Die konfokale Laserrastermikroskopie (confocal laser scanning microscope = CLSM) hat sich in den vergangenen zehn Jahren zu einer in der Praxis häufig eingesetzten Technik entwickelt.
Heute kommt sie in der biologischen Forschung, chemischen Analyse und Materialprüfung bevorzugt zum Einsatz.
In der konfokalen Mikroskopie (Abb. 8) werden Strukturen erkannt, indem das von einer speziell markierten Probe emittierte oder reflektierte Licht aus einer einzigen Fokalebene gebündelt und sämtliches Licht, das nicht aus dieser Ebene stammt, unterdrückt wird (FLOCK et al. 1998).
Abb. 8: Die Abbildung (Quelle: Benutzerhandbuch Leica TCS SP2) zeigt eine schematische Übersicht der Funktionsweise eines konfokalen Laserrastermikroskops.
Bei einem konfokalen Punktscanner fokussieren die Linsen des Mikroskops das Laserlicht auf einen einzelnen Punkt der Probe (der Fokalpunkt). Laser eignen sich in der konfokalen Mikroskopie hervorragend als Lichtquellen, da sie sehr helles Licht abgeben und der Strahl nur eine geringe Abweichung aufweist. Darüber hinaus sind sie sehr einfach zu fokussieren
und stabil in der Intensität. Gerade diese Stabilität ist bei quantitativen Messungen von Bedeutung. Der Laser tastet die Probe nun Punkt für Punkt ab und erzeugt so das gescannte Bild. Fluoreszenzlicht und Reflexionslicht der Probe werden durch das Objektiv zurückgeleitet. Das Mikroskop und das optische System des Scan-Moduls fokussieren das vom Fokalpunkt emittierte Licht auf einen zweiten Punkt, den Konfokalpunkt. Durch die am Konfokalpunkt befindliche winzige Öffnung (sog. Pinhole), kann das Licht vom Fokalpunkt in den Detektor gelangen. Außerfokales Licht gelangt nicht durch die Öffnung (LEICA-MICROSYSTEMS 2002).
Wie bei konventionellen Epifluoreszenzmikroskopen wird eine Linse ebenso als Kondensor wie auch als Objektiv verwendet. Der große Vorteil ist, dass die Notwendigkeit, zwei Linsen exakt miteinander abzugleichen und gemeinsam auszurichten, entfällt. Ein kollimierter und polarisierter, durch eine Apertur geleiteter Laserstrahl wird von einem Strahlenteiler (einem dichroitischen Spiegel) in den hinteren Teil der Objektivlinse reflektiert und auf die Probe fokussiert. Das von der Probe reflektierte Licht wird durch dieselbe Linse zurückgeleitet. Der Lichtstrahl wird durch das Pinhole (d.h. die Konfokalöffnung) fokussiert, um auf diese Weise alles außerfokale Licht, das heißt Licht, das von anderen Bereichen der Probe unterhalb oder oberhalb der Fokalebene abgegeben wird, zu unterdrücken. Das Volumen der optischen Schnitte hängt von verschiedenen Parametern wie dem (variablen) Durchmesser der Öffnung und der Wellenlänge ab. Die innerfokalen Daten jedes Punktes auf der Probe werden von einem lichtempfindlichen Detektor (z. B. einer Photodiode), der hinter der Konfokalöffnung angeordnet ist, aufgezeichnet. Aufgrund ihres sehr hohen Signal-zu-Rauschverhältnisses werden heute Photomultiplier als Detektoren eingesetzt. Das analoge Ausgangssignal wird digitalisiert und an einen Computer weitergeleitet.
