Damit eine eindeutige Zuordnung der gemessenen Kanäle als L-Typ-Calciumkanal möglich war und ein T-Typ-Calciumkanal ausgeschlossen werden konnte, wurde die Leitfähigkeit ermittelt. Dafür wurden zunächst 180 Depolarisationsimpulse unter Kontrollbedingungen aufgezeichnet. Dabei lag das Haltepotential bei –100mV, das Testpotential bei +20mV, die Pulsfrequenz bei 1,6Hz und die Pulsdauer bei 150ms. Bei gleichbleibendem Haltepotential, unveränderter Pulsfrequenz und –dauer wurde das Testpotential in 10mV Schritten von -10mV bis +30mV verändert. Nach 120 Depolarisationsimpulsen wurde das Testpotential jeweils um +10mV verändert. Nach diesem Schema wurden die fünf verschiedenen Testpulse aufgezeichnet. Die Höhe der Stromamplitude veränderte sich in Abhängigkeit des jeweiligen
Wildtyp Wildtyp Wildtyp Linie 1 Linie 1 Linie 2 Linie 2 Linie 3 Linie 3
Abb. 7: PKG-I-Protein-Expression im ventrikulären Myokard von nicht-transgenen (Wildtyp) Tieren und transgenen Tieren der Linie 1, 2 und 3. Das Molekulargewicht der PKG-I entspricht ca. 76 kDa.
Testpotentials (Abb. 8). Anhand der Gleichung G= ∆I/∆U wude die durchschnittliche Leitfähigkeit errechnet. Die Leitfähigkeit in der nicht-transgenen Versuchsgruppe lag bei 20,73±0,32pS und bei der transgenen Gruppe bei 19,65±1,29pS (Signifikanzniveau der beiden Gruppen p=0,451). Je Versuchsgruppe (nicht-transgen/transgen) gingen vier Versuche für die Berechung der Leitfähigkeit mit ein.
Abb. 8: Exemplarische Darstellung von Einzelkanalregistrierungen aus der nicht-transgenen und der transgenen Gruppe bei fünf unterschiedlichen Testpotentialen. Es wurde von einem Haltepotential von –100mV für 150ms auf die angegebenen Testpotentiale depolarisiert.
nicht-transgen transgen
+30mV +20mV
+10mV 0mV -10mV
22ms
1pA
4.3 Versuche mit dem Stickstoffmonoxid-Donator DEA/NO
Die Substanz DEA/NO [2-(N,N-Diethylamino)-diazenolate-2-oxide.Na] ist ein Stickstoffmonoxid-Donator. Im Herzmuskel produziertes Stickstoffmonoxid vermag den positiv-inotropen Effekt β-Adrenoceptor-vermittelter Stimulation zu hemmen. Das Stickstoffmonoxid führt zu einer Aktivierung der Guanylatcyclase und somit zu einem Anstieg von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP). Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sollen eine mögliche Beeinflussung des basalen L-Typ-Calciumstromes durch Stickstoffmonoxid, cGMP und der Proteinkinase G-Typ I aufzeigen (Abb. 9).
Für einen Versuch wurden 250µl Zellisolat in ein Kulturschälchen gegeben. Nach Sedimentation und Spülen der Zellen, wurden zunächst Aufzeichnungen unter Kontrollbedingungen aufgenommen. Nach mindestens 180 Depolarisationsimpulsen wurde dem Zellbad eine bestimmte Menge der Substanz DEA/NO (Alexis) zugefügt, so dass deren Endkonzentration bei 10-7M lag. Die eingesetzte Konzentration von DEA/NO stützte sich auf den von ABI-GERGES et al. (2002) angegebenen Referenzbereich in Untersuchungen des L-Typ-Calciumkanals von Rattenkardiomyozyten. Nach einer Einwirkzeit von drei Minuten wurden 360-600 Depolarisationsimpulse aufgezeichnet. Die nachfolgende Tabelle 3 stellt die Ergebnisse der statistischen Auswertung dieser Versuchsreihe dar. In den Versuchen (n=7)
Abb. 9: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion von Stickstoffmonoxid im Kardiomyozyten. Grau unterlegtes Feld: mögliche Hemmung des basalen Calciumstromes durch die PKG-I nach Gabe von DEA/NO [10-7M].
