Einfluß der Proteinkinase G-Typ I auf
die muscarinerg- und Stickstoffmonoxid-vermittelte Hemmung des L-Typ-Calciumkanals in Kardiomyozyten
transgener, Proteinkinase G-Typ I-überexprimierender Mäuse
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von MICHAELA BASTEIN
aus Buchholz i. d. N.
Hannover 2004
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H.-J. Hedrich 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. rer. nat. U. Ebert
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2004
Die vorliegende Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.
1 Einleitung... 9
2 Literaturübersicht ... 10
2.1 Historische Betrachtung der Patch-Clamp-Technik... 10
2.2 Struktur und Funktion des kardialen L-Typ-Calciumkanals ... 12
2.3 Regulation des kardialen L-Typ-Calciumkanals durch extrinsische und intrinsische Mediatoren... 14
2.3.1 Ca2+-abhängige Inaktivierung... 14
2.3.2 Regulation durch Proteinkinasen ... 15
2.3.3 Regulation durch Phosphatasen ... 18
2.3.4 Regulation durch β-Adrenoceptoren ... 19
2.3.5 Regulation durch m2-Acetylcholinrezeptoren ... 21
2.3.6 Regulation durch Stickstoffmonoxid und Stickstoffmonoxid-Synthasen ... 22
3 Material und Methoden... 24
3.1 Tiere und Tierhaltung ... 24
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 27
3.3 Eingesetzte Substanzen und Lösungen ... 28
3.3.1 Substanzen ... 28
3.3.2 Lösungen... 30
3.4 Versuchsdurchführung ... 32
3.4.1 Präparation und enzymatische Isolation der Mäuse-Kardiomyozyten ... 32
3.4.2 Herstellung der Pipetten... 33
3.4.3 Apparativer Aufbau der Patch-Clamp-Anlage ... 33
3.4.4 Messung von Membranströmen... 34
3.5 Auswertung... 36
3.5.1 Erstellen der Ereignislisten ... 36
3.5.2 Auswertung der Ereignislisten... 36
3.6 Mathematische Auswertung und statistische Verfahren ... 38
4 Ergebnisse... 39
4.1 Nachweis der Proteinkinase G-Typ I auf Proteinebene ... 40
4.2 Charakterisierung der gemessenen Ionenkanäle als L-Typ-Calcium-Kanal anhand der Leitfähigkeitsberechnung ... 40
4.5 Versuche mit dem Parasympathomimetikum Carbachol... 52
4.6 Versuche mit Isoproterenol und Carbachol... 57
4.7 Versuche mit Isoproterenol, Carbachol und dem zyklischen Guanosin- monophosphat-Analogon 8-Bromoguanosine 3‘: 5‘ Cyclic-Monophosphat (8- Br-cGMP) ... 62
4.8 Versuche mit Pertussistoxin-präinkubierten Kardiomyozyten bei Gabe von Isoproterenol und Carbachol... 67
5 Diskussion ... 72
6 Zusammenfassung ... 81
7 Summary... 83
8 Literaturverzeichnis ... 85
9 Anhang ... 103
AC Adenylatcyclase
AK Antikörper
αMHC alpha Myosin-Heavy-Chain ( alpha Myosin Schwerkette)
ATG Adenin-Thymin-Guanin
ATP Adenosin-Tri-Phosphat
BamH Restriktionsendonuklease von Bacillus amyloliquefaciens
BAPTA-AM 1,2-bis (o-Aminophenoxy) ethane-N, N, N’, N’-tetraacetic Acid Tetra (acetoxymethyl) Ester
β1-AR beta1-Adrenoceptor
bp Basenpaare
8-Br-cGMP 8-Bromoguanosine 3‘: 5‘ Cyclic Monophosphat
°C Grad Celsius
CaCl2 Calciumchlorid
CaMK Calmodulin-abhängige Kinase cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
cDNA komplementäre DNA
cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
ClaI Restriktionsendonuklease von Caryophanon latum
DAG Diacylglycerol
DEA/NO 2- (N, N- Diethylamino)- diazenolate- 2- oxide. Na DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxnucleotidtriphosphat
ECL Enhanced chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA Ethylenglykol bis (β-Aminoethyl Ether)- N, N, N’,N’- Tetraacetic Acid eNOS endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase
ET-1 Endothelin 1
et al. et alii
fA Femtoampere
g Gramm
Gα alpha-Untereinheit des G-Proteins Gβγ beta/gamma-Untereinheit des G-Proteins
GC Guanylatcyclase
GDP Guanosin-Di-Phosphat Gi inhibierendes G-Protein
GΩ Gigaohm
Gs stimulierendes G-Protein GTP Guanosin-Tri-Phosphat HCl Chlorwasserstoffsäure
HEPES N-[2-Hydroxyethyl] piperazine- N‘-[2-ethanesulfonic acid]
HRP Horse-Radish-Peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)
Hz Hertz
IE Internationale Einheiten
iNOS induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
KOH Kaliumhydroxid
M Molar
MaeIII Restriktionsendonuklease von Methanococcus aeolicus m2-AChR muscarinerger Acetylcholinrezeptor Typ 2
MgCl2 Magnesiumchlorid MgSO2 Magnesiumsulfat
mg Milligramm
ml Milliliter
mmol Millimolar
ms Millisekunden
mV Millivolt
MΩ Megaohm
µl Mikroliter
µmol Mikromolar
NaCl Natriumchlorid
NADPH Nicotinamidadenindinucleotidphosphat
NaF Natriumfluorid
NaOH Natriumhydroxid
NMRI Maus Auszucht Mäusestamm des Naval Medical Research Institute nNOS neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase
NO Stickstoffmonoxid
Nonidet P 40 (Octylphenoxy)polyethoxyethanol
O2 Sauerstoff
pA Picoampere
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) PDE-2 Phosphodiesterase -2
pH potenium hydrogenii
PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PKG-I Proteinkinase G-Typ I (cGMP-abhängige Proteinkinase G-Typ I) PP1 Proteinphosphatase 1
PP2A Proteinphosphatase 2A
pS Picosiemens
PTX Pertussistoxin
p-Wert probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit, Signifikanzniveau)
RP Rückwärts-Primer
SDS Natriumdodecylsulfat
SV40 T-Antigen Tumor-Antigen des Simian Virus 40
Tab. Tabelle
Taq Polymerase von Thermophilus aquaticus TEA-OH Tetraethyl-ammonium
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylenediamine
TE-Puffer Pufferlösung bestehend aus 10mmol/l Tris und 1mmol/l EDTA TRITON x-100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Tween 20 Polyoxyethylene-Sorbitan Monolaurate
U Unit
VP Vorwärts-Primer
cell, c) Inside-out, d) Outside-out. ... 11
Abb. 2: Schematische Darstellung des kardialen L-Typ-Calciumkanals ... 12
Abb. 3: Membranproteine an den Triaden einer Skelettmuskelfaser, die an der Regulation von intrazellulären Ca2+-Ionen-Signalen beteiligt sind ... 13
Abb. 4: Das αMHC-PKG-I-Transgen. ... 24
Abb. 5: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. ... 34
Abb. 6: Cell-attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. ... 35
Abb. 7: PKG-I-Protein-Expression im ventrikulären Myokard von nicht-transgenen (Wildtyp) Tieren und transgenen Tieren der Linie 1, 2 und 3. ... 40
Abb. 8: Exemplarische Darstellung von Einzelkanalregistrierungen aus der nicht-transgenen und der transgenen Gruppe bei fünf unterschiedlichen Testpotentialen. ... 41
Abb. 9: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion von Stickstoff- monoxid im Kardiomyozyten. ... 42
Abb. 10: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht- transgenen Versuchsgruppe. DEA/NO-Versuchsreihe ... 45
Abb. 11: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. DEA/NO-Versuchsreihe ... 46
Abb. 12: Schematisches Modell der β1-adrenergen Signaltransduktion im Kardiomyozyten. ... 47
Abb. 13: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion von Stickstoffmonoxid und Isoproterenol im Kardiomyozyten... 47
Abb. 14: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht- transgenen Versuchsgruppe. Isoproterenol-DEA/NO-Versuchsreihe ... 50
Abb. 15: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. Isoproterenol-DEA/NO-Versuchsreihe... 51
Abb. 16: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion durch den m2-Acetylcholinrezeptor. ... 52
Abb. 17: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht- transgenen Versuchsgruppe. Carbachol-Versuchsreihe... 55
Abb. 18: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. Carbachol-Versuchsreihe ... 56
Abb. 19: Schematisches Modell der β1-adrenergen und m2-muscarinergen Signaltransduktion im Kardiomyozyten. ... 57
Abb. 20: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht- transgenen Versuchsgruppe. Isoproterenol-Carbachol-Versuchsreihe ... 60
Abb. 21: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. Isoproterenol-Carbachol-Versuchsreihe ... 61
Abb. 22: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion über den β1- Adrenoceptor, den m2-Acetylcholinrezeptor und über 8-Br-cGMP im Kardiomyozyten... 62
Abb. 23: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht- transgenen Versuchsgruppe. Isoproterenol-Carbachol- 8-Br-cGMP-Versuchsreihe ... 65
Abb. 24: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. Isoproterenol-Carbachol-8-Br-cGMP-Versuchsreihe ... 66
Abb. 25: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion über den m2-Acetylcholinorezeptor, nachdem der Weg über das Gi-Protein durch das Pertussistoxin gehemmt wird... 67
Abb. 27: Pertussistoxin-präinkubierte Kardiomyozyten: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. ... 71
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Eingesetzte Substanzen ... 28 Tab. 2: Übersichtstabelle der durchgeführten Versuchsreihen; mit dem Zellisolat
eines Tieres konnte z.T. mehr als ein Versuch durchgeführt werden ... 39 Tab. 3: Einzelkanalparameter des Calciumkanals aus Versuchen mit Kardio-
