Das Pertussistoxin ist ein hochpotentes Toxin, das von dem Bakterium Bordetella pertussis gebildet wird. Das Toxin hemmt Pertussistoxin-sensitive Gi-Proteine. Die Gi-Proteine sind an den muscarinergen m2-Acetylcholinrezeptor gekoppelt und inhibieren die Adenylatcyclase.
Durch die Präinkubation der Zellen mit Pertussistoxin wird eine muscarinerg-vermittelte Hemmung (Carbachol) des L-Typ-Calciumkanals über Gi-Proteine unterbunden. Diese Versuchsreihe soll Aufschluß geben, ob über den m2-Acetylcholinrezeptor ein NO-Synthase/cGMP/Proteinkinase G-Typ I-Signalweg aktiviert wird, welcher die β-adrenerg-gesteigerte L-Typ-Calciumkanalaktivität reduziert (Abb. 25).
Für diese Versuchsreihe wurden die isolierten Kardiomyozyten mit Pertussistoxin (Sigma) drei Stunden lang bei Zimmertemperatur (22°C) präinkubiert [0,2µg Toxin/1ml Zellisolat].
Die eingesetzte Konzentration von Pertussistoxin wurde anhand von eigens durchgeführten Vorversuchen ermittelt. Höhere Konzentrationen führten zu einem vorzeitigem Zelltod. Es wurden zuerst Depolarisationsimpulse unter Kontrollbedingungen, dann nach Gabe von Isoproterenol (Endkonzentration 10-6M) und nach Gabe von Carbachol (Endkonzentration 10-6M) aufgezeichnet. Die Versuchergebnisse sind in der Tabelle 8 abgebildet. In den Versuchen (n=8) mit Kardiomyozyten aus Zellisolaten von sieben nicht-transgenen Tieren führte Isoproterenol zu einer signifikanten Steigerung der Offenwahrscheinlichkeit um
Abb. 25: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion über den m2 -Acetylcholin-rezeptor, nachdem der Weg über das Gi-Protein durch das Pertussistoxin gehemmt wird.
Grau unterlegtes Feld: mögliche Reduktion des Isoproterenol [10-6M]-gesteigerten L-Typ-Calciumstromes durch Aktivierung eines NO-Synthase/cGMP/PKG-I-Signalweges nach Gabe von Carbachol [10-6M].
β1-AR L-CC
-68,15±21,86%, der Verfügbarkeit um 74,84±26,3% und des Spitzenstromes um 133,7±21,8%.
Unter Carbachol blieben die Offenwahrscheinlichkeit (79,69±28,29%)∗, die Verfügbarkeit (71,6±29,8%)* und der Spitzenstrom (128,3±21,1%)* im Vergleich zu Isoproterenol nahezu unverändert. In den Versuchen (n=8) mit Kardiomyozyten aus Zellisolaten von acht transgenen Tieren steigerte Isoproterenol signifikant die Offenwahrscheinlichkeit um 61,13±13,6%, die Verfügbarkeit um 94,17±37,1% und den Spitzenstrom um 128,5±19,8%.
Die Zugabe von Carbachol hatte keinen wesentlichen Einfluß auf die Offenwahrscheinlichkeit (52,8 ±11,7%)*, die Verfügbarkeit (78,3±28,0%)* und den Spitzenstrom (126,3±26,2%)*. Der Vergleich des Isoproterenoleffektes zwischen nicht-transgener und transgener Versuchsgruppe war für die entsprechenden Parameter im ungepaarten t-Test nicht-signifikant (p>0,05). Der direkte Vergleich beider Gruppen bezüglich des Carbachol-vermittelten Effektes ergab ebenfalls keinen signifikanten Unterschied.
Die Abbildungen 26 und 27 zeigen Einzelkanalregistrierungen aus dieser Versuchsreihe von beiden Versuchsgruppen und geben die Veränderung der L-Typ-Calciumkanalaktivität nach Substanzzugabe grafisch wieder.
