konduktiv Äußeres Ohr Mittelohr
Schallleitungsschwerhörigkeit
konduktiv
Desweiteren soll auf den sensorineuralen Hörverlust genauer eingegangen werden, da sich die vorliegende Arbeit mit Nanopartikeln als Drug-Delivery-System ins Innenohr beschäftigt, was einen therapeutischen Einsatz bei Schallempfindungsschwerhörigkeit ermöglichen könnte.
3.2.2 Pathophysiologie sensorineuralen Hörverlustes
Bei den retrocochleären Schallempfindungsschwerhörigkeiten können sowohl Schädigungen am Hörnerven als auch des Zentralen Nervensystems zu Hörminderung und Taubheit führen.
Ursächlich kommen hier vor allem Tumoren in diesem Bereich wie Akustikusneurinome in Betracht, aber auch Traumata, entzündliche Veränderungen (Meningitis) oder Hydrocephalus, wie es auch für Hunde und Katzen mehrfach nachgewiesen wurde (STEISS et al. 1994).
Die häufigste Form der Schwerhörigkeit beim Menschen stellt jedoch die Innenohr- schwerhörigkeit, also der sensorische Hörverlust dar, der durch eine irreversible Schädigung der Haarzellen im Cortischen Organ gekennzeichnet ist. Die Informationsübertragung von der Cochlea zum Gehirn ist nicht mehr gegeben, wenn die mechano-elektrische Transduktion unterbleibt. Innenohrschäden können zum einen kongenital (angeboren) auftreten, wobei man zwischen hereditären (genetisch bedingt), pränatalen (vor der Geburt erworben) und perinatalen Störungen (während der Geburt erworben) unterscheidet, und zum anderen postnatal erworben sein (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
Ursachen pränatal erworbener Hörstörungen können Infektionen der Mutter während der Schwangerschaft (z. B. Röteln, Toxoplasmose), Stoffwechselerkrankungen (z. B. Diabetes mellitus, Hypothyreose), Medikamenteneinnahme (z. B. Contergan) oder Alkoholabusus sein.
Perinatal sind vor allem Geburtstraumen, die mit Hypoxie einhergehen, mögliche Ursachen einer Hörstörung. Bei den hereditären Hörschädigungen unterscheidet man syndromale und nicht-syndromale Ausprägungen, die sowohl rezessiv als auch dominant vererbt werden können. Syndromale Erkrankungen können mit Augensymptomen (z. B. Cogan-Syndrom, Waardenberg-Klein-Syndrom), mit Nierenerkrankungen (z. B. Alport-Syndrom) oder mit Schilddrüsensymptomen (z. B. Pendred-Syndrom) vergesellschaftet sein. Bei den nicht- syndromalen Taubheitsursachen stellt die Mutation der gap-junction-Proteine Connexin 26 und 31 (LEFEBVRE u. VAN DE WATER 2000; X. Z. LIU et al. 2009) eine zentrale Gruppe beim Menschen dar. Auch bei Hunden und Katzen, die taub geboren werden und erst ab dem
5. bis 7. Tag nach der Geburt akustische Reize aufnehmen können, wurden hereditäre Innenohrdefekte untersucht und zum Teil als Tiermodell für das Waardenburg-Syndrom des Menschen genutzt, das durch angeborene Taubheit in Assoziation mit Pigmentierungsstörungen von Haut, Haar und Iris gekennzeichnet ist (WAARDENBURG 1951). Bei Hunden ist angeborene Taubheit bei Dalmatinern sehr gut untersucht (MAIR 1976; HOLLIDAY et al. 1992), aber auch die Merle-Pigmentierung (z. B. Merle-Sheltie, Blue-Merle-Collie, Tigerdogge) und Träger des Piebald-Gens (z. B. Bullterrier, Samoyede, Greyhound) sind mit Taubheit assoziiert. Auch die Taubheit weißer Katzen ist eingehend studiert worden (MAIR 1973), wobei die primäre Degeneration der epithelialen und sensorischen Elemente in der ersten Woche nach der Geburt auftritt und sich die sekundäre Degeneration der neuronalen Strukturen danach entwickelt (BOSHER u. HALLPIKE 1965;
PUJOL et al. 1977).