myozyten nicht-transgener und transgener Tiere nach Gabe DEA/NO... 44 Tab. 4: Einzelkanalparameter des Calciumkanals aus Versuchen mit Kardio-
myozyten nicht-transgener und transgener Tiere nach Gabe von
Isoproterenol und DEA/NO. ... 49 Tab. 5: Einzelkanalparameter des Calciumkanals aus Versuchen mit Kardio-
myozyten nicht-transgener und transgener Tiere nach Gabe von Carbachol. .... 54 Tab. 6: Einzelkanalparameter des Calciumkanals aus Versuchen mit Kardio-
myozyten nicht-transgener und transgener Tiere nach Gabe von
Isoproterenol und Carbachol. ... 59 Tab. 7: Einzelkanalparameter des Calciumkanals aus Versuchen mit Kardio-
myozyten nicht-transgener und transgener Tiere nach Gabe von
Isoproterenol, Carbachol/8-Br-cGMP... 64 Tab. 8: Einzelkanalparameter des Calciumkanals aus Versuchen mit
Pertussistoxin-präinkubierten Kardiomyozyten nicht-transgener und
transgener Tiere nach Gabe von Isoproterenol und Carbachol. ... 69
1 Einleitung
Die Kontraktionsleistung der Herzmuskulatur wird im wesentlichen durch die Konzentration an freien Calciumionen in der Herzmuskelzelle bestimmt. Die Aufrechterhaltung der fein abgestimmten Calciumhomöostase im menschlichen und tierischen Myokard ist essentiell für die geregelte Kopplung von Exzitation und Kontraktion der Myofilamente. Der kardiale L- Typ-Calciumkanal hat einen entscheidenden Einfluß auf die Erhaltung der intrazellulären Calciumkonzentration und eine damit verbundene Triggerfunktion für die sarkoplasmatische Retikulum-Ca2+-ATPase. Die Regulation des L-Typ-Calciumkanals verläuft über eine Beteiligung unterschiedlicher Botenstoffe und Signalkaskaden. MERY et al. (1991), JIANG et al. (2000) und KLEIN et al. (2000) konnten die Proteinkinase G-Typ I (PKG-I) als einen wesentlichen Faktor für die Steuerung der Einzelkanalaktivität charakterisieren. Im Stadium der chronischen Herzinsuffizienz ist die Einzelkanalaktivität deutlich erhöht (SCHRÖDER et al., 1998). In einer Arbeit an Kardiomyozten herzinsuffizienter Patienten wiesen DREXLER et al. (1998) nach, dass die Aktivität der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (NO- Synthase) gesteigert war und der positiv-inotrope Effekt β-adrenerger Stimulierung durch produziertes Stickstoffmonoxid (NO) vermindert wurde. Zahlreiche Studien befassten sich mit der Auswirkung von Stickstoffmonoxid auf das kardiovaskuläre System. Der Mechanismus der Signaltransduktion konnte dennoch bisher nicht zweifelsfrei aufgeklärt werden. So wird einerseits von ABI-GERGES et al. (2001) ein NO/Guanylat- cyclase (GC)/cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP)/PKG-I-Signalweg angenommen, während DITTRICH et al. (2001) einen NO-vermittelten Effekt durch Aktivierung der Phosphodiesterase-2 beschrieben. Die durch den m2-Acetylcholinrezeptor induzierte negativ- inotrope Wirkung auf die Aktivität des L-Typ-Calciumkanals wird neben einer Hemmung der Adenylatcyclase auf die Aktivierung eines NO-Synthase/NO/GC/cGMP-Signalweges zurückgeführt (HAN et al., 1996; HARE et al., 1998).
Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Proteinkinase G-Typ I und dem NO- und muscarinerg-vermittelten Signalweg im Kardiomyozyten aufzeigen zu können, wurde ein transgenes, Proteinkinase G-Typ I-überexprimierendes Mausmodell generiert. An isolierten Kardiomyozyten adulter nicht-transgener und transgener Tiere sollten vergleichend Einzelkanalmessungen mittels der Patch-Clamp-Technik durchgeführt werden.
Dementsprechend wurde in einzelnen Versuchsreihen der Effekt stimulierender und inhibitorischer Substanzen auf die L-Typ-Calciumkanalaktivität untersucht. Die Ergebnisse sollen Aufschluß geben über die Rolle der PKG-I in der muscarinergen und Stickstoffmonoxid-mediierten Regulation des kardialen L-Typ-Calciumkanals.
2 Literaturübersicht
2.1 Historische Betrachtung der Patch-Clamp-Technik
Die Ursprünge zur Untersuchung von Zellmembranen reichen in das achtzehnte Jahrhundert zurück. Der Arzt und Naturforscher Luigi Galvani (1727-1798) veröffentlichte eine Arbeit, die das Vorhandensein einer „tierischen Elektrizität“ postulierte. Der Wissenschaftler Carlo Matteucci (1811-1868) konnte Mitte des neunzehnten Jahrhunderts erstmals direkt den elektrischen Strom eines Muskels messen. Auf der Basis zahlreicher Untersuchungen über die
„tierische Elektrizität“ durch Emil du Bois-Reymonds (1818-1896) wurde im gleichen Jahrhundert die wissenschaftliche Elektrophysiologie begründet. Der Naturwissenschaftler Julius Bernstein entwickelte Anfang des zwanzigsten Jahrhunderts die „Membrantheorie der bioelektrischen Ströme“ und erklärte, dass eine ungleiche Ionenverteilung an der selektiv permeablen Zellmembran für das Ruhepotential verantwortlich sei. In den dreißiger Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts wurde von Kenneth S. Cole und H. J. Cutis die Technik der sogenannten Spannungsklemme entwickelt und es konnte damit die Erhöhung der Membranleitfähigkeit einer Nervenzelle nach Erregung gezeigt werden. Den Wissenschaftlern Alan Hodgkin und Andrew Huxley gelang es Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts, die Höhe und den zeitlichen Verlauf eines Aktionpotentials nachzuweisen, wofür sie 1963 den Nobel- Preis für Medizin und Physiologie bekamen. Die ersten Einzelkanaluntersuchungen mit der Patch-Clamp-Technik konnten Mitte der siebziger Jahre des vorigen Jahrhunderts von den Wissenschaftlern Bert Sakmann und Erwin Neher an Froschmuskelzellen durchgeführt werden. Sie arbeiteten fortwährend an einer Verbesserung der Methode, denn die Aufzeichnungen waren anfangs durch ein starkes Hintergrundrauschen gekennzeichnet, welches durch die unzähligen Kanäle und Ionentransporter auf der Gesamtoberfläche der Zelle verursacht wurde. Erst durch die Entwicklung des Gigaseals, bei dem der Abdichtwiderstand zwischen Pipette und Zellmembran einen Wert von bis zu 100 Gigaohm erreichte, konnte das Hintergrundrauschen minimiert werden. Damit konnten Manipulationen an der Zelle vorgenommen werden, ohne dass die Verbindung zwischen Pipette und Zellmembran abriß. Neher und Sakmann gelang es erstmalig, einzelne Kanäle direkt zu beobachten und sie wurden dafür 1991 mit dem Nobel-Preis für Medizin und Physiologie ausgezeichnet.
Heutzutage ist die Patch-Clamp-Technik eine etablierte und weltweit angewandte Methode zur Untersuchnug von Membranströmen. Abhängig von der Fragestellung wird die geeignete Patchkonfiguration (Cell-attached; Whole-cell; Inside-out; Outside-out) ausgewählt.
Abb. 1: Die wichtigsten Patch-Clamp-Konfigurationen: a) Cell-attached, b) Whole-cell, c) Inside-out, d) Outside-out (aus NUMBERGER und DRAGUHN, 1996).
2.2 Struktur und Funktion des kardialen L-Typ-Calciumkanals
Calciumkanäle kommen in vielen unterschiedlichen Zellen vor und vermitteln über ihren Calciumeinstrom verschiedene Effekte. Neben dem in dieser Arbeit betrachteten kardialen L- Typ-Calciumkanal existieren im menschlichen und tierischen Organismus noch weitere Calciumkanaltypen. Dabei unterscheiden sich die Kanäle vom L-, N-, P-, Q-, R- und T-Typ unter anderem in ihrer Lokalisation im Gewebe, ihrer Funktion, ihrer Regulation, der Zusammensetzung ihrer Untereinheiten, ihrer Öffnungsdauer und ihrem Schwellenwert zur Aktivierung. Die verschiedenen Calciumkanaltypen werden in Abhängigkeit ihrer α1- Untereinheit in drei Familien unterteilt: CaV1, CaV2, CaV3. Im Herzen sind Calciumkanäle vom L (long lasting)-Typ und vom T (transient)-Typ ausgebildet. Der kardiale L-Typ ist spannungsabhängig, gehört zur Familie CaV1 und setzt sich aus der α1-, α2-, β- und δ- Untereinheit zusammen (CATTERALL, 2000). Die α1-Untereinheit besteht aus vier Domänen, welche jeweils sechs transmembranäre Segmente beinhalten, und bildet die transmembranäre Pore, ähnlich wie sie bereits beim Natriumkanal beschrieben wurde (TANABE et al., 1987). Die β-Untereinheit liegt intrazellulär und hat keine transmembranären Segmente (RUTH et al., 1989). Die α2-Untereinheit stellt ein extrazelluläres, glykosyliertes Membranprotein dar, welches über eine Disulfidbrücke mit dem transmembranären Segment der δ-Untereinheit verbunden ist (GURNETT et al., 1996).
Abb. 2: Schematische Darstellung des kardialen L-Typ-Calciumkanals (modifiziert nach CATTERALL, 2000).
Die L-Typ-Calciumkanäle sind überwiegend im Sarcolemm des transversalen Tubulus Systems angeordnet. Eine Reihe von Calciumkanal-Blockern, zu denen Derivate des 1,4- Dihydropyridins, des Phenylalkylamins und des Benzothiazepins gehören, binden an die α1- Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals und vermindern die Calcium-Leitfähigkeit (SPEDDING u. PAOLETTI, 1992). Die Bindungsstellen werden als Dihydropyridin- Rezeptoren bezeichnet. Die Dihydropyridin-Rezeptoren sind in enger räumlicher Nähe zu den Ryanodinrezeptoren, den Calciumkanälen des sarcoplasmatischen Retikulums.