∗ bezogen auf die Kontrolle
Versuche nicht-transgen, n=8 Versuche transgen, n=8 Kontrolle nach
Isoproterenol
nach
Carbachol p1* p2* p3* Kontrolle nach
Isoproterenol
nach
Carbachol p1* p2* p3*
Offenwahr-scheinlichkeit (%) 7,75±2,69 11,18±2,68 12,02±2,85 <0,05 <0,05 >0,05 10,19±3,72 16,17±6,05 14,16±4,84 <0,05 <0,05 >0,05 Verfügbarkeit (%) 45,34±6,83 68,5±6,95 65,94±6,4 <0,001 <0,001 >0,05 42,89±8,63 66,03±5,5 63,96±5,7 <0,001 <0,001 >0,05 Spitzenstrom (fA) 30,83±8,75 69,63±15,9 68,46±16,01 <0,001 <0,001 >0,05 49,61±20,46 100,5±39,84 91,15±33,7 <0,01 <0,05 >0,05 Inaktivierung (%) 69,04±6,2 72,7±3,9 68,7±5,6 >0,05 >0,05 >0,05 64,96±5,42 60,05±7,11 70,77±4,5 >0,05 >0,05 >0,05
Stromamplitude
(-pA) 0,72±0,02 0,73±0,02 0,72±0,02 >0,05 >0,05 >0,05 0,71±0,02 0,71±0,02 0,72±0,02 >0,05 >0,05 >0,05 Latenzphase (ms) 27,54±3,01 22,98±4,71 19,21±1,7 >0,05 >0,05 >0,05 31,76±6,81 24,24±5,64 24,19±4,5 <0,05 <0,05 >0,05 mittlere Offenzeit
(ms) 0,43±0,08 0,43±0,05 0,44±0,06 >0,05 >0,05 >0,05 0,47±0,05 0,51±0,08 0,47±0,06 >0,05 >0,05 >0,05 mittlere
Geschlossenzeit (ms)
4,79±0,96 3,22±0,7 3,53±1,0 <0,05 >0,05 >0,05 3,13±0,7 2,93±0,6 2,78±0,6 >0,05 >0,05 >0,05 Änderung
Offenwahr-scheinlichkeit (%)*
⎯ 68,15±21,86 79,69±28,29 <0,05 <0,01 >0,05 ⎯ 61,13±13,6 52,8±11,7 <0,001 <0,01 >0,05 Änderung
Verfügbarkeit (%)* ⎯ 74,84±26,3 71,6±29,8 <0,05 <0,05 >0,05 ⎯ 94,17±37,1 78,3±28,0 <0,05 <0,05 >0,05 Änderung
Spitzenstrom (%)* ⎯ 133,7±21,8 128,3±21,1 <0,001 <0,001 >0,05 ⎯ 128,5±19,8 126,3±26,2 <0,001 <0,001 >0,05
* = angegeben ist die prozentuale Zunahme von Isoproterenol und Carbachol zur Kontrolle p1* = angegeben ist der p-Wert Isoproterenol versus Kontrolle, ein p-Wert <0,05 ist signifikant p2* = angegeben ist der p-Wert Carbachol versus Kontrolle, ein p-Wert <0,05 ist signifikant p3* = angegeben ist der p-Wert Carbachol versus Isoproterenol, ein p-Wert <0,05 ist signifikant
69
20ms
20fA1pA
Abb. 26: Pertussistoxin [0,2µg Toxin/1ml Zellisolat]-präinkubierte Kardiomyozyten: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht-transgenen Versuchsgruppe. Oberhalb der Grafiken: Spannungsprotokoll: bei einem Haltepotential von –100mV und Testpotential von +20mV wurden repetitive, 150ms dauernde Depolarisationsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz gegeben. Linke Grafik: Kontrollbedingungen. Mittlere Grafik: nach Isoproterenol [10-6M]. Rechte Grafik: nach Isoproterenol [10-6M] und Carbachol [10-6M]. Maßeinheiten: 0,5cm vertikal: 1 Picoampere (pA) Stromamplitudenhöhe; 1cm vertikal: 38 Femtoampere (fA) Summenstromgröße; 1cm horizontal: 20 Millisekunden (ms) Depolarisationsimpulsdauer.