Postnatal erworbener sensorischer Hörverlust geht mit einer Zerstörung zuvor intakter Haarzellen einher. Eine mechanische Schädigung kann dabei durch ein akutes oder chronisches akustisches Trauma (PLINKERT u. DE MADDALENA 1996) oder ein stumpfes Schädeltrauma entstehen, während mit zunehmendem Alter degenerative Prozesse zu Altersschwerhörigkeit (Presbyakusis) führen können. Einen wesentlichen Anteil an erworbenen Hörschädigungen besitzen Ototoxine, die unterschiedlichen Ursprungs sein können. Infektionskrankheiten (z. B. Mumps, Fleckfieber, Borreliose) können ototoxisches Potenzial besitzen, bzw. Exotoxine verschiedenster Bakteriengattungen, die an Mittelohrentzündungen beteiligt sind. Auch Stoffwechselprodukte, die bei Schilddrüsen-, Leber- oder Nierenfunktionsstörungen auftreten, können potenziell ototoxisch wirken.
Exogene Noxen, die neben der Lärmexposition auch in experimentellen Studien Anwendung finden (WEST et al. 1973), stellen ototoxische Medikamente wie beispielsweise Aminoglykosidantibiotika (z. B. Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Gentamicin), Diuretika (z. B. Furosemid, Etacrynsäure) und Zytostatika (z. B. Cisplatin, Carboplatin) dar.
Dabei ist nicht nur eine lokale Applikation der Substanzen toxisch, wenn diese beispielsweise bei Perforation des Trommelfells die semipermeable Membran des Runden Fensters durchdringen, sondern auch die systemische Verabreichung der Medikamente. Es kommt zu einer Haarzellschädigung mit anschließender -apoptose beginnend an der Basis der Cochlea
mit fortschreitendem Haarzellverlust nach apikal in Abhängigkeit von Dosis und Dauer der Applikation.
Nach initialer Schädigung der Haarsinneszellen kommt es sekundär zu einer Degeneration der nachgeschalteten Spiralganglienzellen (OTTE et al. 1978; SPOENDLIN 1984), wobei eine Apoptose großer Teile der Spiralganglienzellpopulation bereits innerhalb weniger Stunden nach intracochleärer Aminoglykosidinjektion nachzuweisen ist. Mit dem Verlust der Haarzellen fehlt zum einen die afferente Innervation der Spiralganglienzellen durch ankommende Aktionspotenziale und freigesetzte Neurotransmitter, zum anderen fehlt die Bildung neurotropher Faktoren durch die Sinneszellen, so dass dieser trophische Effekt auf die Spiralganglienzellen unterbleibt. Mit Verlust der elektrischen und neurotrophen Stimulation in Folge des Haarzelluntergangs zeigt sich so sekundär immer eine Spiralganglienzelldegeneration.
3.2.3 Das Cochlea-Implantat als Therapieoption bei sensorischer Hörstörung
Ist die Hörminderung bei einem Patienten so weit fortgeschritten, dass das Resthörvermögen für die Verwendung eines Hörgerätes nicht mehr nutzbar ist, so kann mit Hilfe einer elektronischen Innenohrprothese (Cochlea-Implantat, CI) die Wiedererlangung des Sprach- verständnisses und damit eine erhebliche Steigerung der Lebensqualität ermöglicht werden (CLARK et al. 1987; MATSCHKE u. PLATH 1988). Grundvoraussetzung für die Implantation solch einer Prothese ist eine rein sensorisch bedingte cochleäre Taubheit mit erhaltener Leitfähigkeit des Hörnerven und intakter zentraler Hörbahn, so dass das Implantat durch direkte elektrische Reizung der Spiralganglienzellen die Funktion der Haarzellen übernehmen und einen Höreindruck vermitteln kann (LENARZ 1998). Das CI setzt sich aus mehreren Einzelkomponenten zusammen: der eigentlichen Cochlea-Implantat-Elektrode, einer Sende- und Empfangsspule, einem Sprachprozessor und dem Mikrophon. Akustische Informationen werden über das Mikrophon aufgenommen und dem Sprachprozessor zugeleitet, der sie nach Filterung, Komprimierung und Entrauschung in elektrisch kodierte Impulse umwandelt. Dieses generierte Signalmuster in Form von elektromagnetischer Induktion wird von der Sendespule transkutan auf die subkutan retroauriculär implantierte Empfängerspule übertragen (LEHNHARDT et al. 1986).