Abb. 3: Membranproteine an den Triaden einer Skelettmuskelfaser, die an der Regulation von intrazellulären Ca2+-Ionen-Signalen beteiligt sind (nach MICKELSON und LOUIS aus v. ENGELHARDT und BREVES, 2000).
Die Hauptfunktion des L-Typ-Calciumkanals ist die Regelung des Calciumstromes und damit die intrazelluläre Konzentration von Calciumionen, damit eine geregelte Transduktion des Ca2+-Signals in die mechanische Kopplung der Myofilamente (Kontraktion) gegeben ist. Dem L-Typ-Calciumkanal werden drei Zustände zugeordnet: ein „mode 0“-Zustand, in dem sich der Kanal nicht öffnet, ein „mode 1“-Zustand, der durch kurze Öffnungszeiten (~1ms) gekennzeichnet ist und ein „mode 2“-Zustand, in dem die Öffnungsdauer des Kanals um das 5-20fache verlängert ist (HESS et al., 1984).
2.3 Regulation des kardialen L-Typ-Calciumkanals durch extrinsische und intrinsische Mediatoren
2.3.1 Ca2+-abhängige Inaktivierung
Die Calciumhomöostase ist essentiell für eine geregelte, fein abgestimmte Herzmuskelaktivität. Im Herzmuskel wird der Calciumeinstrom weitgehend über den kardialen L-Typ-Calciumkanal reguliert. Durch die Aktivierung der L-Typ-Calciumkanäle kommt es zu einem Einstrom von Calciumionen in das Zellinnere. Die mikromolare Veränderung der Calciumkonzentration führt zu einer Aktivierung der Ryanodinrezeptoren, welche eine schlagartige Freisetzung von Calciumionen aus dem sarcoplasmatischen Retikulum induzieren. Durch die Freisetzung steigt die Calciumkonzentration im Cytoplasma von ca. 0,1µmol/L um das 10-15fache auf ca. 1-1,5µmol/L an. Der Hauptteil des Calciums bindet an Troponin-C, und führt zu einer Konformationsänderung des Troponin- Tropomyosin-Komplexes. Es kommt zu einer Verlagerung des Sperrproteins Tropomyosin am dünnen Filament, so dass sich die Myosinköpfe des Myosinfilamentes an die Actinmoleküle binden können. Durch diese Querbrückenbindung kippen die Myosinköpfe ab, was zu einem Vorübergleiten zwischen Aktin- und Myosinfilamenten führt und in eine Verkürzung der Myofibrillen resultiert (Kontraktion). Ein geringer Teil des Calciums trägt zur Erhöhung der freien Calciumkonzentration bei. Die freie Calciumkonzentration führt über eine Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase zu einer Inaktivierung des inhibitorischen Regulatorproteins (Phospholamban) der sarcoplasmatischen Retikulum-Ca2+-ATPase. Die dadurch aktivierte sarcoplasmatische Retikulum-Ca2+-ATPase vermittelt den Rücktransport von Calcium aus dem Cytoplasma in das sarcoplasmatische Retikulum. Kommt es zu einer Anhäufung von freiem, intrazellulärem Calcium, wird der L-Typ Calciumkanal inaktiviert (LEE et al., 1985; NILIUS u. BENNDORF, 1986). Diese Calcium-konzentrationsabhängige Inaktivierung verläuft schneller als die spannungsabhängige. Frühere Untersuchungen über den Mechanismus der Inaktivierung postulieren, dass der L-Typ-Calciumkanal durch ein Binden von Calciumionen an den Kanal selbst oder an ein assoziiertes Protein inaktiviert wird (HAACK u. ROSENBERG, 1994). Diverse, neuere Experimente zeigen, dass die calciumabhängige Inaktivierung durch ein Binden von Calciumionen und von Calmodulin an die C-terminale Domäne des kardialen L-Typ-Calciumkanals verursacht wird (SOLDATOV et al., 1997, 1998; ZÜHLKE u. REUTER, 1998; PETERSON et al., 1999; QIN et al., 1999;
ZÜHLKE et al.,1999).
2.3.2 Regulation durch Proteinkinasen
Aus den vorangegangenen Beschreibungen erklärt sich, dass die L-Typ-Calciumkanalaktivität sehr genau reguliert wird. Diese Regulation verläuft unter der Beteiligung von unterschiedlichen second messenger-Systemen.
Mehrere G-Protein (Heterotrimer, das aus einer GDP-gebundenen Gα-Untereinheit und einer Gβ/γ-Untereinheit besteht)-gekoppelte Rezeptoren agieren über den cAMP/Proteinkinase A- Signalweg. Eine Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zu einer Wechselwirkung mit der Gα-Untereinheit, einem Austausch von GDP zu GTP und einer Dissoziation der Gα- Untereinheit von dem Gβ/γ-Dimer. Die Gα-Untereinheit bindet an die Adenylatcyclase. Die Rezeptoren sind entweder mit die Adenylatcyclase stimulierenden Gs- oder mit die Adenylatcyclase hemmenden Gi-Proteinen gekoppelt. Eine Aktivierung der Adenylatcyclase führt zur Bildung von cyclischem Adenosinmonophosphat aus ATP. Das cyclische AMP bindet an die regulatorische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase A. Die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A phosphoryliert eine oder mehrere Untereinheiten des Calciumkanals, wodurch es zur Öffnung des Kanals kommt (McDONALD et al., 1994). Eine Stelle, die durch die cAMP-abhängige Proteinkinase phosphoryliert wird, ist die 242kDa-Form der kardialen α1-Untereinheit (DE JONGH et al., 1996). In einer Studie an kultivierten chinesischen Hamsterovarialzellen, welche die α1- Untereinheit des kardialen L-Typ-Calciumkanals exprimierten, konnte gezeigt werden, dass die Proteinkinase A verantwortlich für die Regulation der Phosphorylierung der α1- Untereinheit ist (SCULPTOREANU et al., 1993). Neben der α1-Untereinheit ist auch die β2a- Untereinheit entscheidend an der Regulation des kardialen Calciumkanals durch die Proteinkinase A beteiligt (BÜNEMANN et al., 1999).
Die intrazelluläre Signalkaskade wird durch Phosphodiesterasen, die das cyclische AMP zu 5`-AMP umwandeln, und Serin/Threonin-Phosphatasen gegenreguliert. Die an diesem Signalweg beteiligte Proteinkinase A ist ein Tetramer, bestehend aus zwei katalytischen Untereinheiten, welche an eine regulatorische Dimeruntereinheit gekoppelt sind. Von der regulatorischen Untereinheit existieren die R-I-Form, die sich im Cytosol befindet, und die R- II-Form, die an die Zellmembran gebunden ist.
Die Proteinkinase C spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle in der Regulierung des L-Typ- Calciumkanals. Mehrere Gp-Protein gekoppelte Rezeptoren (α1-Adrenceptor, Endothelin-, Angiotensin II-Rezeptor) verändern die Signalkaskade, indem sie die Proteinkinase C
aktivieren. Das aktivierte Gp-Protein stimuliert die Phospholipase C, welche das Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) hydrolisiert und zur Bildung von Inositoltrisphosphat und Diacylglycerol (DAG) führt. Das Diacylglycerol, das Phosphatidylserin und in bestimmten Fällen Ca2+-Ionen aktivieren zusammen die Proteinkinase C. Von der Proteinkinase C sind in der Säugetierzelle elf Isoformen bekannt, die in drei Gruppen unterteilt werden: die klassischen PKCs (cPKC), welche durch Diacylglycerol oder Phorbolester aktiviert werden und Ca2+-sensitiv sind, die „novel“ PKCs (nPKC), welche durch Diacylglycerol oder Phorbolester aktiviert werden und nicht Ca2+- sensitiv sind, die atypischen PKCs, welche weder durch Diacylglycerol, noch durch Phorbolester und auch nicht durch Ca2+ aktiviert werden (HOFMANN, 1997). In vitro werden die α1- und die β2-Untereinheit des kardialen L-Typ-Calciumkanals durch die Proteinkinase C phosphoryliert. Frühere Untersuchungen über den PKC-abhängigen Signalweg zeigten unterschiedliche Effekte. Einige Autoren konnten nach der Gabe von Endothelin (ET-1) einen deutlichen Anstieg des basalen Calciumstromes (BKAILY et al., 1995; HE et al., 2000), einen deutlichen Abfall des basalen Calciumstromes (CHENG et al., 1995) oder keine Veränderung des basalen Calciumstromes (THOMAS et al., 1997; DELPECH et al., 1997) beobachten.
Andere Experimentatoren konnten einen biphasischen Effekt (Abfall gefolgt von einem Anstieg) zeigen (WOO u. LEE, 1999).
Von der Proteinkinase G existieren zwei Typen (I und II). Die Typ I Proteinkinase (PKG-I) ist ein Homodimer, wobei jede Untereinheit eine Masse von etwa 75kDa besitzt. Sie kommt hauptsächlich im Cytoplasma von Gefäßmuskelzellen, Gefäßendothelzellen, Kardiomyozyten, Fibroblasten, Leukozyten und speziellen Regionen des Nervensystems vor.
Die Typ II Proteinkinase hat eine Masse von 86kDa und ist membrangebunden. Die Proteinkinase Typ II kommt in Nierenzellen, in der Mukosa des Intestinums, in Chondrozyten und in Zellen der Glandula parotis vor, aber nicht in Kardiomyozyten und vaskulären Myozyten. Eine Aktivierung der Guanylatcyclase führt zur Bildung von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP) aus GTP. Das cyclische Guanosinmonophosphat wiederum aktiviert die Proteinkinase G-Typ 1. Es werden unterschiedliche Mechanismen der cGMP/Proteinkinase G-Typ I-vermittelten Inhibition des L-Typ-Calciumkanals vermutet:
eine direkte Phosphorylierung des Kanals durch die Proteinkinase G und eine Proteinkinase G-vermittelte Aktivierung einer Phosphatase, die den Kanal dephosphoryliert Die Rolle des cGMP/Proteinkinase G-Typ I Signalweges wird kontrovers diskutiert. Einige Studien konnten an unterschiedlichen Spezies eine Guanylatcyclase/cGMP/PKG-I-vermittelte Inhibition des
L-Typ-Calciumkanals nachweisen (HADDAD et al., 1995; JIANG et al., 2000; MERY et al., 1991; SUMII u. SPERELAKIS, 1995). Die Autoren konnten zeigen, dass die Hemmung direkt durch die Proteinkinase-G vermittelt wird und nicht durch die Aktivierung von Phosphodiesterasen oder Phosphatasen. Eine cGMP/PKG-I-vermittelte Stimulation des L- Typ-Calciumkanals wurde in Kardiomyozyten von Kaninchen beobachtet (HAN et al., 1998;
WANG et al., 2000).