70
Abb. 27: Pertussistoxin [0,2µg Toxin/1ml Zellisolat]-präinkubierte Kardiomyozyten: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe.
Oberhalb der Grafiken: Spannungsprotokoll: bei einem Haltepotential von –100mV und Testpotential von +20mV wurden repetitive, 150ms dauernde
Depolarisationsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz gegeben. Linke Grafik: Kontrollbedingungen. Mittlere Grafik: nach Isoproterenol [10-6M]. Rechte Grafik: nach Isoproterenol [10-6M] und Carbachol [10-6M]. Maßeinheiten: 0,5cm vertikal: 1 Picoampere (pA) Stromamplitudenhöhe; 1cm vertikal: 38 Femtoampere (fA)
Summenstromgröße; 1cm horizontal: 20 Millisekunden (ms) Depolarisationsimpulsdauer.
1pA38fA
20ms
71
5 Diskussion
Der Calciumeinstrom durch den L-Typ-Calciumkanal ist für die Aktivierung von Ca2+ -abhängigen Signaltransduktionen und die Kopplung von Exzitation und Kontraktion im Kardiomyozyten von ausschlaggebender Bedeutung. Dieser Kanal wird durch unterschiedliche Botenstoffe und Signalkaskaden reguliert.
Die vorliegende Arbeit fokussierte in einem Mausmodell mit kardialer Überexpression der Proteinkinase G-Typ I auf eine mögliche Beteiligung dieser Proteinkinase an der Stickstoffmonoxid- und muscarinerg-vermittelten Reduktion der β-adrenerg-gesteigerten L-Typ-Calciumkanalaktivität. Die Messungen des Calciumstromes erfolgten mittels der Patch-Clamp-Technik.
Die Patch-Clamp-Technik ist eine etablierte Methode, um Ionenströme von Zellen zu messen und das Schaltverhalten von Kanälen zu untersuchen. Je nach Schwerpunkt der Untersuchung wird eine geeignete Patch-Konfiguration gewählt. Die in dieser Arbeit angewendete Cell-attached-Konfiguration eignet sich besonders, um das Einzelkanalschaltverhalten, in diesem Fall das des L-Typ-Calciumkanals, im Vergleich nicht-transgene Maus versus transgene Maus zu erforschen. Bei der Cell-attached-Konfiguration bleibt die Membran unter der Pipette intakt. Die Proteine befinden sich intrazellulär in ihrer natürlichen Umgebung und sowohl die second messenger-Systeme, als auch die intrazelluläre Ionenkonzentration bleiben unbeeinflußt. Das extrazelluläre Milieu wird durch die kaliumreiche Pufferlösung bestimmt und bewirkt durch eine Angleichung der K+-Konzentration extrazellulär zu intrazellulär eine Inaktivierung von Kalium-Kanälen. Lediglich unterhalb der Pipette wird das extrazelluläre Potential vom Verstärker vorgegeben. So können definierte Messverhältnisse geschaffen und unerwünschte Störfaktoren, die die Untersuchungen beeinflussen, auf ein Minimum reduziert werden. Diese Versuchsbedingungen ermöglichen eine differenzierte Betrachtung der Kanal-aktivitätsunterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen unter vorgegebenen Bedingungen. Im Gegensatz dazu erfaßt die ruptured-patch Whole-cell-Konfiguration die gesamte Membran einer Zelle. Dabei wird die Membran unter der Pipette durchbrochen und die Pipettenlösung ist direkt mit dem Zellinneren verbunden. Das Cytoplasma verliert seine natürliche Zusammensetzung und die second messenger-Systeme werden beeinflußt. Die Whole-cell-Messung ist eine Mittelung vieler simultan aktiver Ionenkanäle ohne genauere Betrachtung von Einzelkanälen. Durch das höhere Rauschen (verursacht durch die unzähligen Kanäle) sind Einzelkanalanalysen lediglich unter günstigsten Bedingungen möglich.