Schließlich wird die Information an die intracochleär implantierte Mehrkanalelektrode weitergeleitet, die schließlich indirekten Kontakt mit dem Spiralganglion hat. Die Reizelektrode wird über das Runde Fenster oder per Cochleostomie in die Scala tympani eingeführt, wobei eine möglichst modiolusnahe Insertion einen engen Nerven-Elektroden- Kontakt sicherstellen soll (SHEPHERD et al. 1993). Die je nach Hersteller bis zu 22 Elektrodenkontakte sind schließlich unterschiedlich tief in der Cochlea positioniert und können so verschiedene Abschnitte der Basilarmembran getrennt voneinander tonotop reizen.
Die selektive Stimulation der einzelnen Fasern des Hörnervs wird schließlich analog zum physiologischen Hörvorgang über die zentrale Hörbahn zum auditorischen Cortex geleitet, wo der Höreindruck erzeugt wird (LENARZ 1997).
Da das CI also die mechano-elektrische Transduktion der Haarzellen übernimmt, ist der Erfolg der Implantation im Wesentlichen von einer guten Nerven-Elektroden-Interaktion abhängig. Neben einer möglichst modiolusnahen Insertion der Elektrode wird auch eine weitgehende Unterdrückung der Bindegewebsproliferation angestrebt, die durch postoperativ eintretende Entzündungsvorgänge hervorgerufen werden kann. Zusätzlich beeinflusst die Anzahl funktionsfähiger Spiralganglienzellen den späteren Höreindruck und das Sprachverständnis (SUTTON 1983). Die therapeutischen Maßnahmen beinhalten also die Applikation entzündungshemmender Glukokortikoide zur Reduktion des Bindegewebes, aber auch die Intervention mit neurotrophen Faktoren, Genen oder auch elektrischer Stimulation, um eine fortschreitende Spiralganglienzelldegeneration aufzuhalten (WEFSTAEDT et al.
2006). Doch um wirklich gezielt an bestimmten Zelltypen angreifen und auch einen Langzeiteffekt erzielen zu können, ist es nötig neue Drug-Delivery-Systeme zu entwickeln, die mit dem CI kombinierbar sind.
3.3 Drug-Delivery-Systeme
3.3.1 Überblick über Substanzen zur Verbesserung der Nerven-Elektroden- Interaktion
In vielen vorangegangenen Studien wurden bereits Möglichkeiten untersucht, die Spiralganglienzelldegeneration nach Ertaubung aufzuhalten bzw. diese sogar zu regenerieren, das Bindegewebe zurückzudrängen oder auch Einfluss auf geschädigte Haarzellen zu nehmen.
Im Falle der Entzündungshemmung und Verringerung der Bindegewebsbildung haben sich Glukokortikoide als sehr wirksam erwiesen (DE CEULAER et al. 2003; STOVER et al.