In einer Studie an Wildtyp, Prkg1tm1Naw-, Prkg1tm2.1Naw- und Prkg1tm2Naw-Knockout-Mäusen wurde die Kontraktionskraft in den Wildtyp-Mäusen durch cGMP-Analoga reduziert, nicht aber in den Knockout-Mäusen (WEGENER et al., 2002). Es konnte dabei in juvenilen und adulten Mäusen gezeigt werden, dass der negativ-inotrope Effekt durch die Proteinkinase G- Typ I vermittelt wurde. Die Untersuchung beschränkte sich jedoch auf die Kontraktionskraft und gab keinerlei Auskunft über den Ionenstrom durch den L-Typ-Calciumkanal. In allen Studien wurde die Whole-cell Patch-Clamp-Technik angewendet und es gab bis zum Jahre 2000 keine Studie, die den Einfluß von cGMP und der Proteinkinase G-Typ I auf den L-Typ- Calciumkanal in detaillierten single-channel-Betrachtungen untersuchte. KLEIN et al. (2000) führten diese detaillierten Untersuchungen erstmalig an Kardiomyozyten von Mäusen durch und konnten zeigen, dass es nach Gabe von 8-Br-cGMP zu einem Rückgang des stimulierenden Effektes von Isoproterenol kam, und dass die Proteinkinase G-Typ I an dieser Hemmung beteiligt war.
Neben den hier aufgeführten Proteinkinasen wird eine Beteiligung von weiteren Kinasen an der Regulation von L-Typ-Calciumkanälen in Herzmuskelzellen diskutiert.
YOKOSHIKI et al. (1996) konnten an Herzmuskelzellen von Ratten und CHIANG et al.
(1996) an Kardiomyozyten von Meerschweinen zeigen, dass es nach Hemmung der Protein- Tyrosinkinase zu einer Abnahme des Calciumstromes kam. In Kardiomyozyten von Katzen wurde nach Hemmung der Protein-Tyrosinkinase ein biphasischer Effekt beobachtet (WANG u. LIPSIUS, 1998). Ein Anstieg des Calciumstromes konnte in humanen Kardiomyozyten nach Hemmung der Protein-Tyrosinkinase festgestellt werden (BOIXEL et al., 2000). Es ist bisher nicht vollständig geklärt, wie die Regulation des L-Typ-Calciumkanals durch Protein- Tyrosinkinasen erfolgt und ob die Tyrosinkinasen mit bestimmten Proteinkinasen interagieren. Neben den Untersuchungen der Tyrosinkinasen befaßte sich eine Reihe von Studien mit dem Einfluß der Calmodulin-abhängigen Kinase (CaMK) auf den positiven Feedback-Mechanismus und die Ca2+-abhängige Öffnung des L-Typ-Calciumkanals (YUAN u. BERS, 1994; ZÜHLKE et al., 1999; ZÜHLKE et al., 2000).
2.3.3 Regulation durch Phosphatasen
In nahezu allen Aspekten der Zellfunktion ist die Phosphorylierung und die Dephosphorylierung der Aminosäuren Serin und Threonin beteiligt. Eine Vielzahl von Phosphatasen ist für die balancierende Dephosphorylierung von Proteinen zuständig. Neben den Serin/Threonin-spezifischen Phosphatasen PP1, PP2A, PP2B, PP2C, PP3, PP4, PP5, PP6 und PP7 existieren noch weitere, wie z. B. die Tyrosin Phosphatasen. Die Rolle der Phosphatasen wurde in zahlreichen Studien an unterschiedlichen Spezies untersucht. In Abwesenheit neuronaler und humoraler Stimulation konnte in ventrikulären Myozyten von Mäusen die bedeutende Funktion der Phosphatasen PP1 und PP2A an der Regulation der steady-state Calciumkanalaktivität gezeigt werden (DUBELL et al., 2002). Einen positiv- inotropen Effekt beobachteten NEUMANN et al. (1994) nach Gabe des Phosphataseinhibitors Calyculin A in Meerschweinkardiomyozyten. ONO und FOZZARD (1993) kamen in ihrer Untersuchung an Kaninchenkardiomyozyten zu dem Schluß, dass zwei modulierende Phosphorylierungsstellen am L-Typ-Calciumkanal existieren, die von zwei unterschiedlichen Phosphatasen dephosphoryliert werden. WIECHEN et al. (1995) konnten in ihrer Arbeit an Meerschweinkardiomyozyten zeigen, dass die Verfügbarkeit und die Modulation des „mode 2“-Zustandes durch die Phosphatasen PP1 und PP2A beeinflußt wurden. Eine ähnliche Reduktion des Calciumstromes durch PP2A-selektive Dephosphorylierung wurde an humanen glatten Muskelzellen beobachtet (GROSCHNER et al.,1996). Aufgrund der gewonnenen Erkenntnisse kamen DAVARE et al. (2000) zu der Überlegung, dass eine Phosphatase direkt mit dem Calciumkanal verbunden sein muß, um effektiv die Phosphorylierung der Serin 1928-Stelle gegenregulieren zu können. In einem Rattenmodell war bei chronischer β-adrenerger Stimulation die Aktivität der Phosphatasen erhöht, welche eine Dephosphorylierung des Phospholambans zur Folge hatte (BOKNIK et al., 2000). SHEN und PAPPANO (2002) zeigten in einer Arbeit an Meerschweinkardiomyozyten, dass die Hemmung des cAMP-gesteigerten Calciumstromes durch eine cGMP/PKG–vermittelte Aktivierung von Phosphatasen erfolgte. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die an Zellen von Säugetieren gewonnen wurden, konnte in Kardiomyozyten von Amphibien kein Zusammenhang zwischen einer Phosphorylierung des L-Typ-Calciumkanals durch die Proteinkinase A und einer Dephosphorylierung durch eine Microcystin (Phosphataseinhibitor)-sensible Phosphatase beobachtet werden (HARTZELL et al., 1995).
2.3.4 Regulation durch β-Adrenoceptoren
An der Regulation von Ionenkanälen sind eine Reihe von biochemischen Vorgängen, wie die Produktion eines second messengers und die Aktivierung einer Proteinkinase, beteiligt. Einen Prototyp dieses Regulationsweges stellt die β- adrenerge Regulation des kardialen L-Typ- Calciumkanals dar (HARTZELL, 1988). Sowohl der β1- als auch der β2-Adrenoceptor ist in Kardiomyozyten ausgebildet. In den 80er Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts konnte in Froschkardiomyozyten eine Änderung der aktiven Kanäle nach β-adrenerger Stimulation beobachtet werden (BEAN et al., 1984). HARTZELL et al. (1991) führten die β-adrenerg- vermittelte Stimulation des Calciumstromes in Frosch-, Ratten- und Meerschwein- kardiomyozyten auf eine cAMP-abhängige Phosphorylierung des L-Typ-Calciumkanals zurück. Eine Aktivierung des β1-Adrenoceptors führt über Stimulierung eines Gs-Proteins zur Aktivierung der membranständigen Adenylatcyclase, die wiederum aus ATP cyclisches AMP bildet. Das cAMP aktiviert die Proteinkinase A, welche den L-Typ-Calciumkanal phosphoryliert. Die phosphorylierten Kanäle sind charakterisiert durch eine erhöhte Offenwahrscheinlichkeit, Verfügbarkeit und eine erhöhte Bereitschaft zu längeren Öffnungszeiten (TSIEN et al., 1986; McDONALD et al., 1994).
In diversen Studien konnte in unterschiedlichen Spezies ein erhöhter Calciumstrom nach Gabe des β-Adrenoceptor-Agonisten Isoproterenol beobachtet werden. Die β-Adrenoceptor- vermittelte Stimulation verkürzte die durchschnittliche Dauer des inaktivierten Zustandes des Kanals. Eine Steigerung des Calciumstromes durch Potenzierung von hoch aktiven Öffnungszuständen konnte nach β-adrenerger Stimulation in Meerschweinkardiomyozyten gezeigt werden (YUE et al., 1990). Der β-Adrenoceptor-Agonist Isoproterenol bewirkte eine Verschiebung der Spannungsabhängigkeit des L- Typ- Calciumkanals und eine Veränderung des Öffnungszustandes zum „mode 2“ mit verlängerten Öffnungszeiten (McDONALD et al., 1994). HIRANO et al. (1994) wiesen nach, dass die β-adrenerge Steigerung des kardialen Calciumstromes durch mehrere, voneinander unabhängig phosphorylierte, funktionelle Regulationsstellen erfolgte.
Die intrazelluläre Signaltransduktion des β2-Adrenoceptors und der Effekt auf den L-Typ- Calciumstrom unterscheiden sich von der des β1-Adrenoceptors (SCHRÖDER u. HERZIG, 1999). So war in Meerschweinkardiomyozyten die β1-Adrenoceptor-Aktivierung allein verantwortlich für die Stimulation des Calciumstromes, und die β2-Adrenoceptor-Aktivierung hatte keinen Einfluß auf die Stimulierung des Calciumkanals (HOOL u. HARVEY, 1997). In Rattenkardiomyozyten und in einem Maus- Modell mit Überexpression von humanen β2-
Adrenoceptoren konnte gezeigt werden, dass der β2-Adrenoceptor an stimulierende Gs-und inhibierende Gi-Proteine gekoppelt ist (XIAO et al., 1995, 1999). Das konkurrierende Binden an die Gi-Proteine verhinderte komplett eine β2-Adrenoceptor/Gs-Protein-vermittelte Antwort.