Um den Mechanismus des Proteinkinase G-Typ I Signalweges im Kardiomyozyten zu erforschen, wurde in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. Kai C. Wollert ein Mausmodell mit kardialer Überexpression der Proteinkinase G-Typ I generiert. Durch die Kopplung der cDNA der humanen PKG-I (TAMURA et al., 1996) an den αMHC-Promotor (GULICK et al., 1991) der Maus konnte eine selektive Überexpression der PKG-I im Myokard erzeugt werden. Es wurden drei voneinander unabhängige Stämme etabliert [(B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)1Zhg), (B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)2Zhg), (B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)3Zhg)], die mit nicht-transgenen C57BL/6 Weibchen fortgesetzt rückgekreuzt wurden. In den Rückkreuzungen teilten sich die geborenen Jungtiere, entsprechend der Mendelschen Gesetzmäßigkeit, erwartungsgemäß im Verhältnis 1:1 in transgene und transgene Tiere auf. Für die einzelnen Versuchsreihen wurden adulte, weibliche nicht-transgene (+/+) Mäuse und deren nicht-transgene (Tg/+) Geschwistertiere verwendet, so dass die Versuchsergebnisse unter dem Aspekt „Effekt der endogenen PKG-I im Vergleich zum Effekt der endogenen plus der überexprimierten PKG-I“ betrachtet werden konnten. Obgleich ein segregierender genetischer Hintergrund vorlag, konnte kein Hinweis auf eine Beeinflussung der Funktion der PKG-I durch modifizierende Gene gefunden werden. Dieser Sachverhalt wird durch den statistischen Vergleich der Basalwerte aller Versuche belegt (s. Anhang). Der genetische Nachweis der Tiere erfolgte durch PCR. Aus Proben der isolierten Kardiomyozyten erfolgte eine Quantifizierung des PKG-I-Proteins mittels eines anti-human-PKG-I-Antikörpers (MARKERT et al., 1995) durch die Western-Blot-Methode. Die Expression der Proteinkinase G-Typ I war in den transgenen Tieren ca. 20fach stärker als in den nicht-transgenen Tieren.
In einer Studie mit Prkg1tm1Hfm–Knockout Mäusen (sogenannte „null mutants“) wurde eine 50%ige Sterberate innerhalb der ersten fünf bis sechs Lebenswochen beobachtet (PFEIFER et al., 1998), so dass Untersuchungen an adulten Tieren nahezu unmöglich waren.
In einem anderen Mausmodell konnte durch ein selektives, myokardspezifisches Ausschalten der PKG-I (Prkg1tm1Naw, Prkg1tm2.1Naw, Prkg1tm2Naw) die Lebenserwartung bis ins Adultenalter verlängert werden (WEGENER et al., 2002). FEIL et al. (2003) konnten beobachten, dass in den Knockout-Mäusen durch den Gendefekt kompensatorische Mechanismen aktiviert werden. Dies war ein weiterer Aspekt, warum für die vorliegende Arbeit ein Mausmodell mit kardialer Überexpression der Proteinkinase G-Typ I anstelle einer PKG-I-Knockout-Maus gewählt wurde.
Die gemessenen Kanäle konnten anhand der vorgegebenen Versuchsbedingungen und der Berechnung der Leitfähigkeit als L-Typ-Calciumkanal identifiziert werden. Der Einwärtsstrom positiver Ionen in die Zelle wurde in der Cell-attached-Konfiguration auf dem Bildschirm als nach unten weisender Strom dargestellt. So konnte während der Messaufnahme eindeutig zwischen einem Einwärtsstrom und einem Auswärtsstrom (nach oben weisender Strom) differenziert werden. Durch die Verwendung von Bariumionen als divalente Ladungsträger in der Pipettenlösung konnte ein Strom durch Natrium- oder Kaliumkanäle ausgeschlossen werden, da diese Kanäle nur für monovalente Ladungsträger durchgängig sind. Durch Inkubation der Zellen mit BAPTA-AM (ein Calciumchelatbildner) wurden extrazellulär und intrazellulär freie Calciumionen gebunden, so dass die Messungen nicht durch andere aktive Calciumkanäle auf der übrigen Zellmembran beeinflußt wurden.
