Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Typ I Allergie des Pferdes:
Phänotypische Charakterisierung equiner Typ I Effektorzellen und ihre Antikörper vermittelte Modulation
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doctor of Philosophy (PhD)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von
Jens Rohwer aus Wyk
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Prof. Dr. med. R. E. Schmidt
Prof. Dr. med. vet. Dr. h. c. Wolfgang Leibold
1. Gutachten: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker Prof. Dr. med. R. E. Schmidt
Prof. Dr. med. vet. Dr. h. c. Wolfgang Leibold
2. Gutachter: Prof. Dr. med. S. C. Bischoff
Tag der öffentlichen Disputation: Mittwoch, 10. November 2004
For what it´s worth
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen... 8
1 Einleitung und Zielsetzung ... 11
1.1 Das Sommerekzem des Pferdes - eine Typ I Allergie...11
1.2 Defizite der veterinärmedizinischen Forschung bei der Typ I Allergie ...11
1.3 Schwerpunkte dieser Arbeit ...13
2 Literaturübersicht ... 15
2.1 Immunglobuline ...15
2.1.1 Immunglobulinsystem des Pferdes ...17
2.1.2 Sekundärfunktionen von Antikörpern...21
2.2 Allergie ...26
2.2.1 Physiologische Immunmechanismen als Grundlage der überschießenden Reaktionen bei Allergien...26
2.2.2 Die saisonal rekurrierende atopische Dermatitis des Pferdes – das Sommerekzem..32
2.2.3 Immunglobulin-Isotypen und ihre potentielle Bedeutung für die Typ I-Allergie des Pferdes...36
2.3 Immunmodulation...37
2.3.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten...37
2.3.2 Immunmodulation der Typ I-Allergie...38
2.3.3 Immunmodulation durch allergenspezifische Antikörper anderer Isotypen als IgE..42
3 Geräte, Material und Methoden ... 45
3.1 Geräte ...45
3.2 Material...46
3.2.1 Klinikbedarf ...46
3.2.2 Laborbedarf...47
3.2.3 Reagenzien...48
3.2.4 Puffer, Lösungen und Medien...49
3.2.5 Allergene...52
3.2.6 Antikörper und Seren...53
3.2.7 Lösungen für die Durchflusszytometrie und Dichtegradientenzentrifugation...55
3.2.8 Tiere ...55
3.3 Methoden...56
3.3.1 Blutentnahme ...56
3.3.2 Serumgewinnung ...56
3.3.3 Zellzahl und Vitalitätsbestimmung ...56
3.3.4 Anfertigen von Blutausstrichen und Leukozytendifferenzierung...57
3.3.5 Anfertigung von Zytospins ...57
3.3.6 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode):...58
3.3.7 Gewinnung und Isolierung von Leukozyten aus dem Blut...59
3.3.8 Magnetisches Sortieren (MACS) von IgE+ Zellen...60
3.3.9 Funktioneller in vitro-Test (FIT) zur Bestimmung des Sensibilisierungsgrades basophiler Granulozyten ...62
3.3.10 Kompetitiver Histamin-Radio-Immuno-Assay (RIA) ...65
3.3.11 Immunisierung von Ziegen zur Gewinnung von polyklonalem goat anti Acylhistamin Antiserum ...68
3.3.12 Vitalitätsbestimmung von Zellen mittels Fluorochromen ...69
3.3.13 Durchflusszytometrie...70
3.3.14 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ...72
3.3.15 Statistische Verfahren ...74
3.3.16 Zellkultur...75
4 Ergebnisse ... 77
4.1 Phänotypische Charakterisierung IgE positiver Zellen im peripheren Blut des Pferdes.77 4.1.1 Verteilung IgE positiver Zellen im peripheren Blut des Pferdes ...80
4.1.2 Anreicherung von IgE positiven Zellen im magnetischen Feld (MACS sorting)...85
4.1.3 Lichtmikroskopische Darstellung IgE positiver Zellen des Pferdes ...89
4.2 Methodische Vorarbeiten ...95
4.2.1 Spezifität der eingesetzten monoklonalen Antikörper und Seren zur Überprüfung der generellen Sensibilisierung im FIT...95
4.2.2 Intraindividuelle Reproduzierbarkeit des FIT und Konfidenz der Überprüfung der generellen Sensibilisierung ...97
4.3 Diskordante Dominanz der IgG oder IgE vermittelten Freisetzung von Histamin aus basophilen Granulozyten ...99 4.3.1 Erfassung verschiedener Reaktionsmuster bei der Überprüfung der generellen
4.3.3 Analyse des bifunktionellen Nachweises der generellen Sensibilisierung ...112
4.3.4 Überprüfung der Hypothese Basophile von atopischen Pferden seien IgE reagibler als die gesunder Individuen...117
4.3.5 Freisetzung von Histamin durch verschiedene Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers gegen equines IgE ...119
4.3.6 Modulation der Histaminfreisetzung über die kombinierte Aktivierung der generellen und der spezifischen Sensibilisierung ...121
4.4 Funktionelle Überprüfung monoklonaler anti equiner Immunglobulinisotypen Antikörper im FIT ...127
4.4.1 Überprüfung der Histamin freisetzenden Potenz equiner IgG Isotypen nach Kreuzvernetzung ...127
4.4.2 Überprüfung einer inhibitorischen Potenz equiner IgG Isotypen nach Kreuzvernetzung ...129
5 Diskussion... 135
5.1 Untersuchungen zur Histaminfreisetzung über Antikörper gegen equine Immunglobulin Isotypen...135
5.2 Membranimmunfluoreszenz gegen equines IgE ...136
5.3 Magnetisches Sortieren und lichtmikroskopische Differenzierung IgE tragender Zellen beim Pferd ...140
5.4 Qualität der funktionellen, generellen Sensibilisierung basophiler Granulozyten über mehr als einen Isotyp...141
5.5 Interpretation der funktionellen Sensibilisierung allergischer Effektorzellen durch Immunglobuline der Klassen IgE und IgG ...145
5.6 Modulation der Histaminfreisetzung über kombinatorische Inkubationen aktivierender Stimuli...147
6 Zusammenfassung ... 152
7 Summary ... 155
8 Literaturverzeichnis ... 158
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und termini technici Abb. Abbildung
ADCC Antibody Depending Cytotoxicity (Antikörperabhängige Zelltoxizität)
Anti gegen gerichtet
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)
Bo Bovine (bovin)
BSA Bovines Serumalbumin
bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise
C1q Fragment der Komplementkomplemente C1
C5a aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5 ca. zirka
CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungs- antigenen)
CD4+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren
CD8+ Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren
CO2 Kohlenstoffdioxid
CpG Cytosin-Phosphate-Guanosin CR Complement Receptor (Komplementrezeptor) DNA/DNS Desoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Enzymgekoppelter Immunfestphasentest)
Eq, eq Equine (equin)
Events Messereignisse in der Durchflusszytometrie
Fab Fragment antigen binding (atigen bindende Anteile von leichten und schweren Ketten eines Immunglobulins)
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)
Fc Fragment cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung)
FCM Flow Cytometer (Durchflusszytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® g Gramm
G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) generelle
Sensibilisierung
Sensibilisierung basophiler Granulozyten durch membranständige Antikörper (IgE und IgG)
heterobridging Kreuzvernetzen verschiedener Immunglobulinisotypen auf der Membran Basophiler
H & L Heavy and Light (schwere und leichte Ketten der Immunglobuline) HRF Histamine Releasing Factors (Histamin freisetzende Faktoren) HRP Horse-Radish-Peroxidase (Meerrettich Peroxidase)
ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IgA Immunglobulin A
IgE Immunglobulin E
IgG Immunglobulin G
IgG1,2, u.a. Subtypen/ Isotypen aus der Klasse des Immunglobulins G
IgM Immunglobulin M
IL Interleukin i.m. intra muskulär
ITAM Immunglobulinreceptor associated Tyrosine-based Activating Motif (Immunglobulinrezeptor assoziiertes Tyrosin basierendes aktivierendes Motiv)
ITIM Immunglobulinreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif
(Immunglobulinrezeptor assoziiertes Tyrosin basierendes hemmendes Motiv
L Liter
LIR Leucocyte Inhibitory Receptor (Leukozyten hemmender Rezeptor)
LRP Leukozytenreiches Plasma
µ mikro (x 10-6) m milli (x 10-3)
M Molar (Mol/L)
MACS Magnetic Cell Sorting (magnetisches Sortieren von Zellen) mAK monoklonale(r) Antikörper
mfl Mean Fluorescence (mittlere Fluoreszenzintensität)
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute(n)
MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen des Blute) muAB Murine Antibody(s) (Mäuseantikörper)
MW arithmetischer Mittelwert
N oder (N=…) bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen oder Probanden
(n=…) Bei Mittelwerten mehrerer Probanden die Anzahl der Einzelbeobachtungen je Proband
n nano (x 10-9)
NaCl Natriumchlorid n.n. Not Named (nicht benannt) Nr. Nummer
NSB Non Specific Binding (unspezifische Bindung im RIA) P Wahrscheinlichkeit mit der die Hypothese nicht zutrifft
PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PBL Peripheral Blood Leucocytes (periphere Blutleukozyten) PE Phycoerythrin
Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen PI oder PJ Propidiumiodid
PMN Polymorphonuclear Leukocytes (hier Granulozyten inklusive Basophile und Eosinophile)
Px Peroxidase
RIA Radio Immunosorbent Assay (Radio Immunadsorptionstest) RT Raumtemperatur
s. siehe
s.c. sub cutan
SD Standard Deviation (Standardabweichung) sek Sekunde(n)
SEM Standard error of mean (Standardfehler)
SIT Specific Immunotherapy (spezifische Immuntherapie)
sog. So genannte(r)
spezifische Sensibilisierung
Sensibilisierung basophiler Granulozyten durch membranständige allergenspezifische Antikörper
SPT Skin Prick Test (Hauttest auf Allergie)
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Superbridging Kreuzvernetzen sekundärer Antikörper auf der Oberfläche Basophiler Tab. Tabelle
TCR T Cell Receptor (T-Zellrezeptor) TNF Tumornekrosefaktor
u.a. unter anderem
UV Ultraviolett vgl. vergleiche
v/v Volumen pro Volumen
well Vertiefung einer Mikrotiterplatte
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
1.1 Das Sommerekzem des Pferdes - eine Typ I Allergie
Unter den bei Mensch und Tier zunehmenden allergischen Erkrankungen stellt die
„Sofortreaktion“ vom Typ I ein besonderes Problem dar: Zwar kennt man die zentralen Mechanismen dieser Überempfindlichkeit beim Menschen. Die bevorzugt durch Antikörper vermittelte und durch Allergen ausgelöste Aktivierung basophiler Granulozyten (Basophiler) und Mastzellen ist auch für das equine System bekannt, doch ist eine kausale oder zentral eingreifende, dauerhafte Therapie nicht in Sicht. Auch die gelegentlich wirksame Hyposensibilisierung bleibt in ihren beteiligten Mechanismen weitgehend unverstanden.
Zur langsamen Entwicklung auf diesem Gebiet trägt bei, dass kaum gut definierte Tiermodelle für die Typ I Allergie zur Verfügung stehen. Im Gegensatz zur Maus, bei der bisher keine natürlicherweise auftretende IgE vermittelte Überempfindlichkeit beschrieben ist, findet man bei Pferden regelmäßig Krankheitsbilder, welche die Vermutung nahe legen, es handle sich um eine allergische Reaktion. Als eines der klassischen könnte sich das Sommerekzem der Pferde herausstellen, dass gleichzeitig ein gravierendes Problem für Pferde und Pferdehalter ist. Ihm steht die Veterinärmedizin derzeit noch ebenso hilflos gegenüber wie die Humanmedizin zahlreichen Typ I Allergieformen beim Menschen.
1.2 Defizite der veterinärmedizinischen Forschung bei der Typ I Allergie
Der Vorteil des Sommerekzems ist seine relativ klare Pathogenese: Pferde werden saisonal in den Sommermonaten bevorzugt von bestimmten Gnitzenarten (häufig Culicoides species) an charakteristischen Körperstellen gestochen. Mit dem Speichel dieser Gnitzen werden Substanzen „appliziert“, auf die zahlreiche Pferde mit klinischen und histopathologischen Symptomen reagieren, die in Verlauf und Ausprägung charakteristisch für eine Typ I Allergie sind.