2006). Ein protektiver Effekt auf Spiralganglienzellen konnte für verschiedene neurotrophe Faktoren wie beispielsweise BDNF, GDNF, FGF und NT-3 (ERNFORS et al. 1996;
STAECKER et al. 1998; YAGI et al. 2000; MCGUINNESS u. SHEPHERD 2005;
MARUYAMA et al. 2008) im Innenohr nachgewiesen werden, wobei sowohl einzelne Faktoren, als auch Kombinationen untereinander oder mit elektrischer Stimulation (KANZAKI et al. 2002; SHEPHERD et al. 2005; SHEPHERD et al. 2008) zu höherer Spiralganglienzellzahl führten. Sogar bei einer verzögerten Gabe nach Ertaubung waren die Ergebnisse vielversprechend (GILLESPIE et al. 2004; YAMAGATA et al. 2004; MILLER et al. 2007). Leider handelt sich dabei nicht um einen Langzeiteffekt, sondern unmittelbar nach dem Einstellen der BDNF-Behandlung sinkt die Anzahl der überlebenden Neuronen, die sich dann nicht mehr von der unbehandelten Seite unterscheidet (GILLESPIE et al. 2003). Die Rate der neuronalen Degeneration nimmt im Verhältnis zu ertaubten, unbehandelten Cochleae sogar signifikant zu, so dass eine dauerhafte Therapie angestrebt werden muss.
Eine Möglichkeit stellt die noch an ethische und technische Grenzen stoßende Gentherapie dar, bei der Segmente genetischen Materials in die Zellen eingeschleust werden, so dass sie transgene Proteine exprimieren und Funktion und Verhalten der Zellen ändern können (STAECKER et al. 2004). Dabei kommen drei verschiedene Ansatzpunkte in Betracht:
erstens können Gene neurotropher Faktoren in die Zellen eingeschleust werden, um Spiralganglien- oder Haarzellen zu protektieren und zu regenerieren, wie es mit GDNF, BDNF und NT-3 allein oder in Kombination mit elektrischer Stimulation bereits geschehen ist (LALWANI et al. 1996; YAGI et al. 2000; REJALI et al. 2007). Als zweite Möglichkeit könnten funktionelle Haarzellen regeneriert werden, indem sie aus Unterstützungszellen
transdifferenziert werden, wie es für Math1 bzw. Atoh1 gezeigt werden konnte, einem Gen, das in der embryonalen Entwicklung des Corti-Organs eine wesentliche Rolle spielt (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005). In einer Meerschweinchenstudie konnte nachgewiesen werden, dass höhere Haarzellzahlen und niedrigere Hörschwellen im Vergleich zur ertaubten unbehandelten Kontrolle auf eine Umwandlung von Stützzellen in Haarzellen schließen lassen. Drittens könnten Gene, deren Dysfunktion oder Mutation mit Hörverlust assoziiert ist, als Ziel für die Gentherapie im Mittelpunkt stehen (LEFEBVRE u.
VAN DE WATER 2000; X. Z. LIU et al. 2009). Als Beispiel sei das GJB2-Gen genannt, welches das gap-junction Protein Connexin 26 codiert und dessen Mutation zum angeborenen sensorineuralen Hörverlust führt und damit auch einen Angriffspunkt für eine mögliche Gentherapie darstellt (KUDO et al. 2003; VAN EYKEN et al. 2007).
3.3.2 Vergleich verschiedener Drug-Delivery-Systeme im Innenohr
Die Blut-Cochlea-Barriere verhindert in vielen Fällen eine systemische Behandlung des Innenohres. Dies bedeutet, dass eine lokale Therapie mit Pharmaka oft die einzige Interventionsmöglichkeit darstellt. Dabei können die verschiedenen Methoden der Wirkstoffapplikation danach unterschieden werden, ob sie intratympanal, also in das Mittelohr, oder intracochleär erfolgen.
Bei der intratympanalen Verabreichung müssen die Wirkstoffe durch die Rundfenstermembran diffundieren, um sich danach in der Scala tympani ausbreiten zu können, was zu einem großen Konzentrationsgradienten zwischen Basis und Apex führen kann. Die Rundfenstermembran stellt auch eine physikalische Barriere dar, die in ihrer Dicke und Durchlässigkeit große individuelle Unterschiede aufweisen kann (BANERJEE u.
PARNES 2004), was eine kontrollierte Dosierung für den einzelnen Patienten deutlich erschwert. Außerdem können Wirkstoffe über die Eustachische Röhre verloren gehen.
Andererseits ist das Mittelohr leicht zugänglich und das chirurgische Trauma verhältnismäßig gering.