Ein entscheidendes Kriterium zur Unterscheidung des L-Typ-Calciumkanals von dem T-Typ-Calciumkanal war die Bestimmung der Leitfähigkeit. Die Berechnung ergab bei den nicht-transgenen Tieren eine mittlere Leitfähigkeit von 20,73±0,32pS und bei den nicht-transgenen Tieren von 19,65±1,29pS. Der Unterschied der Leitfähigkeit zwischen den beiden Gruppen war nicht signifikant. McDONALD et al. (1994) gaben die Leitfähigkeit des L-Typ-Calciumkanals bei einem 100mM Bariumionen-Ladungsträger mit 25pS und die des T-Typ-Calciumkanals mit ∼8pS an, während KLEIN et al. (2000) bei einem 70mM Bariumionen-Ladungsträger die Leitfähigkeit des L-Typ-Calciumkanals mit 17,3±3,1pS beschrieben. Die Angaben von KLEIN et al. (2000) zeigen eine gute Übereinstimmung mit den in dieser Arbeit errechneten Leitfähigkeiten. Eine mögliche Erklärung für die Differenz zwischen den ermittelten Leitfähigkeiten und der Literaturangabe von McDONALD et al. (1994) ist die unterschiedliche Konzentration des Ladungsträgers in der Pipettenlösung (in dieser Untersuchung 70mM Barium zu 100mM Barium in der Literaturangabe). Anhand der errechneten Leitfähigkeiten konnte eine Interferenz von T-Typ-Calciumkanälen im gemessenen Membranareal ausgeschlossen werden.
Bei der angewendeten Einzelkanalmessung der Patch-clamp-Technik handelt es sich um eine zeitaufwendige Methode, da nur ein geringer Anteil der Kanäle über den erforderlichen Zeitraum registrierbar ist, um einen Substanzeffekt zu testen. Vor diesem Hintergrund wurde auf das Erstellen von Dosis-Wirkungs-Kurven in der Einzelkanalbetrachtung abgesehen. Es wurden für die eingesetzten Substanzen daher Konzentrationen gewählt, die bereits von anderen Arbeitsgruppen in Untersuchungen des L-Typ-Calciumkanals (s. Literaturangaben Kap. 4.3, 4.4, 4.5, 4.7) als sicher wirksam eingestuft werden konnten.
Der Botenstoff Stickstoffmonoxid ist an unterschiedlichen Regulationsmechanismen im kardiovaskulären System beteiligt. Der Einfluß und der Regulationsmechanismus von Stickstoffmonoxid am β-adrenergen und muscarinergen Signalweg wird kontrovers diskutiert.
Neben einer NO/GC/cGMP-induzierten Aktivierung der Phosphodiesterase-2 (HAN et al., 1996, GALLO et al., 2001; DITTRICH et al., 2001) wird eine NO/GC/cGMP-vermittelte Stimulation der Proteinkinase G-Typ I (WAHLER u. DOLLINGER, 1995; ABI-GERGES et al., 2001) als Regulationsmechanismus des L-Typ-Calciumkanals in Betracht gezogen. Um eine mögliche Beteiligung der Proteinkinase G-Typ I an der NO/GC/cGMP-vermittelten Regulation des L-Typ-Calciumkanals zu untersuchen, wurde den Kardiomyozyten in den entsprechenden Experimenten der Stickstoffmonoxid-Donator DEA/NO appliziert. Bei alleiniger Gabe von DEA/NO (s. Kap. 4.3, S. 42) kam es in der nicht-transgenen Versuchsgruppe zu einer geringen Reduktion der wesentlichen Kanalaktivitätsparameter Offenwahrscheinlichkeit, Verfügbarkeit und Spitzenstrom. In der transgenen Gruppe führte die Gabe von DEA/NO zu einem signifikanten Abfall der Kanalaktivität (s. Tab. 3, S. 44).