Der Nutzung dieser klaren Erkrankung bei Pferden zur Klärung zentraler Typ I- Allergiemechanismen steht der Mangel an hinreichenden Grundkenntnissen und geeigneten Reagenzien entgegen:
Einleitung und Zielsetzung
Vom Culicoides-Allergen ist derzeit nur eine relativ grobe Präparation bestimmter Culicoidesarten zugänglich. Eine informative Mechanismusanalyse ist mit definierten Antigenen, bevorzugt Haptenen, jedoch weit besser möglich.
Zwar weiß man um die zentrale Bedeutung von Mastzellen und Basophilen beim Sommerekzem, doch ist mangels geeigneter Reagenzien bisher nicht zuverlässig dokumentiert, welche Immunglobulinisotypen auf welchen Fc-Rezeptoren (FcR) dieser Zellen binden und eine Aktivierung vermitteln oder verhindern können. Zudem ist beim Pferd unbekannt, ob und welche Zytokine oder Chemokine die Reaktionsfähigkeit von Basophilen und Mastzellen beeinflussen können.
Bei besser untersuchten Spezies (Mensch, Maus, Ratte) sind Basophile und Mastzellen konstitutiv mit einem FcεRI ausgestattet. Er ist so hochaffin für den Fc-Teil von IgE, dass er es in freier Form binden und damit diese Zellen für die vom spezifischen Bindungsteil (Paratop) dieser Antikörper erkannten Determinaten (Epitope) auf Antigenen sensibilisiert.
Zumindest für Mastzellen der Ratte wurde gezeigt, dass der FcεRI auch einen bestimmten IgG-Isotypen (IgG2a) binden kann, wenn auch mit geringerer Affinität als das IgE (BENHAMOU et al. 1994). Werden auf Mastzellen und Basophilen zusätzlich verschiedene Formen von FcγRII gefunden, so können sie erheblich modulatorische fördernde wie hemmende Wirkung auf das Reaktionsverhalten dieser Zellen haben, sobald beide Rezeptoren, der FcεRI und der FcγRII, durch ein an Antigen gebundenes IgE und IgG überbrückt werden (DAERON et al. 1995).
Neben der Modulation des Reaktionsverhaltens von Basophilen und Mastzellen durch verschiedene Immunglobulinisotypen, kann die Expression des FcεRI in weiten Bereichen (zwischen wenigen hundert bis 106 Rezeptoren / Basophilem) durch die Menge an freiem IgE quantitativ moduliert werden (LANTZ et al. 1997, MAC GLASHAN, Jr. et al. 1997).
Insgesamt kann das Reaktionsverhalten von Basophilen und Mastzellen von mehreren Einflüssen abhängen: Der Anzahl exprimierter FcεRI, der Anzahl gebundener IgE-Moleküle pro Antigen und deren Affinität zum Antigen (COLLINS et al. 1995 & 1996), der antagonistischen oder unterstützenden Bindung von geeigneten IgG-Isotypen und den modulierenden Einwirkungen von Chemo- und Zytokinen (KUNA et al. 1993;
YAMAGUCHI et al. 1996).
1.3 Schwerpunkte dieser Arbeit
In ihrer Dissertationsarbeit ist es Frau Dr. KAUL gelungen, einen sensitiven funktionellen in vitro-Nachweis zu entwickeln, mit dem die in vivo-Sensibilisierung equiner Basophiler qualitativ und quantitativ erfasst werden kann (KAUL 1998).
Dieser funktionelle in vitro-Test (FIT) wurde bisher unter anderem für die Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus, einem der Allergenspender für Pferde mit Sommerekzem, zur diagnostischen Reife etabliert. Damit ist es nun möglich, Tiere zu identifizieren und in ihrem Sensibilisierungsgrad gegen Culicoides nubeculosus zu differenzieren, unabhängig vom Grad der klinischen Ausprägung an Sommerekzemsymptomen – sensibilisierte Pferde, die zum Zeitpunkt der Untersuchung frei von Symptomen sind, werden im FIT als sensibilisiert
„erkannt“ . Zum anderen ermöglicht dieses Verfahren, die funktionelle Aktivierung der Basophilen selektiv an der Menge des freigesetzten Histamins zu quantifizieren.
In der Allergiediagnostik beim Menschen wird der Allergiestatus häufig über die Bestimmung von Gesamt-IgE im Serum (RIST: radio-immuno-sorbent-test) oder von allergenspezifischem IgE (RAST: radio-allergen-sorbent-test) ermittelt. Damit wird freies, in vivo nicht immunkomplexiertes IgE gemessen. In wie weit diese Testverfahren eine Diagnostik der Typ I Allergie unterstützen können, wird kontrovers diskutiert (DOLEN 2003).
In diesen Testverfahren werden regelmäßig Probanden ermittelt, bei denen ein positiver ex vivo Test keine klinische Entsprechung findet. Im Gegensatz bietet eine Bestimmung der Antikörper, die auf den Basophilen so gebunden haben, dass sie die Zellen zu aktivieren vermögen (im FIT zur Freigabe von Histamin), eine hohe Übereinstimmung zur klinischen Ausprägung der Allergie.
Trotz eines positiven FIT-Ergebnisses (Reaktion der Basophilen muss also stattgefunden haben) findet sich auch in diesem Testsystem das gleiche Paradoxon: Es werden Tiere ermittelt, die trotz bestehender Sensibilisierung keine klinischen Zeichen einer Allergie entwickeln. Es stellt sich die Frage, wie und auf welcher Ebene eine Modulation der immunologischen Reaktion stattfindet.
Zu beachten ist hier, dass bisher kein Trennungsverfahren für Basophile des Pferdes vorliegt.
Eine Möglichkeit der Interaktion verschiedener Zelltypen ist nicht auszuschließen. Um eine Beteiligung anderer Zellen zu erfassen, wird markiertes IgE eingesetzt, um im FCM (Flow Cytometry) Zellen, die IgE binden zu detektieren.
Diese Zellen können dann mit magnetischen Kügelchen gekoppelt werden und in einem elektrostatischen Feld von unmarkierten getrennt werden (MACS), um sie anzureichern, zu charakterisieren und zu kultivieren.
Einleitung und Zielsetzung
Somit stellen sich für die Analyse verantwortlicher Mechanismen bei Pferden mit Sommerekzem folgende vordringliche Fragen:
• Bindet IgE vom Pferd (eqIgE) an Basophile und Mastzellen in freier Form (spräche für einen FcεRI) oder nur nach vorheriger Bindung an ein Antigen, also in immunkomplexierter Form (IC-IgE)?