L-CC
mit Kardiomyozyten aus Zellisolaten von sechs nicht-transgenen Tieren kam es nach Gabe von DEA/NO zu einer nicht-signifikanten Reduktion der Offenwahrscheinlichkeit um -29,04±11,5%, der Verfügbarkeit um –2,94±3,33% und des Spitzenstromes um –3,3±13,2%.
In den Versuchen (n=7) mit Kardiomyozyten aus Zellisolaten von sechs transgenen Tieren führte DEA/NO zu einem signifikanten Abfall der Offenwahrscheinlichkeit um -57,44±4,77%, der Verfügbarkeit um –29,1±5,89% und des Spitzenstromes um -65,31±5,37%. Der direkte Vergleich beider Gruppen bezüglich des DEA/NO-induzierten Effektes ergab einen signifikanten Unterschied. Die Abbildungen 10 und 11 stellen Einzelkanalregistrierungen von beiden Versuchsgruppen aus dieser Versuchsreihe dar und geben die Veränderung der L-Typ-Calciumkanalaktivität nach Substanzzugabe grafisch wieder.
Kontrolle nach DEA/NO p Kontrolle nach DEA/NO p
Offenwahr-scheinlichkeit (%) 3,35±0,73 2,01±0,5 0,09 4,02±0,68 1,66±0,27 0,002
Verfügbarkeit (%) 62,79±6,33 60,98±6,62 0,45 77,97±5,15 55,84±6,85 0,002
Spitzenstrom (fA) 21,01±3,57 16,49±3,02 0,15 33,35±5,34 11,39±2,12 0,002
Inaktivierung (%) 71,76±6,9 76,99±4,85 0,367 77,15±4,88 80,42±4,08 0,516
Stromamplitude (-pA) 0,74±0,05 0,76±0,05 0,177 0,85±0,03 0,85±0,03 0,668
Latenzphase (ms) 36,43±3,84 45,77±2,11 0,029 44,31±11,57 55,3±12,16 0,208
mittlere Offenzeit (ms) 0,66±0,06 0,52±0,07 0,242 0,65±0,04 0,54±0,06 0,035
mittlere
Geschlossenzeit (ms) 12,03±2,66 15,04±2,56 0,008 11,43±1,71 18,22±2,69 0,016
Änderung
Offenwahr-scheinlichkeit (%)* ⎯ -29,04±11,5 0,052 ⎯ -57,44±4,77 <0,0001
Änderung
Verfügbarkeit (%)* ⎯ -2,94±3,33 0,411 ⎯ -29,1±5,89 0,003
Änderung
Spitzenstrom (%)* ⎯ -3,3±13,2 0,81 ⎯ -65,31±5,37 <0,0001
* = angegeben ist die prozentuale Abnahme zur Kontrolle, ein p-Wert <0,05 ist signifikant
44
Abb. 10: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht-transgenen Versuchsgruppe. Oberhalb der Grafiken:
Spannungsprotokoll: bei einem Haltepotential von –100mV und Testpotential von +20mV wurden repetitive, 150ms dauernde Depolarisationsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz gegeben. Linke Grafik: Kontrollbedingungen. Rechte Grafik: nach DEA/NO [10-7M]. Maßeinheiten: 0,5cm vertikal: 1 Picoampere (pA) Stromamplitudenhöhe; 1cm vertikal: 20 Femtoampere (fA) Summenstromgröße; 1cm horizontal: 20 Millisekunden (ms) Depolarisationsimpulsdauer.
1pA
20ms
20fA 45
Abb. 11: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. Oberhalb der Grafiken:
Spannungsprotokoll: bei einem Haltepotential von –100mV und Testpotential von +20mV wurden repetitive, 150ms dauernde Depolarisationsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz gegeben. Linke Grafik:
Kontrollbedingungen. Rechte Grafik: nach DEA/NO [10-7M]. Maßeinheiten: 0,5cm vertikal: 1 Picoampere (pA) Stromamplitudenhöhe; 1cm vertikal: 20 Femtoampere (fA) Summenstromgröße; 1cm horizontal: 20 Milli-sekunden (ms) Depolarisationsimpulsdauer.
20ms
20fA1pA 46
4.4 Versuche mit dem ß-Sympathomimetikum Isoproterenol und DEA/NO
Die Substanz Isoproterenol ist ein Sympathomimetikum mit vorwiegender Stimulation der β-Adrenoceptoren. Die Stimulation des β1-Adrenoceptors führt über eine Aktivierung der Adenylatcyclase zu einem intrazellulären Anstieg von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP). Das cAMP wiederum aktiviert die Proteinkinase A, welche den L-Typ-Calciumkanal phosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sollen eine mögliche Beeinflussung des β1-Adrenoceptor/cAMP/Proteinkinase A- vermittelten Effektes durch den NO/GC/cGMP/Proteinkinase G-Typ I-Signalweg aufzeigen (Abb. 12 und 13).