Eine Hemmung der Gi-Proteine durch Pertussistoxin bewirkte eine β2-Adrenoceptor/Gs- stimulierte Steigerung des Calciumstromes (XIAO et al., 1999). Zu einem gegensätzlichen Ergebnis kam man in einer anderen Studie mit dem gleichen Maus-Modell. Eine β2- vermittelte Steigerung des Calciumstromes konnte darin nicht nachgewiesen werden und eine Reduktion des Calciumstromes führte man auf die tonische Aktivierung von Gi-Proteinen zurück (HEUBACH et al., 2001).
Die Antwort auf β-adrenerge Stimulation ist im Stadium der Herzinsuffizienz erheblich reduziert. In Studien an Kardiomyozyten herzinsuffizienter Ratten (XIAO et al., 2003) und an humanen Kardiomyozyten herzinsuffizienter Patienten (BRISTOW et al., 1982, 1986) konnte eine selektive Herunterregulation der β1-Adrenoceptoren beobachtet werden, die mit einer Steigerung des β2/β1-Adrenoceptor-Verhältnisses einher ging. Die Bedeutung der β2- Adrenoceptor-vermittelten Regulation des L-Typ-Calciumkanals im insuffizienten Herzen konnte in einer Arbeit mit humanen und caninen Kardiomyozyten gezeigt werden. Die zelluläre Antwort auf β2-Agonisten war bei diesen Kardiomyozyten erhöht, im Vergleich zu Kardiomyozyten gesunder Tiere und der positiv-inotrope Effekt wurde nicht über eine cAMP- abhängige Phosphorylierung von Phospholamban oder eine Anhebung der cAMP- Konzentration vermittelt (ALTSCHULD et al., 1995). In einer weiteren Studie konnte neben der Phosphorylierung des L-Typ-Calciumkanals durch den cAMP/PKA-Signalweg über beide β-Adrenoceptoren eine Phosphorylierung von Regulatorproteinen (u. a. Phospholamban) im β2-Adrenoceptor-vermittelten Signalweg in caninen Kardiomyozyten nicht nachgewiesen werden (KUSCHEL et al., 1999).
Einen weiteren Mechanismus β-adrenerg-vermittelter Inotropie fanden NEUMANN et al.
(1991) in der Inhibition der PP1 Aktivität. Einen zeitverzögerten Effekt nach Gabe von unterschiedlichen Adenylatcyclaseaktivatoren beobachteten JUREVICIUS und FISCHMEISTER (1996) in Froschkardiomyozyten. Die Gabe von Isoproterenol (Aktivator der membrangebundenen Adenylatcyclase durch β-Adrenoceptor) erzeugte eine schnelleren Anstieg des Calciumstromes und eine deutlich höhere cAMP-Konzentration in unmittelbarer Nähe des Calciumkanals als die Gabe von Forskolin. Sie erklärten diese Beobachtungen durch eine unterschiedliche Kompartimentierung von cAMP und eine unmittelbare Lokalisation des β-Adrenoceptors mit dem L-Typ-Calciumkanal.
2.3.5 Regulation durch m2-Acetylcholinrezeptoren
Es existieren fünf Subtypen von muscarinergen Acetylcholinrezeptoren: m1, m2, m3, m4, m5. Während die m1-, m3-, m4- und m5-Subtypen hauptsächlich im Gehirn vorkommen, wird im Herzen der m2-Acetylcholinrezeptor exprimiert. Die m2- und die m4-Acetylcholinrezeptoren sind an Pertussistoxin-sensitive, inhibierende Gi- und Ionenkanal-aktivierende Go-Proteine gekoppelt (CAULFIELD u. BIRDSALL, 1998). Eine Aktivierung des muscarinergen Rezeptors führt zu einer Reduktion der β-adrenergen Stimulierung in Herzmuskelzellen. Eine Reihe von Studien konnte den muscarinerg-vermittelten negativ-inotropen Effekt nach vorheriger β-adrenerger Stimulation zeigen. Der Mechanismus dieses Effektes bleibt widersprüchlich. Zum einen wird die Hemmung der Adenylatcyclase durch Gi-Proteine diskutiert, zum anderen wird eine Aktivierung der Phosphatase-2A, oder die Beteiligung eines NO/cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP)/Phosphodiesterase-2- (PDE2) oder eines NO/cGMP/PKG-Signalweges vermutet (MERY et al., 1997). Sowohl das Gi2α-Protein (CHEN et al., 2001), als auch das Goα-Protein (VALENZUELA et al., 1997) sind für die muscarinerg-vermittelte Regulation entscheidend. Die Hemmung der Adenylatcyclase als Mechanismus muscarinerger Regulation des Calciumstromes wurde von HARTZELL (1988) beschrieben und u.a. in Meerschweinkardiomyozyten (HESCHELER et al., 1986) und in Froschkardiomyozyten (MERY et al., 1996) aufgezeigt. HERZIG et al. (1995) beobachteten in Meerschweinkardiomyozyten, dass die muscarinerg-vermittelte Inhibition des Calciumstromes mit einer Aktivierung der Phosphatase-2A einher ging. Einen signifikanten Abfall der Kontraktionskraft und der Herzfrequenz ohne vorherige Prästimulation durch Sympathomimetika beobachteten GEORGE et al. (1973) in Rattenherzen nach alleiniger Gabe eines m-Acetylcholinrezeptor-Agonisten. Dieser inhibierende Effekt war mit einer Steigerung der cGMP-Konzentration und einer Reduktion des cAMP-Levels verbunden. Im Gegensatz dazu wurde in einer Arbeit an isolierten Meerschweinventrikeln gezeigt, dass die muscarinerg-induzierte Hemmung des β-Adrenoceptor-vermittelten inotropen Effektes mit einer Erhöhung des cGMP-Spiegels korreliert war und nicht mit einem Abfall des cAMP- Spiegels (WATANABE u. BESCH, 1975). Eine muscarinerg-induzierte Reduktion β- adrenerg-gesteigerter Kontraktionskraft ging in isolierten Meerschweinkardiomyozyten ohne Veränderung der intrazellulären cAMP-Konzentration einher (SCHMIED u. KORTH, 1990).
Eine Beteiligung des NO-Synthase/NO/Guanylatcyclase (GC)/cGMP-Signalweges an der muscarinergen Regulation konnte in Rattenkardiomyozyten (STERIN-BORDA et al., 1995;
BALLIGAND et al., 1995; HARE et al., 1998), in Zellen des atrio-ventrikulären Knotens von Kaninchen (HAN et al., 1996) und in Hundeherzen (HARE et al., 1995) nachgewiesen
werden. Andere Studien mit Froschkardiomyozyten (MERY et al., 1996) und humanen Kardiomyozyten (KILTER et al., 1995; VANDECASTEELE et al., 1998) ergaben keinen Anhaltspunkt für eine Beteiligung von NO an der muscarinerg-vermittelten Hemmung des Calciumstromes. Zu widersprüchlichen Ergebnissen kamen HAN et al. (1998) und VANDECASTEELE et al. (1999) in ihren Arbeiten an eNOS-defizienten (Nos3tm1Plh) Mäusen, welche durch gezielte Mutagenese generiert worden waren. Während HAN et al.
(1998) beschreiben, dass der eNOS/NO/GC/cGMP-Signalweg an der muscarinergen Regulation des L-Typ-Calciumkanals beteiligt ist, schließen VANDECASTEELE et al.
(1999) eine Beteiligung der endothelialen NO-Synthase am muscarinergen Signalweg aus.
Obgleich die Autoren 129S6 und C57BL6/J als Rezipienten für das Transgen angeben, können die Befunde nicht eindeutig einem genetischen Hintergrund zugeordnet werden. Aus der Literatur ist nicht zu entnehmen, ob es sich um Inzuchttiere handelt, oder ob der genetische Hintergrund segregiert. Daher ist es durchaus denkbar, dass HAN et al. (1998) und VANDECASTEELE et al. (1999) in ihren Studien, aufgrund des unterschiedlichen genetischen Hintergrundes der Versuchstiere, zu unterschiedlichen Ergebnissen gelangen. In zwei darauffolgenden Arbeiten (BELEVYCH u. HARVEY, 2000; GÖDECKE et al., 2001), ebenfalls mit eNOS-defizienten Mäusen, konnte die von VANDECASTEELE et al. (1999) aufgestellte These bestätigt werden. Im Gegensatz zu BELEVYCH und HARVEY (2000), die mit dem gleichen Mäusestamm (Nos3tm1Plh) wie HAN et al. (1998) und VANDECASTEELE et al. (1999) arbeiteten, verwendeten GÖDECKE et al. (2001) eine selbstgenerierte eNOS- defiziente Maus (Nos3tm1Gdk). Eine eindeutige Angabe über den genetischen Hintergrund geht aus der Literatur ebenfalls nicht hervor.
2.3.6 Regulation durch Stickstoffmonoxid und Stickstoffmonoxid-Synthasen
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiger Botenstoff, der verschiedene physiologische Prozesse im kardiovaskulären System reguliert. An der Produktion von NO sind Stickstoffmonoxid-Synthasen (NO-Synthasen) beteiligt. Sie wandeln L-Arginin zu L-Citrullin und NO in Anwesenheit von O2 und NADPH um. Es existieren drei Isoformen der NO- Synthasen, die in einer Vielzahl von Zelltypen vorkommen. Die induzierbare NO-Synthase (iNOS, NOS II) wird unter pathophysiologischen Bedingungen unter anderem im Kardiomyozyten als Antwort auf bestimmte Zytokine vermehrt exprimiert. Die endotheliale NO-Synthase (eNOS, NOS III) wird ebenfalls im Kardiomyozyten ausgebildet, jedoch ohne
Zytokinstimulation. Die neuronale NO-Synthase (nNOS, NOS I) wird unter physiologischen Bedingungen im Kardiomyozyten synthetisiert. Viele der modulatorischen Effekte von NO werden durch eine Aktivierung der Guanylatcyclase (GC) und der Bildung von cGMP vermittelt. Die Beteiligung von NO am β-adrenergen und muscarinergen Signalweg wird kontrovers diskutiert. BALLIGAND et al. (1993) konnten die Ausbildung des L-Arginin/NO- Signalweges sowohl in neonatalen, als auch in adulten Rattenkardiomyozyten nachweisen.