Die intracochleäre Applikation hat den Vorteil, dass man direkten Zugang zu den sensorischen und neuronalen Zellen hat und die Wirkstoffverteilung zu apikalen Regionen besser erfolgen kann. Die Auswahl der Moleküle ist nicht mehr von der Rundfenster- membranpassage abhängig und es kann wesentlich präziser dosiert werden. Andererseits ist
aber die Möglichkeit des chirurgischen Traumas größer und in das Innenohr verbrachte Langzeitkatheter bergen das Risiko von reaktiver Bindegewebsproliferation.
Technisch lässt sich eine intracochleäre Dauerapplikation über verschiedene Methoden lösen:
die einfachste Möglichkeit direkt eine Substanz in das Innenohr zu verbringen, ist eine Bolusapplikation unter Verwendung einer Mikroliterspritze. So kann beispielsweise mit der Cochlea-Implantation einmalig eine Glukokortikoidapplikation erfolgen, was nachweislich die reaktive Fibrosierung minimiert und damit zu geringeren Impedanzen führt (DE CEULAER et al. 2003; PAASCHE et al. 2006a). Wirkstoffe können auch über Mikrokatheter oder osmotische Pumpen verabreicht werden. Dieser Ansatz ist aber nur zeitlich befristet umsetzbar, da das Risiko der Fibrosierung der Hörschnecke besteht (BROWN et al. 1993;
CARVALHO u. LALWANI 1999). Die Kombination der Elektrode mit einem Injektionskatheter zur Medikamentenapplikation stellt dennoch einen interessanten Ansatz zur Lokaltherapie des Innenohres dar (PAASCHE et al. 2003; HOCHMAIR et al. 2006;
PAASCHE et al. 2006b).
Eine weitere innovative Möglichkeit, neurotrophe Faktoren über einen längeren Zeitraum im Innenohr freizusetzen, besteht in der zellbasierten Therapie (NAKAGAWA u. ITO 2004, 2005). So wurden transgene Fibroblasten, die BDNF produzieren, in eine Agarosematrix eingekapselt und über eine modifizierte Elektrode ins Innenohr verbracht, was zu einer verbesserten Spiralganglienzellprotektion führte, die allerdings nach apikal abnahm (REJALI et al. 2007). Es existieren auch noch keine verlässlichen Daten darüber, wie lange die BDNF- Produktion anhält und ob diese Bindegewebsvorläuferzellen nicht wandern, proliferieren und damit letztendlich zu einer Obliteration der Cochlea durch Fibrosierung führen bzw. eine immunologische Reaktionen hervorrufen. Eine für die Zukunft sehr vielversprechende zellbasierte Therapieoption stellen die mesenchymalen Stammzellen dar, die als pluripotente xenogene oder autologe Transplantate in die Cochlea verbracht werden können (LI et al.
2004; NAITO et al. 2004; MATSUOKA et al. 2007). Für die Regeneration der sensorischen Zellen ist es in diesem Fall nicht nur von Bedeutung, die Zellen gezielt an den gewünschten Wirkort zu bringen, sondern sie müssen auch zum korrekten Phänotyp ausdifferenzieren und die passende dreidimensionale Gewebestruktur annehmen, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Dieses Entwicklungsfeld ist noch sehr jung, so dass die für die richtige Differenzierung der Stammzellen benötigten Umweltbedingungen noch zu untersuchen sind.
Eine bereits eingehend untersuchte Möglichkeit des Gentransfers ins Innenohr besteht über virale Vektoren, wobei insbesondere Adeno- (RAPHAEL et al. 1996), Lenti- (HAN et al.