• Welche Leukozyten des peripheren Blutes sind in der Lage, eqIgE zu binden?
• Kann an Basophile oder Mastzellen gebundenes IgE diese aktivieren, sobald ein monoklonaler Antikörper gegen IgE oder ein geeignetes Antigen sie überbrückt (bridging)?
• Kann die klinische Diagnose Typ I Allergie durch diese Aktivierung reproduzierbar bestätigt werden?
• Können weitere Isotypen gefunden werden, die equine Basophile neben IgE sensibilisieren?
• Wenn equine Basophile durch verschiedene Isotypen sensibilisert werden, unterscheidet sich deren aktivierendes oder inhibierendes Potenzial?
• Unterscheidet sich die Sensibiliserung von Basophilen durch verschiedene Isotypen zwischen allergischen und gesunden Pferden?
• Wird die Reaktion Basophiler durch gleichzeitiges Kreuzvernetzen sensibilisierender Antikörper unterschiedlichen Isotyps moduliert?
Derartige Untersuchungen waren bisher beim Pferd nicht möglich, da keine spezifischen Nachweisreagenzien für den Besatz Basophiler mit Immunglobulinisotypen zur Verfügung standen. Aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vom Pferd aufgereinigte IgE Präparationen enthielten einen zu großen Anteil anderer, nicht eindeutig definierbarer Ig- Isotypen (SUTER & FEY, 1981 & 1983), als dass Immunnisierungen von Mäusen zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen equines IgE Erfolg versprechend gewesen wären.
Ähnliches gilt für 3 der 6 (7) equinen IgG Isotypen.
2 Literaturübersicht
2.1 Immunglobuline
Die Grundform (Monomer) funktionsfähiger Immunglobuline besteht aus vier Polypeptidketten, zwei identischen schweren (H-Ketten) und zwei identischen leichten (L-) Ketten, die durch Disulfidbrücken kovalent miteinander verbunden sind. Diese Disulfidbrücken sorgen für die Stabilität des Immunglobulins.
Das Molekulargewicht (MG) der schweren Ketten liegt dabei zwischen 50 000 – 75 000 Dalton, während die leichten Ketten ein Molekulargewicht von ca. 25 000 Dalton beitzen (JANEWAY & TRAVERS 2002).
Sowohl die schweren als auch die leichten Ketten setzen sich aus unterschiedlichen Domänen zusammen. Die leichten Ketten besitzen dabei eine variable und eine konstante Region, während die schweren Ketten neben der variablen Domäne je nach Isotyp 3 (IgG, IgA, IgD) bzw. 4 (IgM und IgE) konstante Domänen und für die Immunglobuline mit 3 konstanten Domänen eine Hinge-Region besitzen. Die Hinge-Region ermöglicht den Antigen bindenden Bereichen (Fab), unterschiedliche Winkelungen einzunehmen, ohne die Antigenspezifität durch Konformationsänderung zu verlieren.
Durch enzymatische Spaltung mit Papain können Antikörpermoleküle in drei Fragmente gespalten werden: zwei identische Fragmente, die die Antigenbindungsfähigkeit besitzen (Fab-Fragmente; Fragment antigen binding) und ein nicht antigenbindendes Fragment, das sich leicht kristallisieren lässt (Fc-Fragment; Fragment crystallizable). Die Antigenbindungsstelle ergibt sich aus der dreidimensionalen Struktur der Fab-Region, die durch ihre Aminosäuresequenz bestimmt wird. Da die Bindung des Antigens an den Antikörper auf der Ausbildung heteropolarer, nicht-kovalenter Bindungen beruht, ist eine enge strukturelle Übereinstimmung von Epitop (Bindungsbereich des Antigens) und Paratop (Bindungsbereich des Antikörpers) notwendig. Die einzelnen an der Bindung beteiligten Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, Van der Waals Kräfte, hydrophobe Interaktionen, sowie elektrostatische Kräfte, sind alle reversibel, und einzeln genommen nur sehr schwache Bindungen. Nur die Summe dieser Kräfte, sowie die Eigenschaft der Immunglobuline, mindestens zwei identische Bindungsstellen zu besitzen, erklärt deren hohe Affinität zu ihrem Bindungspartner und somit ihre biologische Kompetenz, geringe Antigenmengen selektiv zu binden.
Literaturübersicht
Die Vielfältigkeit der Antigenbindungsstelle wird v.a. durch die drei (sechs im gesamten Paratop) so genannten complementarity determining regions (CDR) gebildet, die auch als hypervariable Bereiche bezeichnet werden.
Die Fc-Region bestimmt die Sekundärfunktionen des Antikörpers, z.B. Komplementbindung und Interaktionen mit spezifischen Rezeptoren (Fc-Rezeptoren), zumeist erst nach Antigenbindung.
Aufgrund biochemischer Parameter unterscheidet man fünf Klassen an Immunglobulinen:
IgM, IgG, IgD, IgE und IgA und Subklassen wie IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 bzw. IgA1 und IgA2 (JANEWAY & TRAVERS 2002). Die Ig-Klasse bzw. Subklasse wird durch die Aminosäuresequenz der konstanten Domäne der schweren Ketten bestimmt. Nach serologischen und funktionellen Parametern spricht man statt von Klassen und Subklassen nur von Immunglobulin-Isotypen, die durch die Antigenität dieser Moleküle bestimmt werden.
Bei den leichten Ketten werden zwei Typen unterschieden, die als lambda (λ) oder kappa (κ) bezeichnet werden. Das Verhältnis von λ- zu κ- Ketten beträgt beim Menschen 2:3.
Auch beim Pferd konnten entsprechende lambda und kappa Ketten gefunden werden (MONTGOMERY 1973), deren Verhältnis bei 12:1 liegt (GIBSON 1974, HOME et al. 1992, FORD et al. 1994).