Bei dem Detektor handelt es sich um einen Punktdetektor, der nur das Licht von einem Punkt der Probe empfängt. Daher kann mit dem konfokalen Mikroskop - im Gegensatz zum konventionellen Mikroskop, bei dem ein größerer Bereich der Probe zu sehen ist - zu einem Zeitpunkt immer nur ein Punkt der Probe beobachtet werden. Ein Gesamtbild der Probe ergibt sich daher erst durch das punktweise Abtasten der Probe, wobei entweder der Lichtpunkt oder die Probe verschoben wird. Diese beiden Möglichkeiten haben zu der Entwicklung von zwei unterschiedlichen Typen von konfokalen Mikroskopen geführt: Mikroskope mit beweglichem Objekttisch (Stage-scanning) und Mikroskope mit Strahlen- oder Spiegeltechnik, bei der der
Lichtpunkt über die feststehende Probe wandert und sie mit Hilfe von kleinen, schnellen, mit Galvanometern betriebenen Spiegeln Punkt für Punkt abtastet.
Wird eine Abfolge von optischen Schnitten durch die Probe zu einem Bildstapel zusammengesetzt und anschließend digital verarbeitet, hat das den Vorteil, dass aus diesem mehrdimensionalen Datensatz entweder ein berechnetes zweidimensionales Bild (Projektion) erstellt oder eine verkleinerte 3D-Darstellung der Probe auf einem geeigneten Computer erzeugt werden kann (MACDONALD u. RUBEL 2008).
Dadurch besteht nun die Möglichkeit, das angezeigte Bild auf vielfache Weise zu verändern:
Verstärken der Kontraste durch Schwellwerte, lineare Kontraststreckung und Gammakorrektur
Doppelbelichtung von Bildern in Experimenten.
Digitales Filtern zum Vergrößern von Kanten, zum Glätten, Entstören etc.
Rekonstruktion von 3D-Ansichten mit Hilfe von zu Bildstapeln zusammengesetzten optischen Schnitten.
Zusammenstellung von digitalen Filmen anhand von mit dem Mikroskop aufgenommenen Zeitserien.
Quantisierung und Messungen
Diese Art der Bildbearbeitung erhöht nicht die Qualität der gesammelten Daten; sie dient jedoch dazu, die Sicht zu verbessern und die qualitative Interpretation der Daten zu erleichtern.
4 Material und Methoden
4.1 Material
Ein Verzeichnis der verwendeten Lösungen, Reagenzien und Chemikalien (10.2), der Pharmaka (10.3), Geräte (10.5) sowie des verwendeten Laborbedarfs inklusive Verbrauchs-materialien (10.4) findet sich in Tabellenform im Anhang. Auch die Herstellung einzelner Lösungen und Medien (10.1) ist in Abschnitt 10 (Anhang) genauer erläutert.
4.1.1 Hyperverzweigte Polylysine
Die Herstellung der Hyperverzweigten Polylysine (Abb. 9) erfolgte im Laboratoire des Polymères an der Schweizer Partneruniversität École Polytechnique Fédérale in Lausanne nach dem Prinzip der thermischen Polymerisation von L-Lysinhydrochlorid (SCHOLL et al.
2007a).
Abb. 9: Diese Abbildung illustriert die katalysierte thermische Polymerisation von L-Lysinhydrochlorid (links) bei 150 °C mit Hilfe einer metallischen Base MOH zu Hyperverzweigtem Polylysin (rechts)
(Quelle: bereitgestellt durch die „École Polytechnique Fédérale in Lausanne).
Zu Beginn wurde L-Lysinhydrochlorid zur Neutralisation mit einer metallischen Base auf 150 °C erhitzt, bis es vollständig geschmolzen war und die entsprechende Aminosäure L-Lysin frei vorlag. In vorangegangenen Experimenten wurden die Hydroxide von Na, Li, K und Cs für die Herstellung untersucht und verglichen, wobei die Verwendung von Kaliumhydroxid zu einem Produkt mit dem höchsten Molekulargewicht führte.
M = Li, Na, K, Cs
Catalyst = Zr(OnBu)4, Ti(OnBu)4, Sb(OEt)3 or PyBoA in 3 mol%
In Relation zum L-Lysin-Monomer wurden nun 3 mol% eines Katalysators addiert, während das bei der Polymerisation entstandene Wasser permanent aus dem offenen Reaktor entweichen konnte.