1999), Herpes- und Vacciniaviren (DERBY et al. 1999) auf ihre Transfektionsraten und Expressionseigenschaften hin studiert wurden. Auf diese Weise konnten protektive Wirkungen auf Innenohrzellen nachgewiesen werden (DUAN et al. 2004), wobei festzuhalten ist, dass eine Applikation der Viren über Cochleostomie zu einer besseren Verteilung im Innenohr und zu höheren Transfektionsraten führt, als die Rundfensterapplikation (STOVER et al. 1999). Als Nachteile der viralen Vektoren ist deren Unspezifität gegenüber verschiedenen Zelltypen zu nennen und die mögliche Migration und Transfektion der Gegenseite oder anderer Gewebe und Organe. Des Weiteren sind die Transfektionsraten meist sehr niedrig und die Genexpression zeitlich oft nur begrenzt. Hinzu kommt deren Potenzial entzündliche oder immunologische Reaktionen hervorzurufen (KHO et al. 2000; STOVER et al. 2000) und ihre mögliche Infektiosität, was den Hauptgrund für ethische Bedenken darstellt und damit den Einsatz viraler Vektoren am Menschen grundsätzlich in Frage stellt.
Aus diesem Grund ist es notwendig nonvirale Vektoren zu entwickeln, die möglichst spezifisch für bestimmte Zelltypen sind, einen Langzeiteffekt erzielen können und dabei biokompatibel sind, wie man es sich für Nanopartikel im Innenohr verspricht (PANYAM u.
LABHASETWAR 2003; PARKER et al. 2003).
Als erste nonvirale Vektoren wurden Liposomen untersucht, die sich durch einfache Produktion, geringe Toxizität und fehlende immunologische Effekte auszeichneten. Leider war der Wirkstofftransport nicht zielgerichtet und die Effizienz des Gentransfers nur sehr unzureichend (WAREING et al. 1999; STAECKER et al. 2001), so dass aktuelle Studien diese Eigenschaften in Nanopartikeln zu vereinen suchen.
3.3.3 Nanobiotechnologie
3.3.3.1 Allgemeines, Eigenschaften, Anwendungen in der Industrie
Als Nanopartikel bezeichnet man einen Verbund von wenigen bis einigen tausend Atomen oder Molekülen, die gemeinsam einen Durchmesser von 10 bis 500 nm besitzen. Diese winzigen Partikel werden gezielt nach gewünschten Eigenschaften und Anwendungsgebieten synthetisch hergestellt und können die unterschiedlichsten Grundgerüste aufweisen (Abb. 5).
Sie weisen sich durch einige Besonderheiten aus, die einen Übergang von atomaren zu
typischen Festkörpereigenschaften darstellen. Dies betrifft die Leitfähigkeit, optische Eigenschaften aber auch die chemische Reaktivität, die aufgrund der extrem großen Teilchenoberfläche in Relation zum kleinen Volumen zu beschleunigten chemischen Reaktionen und damit zum Einsatz als Katalysatoren führt. So können neue Materialeigenschaften durch die Nanopartikel allein oder in Kombination mit konventionellen Materialien entwickelt und verbessert werden, so dass Nanopartikel, nanostrukturierte Oberflächen oder molekulare Nanostrukturen interdisziplinär in Medizin, Elektronik (Leseköpfe für Festplatten, Mikrochips), Optik (optische Leuchtdioden) und Materialwissenschaften (Oberflächenbeschichtungen mit Lotus-Effekt, Titandioxid- Nanopartikel als UV-Filter) untersucht und genutzt werden.
Abb. 5: Diese Schemata demonstrieren Nanopartikel, denen unterschiedliche Gerüststrukturen zugrunde liegen, so dass sich verschiedene Eigenschaften und Anwendungsgebiete für die
synthetisch hergestellten Stoffe ergeben (Quelle: EU-Vertrag NMP4-CT-2006-026556).
3.3.3.2 Einsatz in der Biomedizintechnik
Nanotechnologie wird in der Medizin für Diagnose, Monitoring und Behandlung von Krankheiten eingesetzt (JAIN 2008) und ist dabei eng mit der Genomik und Proteomik verknüpft (WAGNER u. ZWECK 2006). Sie ermöglicht einen Einblick in die molekularen Ursachen von Krankheiten, die Funktionen von Genen und Proteinen und bildet damit neue Ansätze für die Diagnose und Therapie (Gen-, Proteintherapie, Antikörper). Zusätzlich können nanoskalige oder -strukturierte Biomaterialien die Eigenschaften von Implantaten verbessern.