Der nicht-signifikante Effekt in der nicht-transgenen Gruppe läßt sich durch eine Aktivierung der, in nur sehr geringer Konzentration vorliegenden, endogenen Proteinkinase G-Typ I erklären. Der Effekt von DEA/NO fiel in der transgenen Gruppe aufgrund der Überexpression der Proteinkinase G-Typ I dementsprechend stärker aus. Dieses ist als deutlicher Hinweis darauf zu werten, dass die Proteinkinase G-Typ I an der NO-vermitttelten Regulation des L-Typ-Calciumkanals beteiligt ist. In einer weiteren Versuchsreihe wurde der Effekt von DEA/NO auf den β-adrenerg stimulierten L-Typ-Calciumkanal untersucht. Der β1-/β2 -Adrenoceptoragonist Isoproterenol bewirkt über stimulierende Gs-Proteine eine Aktivierung der Adenylatcyclase. Diese bildet aus ATP cyclisches AMP, welches die Proteinkinase A stimuliert und eine Phosphorylierung des L-Typ-Calciumkanals zur Folge hat (HARTZELL, 1988). In der entsprechenden Versuchsreihe (s. Kap. 4.4, S. 47) wurden die Kardiomyozyten dazu mit Isoproterenol vorstimuliert. Die Stimulation der Kardiomyozyten duch Isoproterenol führte zu einer gesteigerten Kanalaktivität, welche sich in einer Erhöhung der Offenwahrscheinlichkeit, der Verfügbarkeit, einem daraus resultierend gesteigerten Spitzenstrom und einer Verkürzung der Geschlossenzeit äußerte. Die Aktivitätsänderung fiel dabei in beiden Versuchsgruppen (nicht-transgen/transgen) gleich aus. Daraus läßt sich schließen, dass die nicht-stimulierte Proteinkinase G-Typ I keinen Einfluß auf den β-adrenergen Signalweg hat.
Eine Reihe von Studien konnte die Steigerung der Verfügbarkeit und der Offenwahrscheinlichkeit und die Veränderung der Offen- und Geschlossenzeit als
Mechanismen Isoproterenol-induzierter L-Typ-Calciumkanalaktivierung belegen (TSIEN et al., 1986; MC DONALD et al., 1994). Die Erkenntnisse waren in Kardiomyozyten der Spezies Frosch (HARTZELL et al., 1991; DITTRICH et al., 2001), Ratte (HARTZELL et al., 1991), Maus (KLEIN et al., 2000) und Meerschwein (HARTZELL et al., 1991; HIRANO et al., 1994; WAHLER und DOLLINGER, 1995) reproduzierbar.
Im Rahmen der eigenen Untersuchungen konnte eine Reduktion des Isoproterenol-induzierten Effektes durch die Gabe von DEA/NO beobachtet werden (s. Kap. 4.4, S. 47). In der nicht-transgenen Gruppe sanken die Offenwahrscheinlichkeit, die Verfügbarkeit und der Spitzenstrom annähernd auf das Kontrollniveau herab (s. Tab. 4, S. 49), was sich durch eine NO-vermittelte Aktivierung der endogenen Proteinkinase G-Typ I erklären läßt. Bei den transgenen Tieren führte DEA/NO zu einem signifikanten Abfall der Kanalaktivität unter das Kontrollniveau. In dieser Gruppe fiel der Effekt aufgrund der höheren Konzentration an Proteinkinase G-Typ I erwartungsgemäß stärker aus. Der direkte Vergleich beider Gruppen bezüglich der DEA/NO-induzierten Hemmung der Calciumkanalaktivität ergab einen signifikanten Unterschied. Aus den Ergebnissen läßt sich ableiten, dass der NO/GC/cGMP/Proteinkinase G-Typ I-Signalweg an der Hemmung des durch Isoproterenol gesteigerten Calciumeinstromes beteiligt ist. Die Reduktion der L-Typ-Calciumkanalaktivität durch DEA/NO war bei β-adrenerg-prästimulierten Kardiomyozyten stärker ausgeprägt als bei Kardiomyozyten, die nicht prästimuliert wurden. Das deutet darauf hin, dass der NO/GC/cGMP/Proteinkinase G-Typ I-Signalweg bei einer gesteigerten Sympathikusaktivierung von Bedeutung für die Regulation des L-Typ-Calciumkanals ist. In einer Arbeit von WAHLER und DOLLINGER (1995) konnte in Kardiomyozyten von adulten Meerschweinen die NO/cGMP/PKG-I-vermittelte Reduktion des Calciumstromes bereits nachgewiesen werden. Sie beobachteten nach Gabe des NO-Donators SIN-1 ebenfalls eine deutliche Inhibition des cAMP-stimulierten Calciumstromes. Die anti-adrenerge Wirkung von NO auf die Calciumkanalaktivität und die Vermittlung dieses Effektes durch die Proteinkinase G-Typ I konnten in einer weiteren Studie an ventrikulären Kardiomyozyten von adulten Ratten reproduziert werden (ABI-GERGES et al., 2001). Neben der Regulation des L-Typ-Calciumkanals durch NO und der Proteinkinase G-Typ I konnten WEGENER et al.