Im Rahmen der Arbeiten von Frau Dr. Wagner zum Ig-System des Pferdes (OVERESCH et al. 1998; WAGNER et al. 1995, 1997 & 1998) ist es gelungen, erstmals den konstanten Bereich der schweren Kette des equinen IgE vollständig und monoklonal zu exprimieren und zwar in Form eines spezifischen Antikörpers gegen ein Hapten (NIP = Nitrophenol). Somit steht ein monoklonales eqIgE mit definierter Haptenspezifität zur Verfügung. Unter Verwendung der gleichen Methode entwickelt Frau Wege die bisher fehlenden equinen IgG Isotypen. Auf Grund der beteiligten murinen Ketten, welche die Spezifität der equimurinen Antikörper bestimmen, detektieren auch diese Isotypen NIP. Ein aktualisiertes Bild der equinen Antikörperklassen steht somit zur Verfügung:
2.1.1 Immunglobulinsystem des Pferdes
Erste Untersuchungen zum Immunglobulinsystem des Pferdes wurden Mitte der sechziger bis Anfang der siebziger Jahre des 20. Jahrhunderts durchgeführt. Zu dieser Zeit galt das Interesse allerdings nicht dem Pferd an sich. In der Humanmedizin dienten Pferdeseren als Antikörperquelle zur passiven Immunisierung (Hyperimmunseren), beinhalteten aber das Risiko der „Serumkrankheit“, einer Allergie vom Typ III gegen Proteinbestandteile des equinen Serums bei wiederholter Applikation. Ziel war es daher, Antikörper möglichst von solchen Serumbestandteilen reinigen zu können. Anhand der Serumelektrophorese zeigte sich, dass sich das „Gesamtimmunglobulin“ in verschiedene Fraktionen auftrennen ließ. So konnten bereits IgM (ROCKEY et al. 1964; HILL & CEBRA 1965), IgA ( VAERMANN et al 1971, MC GUIRE et al. 1973), sowie vier IgG-Isotypen (IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T)) (ROCKEY et al. 1964; MONTGOMERY 1973; MC GUIRE et al. 1973) differenziert werden.
SUTER & FREY präparierten 1983 equines IgE aus Serum endoparasitisch stark infizierter Fohlen und gaben dessen Reinheitsgrad mit 83% an. Antiseren aus mit dieser IgE-haltigen Präparation immunisierten Kaninchen zeigten Kreuzreaktionen mit humanem, murinem und Ratten IgE.
Die ersten Forschungsarbeiten, die sich mit equinen Immunglobulinen beschäftigten, basierten auf serologischen und biochemischen Parametern. Dabei wurden unterschiedliche Aufreinigungsverfahren angewandt, wie zum Beispiel die DEAE- Cellulose- Säulenchromatografie aus der γ-Globulinfraktion aus Pferdeserum (HELMS & ALLEN 1970), die Ionenaustauschchromatographie (WIDDERS et al. 1986) oder aber Aufreinigung über die unterschiedliche Protein A und G Bindung (SHIMAZAKI & NAKAJIMA 1987). Bei diesen Verfahren trat wiederholt das Problem der Kontaminationen mit anderen Immunglobulin-Isotypen auf.
Mitte der neunziger Jahre erwachte neues Interesse an den Immunglobulin-Isotypen des Pferdes. Die Analyse der Organisation der Gensegmente für die konstanten Regionen der schweren Ketten (cH-Gene) der equinen Immunglobuline (WAGNER et al. 1998) ergab, dass das Pferd neben je einem IgM, IgE und IgA die genetische Information für mindestens sechs IgG Subtypen besitzt. Damit hat das Pferd nach dem Schwein die größte Anzahl an cγ Genen aller bisher untersuchten Säugetierspezies. Für jeden dieser Genabschnitte konnten ebenso korrespondierende Switch Regionen nachgewiesen werden, deren Nukleotidsequenz es nahelegt, dass alle exprimiert werden (können). Drei der IgG-Isotypen (IgG1 (bisher bezeichnet als IgGa), IgG3 (IgGT) und IgG4 (IgGb)) konnten in equi-murinen Hetero- Hybridoma-Zellen exprimiert werden, indem equine Lymphozyten mit Maus-Myelomzellen
Literaturübersicht
fusioniert wurden. Die übrigen, fehlenden IgG-Isotypen (IgG2, IgG5, IgG6) können seit kurzem in einem Säugetierexpressionssystem produziert werden. Dafür wurde das System mit den konstanten schweren Ketten der fehlenden Immunglobulinisotypen des Pferdes transfiziert. Die murine Ursprungszelle stellt die variable Domäne der Schweren Kette sowie die leichte Kette her. Das entstehende Konstrukt ist also ein zusammengesetztes Immunglobulin mit murinen leichten Ketten sowie der variablen Domäne der schweren Ketten, die übrigen Anteile der schweren Kette stammen aus dem Pferdegenom. Da die gesamte für die Antigenbindung verantwortlichen Bereiche aus der Maus stammen, ist das Paratop dieser drei Produkte identisch. Es determiniert für die Bindung von 4-(hydroxy-3- nitro-phenyl)acetyl (NP). Die so gewonnenen Isotypen stehen somit erstmalig zur Verfügung um monoklonale anti-Isotyp Antikörper zu generieren und funktionelle Effektorfunktionen im equinen System zu bestimmen.
Historische Bezeichnung der Immunglobulinisotypen des Pferdes auf Grund serologischer bzw. biochemischer Untersuchungen
IgM - IgGa - IgG(T)
IgA - IgGb - IgG(B)
IgE - IgGc
IgGa, b, c:
Diese Unterteilung erfolgte schon 1964 durch ROCKEY, der ihre unterschiedliche elektrophoretische Mobilität feststellte.
IgG(T):
Dieser IgG-Isotyp wurde erstmals im Serum von Pferden gefunden, die mit Tetanustoxoid immunisiert worden waren, weshalb es ursprünglich als IgT bezeichnet wurde (VAN DER SCHEER & WYKHOFF 1940). Erst später haben WEIR et al. (1966) es als ein IgG identifiziert und es in IgG(T) umbenannt
IgG(B) oder AI:
Die Zuordnung des von ROCKEY et al. (1964) beschriebenen Globulins wurde ebenfalls kontrovers diskutiert. Es wurde auch als „atypisches Makroglobulin“ (SANDOR et al. 1964) oder „aggregating immunoglobulin“ (AI) (ZOLLA & GOODMAN 1968) bezeichnet.
Serologische (HELMS & ALLEN 1970) sowie strukturelle Eigenschaften dieses Immunglobulins (SEIDE et al. 1987) zeigten allerdings seine Zugehörigkeit zur Klasse der IgGs.