Abb. 12: Schematisches Modell der β1-adrenergen Signaltransduktion im Kardiomyozyten.
β1-AR L-CC
Abb. 13: Schematisches Modell der möglichen Signaltransduktion von Stickstoffmonoxid und Isoproterenol im Kardiomyozyten. Grau unterlegte Felder: die Gabe von DEA/NO [10-7M]
soll über eine Aktivierung der PKG-I die Isoproterenol [10-6M]-induzierte Steigerung des Calciumstromes aufheben. Darüber, ob dabei ein PKG-I-vermittelter Effekt über Signalweg A) oder B) verläuft, kann keine Aussage getroffen werden.
Isoproterenol
Es wurden zunächst Depolarisationsimpulse unter Kontrollbedingungen aufgezeichnet. Dann wurde eine bestimmte Menge der Substanz Isoproterenol (Sigma) in das Kulturschälchen gegeben, so dass die Endkonzentration im Zellbad bei 10-6M lag. Die verwendete Konzentration von Isoproterenol stützte sich auf Literaturangaben von HAN et al. (1996) und KLEIN et al. (2000), die Untersuchungen des L-Typ-Calciumkanals an Zellen des atrio-ventrikulären Knotens von Kaninchen bzw. Mäusekardiomyozyten durchführten. Nach einer dreiminütigen Einwirkzeit wurden erneut Depolarisationsimpulse aufgenommen. Danach wurde DEA/NO in das Kulturschälchen gegeben, so dass die Endkonzentration dieser Substanz 10-7M betrug. Nach erneuter Einwirkzeit begann die Aufzeichnung der Depolarisationsimpulse.
Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 dargestellt. In den Versuchen (n=10) mit Kardiomyozyten aus Zellisolaten von fünf nicht-transgenen Tieren kam es unter Isoproterenol zu einer signifikanten Zunahme der Offenwahrscheinlichkeit um 44,97±12,49%, der Verfügbarkeit um 43,48±11,28% und des Spitzenstromes um 75,49±23,2%. Die Gabe von DEA/NO führte zu einer Reduktion der Isoproterenol-gesteigerten Offenwahrscheinlichkeit (-6,56±9,13%)∗, der Verfügbarkeit (7,42±6,97%)* und des Spitzenstromes (8,56±10,9%)* auf die Ausgangswerte. In den Versuchen (n=8) mit Kardiomyozyten aus Zellisolaten von fünf transgenen Tieren kam es nach Isoproterenolgabe zu einem signifikanten Anstieg der Offenwahrscheinlichkeit um 48,61±12,44%, der Verfügbarkeit um 43,91±10,3% und des Spitzenstromes um 110±19,18%. Die Gabe von DEA/NO bewirkte einen signifikanten Abfall der Offenwahrscheinlichkeit (-48,13±9,46%)*, der Verfügbarkeit (-31,4±6,79%)* und des Spitzenstromes (-47,98±4,93%)* unter das Kontrollniveau.
Der Vergleich des Isoproterenoleffektes zwischen nicht-transgener und transgener Versuchsgruppe war für die genannten Parameter im ungepaarten t-Test nicht-signifikant (p>0,05). Die DEA/NO-vermittelte Hemmung des Calciumstromes unterschied sich zwischen den beiden Gruppen signifikant.
Die Abbildungen 14 und 15 stellen Einzelkanalregistrierungen von beiden Versuchsgruppen aus dieser Versuchsreihe dar.
