Die Tötung der Tiere zur Organentnahme wurde dem Tierschutzbeauftragten der Medizinischen Hochschule Hannover angezeigt.
3.4.1 Präparation und enzymatische Isolation der Mäuse-Kardiomyozyten
Die Maus wurde durch cervikale Dislokation getötet und das Herz entnommen. Das Herz wurde in eine mit 38°C warmer Lösung A gefüllte Glasschale gegeben und eine Kanüle vorsichtig in die Aorta geschoben. Mittels eines Bindfadens wurde die Aorta an der Kanüle befestigt, so dass das Herz über eine auf die Kanüle gesetzte Spritze mit warmer Lösung A durchspült wurde, bis die Coronargefäße blutleer waren. Anschließend wurde das Herz mit der Kanüle an einer Langendorff-Säule fixiert und für 5-6 Minuten mit 38°C warmer Lösung B bei fortwährender Sauerstoffbegasung durchspült. Sobald das Herz prall und homogen hellrosafarben aussah, wurde die Lösung B abgelassen und die Säule mit Lösung C (38°C) befüllt. Das Herz wurde so lange bei fortdauernder Sauerstoffbegasung in der Apparatur belassen, bis es homogen glasig und von weicher Konsistenz (Fingerprobe) war. Dann wurde es abgenommen, die Kanüle entfernt und die Vorhöfe abgetrennt. Das restliche Herz wurde in 38°C warmer Lösung D in 1-2mm³ kleine Stückchen geschnitten. Anschließend wurden die
Myozyten in ein Kunststoff-Röhrchen gegeben und durch vorsichtiges, wiederholtes Ansaugen und Ablassen der Gewebestückchen durch eine umgedrehte 5ml-Pipette aus ihrem Zellverband gelöst. Nach fünfzehn Minuten Wartezeit hatten sich die Zellen abgesetzt. Der Überstand wurde bis auf einen Rest von 5ml abgesaugt und das Kunststoff-Röhrchen mit Lösung E (38°C) gefüllt. Nach weiteren fünfzehn Minuten wurde der Überstand erneut abgesaugt und Lösung F (38°C) in das Gefäß gegeben, bis das Gesamtvolumen 20ml betrug.
Es wurden 20µl einer 0,01M BAPTA-AM-Lösung hinzugefügt, welche dreißig Minuten einwirken mußte, bevor mit den Messungen begonnen werden konnte. Die isolierten Zellen konnten bei Zimmertemperaturlagerung (20-23°C) für acht bis zehn Stunden für Messungen verwendet werden.
3.4.2 Herstellung der Pipetten
Aus Borosilikat Glaskapillaren wurden mittels eines Pipettenziehgerätes zuerst die Pipettenrohlinge gezogen. Die Spitzen der Pipettenrohlinge wurden unter Lupenvergrößerung mit einem Silikonelastomer (Sylgard 184, Firma Dow Corning) beschichtet und über einem Heizdraht ausgehärtet. Die beschichteten Pipettenspitzen wurden abschließend durch die Pipettenschmiede (Microforge) poliert, so dass der Eigenwiderstand der Pipetten nach Befüllung mit der Pipettenlösung zwischen 5-7MΩ betrug.
3.4.3 Apparativer Aufbau der Patch-Clamp-Anlage
Die Meßkammer (Petrischälchen mit Pipette und Badelektrode) war zusammen mit dem Mikroskop, dem Vorverstärker und dem Mikromanipulator auf einem schwingungs-gedämpften Metalltisch untergebracht. Der Metalltisch war zur Abschirmung elektro-magnetischer Störsignale von einem geerdeten Faradayschen Käfig umgeben. Die Meßapparatur war über eine Verbindung mit dem Metalltisch und dem Faradayschen Käfig mitgeerdet. Das Petrischälchen war in den Plantisch eingelassen, welcher mit dem Mikroskop in Verbindung stand und über einen Feintrieb beliebig verstellt werden konnte. Die Pipetten, die blasenfrei mit Pipettenlösung gefüllt waren, wurden über eine Silberchloridelektrode gezogen und in den Pipettenhalter fixiert. Der Pipettenhalter konnte über einen hydraulischen
Mikromanipulator unter Sichtkontrolle bewegt werden. Die Silberchloridelektrode stand über den Pulsgeber des Vorverstärkers mit dem Analog-/Digitalwandler in Verbindung. Die Badelektrode, welche in einem mit kaliumreichen Puffer gefüllten Petrischälchen lag, war mit dem Vorverstärker verbunden und führte über den Verstärker zu dem Analog-/Digitalwandler und schließlich zum Computer. Dieser, der Verstärker und der Analog-/Digitalwandler standen außerhalb des kleinen Faradayschen Käfigs auf einem Schreibtisch. Der gesamte Arbeitsplatz war zusätzlich von einem weiteren geerdeten Faradayschen Käfig umgeben.
