In der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. Kai C. Wollert wurde eine transgene Maus generiert, die Kardiomyozyten-spezifisch die Proteinkinase G-Typ I (PRKG1) überexprimiert. Zur Erzeugung des Transgens wurde die cDNA der humanen PRKG1 (TAMURA et al., 1996) an den murinen α-Myosin Schwerketten (αMHC)-Promotor gekoppelt. Der αMHC-Promotor, welcher sich zwischen dem αMHC (α1)- und dem βMHC (β)- Genlocus befindet, ist in der Lage, eine Kardiomyozyten-spezifische Transgenexpression zu steuern (GULICK et al., 1991). Mittels einer PCR-Mutagenese wurde zunächst eine BamHI Schnittstelle 14bp 5’ des ATG-Startcodons eingeführt. Dann wurde das Fragment zwischen der BamHI Schnittstelle und einer ClaI Schnittstelle 116bp 3’ des TAA-Stopcodons herausgeschnitten. Die cDNA der humanen PKG-I wurde anschließend in die MaeIII Schnittstelle im dritten nicht-kodierenden Exon (α3) des murinen αMHC-Genlocus einkloniert. Abschließend wurde das Intron und das Polyadenylierungssignal des SV40 T-Antigens am 3‘ Ende der PRKG1-cDNA eingefügt. Für die einzelnen Klonierungsschritte wurde ein pBluescript (Stratagene) Plasmidvektor verwendet. Die Bestätigung der genauen Orientierung und der Sequenz der PRKG-1-cDNA erfolgte durch die Firma Invitek aus Berlin.
Im Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg wurde das so konstruierte Transgen fertilisierten Eizellen von superovulierten B6D2F1/Crl Mäusen pronukleär injiziert.
Anschließend wurden diese Oozyten in scheinschwangere Crl:NMRI Mäuse transferiert. Die transgenen Founder-Tiere wurden nach Hannover überführt. Von diesen Tieren wurden drei Mäuse nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit nicht-transgenen C57BL/6 Weibchen zur Etablierung von drei unabhängigen Stämmen [(B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)1Zhg), (B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)2Zhg),); (B6; B6D2F1-Tg(Myh6-PRKG1)3Zhg)] verpaart.
Im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover erfolgte die fortgesetzte Rückkreuzung der drei Stämme auf C57BL/6. Die Mäuse wurden in Gruppen bis zu vier
Abb. 4: Das αMHC-PRKG-I-Transgen. Nähere Erläuterung im Text.
αMHC-Promotor
MAEIII
PRKG-1 SV 40
β α1 α2 α3
VP RP
Tieren in Makrolonkäfigen Typ II auf staubfreiem Weichholzgranulat in Barrierehaltung gehalten. Die durchschnittliche Raumtemperatur lag bei 22±2°C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55±5% und der Raum wurde in der Zeit von 07.00 bis 19.00 Uhr beleuchtet. Als Tierfutter wurde pelletiertes Zuchtfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH [Inhaltsstoffe:
Rohprotein 22,5%, Rohfett 5,0%, Rohfaser 4,5%, Rohasche 6,5%, Calcium 0,9%, Phosphor 0,7%; Zusatzstoffe je kg: Vitamin A 25.000IE, Vitamin D3 1.000IE, Vitamin E 125mg, Kupfer 5mg] verwendet. Trinkwasser wurde den Tieren in Form von Leitungswasser in Tränkflaschen ad libitum angeboten. Die Mäuse sind in dreimonatigen Abständen, gemäß der FELASA-Liste, auf ihren mikrobiellen Status untersucht worden. Hierbei wurden die fakultativ pathogenen Erreger Pneumocystis carinii, Pasteurella pneumotropica, Helicobacter typhlonius, Helicobacter hepaticus, Helicobacter bilis, Staphylococcus aureus und apathogene Darmflagellaten nachgewiesen. Klinisch zeigten die Tiere keine Anzeichen für eine Infektion.
Die Genotypisierung der Tiere erfolgte mittels einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Zu diesem Zweck wurde den Mäusen im Alter von 4 Wochen unter Narkose die Schwanzspitze kupiert. Der Vorwärts-Primer (VP ; CATAGGCTACGGTGTAAAAGAGGC) befand sich 145bp 5‘ des PRKGI Startcodons im αMHC Genlocus und der Rückwärts-Primer (RP;
TACTCCACCGGGTACATACAATCC) 368bp 3‘ des Startcodons in der PRKGI cDNA.