Eine Hemmung der NO-Synthasen führte dabei zu einer Erhöhung des β-adrenerg- vermittelten positiv-inotropen Effektes und einer Blockade des muscarinerg-vermittelten negativ-chronotropen Effektes. Während einige Autoren einen Effekt von NO-Donatoren auf den basalen Calciumstrom beobachteten (KIRSTEIN et al., 1995; WAHLER u.
DOLLINGER, 1995; GALLO et al., 2001), fehlte dieser Effekt in anderen Studien (MERY et al., 1996; ABI-GERGES et al., 2001). Ein stimulierender, dosisabhängiger Effekt von NO wurde bei niedrigen Stickstoffmonoxidkonzentrationen durch eine cGMP-induzierte Hemmung der Phosphodiesterase-2 erzeugt (KIRSTEIN et al., 1995), bzw. cGMP- unabhängig durch eine Aktivierung der Adenylatcyclase (VILA-PETROFF et al., 1999; ABI- GERGES et al., 2002). Die Inhibition des β-adrenerg-stimulierten Calciumstromes durch Beteiligung von NO bzw. NO-Synthasen konnte in Kardiomyozyten von Meerschweinen (WAHLER u. DOLLINGER, 1995), Ratten (ABI-GERGES et al., 2001) und Fröschen (DITTRICH et al., 2001), sowie des Menschen (HARE et al., 1995) gezeigt werden. Der negativ-inotrope Effekt von NO wurde in einigen Studien auf eine Vermittlung des cGMP/Proteinkinase G-Signalweges zurückgeführt (WAHLER u. DOLLINGER, 1995;
VILA-PETROFF et al., 1999; ABI-GERGES et al., 2001; WEGENER et al., 2002), in anderen Studien auf eine cGMP-vermittelte Aktivierung der Phosphodiesterase–2 (HAN et al., 1996; GALLO et al., 2001; DITTRICH et al., 2001) und auf einen cGMP-unabhängigen Signalweg (HU et al., 1997). In einem Tiermodell mit eNOS (Nos3tm1Gdk)-Knockout-Mäusen ging der Mangel an endothelialer NO-Synthase nach Stimulation des β-Adrenoceptors mit einer erhöhten kardialen Kontraktionskraft einher (GÖDECKE et al., 2001). In Kardiomyozyten von Patienten mit Herzinsuffizienz war die Menge von endothelialer NO- Synthase reduziert und die Menge und Aktivität der induzierbaren NO-Synthase erhöht (DREXLER et al., 1998). Die erhöhte iNOS-Aktivität hatte eine Reduktion des positiv inotropen Effektes der β-adrenergen Stimulation zur Folge. Ein wachstumsmindernder Effekt, zum Teil als Folge des NO-verminderten Calciumstromes, konnte in Kardiomyozyten von Ratten nachgewiesen werden (CALDERONE et al., 1998).
3 Material und Methoden
3.1 Tiere und Tierhaltung
In der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. Kai C. Wollert wurde eine transgene Maus generiert, die Kardiomyozyten-spezifisch die Proteinkinase G-Typ I (PRKG1) überexprimiert. Zur Erzeugung des Transgens wurde die cDNA der humanen PRKG1 (TAMURA et al., 1996) an den murinen α-Myosin Schwerketten (αMHC)-Promotor gekoppelt. Der αMHC-Promotor, welcher sich zwischen dem αMHC (α1)- und dem βMHC (β)- Genlocus befindet, ist in der Lage, eine Kardiomyozyten-spezifische Transgenexpression zu steuern (GULICK et al., 1991). Mittels einer PCR-Mutagenese wurde zunächst eine BamHI Schnittstelle 14bp 5’ des ATG-Startcodons eingeführt. Dann wurde das Fragment zwischen der BamHI Schnittstelle und einer ClaI Schnittstelle 116bp 3’ des TAA-Stopcodons herausgeschnitten. Die cDNA der humanen PKG-I wurde anschließend in die MaeIII Schnittstelle im dritten nicht-kodierenden Exon (α3) des murinen αMHC-Genlocus einkloniert. Abschließend wurde das Intron und das Polyadenylierungssignal des SV40 T-Antigens am 3‘ Ende der PRKG1-cDNA eingefügt. Für die einzelnen Klonierungsschritte wurde ein pBluescript (Stratagene) Plasmidvektor verwendet. Die Bestätigung der genauen Orientierung und der Sequenz der PRKG-1-cDNA erfolgte durch die Firma Invitek aus Berlin.
Im Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg wurde das so konstruierte Transgen fertilisierten Eizellen von superovulierten B6D2F1/Crl Mäusen pronukleär injiziert.
Anschließend wurden diese Oozyten in scheinschwangere Crl:NMRI Mäuse transferiert. Die transgenen Founder-Tiere wurden nach Hannover überführt. Von diesen Tieren wurden drei Mäuse nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit nicht-transgenen C57BL/6 Weibchen zur Etablierung von drei unabhängigen Stämmen [(B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)1Zhg), (B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)2Zhg),); (B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)3Zhg)] verpaart.
Im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover erfolgte die fortgesetzte Rückkreuzung der drei Stämme auf C57BL/6. Die Mäuse wurden in Gruppen bis zu vier
Abb. 4: Das αMHC-PRKG-I-Transgen. Nähere Erläuterung im Text.
αMHC-Promotor
MAEIII
PRKG-1 SV 40
β α1 α2 α3
VP RP
Tieren in Makrolonkäfigen Typ II auf staubfreiem Weichholzgranulat in Barrierehaltung gehalten. Die durchschnittliche Raumtemperatur lag bei 22±2°C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55±5% und der Raum wurde in der Zeit von 07.00 bis 19.00 Uhr beleuchtet. Als Tierfutter wurde pelletiertes Zuchtfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH [Inhaltsstoffe:
Rohprotein 22,5%, Rohfett 5,0%, Rohfaser 4,5%, Rohasche 6,5%, Calcium 0,9%, Phosphor 0,7%; Zusatzstoffe je kg: Vitamin A 25.000IE, Vitamin D3 1.000IE, Vitamin E 125mg, Kupfer 5mg] verwendet. Trinkwasser wurde den Tieren in Form von Leitungswasser in Tränkflaschen ad libitum angeboten. Die Mäuse sind in dreimonatigen Abständen, gemäß der FELASA-Liste, auf ihren mikrobiellen Status untersucht worden. Hierbei wurden die fakultativ pathogenen Erreger Pneumocystis carinii, Pasteurella pneumotropica, Helicobacter typhlonius, Helicobacter hepaticus, Helicobacter bilis, Staphylococcus aureus und apathogene Darmflagellaten nachgewiesen. Klinisch zeigten die Tiere keine Anzeichen für eine Infektion.
Die Genotypisierung der Tiere erfolgte mittels einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Zu diesem Zweck wurde den Mäusen im Alter von 4 Wochen unter Narkose die Schwanzspitze kupiert. Der Vorwärts-Primer (VP ; CATAGGCTACGGTGTAAAAGAGGC) befand sich 145bp 5‘ des PRKGI Startcodons im αMHC Genlocus und der Rückwärts-Primer (RP;
TACTCCACCGGGTACATACAATCC) 368bp 3‘ des Startcodons in der PRKGI cDNA.
Zur Isolierung der DNA wurden die Schwanzspitzen bei einer Temperatur von 55°C in 500µl Extraktionspuffer (100mmol/l NaCl, 10mmol/l Tris HCl pH 8,0, 10mmol/l EDTA, 0,5% SDS) und 40µl Proteinase K-Lösung (10mg/ml in 50mmol/l Tris-HCl, pH 8,0, 1mmol/l CaCl2) inkubiert. Anschließend wurde die DNA zweimal mit Phenol und Chloroform gewaschen und das DNA Pellet nach vorheriger Ethanolfällung und vollständiger Trocknung in 100µl TE-Puffer gelöst. Das Gesamtvolumen eines PCR-Ansatzes betrug 50µl und enthielt 2µl der resuspendierten genomischen DNA, 50mmol/l KCl, 20mmol/l Tris-HCl, pH 8,4, 1,5mmol/l MgCl2, 0,1mmol/l dNTPs, je 50pmol Vorwärts- und Rückwärts-Primer und 1 U Taq DNA-Polymerase (Life Technologies). Insgesamt wurden 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 65°C und einer Minute bei 72°C bestand. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 1,5%igem Agarosegel. Die Banden wurden durch Zusatz von Ethidiumbromid unter UV-Bestrahlung detektiert und anschließend fotografiert.
Für die Versuchsreihen wurden weibliche nicht-transgene (+/+; Wildtyp) und transgene (Tg/+) Geschwistertiere aus den Rückkreuzungsgenerationen N4-N7 verwendet. Die Mäuse teilten sich in den Rückkreuzungsgenerationen, entsprechend der Mendelschen Gesetzmäßigkeit, erwartungsgemäß im Verhältnis 1:1 in nicht-transgene (+/+) und transgene (Tg/+) Tiere auf. Das Alter der verwendeten Tiere lag zwischen vier und acht Monaten und das Körpergewicht variierte von 19g bis 23g. Die transgenen Tiere wiesen keinerlei Unterschied bezüglich des mittleren Körpergewichtes im Vergleich zu gleichaltrigen, nicht- transgenen Geschwistertieren auf.
Während der Versuchsreihen wurden von jedem verwendeten Tier eine Probe von dem Herzohr/Herzvorhof und vom Zellisolat verwahrt. Mit diesen Proben erfolgte ein Nachweis der PKG-I auf Proteinebene mittels Western-Blot-Technik nach LAEMMLI (1970). Dazu wurde das Gewebe zunächst in einem Lysispuffer (50mM Tris-HCl, pH 7,4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50mM NaF, 1% TRITON x-100, 0,5% Nonidet P 40) aufgeschlossen.