Die Hauptanwendungsfelder der Nanotechnologie in der Medizin werden in Abbildung 6 zusammengefasst:
Abb. 6: Hauptanwendungsfelder der Nanotechnologie in der Medizin (WAGNER u. WECHSLER 2004)
Neuartige Wirkstoffe (3%)
Als neuartige nanoskalare Moleküle, die direkt zur Therapie von Krankheiten eingesetzt werden können, kommen Dendrimere in Betracht. Diese baumartig verzweigten Makromoleküle in Proteingröße sind mit funktionellen Gruppen an der Oberfläche ausgestattet, die eine direkte Wechselwirkung mit Zellen oder Viren ermöglichen. Auf diese Weise können sie beispielsweise die Oberflächenproteine des HI-Virus besetzen, die Zellaufnahme stören und damit die Infektionskette unterbrechen (RUPP et al. 2007).
In-vivo-Diagnostik (7%)
Bei der In-vivo-Diagnostik werden Nanopartikel vor allem für die molekulare Bildgebung genutzt. Resovist® der Firma Schering beispielsweise enthält Eisenoxid-Nanopartikel, die sich selektiv in der Leber anreichern und in der Magnetresonanztomographie einen starken Kontrast erzeugen (IGARTUA et al. 2002).
Implantate 19%
Wirkstoffe und Therapien
3%
Wirkstoff- transport
54%
In vivo Diagnostik In vitro 7%
Diagnostik 17%
Die Zukunft der molekularen Bildgebung liegt darin, Proteine oder Gene von Krankheiten (z. B. Tumoren) und deren Ausprägung bereits vor Krankheitsausbruch bzw. klinischer Symptomatik nachzuweisen und den Therapieerfolg zu überprüfen. Solch ein nanoskaliges Kontrastmittel sollte im Idealfall für eine gezielte Anreicherung ein spezifisches Zielfindungsmolekül in Form eines Antikörpers oder Peptids an der Oberfläche tragen und eine bildgebende Komponente wie Gadolinium besitzen (MULDOON et al. 2006; SUMER u.
GAO 2008).
In-vitro-Diagnostik (17%)
Der Fokus in der In-vitro-Diagnostik liegt ebenfalls in der Frühdiagnose von Krankheiten über die Detektion von spezifischen Genen, Proteinen oder Nukleinsäuren.
Auf der einen Seite werden Biochips mit nanostrukturierten Elektroden in diagnostischen Apparaten angewendet, mit deren Hilfe Biomoleküle elektrochemisch nachgewiesen werden können. Auf der anderen Seite werden Nanopartikel auch als Marker für Moleküle eingesetzt, wie beispielsweise Gold-Nanopartikel, die mit DNA konjugiert werden und damit als super- spezifisches Suchinstrument für Tumoren, Alzheimer oder Mukoviszidose eingesetzt werden sollen.
Implantate und Biomaterialien (19%)
Durch Nanostrukturierungen sollen Implantateigenschaften wie Gleiteigenschaften, Einwachsverhalten und Proteinanlagerung verbessert werden, die Lebensdauer verlängert und die Revisionsrate verringert werden (H. LIU u. WEBSTER 2006). Durch nanokristalline Diamantbeschichtungen soll beispielsweise bei Gelenkimplantaten Langzeitstabilität erreicht werden, wohingegen metallische Silbernanopartikel als entzündungs- und infektions- hemmende Agenzien für antimikrobielle Oberflächenbeschichtungen genutzt werden können (SCHIERHOLZ et al. 1998). Am Beispiel von Hüftendoprothesen konnte gezeigt werden, dass verringerte Infektionsraten, bessere Biokompatibilität und verbesserte osseointegrative Eigenschaften der Implantate zu Langzeitstabilität, erhöhter Lebensdauer und damit verringerten Revisionsraten führen (NAIR u. LAURENCIN 2008).
Als Biomaterialien kommen Nanopartikel beispielsweise in Knochenersatzmaterialien zur Implantatverankerung und zum Auffüllen von Zysten vor. Diese enthalten nanokristallines