3.4.4 Messung von Membranströmen
Bei der hier angewendeten Cell-attached-Konfiguration wurde zunächst die Glaspipette auf die Zellmembran aufgesetzt. Durch leichtes Ansaugen wurde ein Unterdruck ausgeübt, so dass die Zellmembran sehr fest an der Glaswand der Pipette anlag und somit ein kleiner Abschnitt der Zellmembran (Patch) elektrisch von seiner Umgebung isoliert war. Die Zellmembran blieb bei dieser Methode intakt und es kam zu keiner Beeinflussung der intrazellulären Ionenkonzentrationen und der second messenger-Systeme. Der Extra-zellularraum des Zellmembranabschnittes, welcher sich unter der Pipette befand, wurde von der Pipettenlösung bestimmt und das extrazelluläre Potential an diesem Membranabschnitt
Abb. 5: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus.
durch den Verstärker vorgegeben. Die Kommandospannung wurde über den Verstärker eingestellt. Die Differenz zwischen dem Membranpotential und dem Kommandopotential wurde im Verstärker über einen Rückkopplungsmechanismus bestimmt. An dem Rückkopplungswiderstand herrschte eine Spannung, die proportional zum fließenden Strom war, und welche die Differenz zwischen Membran- und Kommandopotential ausglich. Befand sich ein aktiver Kanal unter der Pipettenspitze, kam es an dem Abschnitt zu einer Veränderung des Membranpotentials. Dabei dienten die Bariumionen der Pipettenlösung als Ladungsträger. Die Änderung wurde über den Analog-/Digitalwandler als Stromstärke auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht. Pro Versuch wurden 250µl des Zellisolats in das Kulturschälchen gegeben. Nach zehnminütiger Sedimentation der Zellen wurden über ein Zuflußsystem ca. 10ml kaliumreiche Badlösung in das Organbad gegeben (2ml/min) und über eine Absaugvorrichtung abgesaugt, bis sich ein Rest von ca.1,5ml in dem Kulturschälchen befand. Eine mit Pipettenlösung blasenfrei gefüllte Pipette wurde in den Pipettenhalter gelegt.
Über den Mikromanipulator wurde die Pipette unter mikroskopischer Kontrolle an eine Zelle herangefahren. Die Grundeinstellungen der Geräte und das Pulsprotokoll beruhten auf Erfahrungswerten der Arbeitsgruppe Dres. Schröder/Klein. Der Widerstand der Pipette (5-7MΩ) im Meßkreis wurde durch ein kontinuierliches, 5ms dauerndes und 5mV starkes Rechtecksignal über den Computer-bildschirm kontrolliert. Sobald die Pipette auf die Zellmembran aufsetzte, wurde über ein Schlauchsystem, das an den Pipettenhalter angeschlossen war, ein Unterdruck in der Pipette erzeugt. Der Widerstand zwischen der Pipette und der Badelektrode lag jetzt bei 20-70GΩ (Bildung eines sogenannten Giga-Seals).
Zur Aktivierung des L-Typ-Calciumkanals wurden repetitive, 150ms dauernde Spannungsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz vorgegeben. Das Haltepotential lag bei –100mV und das Testpotential betrug +20mV. Beim Öffnen eines L-Typ-Calciumkanals änderte sich die Höhe der Stromamplitude auf ca. –0,6 bis -0,7pA. Es wurden 60 Depolarisationsimpulse bei gleichbleibender Pulsvorgabe in einer Datei (≅File) gespeichert und ausgewertet.
Abb. 6: Cell-attached-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik.
Kardiomyozyt