Nachfolgend wurden die Proteine in einem 2fach-Proben-Puffer (5ml 0,5M Tris-HCl, pH 6,8, 4ml Glycerol, 8ml 10%iges SDS, 2ml 2-Mercaptoethanol, 1ml 0,5%iges Bromphenolblau) denaturiert. Für die elektrophoretische Trennung wurde ein 9%iges SDS-Gel (4,35ml entionisiertes Wasser, 2,5ml 1,5M Tris-HCL < pH 8,8, 100µl 10%iges SDS, 3,0ml Acrylamide/Bis[30%ig], 50µl 10%iges Ammonium Persulfat, 5µl TEMED) verwendet. Dann wurden die Proteine für eine Stunde im Naß-Blot Verfahren auf eine Nitrozellulose-Membran (Amersham Pharmacia Biotech) geblottet. Nach mehrmaligem Waschen der Membran mit TBST-Puffer (2,4g Tris, 8g NaCl, in 1000ml destilliertem Wasser bei pH 7,6, 1ml Tween 20) wurden durch Zusatz eines Milchpuffers (5% Milchpulver in TBST gelöst) unspezifische Bindungsstellen abgesättigt. Danach wurde die Membran über Nacht bei 4°C in einer Primärantikörperlösung inkubiert. Diese Lösung bestand aus anti-human-PKG-I–Kaninchen- Antikörper (MARKERT et al., 1995) in 5% Milchpulver/TBST (Verdünnung 1:3500). Die Membran wurde nachfolgend mehrmals gewaschen und in der Sekundärantikörperlösung (anti-Kaninchen-HRP (Amersham Pharmacia Biotech) in 5% Milchpulver/TBST, 1:3500) für eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Abschließend erfolgte die Visualisierung der Antikörperbindung mittels ECL-Reagenzien (Amersham Pharmacia Biotech). Dazu wurde die Membran für 30sec. auf einen Röntgenfilm exponiert. Die resultierende Bande lag bei 76kDa, entsprechend dem Molekulargewicht der Proteinkinase G-Typ I.
3.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien
- Inverses Phasenkontrastmikroskop „Axiovert 35“ Zeiss
- Okular: PI 10x/20 Zeiss
- Objektive: Achrostigmat 5x/0,12; 10x/0,25; 32x/0,40 Ph 1 Zeiss - Stromlieferer für Mikroskop: Autobatterie 12V; 88Ah, 640A Varta
- Langendorff-Säule, 50cm lang Landgraf
- Schüttelwasserbad Typ 1083 Gesellschaft für
Labortechnik
- Thermostatumlaufpumpe Typ M3 Lauda
- Pipettenschmiede Microforge MF-830 Narishige
- Pipettenpuller PP-830 Narishige
- Binoptische Lupe mit Haltevorrichtung, Glühdraht, Trafo Eigenkonstruktion
- pH –Meter CG 840 Schott
- Magnetrührer MR 2002 Heidolph
- Waage A 120 S Sartorius
- Mikromanipulator WR-88 Narishige
- Headstage CV 203 BU Axon Instruments
- Verstärker Axopatch 200B Axon Instruments
- Digitalwandler Digi Data 1200 Series Interface Axon Instruments - schwingungsgedämpfter Metalltisch Luigs u. Neumann
- Arbeitstisch Eigenherstellung
- Plantisch für Zellproben, mit Feintrieb Luigs u. Neumann
- Faradaykäfig Eigenherstellung
- Spülsystem Eigenkonstruktion
- Haltevorrichtung für Headstage, Plantisch, Spülsystem Luigs u. Neumann - Ag-Ag-Cl Badelektrode aus 0,2mm starken Silberdraht Eigenkonstruktion - Personalcomputer 300MHZ Prozessor, 32MB Arbeitsspeicher
- Softwareprogramm PClamp 6, Version 6.0.3 Axon Instruments - Borosilikatglaskapillaren, 1,7mm Außendurchmesser Hilgenberg - Tissue-Culture-Dish Kulturschälchen, 3,5mm Durchmesser Sarstedt
- Blue caps, 50ml Falcon
3.3 Eingesetzte Substanzen und Lösungen 3.3.1 Substanzen
Tab. 1: Eingesetzte Substanzen
Substanz Summenformel Molekulargewicht Hersteller
[2-(N,N- Diethylamino)- diazenolate-2- oxide.Na (DEA/NO)
C4H10N3O2Na 155,10g/mol Alexis
1,2-bis(o- Aminophenoxy) ethane-N,N,N`,N`- tetraacetic Acid Tetra(acetoxymethyl) Ester (BAPTA-AM)
C34H40N2O18 764,70g/mol Calbiochem
8-Bromoguanosine 3`:5`Cyclic- Monophosphat (8-Br-cGMP)
C10H10BrN5O7PNa 446,10g/mol Sigma
Adenosin 5´
Triphosphat (Na2ATP)
C10H14N5O13P3Na2 551,10g/mol Sigma Bariumchlorid BaCl2 * 2H2O 244,28g/mol Merck Calciumchlorid
Dihydrat
CaCl2 * 2H2O 147,02g/mol Merck Carbachol C6H15ClN2O2 182,70g/mol Calbiochem Dimethylsulphoxid
(DMSO)
C2H6OS 78,13g/mol Sigma
Ethylen Glykol bis (β- Aminoethyl Ether)- N,N,N`,N`-Tetraacetic Acid (EGTA)
C14H24N2O10 380,40g/mol Sigma
Glucose Monohydrat C6H12O6 * H20 198,17g/mol Merck Isoproterenol-
Hydrochlorid
C11H17NO3 * HCL 247,70g/mol Sigma
Kaliumchlorid KCl 74,55g/mol Merck Kaliumglutamat C5H8NO4K 185,20g/mol Sigma
Kaliumhydroxid KOH 56,11g/mol Merck
Magnesiumchlorid Hexahydrat
MgCl2 * 6H2O 203,30g/mol Merck Magnesiumsulfat-
Heptahydrat
MgSO4 * 7H2O 246,48g/mol Merck N-[2-Hydroxyethyl]
piperazine-N`-[2- ethanesulfonic acid (HEPES)
C8H18N2O4S 238,30g/mol Sigma
Natriumchlorid NaCl 58,44g/mol Merck
Natriumdihydrogen- phosphat Monohydrat
NaH2PO4 * H2O 137,99g/mol Merck
Natriumhydroxid NaOH 40,00g/mol Merck
Saccharose C12H22O11 342,30g/mol Merck
Tetraethyl-ammonium Hydroxide
(TEA-OH)
C8H21NO 147,30g/mol Sigma
Weitere eingesetzte Substanzen:
- Ampuwa (Firma Fresenius)
- Bovines Serumalbumin (Firma Sigma)
- Collagenase Typ I CLS [187U/mg] (Firma Worthington) - Pertussistoxin (Fima Sigma)
Konzentrationen der verwendeten Substanzen Isoproterenol, Carbachol, DEA/NO und 8-Br- cGMP:
1.) Isoproterenol: wurde für jeden Versuch frisch in einer Ascorbinsäurelösung (1mg/ml) in einer Konzentration von 10-4M gelöst; eine entsprechende Menge dieser Stammlösung wurde dem Zellbad zugefügt, so dass die Endkonzentration 10-6M betrug.
2.) Carbachol: wurde mit entionisiertem, destilliertem und autoklaviertem Wasser in einer Konzentration von 10-4M gelöst und in 50µl Aliquots aufbewahrt (–20°C); eine
entsprechende Menge dieser Stammlösung wurde dem Zellbad zugefügt, so dass die Endkonzentration 10-6M betrug.
3.) DEA/NO: wurde mit entionisiertem, destilliertem und autoklaviertem Wasser in einer Konzentration von 10-5M gelöst und in 50µl Aliquots aufbewahrt (-20°C); eine entsprechende Menge dieser Stammlösung wurde dem Zellbad zugefügt, so dass die Endkonzentration 10-7M betrug.
4.) 8-Br-cGMP: wurde mit entionisiertem, destilliertem und autoklaviertem Wasser in einer Konzentration von 10-1M gelöst und in 50µl Aliquots aufbewahrt (-20°C); eine entsprechende Menge dieser Stammlösung wurde dem Zellbad zugefügt, so dass die Endkonzentration 10-3M betrug.
3.3.2 Lösungen
Die Lösungen wurden mit entionisiertem und destilliertem Wasser hergestellt.
Stammlösung für die Zellisolationslösung: für 1000ml
NaCl KCL NaH2PO4 MgSO4 HEPES
78g 2,98g 1,655g 2,96g 23,83g
in 1000ml Wasser
Zellisolationslösungen:
Die Zellisolationslösungen wurden für jeden Versuch frisch angesetzt und im Wasserbad auf eine Temperatur von 38°C erwärmt.
Lösung A: für 500ml Stammlösung Glucose
50ml 1,09g
mit Wasser auf 500ml auffüllen pH 7,4 mit 1M NaOH
Lösung B: für 320ml
Lösung A Bovines Serumalbumin (BSA)
320ml 320mg
Lösung C: für 140ml
Lösung B Collagenase
187U/mg 0,1M CaCl2
140ml 48,8mg 35µl
Lösung D: für 20ml
Lösung B 0,1M CaCl2
20ml 20µl
Lösung E: für 20ml
Lösung B 0,1M CaCl2
20ml 40µl
Lösung F: für 20ml
Lösung B 0,1M CaCl2
20ml 100µl
Stammlösung für die kaliumreiche Badlösung: für 100ml
KCl HEPES MgCl2
1,865g 2,385g 0,405g
in 100ml Wasser
kaliumreiche Badlösung: für 250ml Stamm-
lösung
Kalium-
glutamat Na2ATP Glukose EGTA 0,1M CaCl2
25ml 5,555g 0,138g 0,45g 0,190g 278µl
mit Wasser auf 250ml auffüllen pH 7,3 mit 1M KOH
Pipettenlösung: für 100ml
BaCl2 Saccharose HEPES
1,708g 3,762g 0,238g
in 100ml Wasser pH 7,4 mit TEA-OH
3.4 Versuchsdurchführung
Die Tötung der Tiere zur Organentnahme wurde dem Tierschutzbeauftragten der Medizinischen Hochschule Hannover angezeigt.