(2002) eine NO/cGMP/PKG-I-vermittelte Regulation der Kontraktionskraft in Kardiomyozyten von Prkg1tm1Naw- und Prkg1tm2Naw-Knockout-Mäusen zeigen. Der Proteinkinase G-Typ I-mediierte negativ-inotrope Effekt von NO wurde dabei sowohl in juvenilen, als auch in adulten Mäusen beobachtet. Daraus läßt sich schließen, dass der Proteinkinase G-Typ I-Signalweg in Kardiomyozyten altersunabhängig ausgebildet ist. Im
Gegensatz dazu beobachteten MERY et al. (1993) und DITTRICH et al. (2001) in Kardiomyozyten von Fröschen sowohl einen aktivierenden als auch einen inhibierenden Effekt von NO auf den L-Typ-Calciumstrom. Sie erklärten dieses mit einer konzentrationsabhängigen Inhibition der cGMP-inhibierten cAMP-Phosphodiesterase und einer Aktivierung der cGMP-stimulierten cAMP-Phosphodiesterase. Ebenso vermuteten GALLO et al. (2001) in ventrikulären Kardiomyozyten von Meerschweinen eine tonische, cGMP/Phosphodiesterase-2-induzierte Inhibition des Calciumstromes als Mechanismus NO-vermittelter Regulation. Die unterschiedlichen Ergebnisse lassen sich möglicherweise durch Speziesunterschiede (Säugetier versus Amphibie) und verwendeter Mess-Konfiguration (Cell-attached versus Whole-cell) erklären.
Der Mechanismus der muscarinerg-vermittelten Hemmung des L-Typ-Calciumkanals war in den letzten Jahren Gegenstand vieler Untersuchungen. Die von den einzelnen Arbeitsgruppen gewonnenen Erkenntnisse variieren. Es wird -neben einer Gi-Protein-vermittelten Hemmung der Adenylatcyclase- eine Aktivierung der Phosphatase-2A, eine Beteiligung des NO/cGMP/PDE-2- (HAN et al., 1996) und eine Beteiligung des NO/cGMP/PKSignalweges (HAN et al., 1998) diskutiert. Um einen möglichen Einfluß der Proteinkinase G-Typ I auf die muscarinerge Regulation des L-G-Typ-Calciumkanals zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit den Kardiomyozyten in unterschiedlichen Versuchsbedingungen Carbachol zugegeben. Die Versuchsergebnisse aus Tabelle 5 (S. 54) zeigen, dass in beiden Versuchsgruppen die Basalaktivität des Kanals nach alleiniger Gabe von Carbachol (s. Kap. 4.5, S. 52) nicht verändert wurde. Daraus läßt sich ableiten, dass die Aktivierung des muscarinergen Rezeptors keinen direkt negativ-inotropen Effekt hat und weder die endogene Proteinkinase G-Typ I, noch die überexprimierte PKG-I durch das Parasympathomimetikum aktiviert werden. HESCHELER et al. (1986) konnten in Kardiomyozyten von Meerschweinen ebenfalls keinen basalen Effekt von Carbachol nachweisen. In einer weiteren eigenen Versuchsreihe wurde zunächst mit Isoproterenol vorstimuliert und dann Carbachol dazugegeben (s. Kap. 4.6, S. 57). Unter Isoproterenol stieg der Calciumstrom an und die einzelnen Parameter unterschieden sich in der nicht-transgenen und transgenen Gruppe bis auf die prozentuale Änderung der Verfügbarkeit nicht-signifikant voneinander. Der erhebliche Unterschied beider Gruppen bezüglich der prozentualen Änderung der Verfügbarkeit geht wahrscheinlich auf eine falsch-positive Signifikanz zurück. Diese These wird durch die Tatsache gestützt, dass die übrigen, verglichenen Parametern keine signifikante Abweichung zeigten und deckt sich mit den Ergebnissen aus der Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Schröder
