Regulation durch Proteinkinasen

Aus den vorangegangenen Beschreibungen erklärt sich, dass die L-Typ-Calciumkanalaktivität sehr genau reguliert wird. Diese Regulation verläuft unter der Beteiligung von unterschiedlichen second messenger-Systemen.

Mehrere G-Protein (Heterotrimer, das aus einer GDP-gebundenen G_α-Untereinheit und einer G_β/γ-Untereinheit besteht)-gekoppelte Rezeptoren agieren über den cAMP/Proteinkinase A-Signalweg. Eine Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zu einer Wechselwirkung mit der G_α-Untereinheit, einem Austausch von GDP zu GTP und einer Dissoziation der G_α -Untereinheit von dem G_β/γ-Dimer. Die G_α-Untereinheit bindet an die Adenylatcyclase. Die Rezeptoren sind entweder mit die Adenylatcyclase stimulierenden G_s- oder mit die Adenylatcyclase hemmenden G_i-Proteinen gekoppelt. Eine Aktivierung der Adenylatcyclase führt zur Bildung von cyclischem Adenosinmonophosphat aus ATP. Das cyclische AMP bindet an die regulatorische Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase A. Die katalytische Untereinheit der Proteinkinase A phosphoryliert eine oder mehrere Untereinheiten des Calciumkanals, wodurch es zur Öffnung des Kanals kommt (McDONALD et al., 1994). Eine Stelle, die durch die cAMP-abhängige Proteinkinase phosphoryliert wird, ist die 242kDa-Form der kardialen α1-Untereinheit (DE JONGH et al., 1996). In einer Studie an kultivierten chinesischen Hamsterovarialzellen, welche die α1 -Untereinheit des kardialen L-Typ-Calciumkanals exprimierten, konnte gezeigt werden, dass die Proteinkinase A verantwortlich für die Regulation der Phosphorylierung der α1 -Untereinheit ist (SCULPTOREANU et al., 1993). Neben der α1-Untereinheit ist auch die β2a -Untereinheit entscheidend an der Regulation des kardialen Calciumkanals durch die Proteinkinase A beteiligt (BÜNEMANN et al., 1999).

Die intrazelluläre Signalkaskade wird durch Phosphodiesterasen, die das cyclische AMP zu 5`-AMP umwandeln, und Serin/Threonin-Phosphatasen gegenreguliert. Die an diesem Signalweg beteiligte Proteinkinase A ist ein Tetramer, bestehend aus zwei katalytischen Untereinheiten, welche an eine regulatorische Dimeruntereinheit gekoppelt sind. Von der regulatorischen Untereinheit existieren die I-Form, die sich im Cytosol befindet, und die R-II-Form, die an die Zellmembran gebunden ist.

Die Proteinkinase C spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle in der Regulierung des L-Typ-Calciumkanals. Mehrere Gp-Protein gekoppelte Rezeptoren (α1-Adrenceptor, Endothelin-, Angiotensin II-Rezeptor) verändern die Signalkaskade, indem sie die Proteinkinase C

aktivieren. Das aktivierte Gp-Protein stimuliert die Phospholipase C, welche das Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) hydrolisiert und zur Bildung von Inositoltrisphosphat und Diacylglycerol (DAG) führt. Das Diacylglycerol, das Phosphatidylserin und in bestimmten Fällen Ca²⁺-Ionen aktivieren zusammen die Proteinkinase C. Von der Proteinkinase C sind in der Säugetierzelle elf Isoformen bekannt, die in drei Gruppen unterteilt werden: die klassischen PKCs (cPKC), welche durch Diacylglycerol oder Phorbolester aktiviert werden und Ca²⁺-sensitiv sind, die „novel“ PKCs (nPKC), welche durch Diacylglycerol oder Phorbolester aktiviert werden und nicht Ca²⁺ -sensitiv sind, die atypischen PKCs, welche weder durch Diacylglycerol, noch durch Phorbolester und auch nicht durch Ca²⁺ aktiviert werden (HOFMANN, 1997). In vitro werden die α1- und die β2-Untereinheit des kardialen L-Typ-Calciumkanals durch die Proteinkinase C phosphoryliert. Frühere Untersuchungen über den PKC-abhängigen Signalweg zeigten unterschiedliche Effekte. Einige Autoren konnten nach der Gabe von Endothelin (ET-1) einen deutlichen Anstieg des basalen Calciumstromes (BKAILY et al., 1995; HE et al., 2000), einen deutlichen Abfall des basalen Calciumstromes (CHENG et al., 1995) oder keine Veränderung des basalen Calciumstromes (THOMAS et al., 1997; DELPECH et al., 1997) beobachten.

Andere Experimentatoren konnten einen biphasischen Effekt (Abfall gefolgt von einem Anstieg) zeigen (WOO u. LEE, 1999).