Um die Biokompatibilität der Hyperverzweigten Polylysine weiter zu steigern und die Oberflächenladung besser kontrollieren zu können, wurde eine Insertion von Polyethylenglykol (PEG) an der Moleküloberfläche nötig.
Zusätzlich zur PEGierung wurden die von uns genutzten Hyperverzweigten Polylysine an der Oberfläche mit einem Fluorophor gekoppelt, um sie bei der Internalisierung in den verschiedensten Kompartimenten sichtbar machen zu können. Die Modifizierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-5-Isothiocyanat (FITC, Firma Pierce) geschah nach Empfehlung der Hersteller. Da für die Durchführung der Experimente Lösungen bevorzugt wurden, wurde jeweils 1 mg Pulver frisch vor dem Einsatz in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst, was bei einem Molekulargewicht von 24.600 g/mol zu einer molekularen Konzentration von 4,1 x 10-5 mol/l führte. Aufgrund der Polydispersität von 11,8 bei einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 nm und einem Polymerisationsgrad von 185 kann hier die Nanopartikelmenge nicht in absoluten Werten angegeben werden, sondern lediglich als mol-Fraktion, was bei allen Mengenangaben in dieser Studie berücksichtigt wurde.
4.1.2 Lipidnanokapseln
Die in dieser Studie verwendeten Lipidnanokapseln wurden in den „Laboratoires Annuaires Ingénierie de la Vectorisation Particulaire“ an der Universität von Angers in Frankreich als einer der Partner des EU-Konsortiums hergestellt.
Für die Herstellung der Partikel, die sich aus einem flüssigen Kern umgeben von einer zusammenhängenden Phasengrenzschicht zusammensetzten und feinst verteilt in wässrigem Medium vorlagen (Abb. 10), kam eine neuartige phaseninversionsbasierte Methode zum Einsatz (HEURTAULT et al. 2002; BEDUNEAU et al. 2006). Dabei setzte sich die ölige Phase aus der lipophilen Einheit zusammen, während die wässrige Phase lediglich Natriumchlorid und Wasser beinhaltete. Zusätzlich wurden Moleküle benötigt, die Einfluss auf die Oberflächenspannung der Grenzschicht nehmen können. Um zunächst eine Öl-in-Wasser Emulsion zu erhalten wurden alle Komponenten im Magnetrührer vermengt und
progressiv erhitzt. Nach einem kurzen Intervall der Transparenz konnte bei etwa 85 °C eine Phasenumkehr beobachtet werden, so dass nun Wassertropfen in öliger Phase vorlagen. Der Temperaturzyklus zwischen 60 und 85 °C um die Zone der Phaseninversion wurde mindestens drei Mal durchlaufen, um eine möglichst stabile Wasser-in-Öl Emulsion zu erhalten und Lipidnanokapseln in der gewünschten Größe zu formieren.
Um die produzierten Nanopartikel gegen den Körpermetabolismus abzuschirmen, war eine hohe Dichte von PEG an deren Oberfläche nötig. Im Anschluss an diesen PEG-Insertionsprozess mussten die Nanopartikel noch zusätzlich mit dem Fluorophor Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) markiert werden, um sie anschließend in Zellen und Geweben lokalisieren zu können (HEURTAULT et al. 2003). Auf diese Weise ist es im Gegensatz zu den Hyperverzweigten Polylysinen möglich, die Anzahl der Lipidnanokapseln in absoluten Werten anzugeben. Für die in dieser Studie durchgeführten Untersuchungen betrug die Konzentration der verwendeten Lösung 9,5 x 1014 Lipidnanokapseln pro ml bzw. 11 mg/ml bei einem Durchmesser der Lipidnanokapseln von 56,2 nm und einer Oberfläche von 9923 nm2.
Abb. 10: Diese schematische Zeichnung zeigt die Zusammensetzung von Lipidnanokapseln.
(Quelle: bereitgestellt durch die Universität von Angers)
4.1.3
ZelllinienDie Zytokompatibilitätsprüfung wird immer notwendiger für die Qualitätssicherung von Herstellungschargen und Neuprodukten, in diesem Fall multifunktionalen Nanopartikeln zum Wirkstofftransport (DIN EN ISO 10993). Dabei kann die In-vitro-Testung mittels
Zellkulturen Tierversuche zwar nicht ersetzen, jedoch toxische Materialien selektieren und somit die Zahl der Tierversuche auf ein unumgängliches Maß reduzieren.