(Frau Nicole Schnasse, persönliche Mitteilung, 2003). Infolge der Carbacholgabe kam es in beiden Versuchsgruppen zu einem ähnlich starken Abfall der Offenwahrscheinlichkeit, der Verfügbarkeit und des Spitzenstromes (s. Tab. 6, S. 59). Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe geben keinen Hinweis auf eine Beteiligung der PKG-I an der muscarinerg-vermittelten Hemmung, da der Carbachol-induzierte Effekt in beiden Gruppen gleich stark ausfiel. Diese Tatsache deutet auf einen anderen Signalweg, nämlich eine muscarinerg-mediierte Hemmung der Adenylatcyclase, hin. Zur Überprüfung eines möglichen zusätzlich hemmenden Effektes des L-Typ-Calciumkanals durch Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels (und einer damit verbundenen Aktivierung der Proteinkinase G-Typ I) wurde in einer Versuchsreihe den Kardiomyozyten, nach vorheriger β-adrenerger Stimulation, Carbachol und gleichzeitig 8-Br-cGMP (ein 8-Br-cGMP-Analogon) appliziert (s. Kap. 4.7, S. 62). Die Gabe von Carbachol/8-Br-cGMP führte in der transgenen Gruppe zu einem signifikanten Rückgang der β-adrenerg-gesteigerten Offenwahrscheinlichkeit, Verfügbarkeit und des Spitzenstromes. Die Werte der Parameter sanken bei den transgenen Tieren dabei unter das Kontrollniveau, während sie bei den nicht-transgenen Tieren über dem Kontrollniveau blieben (s. Tab. 7, S. 64). Der Carbachol/8-Br-cGMP-induzierte Effekt in der transgenen Gruppe unterschied sich im Vergleich zu den in der nicht-transgenen Gruppe gemessenen Werten signifikant. Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass der zusätzlich hemmende Effekt in der transgenen Gruppe durch eine cGMP-vermittelte Aktivierung der Proteinkinase G-Typ I bedingt war.
Um zu testen, ob durch den m2-Acetylcholinrezeptor, neben der Aktivierung eines Gi -Proteins, ein NO-Synthase/NO/GC/cGMP/PKG-Signalweg aktiviert wird, wurden die Kardiomyozyten mit Pertussistoxin präinkubiert (s. Kap. 4.8, S. 67). Durch das Toxin wurden m2-Acetylcholinrezeptor-gekoppelte Gi-Proteine gehemmt. Die Präinkubation mit Pertussistoxin hatte keinen Einfluß auf die β-adrenerge Stimulation. Die Gabe von Isoproterenol führte zu einer ähnlichen Steigerung der Kanalaktivität wie in Kardiomyozyten, die nicht mit Pertussistoxin präinkubiert wurden. Das anschließende Zufügen von Carbachol in das Zellbad veränderte die Kanalaktivität in beiden Versuchsgruppen nicht (s. Tab. 8, S. 69). Aus den beobachteten Effekten läßt sich schließen, dass nach Hemmung der Gi-Proteine durch Pertussistoxin in beiden Versuchsgruppen die muscarinerge Signaltransduktion im Kardiomyozyt unterbunden war und es zu keiner Aktivierung eines zusätzlichen Signalweges kam.
Die Ergebnisse der jeweiligen Versuchsreihen (s. Kap.4.5-4.8) geben keinen Hinweis auf eine Beteiligung der Proteinkinase G-Typ I an der muscarinerg-vermittelten Regulation des L-Typ-Calciumkanals in Kardiomyozyten. Es kann ebenfalls kein Anhaltspunkt für eine
muscarinerg-induzierte Aktivierung einer NO-Synthase gefunden werden. Der muscarinerge
muscarinerg-induzierte Aktivierung einer NO-Synthase gefunden werden. Der muscarinerge