So konnten insgesamt fünf equine IgG-Isotypen (IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T) und IgG(B)) mit Hilfe serologischer und biochemischer Verfahren definiert werden (MC GUIRE et al. 1973;
WIDDERS et al. 1986).
Ein IgD konnte bisher beim Pferd weder auf genetischer Ebene, noch im Serum zuverlässig nachgewiesen werden. Jüngste unveröffentlichte Studien werden diese Lücke jedoch bald hinreichend füllen (persönliche Kommunikation WEGE).
Bei Mensch und Maus kommt dem Immunglobulin-Isotyp IgE eine zentrale Bedeutung in der Allergie vom Typ I zu: IgE bindet über einen hochaffinen Rezeptor (FcεRI) bereits unkomplexiert an die dominierenden Typ I Effektorzellen (Mastzellen, basophile Granulozyten). Spezifische Antigenbindung an die zellständigen IgE-Moleküle führt, sofern diese in ausreichender Dichte vorhanden sind, zu einer Kreuzvernetzung der Immunglobuline und Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren. Hierdurch wird die Zelle aktiviert und es erfolgt die Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren sowie die Neusynthese und Freisetzung weiterer Mediatoren.
Anzahl und Anordnung der IGH-Gene beim Equiden
Die frühen serologischen und biochemischen Differenzierungen der Pferdeimmunglobuline wurden in den letzten Jahren durch die Untersuchung der Gene ergänzt, die für die Pferdeimmunglobuline codieren.
Dabei konnten die unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen ihrem entsprechenden Gen zugeordnet werden (WAGNER et al. 1998). Zur Vereinfachung wurde auf dem Immunoglobulin und Fc-Rezeptor Workshop in Uppsala, Schweden 2001 eine neue Nomenklatur festgelegt.
Literaturübersicht
Tab. 1 Nomenklatur des equinen Immunglobulinsystems Ig-isotypen
alte Nomenklatur
Ig-isotypen
neue Nomenklatur(a)
IGH Gene (b) GenBank accession number
IgM IgM IGHM L49414
IgGa IgG1 IGHG1 AJ302055
IgG2 IGHG2 AJ302056
IgG(T) IgG3 IGHG3 AJ312379
IgGb IgG4 IGHG4 AJ302057
IgG(T)(c) IgG5 IGHG5 AJ312380
IgGc(c) IgG6 IGHG6 AJ312381
IgE IgE IGHE AJ305046
IgA IgA IGHA nt
(a) Die neue Nomenklatur wurde im Immunoglobulin und Fc-receptor Workshop in Uppsala, Schweden 2001 festgelegt (http://medicine.uiowa.edu/CigW).
(b) Die offizielle IGH Nomenklatur, festgelegt auf der internationalen ImMunoGeneTics database (IMGT) (http://imgt.cines.fr).
(c) konnte auf Grund der in der Doktorarbeit von Anja Wege hergestellten rekombinanten Imunglobulin G Isotypen zugeordnet werden
Bei der Untersuchung der Anordnung der unterschiedlichen IGHG-Gene, konnte folgende Reihenfolge festgestellt werden:
5´ VDJ- IGHM - IGHG1 – IGHG2 - IGHG3 - IGHG4 - IGHG5 - IGHG6 - IGHE - IGHA 3´
(WAGNER et al. 1997 u. 1998)
Die Benennung der IGHG-Gene erfolgt hier nach der Reihenfolge im Genom. Für alle sechs IGHG-Gene konnte eine S-Region (switch-region; für den Klassenwechsel essentiell) nachgewiesen werden (OVERESCH et al. 1998). Es steht zu vermuten, dass die sechs IGHG- Gene des Pferdes auch in vivo exprimiert werden. Inzwischen wird ein siebtes IGHG-Gen untersucht, zum Zeitpunkt dieser Dissertation bezieht sich diese Aussage nur auf persönliche Kommunikation (WAGNER, WEGE)
Dass bisher nur 5 unterschiedliche IgG`s mit biochemischen und serologischen Verfahren im
andere Erklärung wäre auch eine große Homologie innerhalb der unterschiedlichen Isotypen und daraus resultierend ähnliche biochemische Eigenschaften, so dass es z.B. in der Elektrophorese nicht zu einer Auftrennung kommen kann. Für diese Annahme sprechen auch die Forschungsarbeiten von SHEORAN & HOLMES (1998), die IgG(T) in 2 Fraktionen aufteilen konnten, indem sie eine Aufreinigung über Protein A und G vornahmen. Eine Fraktion zeigte dabei eine hohe Bindungsaffinität an Protein A, während die andere Fraktion nur schwach daran binden konnte. Demnach dürfte das Pferd tatsächlich über mindestens sechs unterschiedliche als vollständige Antikörper exprimierte IgG-Isotypen verfügen.
Sequenzen der unterschiedlichen IGHG Gene beim Pferd
Bei allen sechs IGHG-Genen zeigt sich eine große Homologie innerhalb der einzelnen CH- Domänen, die zwischen 58% (zwischen der CH1 Domäne von IgG3 und IgG5) und 94%
(zwischen der CH1 Domäne von IgG4 und IgG6) liegen. Die größte Variabilität innerhalb der IGHG-Gene findet sich in der Hinge-Region der Immunglobuline. Sie liegt zwischen 8%
(IgG4 zu IgG3) und 53% (IgG4 zu IgG5 und IgG6) (Wagner et al. 2002).
Tab. 2 Homologie zwischen den einzelnen IgG Isotypen des Menschen bzw. des Pferdes
Anzahl der IgG Isotypen Homologie der
Ch Domänen der IGHG
Homologie innerhalb der Hinge-Region
Mensch 4 - 95%
Pferd 6 (7) 58-94% 8-53%
2.1.2 Sekundärfunktionen von Antikörpern
IgG ist der häufigste Isotyp im Blut fast aller Säuger und kommt in hohen Konzentrationen im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten sowie auch auf Schleimhautepithelien im Darm und im respiratorischen Trakt vor. Damit können sie wichtige Aufgaben insbesondere durch die Interaktion mit unterschiedlichen Fc gamma (Fcγ)-Rezeptoren (DOMBROWICZ et al. 1997; DAERON 1997) ausüben. Dazu gehören u.a. die Opsonierung von Pathogenen für die Aufnahme von Phagozyten, Neutralisation von Toxinen, Sensibilisierung von Mastzellen, die Aktivierung von B-Zellen zur Antikörperproduktion (RAVETCH & KINET 1991) und die Aktivierung des Komplementsystems (DUNCAN & WINTER 1988). Welche IgG-
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Isotypen welche Funktionen übernehmen können und an welche Rezeptoren diese binden, ist für den Menschen und für die Maus bereits nachgewiesen (JANEWAY & TRAVERS 2002).