3.4.1 Präparation und enzymatische Isolation der Mäuse-Kardiomyozyten
Die Maus wurde durch cervikale Dislokation getötet und das Herz entnommen. Das Herz wurde in eine mit 38°C warmer Lösung A gefüllte Glasschale gegeben und eine Kanüle vorsichtig in die Aorta geschoben. Mittels eines Bindfadens wurde die Aorta an der Kanüle befestigt, so dass das Herz über eine auf die Kanüle gesetzte Spritze mit warmer Lösung A durchspült wurde, bis die Coronargefäße blutleer waren. Anschließend wurde das Herz mit der Kanüle an einer Langendorff-Säule fixiert und für 5-6 Minuten mit 38°C warmer Lösung B bei fortwährender Sauerstoffbegasung durchspült. Sobald das Herz prall und homogen hellrosafarben aussah, wurde die Lösung B abgelassen und die Säule mit Lösung C (38°C) befüllt. Das Herz wurde so lange bei fortdauernder Sauerstoffbegasung in der Apparatur belassen, bis es homogen glasig und von weicher Konsistenz (Fingerprobe) war. Dann wurde es abgenommen, die Kanüle entfernt und die Vorhöfe abgetrennt. Das restliche Herz wurde in 38°C warmer Lösung D in 1-2mm³ kleine Stückchen geschnitten. Anschließend wurden die
Myozyten in ein Kunststoff-Röhrchen gegeben und durch vorsichtiges, wiederholtes Ansaugen und Ablassen der Gewebestückchen durch eine umgedrehte 5ml-Pipette aus ihrem Zellverband gelöst. Nach fünfzehn Minuten Wartezeit hatten sich die Zellen abgesetzt. Der Überstand wurde bis auf einen Rest von 5ml abgesaugt und das Kunststoff-Röhrchen mit Lösung E (38°C) gefüllt. Nach weiteren fünfzehn Minuten wurde der Überstand erneut abgesaugt und Lösung F (38°C) in das Gefäß gegeben, bis das Gesamtvolumen 20ml betrug.
Es wurden 20µl einer 0,01M BAPTA-AM-Lösung hinzugefügt, welche dreißig Minuten einwirken mußte, bevor mit den Messungen begonnen werden konnte. Die isolierten Zellen konnten bei Zimmertemperaturlagerung (20-23°C) für acht bis zehn Stunden für Messungen verwendet werden.
3.4.2 Herstellung der Pipetten
Aus Borosilikat Glaskapillaren wurden mittels eines Pipettenziehgerätes zuerst die Pipettenrohlinge gezogen. Die Spitzen der Pipettenrohlinge wurden unter Lupenvergrößerung mit einem Silikonelastomer (Sylgard 184, Firma Dow Corning) beschichtet und über einem Heizdraht ausgehärtet. Die beschichteten Pipettenspitzen wurden abschließend durch die Pipettenschmiede (Microforge) poliert, so dass der Eigenwiderstand der Pipetten nach Befüllung mit der Pipettenlösung zwischen 5-7MΩ betrug.
3.4.3 Apparativer Aufbau der Patch-Clamp-Anlage
Die Meßkammer (Petrischälchen mit Pipette und Badelektrode) war zusammen mit dem Mikroskop, dem Vorverstärker und dem Mikromanipulator auf einem schwingungs- gedämpften Metalltisch untergebracht. Der Metalltisch war zur Abschirmung elektro- magnetischer Störsignale von einem geerdeten Faradayschen Käfig umgeben. Die Meßapparatur war über eine Verbindung mit dem Metalltisch und dem Faradayschen Käfig mitgeerdet. Das Petrischälchen war in den Plantisch eingelassen, welcher mit dem Mikroskop in Verbindung stand und über einen Feintrieb beliebig verstellt werden konnte. Die Pipetten, die blasenfrei mit Pipettenlösung gefüllt waren, wurden über eine Silberchloridelektrode gezogen und in den Pipettenhalter fixiert. Der Pipettenhalter konnte über einen hydraulischen
Mikromanipulator unter Sichtkontrolle bewegt werden. Die Silberchloridelektrode stand über den Pulsgeber des Vorverstärkers mit dem Analog-/Digitalwandler in Verbindung. Die Badelektrode, welche in einem mit kaliumreichen Puffer gefüllten Petrischälchen lag, war mit dem Vorverstärker verbunden und führte über den Verstärker zu dem Analog-/Digitalwandler und schließlich zum Computer. Dieser, der Verstärker und der Analog-/Digitalwandler standen außerhalb des kleinen Faradayschen Käfigs auf einem Schreibtisch. Der gesamte Arbeitsplatz war zusätzlich von einem weiteren geerdeten Faradayschen Käfig umgeben.
3.4.4 Messung von Membranströmen
Bei der hier angewendeten Cell-attached-Konfiguration wurde zunächst die Glaspipette auf die Zellmembran aufgesetzt. Durch leichtes Ansaugen wurde ein Unterdruck ausgeübt, so dass die Zellmembran sehr fest an der Glaswand der Pipette anlag und somit ein kleiner Abschnitt der Zellmembran (Patch) elektrisch von seiner Umgebung isoliert war. Die Zellmembran blieb bei dieser Methode intakt und es kam zu keiner Beeinflussung der intrazellulären Ionenkonzentrationen und der second messenger-Systeme. Der Extra- zellularraum des Zellmembranabschnittes, welcher sich unter der Pipette befand, wurde von der Pipettenlösung bestimmt und das extrazelluläre Potential an diesem Membranabschnitt
Abb. 5: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus.
durch den Verstärker vorgegeben. Die Kommandospannung wurde über den Verstärker eingestellt. Die Differenz zwischen dem Membranpotential und dem Kommandopotential wurde im Verstärker über einen Rückkopplungsmechanismus bestimmt. An dem Rückkopplungswiderstand herrschte eine Spannung, die proportional zum fließenden Strom war, und welche die Differenz zwischen Membran- und Kommandopotential ausglich. Befand sich ein aktiver Kanal unter der Pipettenspitze, kam es an dem Abschnitt zu einer Veränderung des Membranpotentials. Dabei dienten die Bariumionen der Pipettenlösung als Ladungsträger. Die Änderung wurde über den Analog-/Digitalwandler als Stromstärke auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht. Pro Versuch wurden 250µl des Zellisolats in das Kulturschälchen gegeben. Nach zehnminütiger Sedimentation der Zellen wurden über ein Zuflußsystem ca. 10ml kaliumreiche Badlösung in das Organbad gegeben (2ml/min) und über eine Absaugvorrichtung abgesaugt, bis sich ein Rest von ca.1,5ml in dem Kulturschälchen befand. Eine mit Pipettenlösung blasenfrei gefüllte Pipette wurde in den Pipettenhalter gelegt.
Über den Mikromanipulator wurde die Pipette unter mikroskopischer Kontrolle an eine Zelle herangefahren. Die Grundeinstellungen der Geräte und das Pulsprotokoll beruhten auf Erfahrungswerten der Arbeitsgruppe Dres. Schröder/Klein. Der Widerstand der Pipette (5- 7MΩ) im Meßkreis wurde durch ein kontinuierliches, 5ms dauerndes und 5mV starkes Rechtecksignal über den Computer-bildschirm kontrolliert. Sobald die Pipette auf die Zellmembran aufsetzte, wurde über ein Schlauchsystem, das an den Pipettenhalter angeschlossen war, ein Unterdruck in der Pipette erzeugt. Der Widerstand zwischen der Pipette und der Badelektrode lag jetzt bei 20-70GΩ (Bildung eines sogenannten Giga-Seals).
Zur Aktivierung des L-Typ-Calciumkanals wurden repetitive, 150ms dauernde Spannungsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz vorgegeben. Das Haltepotential lag bei –100mV und das Testpotential betrug +20mV. Beim Öffnen eines L-Typ-Calciumkanals änderte sich die Höhe der Stromamplitude auf ca. –0,6 bis -0,7pA. Es wurden 60 Depolarisationsimpulse bei gleichbleibender Pulsvorgabe in einer Datei (≅File) gespeichert und ausgewertet.
Abb. 6: Cell-attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik.
Kardiomyozyt kaliumreiche Badlösung
70mM
Ba2+ -100mV
+20mV
L-Typ-Calciumkanal
3.5 Auswertung
3.5.1 Erstellen der Ereignislisten
Die Auswertung der gemessenen Calcium-Kanalströme erfolgte über das Programm Fetchan der Version PClamp 6.0.3. Ein Versuch setzte sich aus mindestens 180 Depolarisationsimpulsen unter Kontrollbedingungen (Basalaktivität des Kanals; keine Substanzzugabe) und mindestens 180 Depolaristionsimpulsen nach Substanzzugabe zusammen. Jeweils 60 Depolarisationsimpulse wurden in einem File (s.o.) gespeichert. Die inaktiven Depolarisationsimpulse eines Files wurden gemittelt und die daraus resultierende Kurve von den Gesamtdepolarisationsimpulsen des Files digital subtrahiert. Anschließend wurde eine Basislinie (stellt den Kanal im geschlossenen Zustand dar) und eine Einheitsamplitude (Gerade, die durch die mittleren Amplituden der Kanalöffnungen geht) festgelegt. Registrierungen, die entweder auf halber Höhe zwischen Basislinie und Einheitsamplitude, oder darüber lagen, wurden als Kanalöffnungen gewertet. Die Auswertung eines Files gab die zeitlichen Veränderungen des Kanalschaltverhaltens im Laufe des Versuches wieder und war somit eine Ereignisliste.
3.5.2 Auswertung der Ereignislisten
Aus den Ereignislisten konnten Parameter abgeleitet werden, die für die Beurteilung des Kanalschaltverhaltens notwendig waren. Folgende Parameter wurden berücksichtigt:
- Verfügbarkeit
- Offenwahrscheinlichkeit - Spitzenstrom
- Inaktivierung - mittlere Offenzeit - mittlere Geschlossenzeit - Stromamplitude
- Latenzphase