Von der Proteinkinase G existieren zwei Typen (I und II). Die Typ I Proteinkinase (PKG-I) ist ein Homodimer, wobei jede Untereinheit eine Masse von etwa 75kDa besitzt. Sie kommt hauptsächlich im Cytoplasma von Gefäßmuskelzellen, Gefäßendothelzellen, Kardiomyozyten, Fibroblasten, Leukozyten und speziellen Regionen des Nervensystems vor.

Die Typ II Proteinkinase hat eine Masse von 86kDa und ist membrangebunden. Die Proteinkinase Typ II kommt in Nierenzellen, in der Mukosa des Intestinums, in Chondrozyten und in Zellen der Glandula parotis vor, aber nicht in Kardiomyozyten und vaskulären Myozyten. Eine Aktivierung der Guanylatcyclase führt zur Bildung von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP) aus GTP. Das cyclische Guanosinmonophosphat wiederum aktiviert die Proteinkinase G-Typ 1. Es werden unterschiedliche Mechanismen der cGMP/Proteinkinase G-Typ I-vermittelten Inhibition des L-Typ-Calciumkanals vermutet:

eine direkte Phosphorylierung des Kanals durch die Proteinkinase G und eine Proteinkinase G-vermittelte Aktivierung einer Phosphatase, die den Kanal dephosphoryliert Die Rolle des cGMP/Proteinkinase G-Typ I Signalweges wird kontrovers diskutiert. Einige Studien konnten an unterschiedlichen Spezies eine Guanylatcyclase/cGMP/PKG-I-vermittelte Inhibition des

L-Typ-Calciumkanals nachweisen (HADDAD et al., 1995; JIANG et al., 2000; MERY et al., 1991; SUMII u. SPERELAKIS, 1995). Die Autoren konnten zeigen, dass die Hemmung direkt durch die Proteinkinase-G vermittelt wird und nicht durch die Aktivierung von Phosphodiesterasen oder Phosphatasen. Eine cGMP/PKG-I-vermittelte Stimulation des L-Typ-Calciumkanals wurde in Kardiomyozyten von Kaninchen beobachtet (HAN et al., 1998;

WANG et al., 2000).

In einer Studie an Wildtyp, Prkg1^tm1Naw-, Prkg1^tm2.1Naw- und Prkg1^tm2Naw-Knockout-Mäusen wurde die Kontraktionskraft in den Wildtyp-Mäusen durch cGMP-Analoga reduziert, nicht aber in den Knockout-Mäusen (WEGENER et al., 2002). Es konnte dabei in juvenilen und adulten Mäusen gezeigt werden, dass der negativ-inotrope Effekt durch die Proteinkinase G-Typ I vermittelt wurde. Die Untersuchung beschränkte sich jedoch auf die Kontraktionskraft und gab keinerlei Auskunft über den Ionenstrom durch den L-Typ-Calciumkanal. In allen Studien wurde die Whole-cell Patch-Clamp-Technik angewendet und es gab bis zum Jahre 2000 keine Studie, die den Einfluß von cGMP und der Proteinkinase G-Typ I auf den L-Typ-Calciumkanal in detaillierten single-channel-Betrachtungen untersuchte. KLEIN et al. (2000) führten diese detaillierten Untersuchungen erstmalig an Kardiomyozyten von Mäusen durch und konnten zeigen, dass es nach Gabe von 8-Br-cGMP zu einem Rückgang des stimulierenden Effektes von Isoproterenol kam, und dass die Proteinkinase G-Typ I an dieser Hemmung beteiligt war.

Neben den hier aufgeführten Proteinkinasen wird eine Beteiligung von weiteren Kinasen an der Regulation von L-Typ-Calciumkanälen in Herzmuskelzellen diskutiert.

YOKOSHIKI et al. (1996) konnten an Herzmuskelzellen von Ratten und CHIANG et al.

(1996) an Kardiomyozyten von Meerschweinen zeigen, dass es nach Hemmung der Protein-Tyrosinkinase zu einer Abnahme des Calciumstromes kam. In Kardiomyozyten von Katzen wurde nach Hemmung der Protein-Tyrosinkinase ein biphasischer Effekt beobachtet (WANG u. LIPSIUS, 1998). Ein Anstieg des Calciumstromes konnte in humanen Kardiomyozyten nach Hemmung der Protein-Tyrosinkinase festgestellt werden (BOIXEL et al., 2000). Es ist bisher nicht vollständig geklärt, wie die Regulation des L-Typ-Calciumkanals durch Protein-Tyrosinkinasen erfolgt und ob die Protein-Tyrosinkinasen mit bestimmten Proteinkinasen interagieren. Neben den Untersuchungen der Tyrosinkinasen befaßte sich eine Reihe von Studien mit dem Einfluß der Calmodulin-abhängigen Kinase (CaMK) auf den positiven Feedback-Mechanismus und die Ca²⁺-abhängige Öffnung des L-Typ-Calciumkanals (YUAN u. BERS, 1994; ZÜHLKE et al., 1999; ZÜHLKE et al., 2000).