Zur Isolierung der DNA wurden die Schwanzspitzen bei einer Temperatur von 55°C in 500µl Extraktionspuffer (100mmol/l NaCl, 10mmol/l Tris HCl pH 8,0, 10mmol/l EDTA, 0,5% SDS) und 40µl Proteinase K-Lösung (10mg/ml in 50mmol/l Tris-HCl, pH 8,0, 1mmol/l CaCl2) inkubiert. Anschließend wurde die DNA zweimal mit Phenol und Chloroform gewaschen und das DNA Pellet nach vorheriger Ethanolfällung und vollständiger Trocknung in 100µl TE-Puffer gelöst. Das Gesamtvolumen eines PCR-Ansatzes betrug 50µl und enthielt 2µl der resuspendierten genomischen DNA, 50mmol/l KCl, 20mmol/l Tris-HCl, pH 8,4, 1,5mmol/l MgCl2, 0,1mmol/l dNTPs, je 50pmol Vorwärts- und Rückwärts-Primer und 1 U Taq DNA-Polymerase (Life Technologies). Insgesamt wurden 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 65°C und einer Minute bei 72°C bestand. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 1,5%igem Agarosegel. Die Banden wurden durch Zusatz von Ethidiumbromid unter UV-Bestrahlung detektiert und anschließend fotografiert.
Für die Versuchsreihen wurden weibliche nicht-transgene (+/+; Wildtyp) und transgene (Tg/+) Geschwistertiere aus den Rückkreuzungsgenerationen N4-N7 verwendet. Die Mäuse teilten sich in den Rückkreuzungsgenerationen, entsprechend der Mendelschen Gesetzmäßigkeit, erwartungsgemäß im Verhältnis 1:1 in nicht-transgene (+/+) und transgene (Tg/+) Tiere auf. Das Alter der verwendeten Tiere lag zwischen vier und acht Monaten und das Körpergewicht variierte von 19g bis 23g. Die transgenen Tiere wiesen keinerlei Unterschied bezüglich des mittleren Körpergewichtes im Vergleich zu gleichaltrigen, nicht-transgenen Geschwistertieren auf.
Während der Versuchsreihen wurden von jedem verwendeten Tier eine Probe von dem Herzohr/Herzvorhof und vom Zellisolat verwahrt. Mit diesen Proben erfolgte ein Nachweis der PKG-I auf Proteinebene mittels Western-Blot-Technik nach LAEMMLI (1970). Dazu wurde das Gewebe zunächst in einem Lysispuffer (50mM Tris-HCl, pH 7,4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50mM NaF, 1% TRITON x-100, 0,5% Nonidet P 40) aufgeschlossen.
Nachfolgend wurden die Proteine in einem 2fach-Proben-Puffer (5ml 0,5M Tris-HCl, pH 6,8, 4ml Glycerol, 8ml 10%iges SDS, 2ml 2-Mercaptoethanol, 1ml 0,5%iges Bromphenolblau) denaturiert. Für die elektrophoretische Trennung wurde ein 9%iges SDS-Gel (4,35ml entionisiertes Wasser, 2,5ml 1,5M Tris-HCL < pH 8,8, 100µl 10%iges SDS, 3,0ml Acrylamide/Bis[30%ig], 50µl 10%iges Ammonium Persulfat, 5µl TEMED) verwendet. Dann wurden die Proteine für eine Stunde im Naß-Blot Verfahren auf eine Nitrozellulose-Membran (Amersham Pharmacia Biotech) geblottet. Nach mehrmaligem Waschen der Membran mit TBST-Puffer (2,4g Tris, 8g NaCl, in 1000ml destilliertem Wasser bei pH 7,6, 1ml Tween 20) wurden durch Zusatz eines Milchpuffers (5% Milchpulver in TBST gelöst) unspezifische Bindungsstellen abgesättigt. Danach wurde die Membran über Nacht bei 4°C in einer Primärantikörperlösung inkubiert. Diese Lösung bestand aus anti-human-PKG-I–Kaninchen-Antikörper (MARKERT et al., 1995) in 5% Milchpulver/TBST (Verdünnung 1:3500). Die Membran wurde nachfolgend mehrmals gewaschen und in der Sekundärantikörperlösung (anti-Kaninchen-HRP (Amersham Pharmacia Biotech) in 5% Milchpulver/TBST, 1:3500) für eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Abschließend erfolgte die Visualisierung der Antikörperbindung mittels ECL-Reagenzien (Amersham Pharmacia Biotech). Dazu wurde die Membran für 30sec. auf einen Röntgenfilm exponiert. Die resultierende Bande lag bei 76kDa, entsprechend dem Molekulargewicht der Proteinkinase G-Typ I.