Für andere Tierarten, inklusive der Equiden, liegen nur wenige oder gar keine Untersuchungen vor.
Die unterschiedlichen IgG-Isotypen dienen auch zur gegenseitigen Regulation, indem sie entweder durch Bindung an unterschiedliche Rezeptoren und Zielzellen wirken oder aber über den so genannten negativen Rückkopplungsmechanismus die weitere Expression von Antikörpern inhibieren. Dabei bewirkt eine große Anzahl löslicher Antikörper eine Suppression der Immunglobulin produzierenden B-Zellen. Durch eine hohe Konzentration von freien Antikörpern werden die Epitope der Antigene abgedeckt und verhindern damit die weitere Bindung von Epitopen an B-Zell-Rezeptoren. Zusätzlich kann ein immunkomplexiertes Antigen über inhibitorische Fcγ-Rezeptoren und den BCR selektiv zu einer Hemmung der B-Zelle führen. Damit werden diese Zellen nicht weiter aktiviert und stellen die Produktion neuer freier Antikörper ein.
Komplementsystem-Aktivierung
Beim Menschen gehören IgG1 und IgG3 zu den Hauptaktivatoren des Komplementsystems (DILLMAN et al. 1995), während bei der Maus auch das IgG2a (DUNCAN et al. 1988, RAJNAVOLGYI et al. 1995) diese Funktion besitzt. Die Effektivität der Aktivierung ist dabei abhängig von der Aminosäuresequenz und der Glykolisierung der CH2-Domäne (THOMMESEN et al. 2000).
Beim Pferd konnte die Aktivierung durch IgGa, b, c nicht aber durch IgG(T) und IgGc nachgewiesen werden (MCGUIRE et al. 1973).
Die Aktivierung der Komplementkaskade löst verschiedene Funktionen aus, wie zum Beispiel die Lyse der Zielzelle, die Aktivierung von Makrophagen oder die Opsonierung von Antigenen durch die Anlagerung von C3b und C4b, die damit die Phagozytose erleichtern.
Auch bei der Beseitigung von Immunkomplexen (Antikörper gekoppelt an Toxine oder Reste von toten Mikroorganismen) spielen aktivierte Komplementkomponenten eine wichtige Rolle, da durch ihre Bindung an die Immunkomplexe diese an Erythrozyten gekoppelt werden können (CR1 oder CD35: complement receptor 1). Die so beladenen Erythrozyten gelangen dann zu Milz und Leber. Dort entfernen und phagozytieren Makrophagen die Komplexe von der Oberfläche der Erythrozyten ohne diese zu beschädigen.
Fc Rezeptor-Bindung
Besonders wichtig für die Funktion der IgG Isotypen ist ihre Fähigkeit, an Fc-Rezeptoren binden zu können. Unter anderem können IgG Isotypen nachdem sie an ein freies Antigen (z.B. Viruspartikel) gebunden haben, Bindung mit Fcγ-Rezeptoren auf phagozytierenden Zellen eingehen und diese dadurch aktivieren.
Auch das Erkennen von Antigen auf infizierten Zellen erfolgt über die Bindung von Immunglobulinen, die dann an Fc-Rezeptoren auf Natürlichen Killerzellen binden können.
Diese als ADCC (antibody dependent cellular cytotoxity) bezeichnete Reaktion führt entweder durch Apoptoseinduktion z.B. über Fas/Fas-Ligand-Interaktion oder durch Freisetzung toxischer Stoffe (Perforin, Granzyme) zum Abtöten der infizierten Zelle.
Da diese Aktivierung auch eine entzündliche Reaktion und damit auch Gewebeschäden auslösen kann, ist es notwendig, dass die Fc-Rezeptoren auf diesen Zellen Antikörper, die an ein Pathogen gebunden haben, von der großen Zahl der ungebundenen IgG`s unterscheiden können. Bei den IgG Isotypen erfolgt nach der Bindung an ein Antigen eine Konformationsänderung im Fc-Teil und erst dadurch wird es ihnen ermöglicht, an die Fcγ- Rezeptoren der Phagozyten zu binden.
Je nach Immunglobulin-Isotyp konnten bei Maus und Mensch unterschiedliche Fc- Rezeptoren nachgewiesen werden (FcαR, FcγR, FcµR, FcεR). Diese werden auf unterschiedlichen Zellen exprimiert und weisen große Unterschiede in ihrer Funktion und Bindungsaffinität auf.
Bei Maus und Mensch konnten drei Fcγ-Rezeptor-Typen nachgewiesen werden (UNKELESS et al. 1988; RAVETCH & KINET 1991), die eine unterschiedliche Affinität zu den einzelnen IgG-Isotypen aufweisen (VAN DE WINKEL & CAPEL 1993).
FcγRI (CD64):
Der FcγRI gehört zu den hochaffin bindenden Rezeptoren und wird auf Monozyten und Makrophagen exprimiert. Auf neutrophilen Granulozyten und Mastzellen kann er durch IFN-γ induziert werden (OKAYAMA et al. 2000). Er besitzt beim Menschen eine hohe Affinität zu IgG1 und IgG3 und bei der Maus für IgG2a, IgG3 und IgG1. Im equinen System wurde bisher kein äquivalenter Rezeptor beschrieben.
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FcγRII (CD32):
FcγRIIa und FcγRIIb gehören zu den niederaffinen Rezeptoren, die auf Makrophagen, Neutrophilen, Eosinophilen, Thrombozyten, Basophilen und B-Lymphozyten exprimiert werden und alle humanen IgG-Isotypen aber nur die murinen IgG1 und IgG2b binden können.
Sie unterscheiden sich auch im Aufbau von den anderen Fcγ-Rezeptoren, da sie monomer sind und entweder aktivierend (FcγRIIa) oder hemmend (FcγRIIb) auf die Zellen wirken (RAVETCH & CLYNES 1998). In einer Veröffentlichung von AGGARWAL wurden zwei monoklonale Antikörper beschrieben, die in Analogie zum humanen System Fc-Rezeptoren des Pferdes binden - eine Zuordnung, ob CD32 oder CD16 entsprechende Strukturen gebunden wurden, fehlt zur Zeit (AGGARWAL et al. 2000).