Für routinemäßige Toxizitätstests wurde die permanente Zelllinie L929 (Mausfibroblasten, CCL-1TM, ATCC, Manassas, VA, USA) eingesetzt. Dabei handelt es sich um adhärent wachsende Fibroblasten, die aus subkutanem areolarem und adipotischem Gewebe einer männlichen C3H/An Maus stammen.
4.1.4 Versuchstiere
Für die vorliegende Arbeit wurden 36 pigmentierte Meerschweinchen des BFA-Stammes beiderlei Geschlechts mit einem Ausgangsgewicht von 250 bis 450 g verwendet. Die Tiere stammen aus der Zucht der Firma Charles River WIGA GmbH, Sulzfeld. Das Tierversuchs-vorhaben wurde gemäß § 8 des Deutschen Tierschutzgesetzes durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES, Oldenburg) unter der Antragsnummer 33.9-42502-04-07/1266 genehmigt. Somit erfolgte die Durchführung der Studie in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz und mit der EU-Richtlinie 86/609/EWG zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere.
Vor Versuchsbeginn wurde durch Ableitung akustisch-evozierter auditorischer Hirnstammpotenziale der Hörstatus der Tiere überprüft. Nur normal hörende Meerschweinchen wurden in das Projekt integriert. Alle Versuche wurden in den Operationsräumen des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt.
4.1.5 Tierhaltung
Die Haltung der Meerschweinchen entsprach der EU-Richtlinie 86/609/EWG und erfolgte in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der Medizinischen Hochschule Hannover unter identischen Bedingungen für alle Tiere. Die Unterbringung erfolgte in Gruppen von drei Tieren in Typ 4 Makrolon-Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Niederlande) bei 20 °C bis 24 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 bis 60%. Der Tagesrhythmus der Tiere wurde über einen elektronisch gesteuerten Hell-Dunkel-Zyklus im 12-stündigen Wechsel beginnend mit einer Hellphase um 7:00 Uhr sichergestellt. Als Einstreu wurde
entkeimte Weichholzfaser verwendet, während sich das Futterangebot aus Trockenpelletfutter (Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest) und Heu zusammensetzte und Trinkwasser den Meerschweinchen ad libitum zur Verfügung stand.
4.1.6 Versuchsgruppen
Die insgesamt 36 Meerschweinchen umfassende Tiergruppe wurde geteilt, so dass 18 Tiere für die Untersuchung der Lipidnanokapseln (LNK) und 18 Tiere für die Hyperverzweigten Polylysine (HP) eingesetzt wurden.
In den Gruppen HP-2, HP-14 und HP-28, sowie LNK-2, LNK-14 und LNK-28 wurden die entsprechenden Nanopartikel via Cochleostomie in die Scala tympani injiziert, wobei jeweils 6 Tiere nach 2 Tagen, 14 Tagen und 28 Tagen getötet wurden (Tabelle 1).
Tab. 1: Übersicht über die Versuchsgruppen und ihre Benennung in dieser Dissertation, die Tierzahlen, die injizierten Nanopartikel und den zeitlichen Verlauf der Untersuchungen bis zur Tötung
Tiergruppe/ Nano- Zeitlicher Verlauf
Tierzahl partikel Tag 0 Tag 2 Tag 14 Tag 28
HP-2, n=6 HP AABR AABR
Cochleostomie Tötung
HP-14, n=6 HP AABR AABR AABR
Cochleostomie Tötung
HP-28, n=6 HP AABR AABR AABR
Cochleostomie Tötung
LNK-2, n=6 LNK AABR AABR
Cochleostomie Tötung
LNK-14, n=6 LNK AABR AABR AABR
Cochleostomie Tötung
LNK-28, n=6 LNK AABR AABR AABR
Cochleostomie Tötung