∗ bezogen auf die Kontrolle
Versuche (n=10) nicht-transgen Versuche (n=8) transgen Kontrolle nach
Isoproterenol
nach
DEA/NO p1* p2* p3* Kontrolle nach
Isoproterenol
nach
DEA/NO p1* p2* p3*
Offenwahr-scheinlichkeit (%) 18,95±3,39 24,21±4,12 16,39±2,92 <0,05 >0,05 <0,01 14,16±3,63 20,96±4,55 7,87±2,5 >0,05 >0,05 <0,01 Verfügbarkeit (%) 49,6±6,15 65,95±6,01 50,22±5,29 <0,001 >0,05 <0,001 45,49±5,29 65,68±8,55 30,53±4,32 <0,01 <0,05 <0,001 Spitzenstrom (fA) 59,5±11,6 97,26±17,67 67,19±13,57 <0,01 >0,05 <0,05 49,54±12,0 102,1±23,46 24,74±7,01 <0,01 >0,05 <0,001 Inaktivierung (%) 50,77±6,2 35,96±6,02 48,02±9,08 <0,01 >0,05 <0,05 59,96±8,68 62,24±8,91 68,06±11,65 >0,05 >0,05 >0,05
Stromamplitude
(-pA) 0,59±0,02 0,61±0,02 0,6±0,02 >0,05 >0,05 >0,05 0,61±0,02 0,63±0,02 0,61±0,01 >0,05 >0,05 >0,05 Latenzphase (ms) 18,96±7,19 15,68±5,26 22,19±7,32 >0,05 >0,05 >0,05 28,92±10,12 24,83±9,86 33,36±12,88 >0,05 >0,05 >0,05 mittlere Offenzeit
(ms) 0,56±0,1 1,35±0,82 0,42±0,06 >0,05 >0,05 >0,05 0,59±0,13 0,74±0,13 0,46±0,16 >0,05 >0,05 >0,05 mittlere
Geschlossenzeit (ms)
6,08±4,23 3,76±2,39 5,23±3,05 >0,05 >0,05 >0,05 12,73±7,71 7,03±3,69 15,15±8,52 >0,05 >0,05 >0,05 Änderung
Offenwahr-scheinlichkeit (%)*
⎯ 44,97±12,49 -6,56±9,13 <0,01 >0,05 <0,001 ⎯ 48,61±12,44 -48,13±9,46 <0,01 <0,01 <0,001 Änderung
Verfügbarkeit (%)* ⎯ 43,48±11,28 7,42±6,97 <0,001 >0,05 <0,01 ⎯ 43,91±10,3 -31,4±6,79 <0,01 <0,05 <0,001 Änderung
Spitzenstrom (%)* ⎯ 75,49±23,2 8,56±10,9 <0,01 >0,05 <0,01 ⎯ 110,2±19,18 -47,98±4,93 <0,001 <0,05 <0,001
* = angegeben ist die prozentuale Zunahme von Isoproterenol zur Kontrolle und die prozentuale Zunahme/Abnahme von DEA/NO zur Kontrolle p1* = angegeben ist der p-Wert Isoproterenol versus Kontrolle, ein p-Wert <0,05 ist signifikant
p2* = angegeben ist der p-Wert DEA/NO versus Kontrolle, ein p-Wert <0,05 ist signifikant p3* = angegeben ist der p-Wert DEA/NO versus Isoproterenol, ein p-Wert <0,05 ist signifikant
49
Abb. 14: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der nicht-transgenen Versuchsgruppe. Oberhalb der Grafiken: Spannungsprotokoll: bei einem Haltepotential von –100mV und Testpotential von +20mV wurden repetitive, 150ms dauernde Depolarisationsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz gegeben. Linke Grafik:
Kontrollbedingungen. Mittlere Grafik: nach Isoproterenol [10-6M]. Rechte Grafik: nach Isoproterenol [10-6M] und DEA/NO [10-7M]. Maßeinheiten: 0,5cm vertikal: 1 Picoampere (pA) Stromamplitudenhöhe; 1cm vertikal: 35 Femtoampere (fA) Summenstromgröße; 1cm horizontal: 20 Millisekunden (ms) Depolarisationsimpulsdauer.
1pA
20ms
35fA 50
Abb. 15: Einzelkanalregistrierungen und Summenströme aus der transgenen Versuchsgruppe. Oberhalb der Grafiken: Spannungsprotokoll: bei einem Haltepotential von –100mV und Testpotential von +20mV wurden repetitive, 150ms dauernde Depolarisationsimpulse mit einer Frequenz von 1,6Hz gegeben. Linke Grafik:
Kontrollbedingungen. Mittlere Grafik: nach Isoproterenol [10-6M]. Rechte Grafik: nach Isoproterenol [10-6M] und DEA/NO [10-7M]. Maßeinheiten: 0,5cm vertikal: 1 Picoampere (pA) Stromamplitudenhöhe; 1cm vertikal: 35 Femtoampere (fA) Summenstromgröße; 1cm horizontal: 20 Millisekunden (ms) Depolarisationsimpulsdauer.
1pA
20ms
35fA 51