FcγRIII (CD16):
Er wird auf natürlichen Killerzellen, Neutrophilen, Eosinophilen und Makrophagen exprimiert und zeichnet sich ebenfalls durch eine niedrige Affinität aus. Beim Menschen kann er IgG1 und IgG3, bei der Maus IgG2a und IgG2b binden. (RAVETCH & KINET 1991).
FcεRI :
Dieser Immunglobulinrezeptor hat die höchste bisher beschriebene Affinität zu seinem Liganden (IgE) mit 1010 M-1. Auf Grund der hohen Bindungsstärke lagert sic bereits freies IgE an diesen Rezeptor an und sensibilisiert so Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren. Obligat wird er von Basophilen und Mastzellen gebildet. Nach Aktivierung sind aber auch Eosinophile, Neutrophile, dendritischen Zellen sowie deren Vorläufer, die Monozyten in der Lage, den FcεRI zu exprimieren (Sihra et al. 1997).
Der funktionelle membranständige FcεRI besteht aus 3 verschiedenen Ketten. Die α-Kette ist der eigentliche Rezeptor für das Fc-Fragment des IgE. Weiterhin findet man eine β-Kette mit vier transmembranösen Schleifen, wobei die Carboxy- und Amino-terminalen Aminosäuren intracytosolisch liegen. Zur Signaltransduktion dient ein Homodimer der γ-Kette, deren intracytosolischer Bereich jeweils eine ITAM-Sequenz aufweist (immunoreceptor tyrosine- based activation motif). Inzwischen wird bereits der Bindung von monomerem IgE eine Signalwirkung zugeordnet, da die Expressionsdichte von FcεRI sowie das Überleben von Mastzellen von der Anwesenheit bzw. Bindung von IgE an diesen Rezeptor abhängt (MACGLASHAN et al, 1999, KITAURA et al, 2003). Beim Pferd wurde die Sequenz der α- Kette durch MCALEESE et al. im Jahr 2000 publiziert, 2003 konnte die gleiche
FcεRII (CD23):
Dieser niederaffine Rezeptor für IgE ist der einzige Fc-Rezeptor, der nicht zur Superfamilie der Immunglobulin-Gene gehört. Seine Struktur ähnelt Typ 2 Lektinen, das carboxyterminale Ende liegt extrazellulär (C-type lectins). Seine Fähigkeit zur Polymerisation ermöglicht erst die Bindung von IgE, Monomere zeigen eine zu geringe Affinität. Dieser Rezeptor wird von einer Reihe von Zellen inklusive Monozyten, Makrophagen, Eosinophilen, Basophilen, T- Zellen und als Bestandteil des B-Zell-Rezeptor-Komplexes auch von B-Zellen exprimiert (DIERKS et al, 1993). Bei letzteren ist er wichtig für die Aufnahme löslicher Antigene und deren Präsentation an CD4+ T-Zellen (GROSJEAN et al, 1994).
Bei den übrigen Zellen kann durch ihn die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die Pino- sowie die Phagozytose induziert werden. Das extracytosolische Spaltprodukt wird auch als IgE-binding factor (IgE-BF) in der Literatur gefunden (YODOI et al, 1989).
Wie wichtig die Fc-Rezeptorbindung für die Immunkompetenz eines Individuums ist, zeigten Studien an Mäusen, denen die genetische Information für die gamma Einheit des Fc- Rezeptors fehlte. Diese wiesen eine starke Immunsuppression mit reduzierter Effektivität der natürlichen Killerzellen, der Makrophagen, der Phagozyten und auch der Mastzellen auf (TAKAI et al. 1994). Auch die Erforschung der equinen Fc-Rezeptorbindung wird unter anderem durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen bestimmte Rezeptoren weiter vorangetrieben (AGGARWAL et al. 2000). Dabei konnten zwei Fcγ-Rezeptoren, die äquivalent zu den bei Maus und Mensch gefundenen FcγRII und FcγRIII sind, beim Pferd nachgewiesen werden. Durch die Verwendung dieser mAK konnte die Fcγ-Rezeptor abhängige Rosettenbildung zwischen Schaferythrozyten und equinen PBMC`s inhibiert und damit die Spezifität der Antikörper nachgewiesen werden.
Vergleichende Untersuchungen der Aminosäuresequenz von IgG Isotypen bei Mensch und Pferd lassen vermuten, dass IgG1, IgG3 und IgG6 an Fcγ Rezeptoren binden können (WAGNER et al. 2002b) und damit wichtige Funktionen in der Immunantwort spielen.
Für das humane IgG1 konnten 17 Aminosäuren in der CH2 Domäne bestimmt werden, die für die Bindung an Fcγ-Rezeptoren wichtig sind (SONDERMANN et al. 2000). 16 dieser Aminosäuren fand man auch in der CH2 Domäne des equinen IgG1 und 15 in der CH2 Domäne des IgG3. Besonders wichtig für die Bindungsaffinität an die Fcγ-Rezeptoren scheint hierbei das Leucin (235) zu sein, das, wenn es Glu235 ersetzt, die Affinität des murinen IgG2b um das 100fache steigern konnte (DUNCAN et al. 1988). Dieses Leucin findet sich nur beim equinen IgG1, IgG3 und IgG6, nicht allerdings bei den anderen drei IgG Isotypen (WAGNER et al. 2002b).
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2.2 Allergie
2.2.1 Physiologische Immunmechanismen als Grundlage der überschießenden Reaktionen bei Allergien
Sämtliche Immunmechanismen, aus denen sich nach heutigem Verständnis das klinische Bild einer Allergie entwickeln kann, finden im Rahmen physiologischer Prozesse ihre Entsprechung. Die Initiation der jeweiligen Immunmechanismen ist immer Bestandteil einer adaptiven Immunantwort, während die reaktiven, häufig inflammatorischen Prozesse eher dem angeborenen Ast des Immunsystems angehören. Immunmechanismen, die sich, entgegen ihrer eigentlichen Bestimmung, inadäquat, oft in überschießendem Maße gegen Antigene richten und so zur Erkrankung des Individuums führen, bezeichnet man daher als Allergien.
Sie sind somit Hypersensibilitäts- oder Überempfindlichkeitsreaktionen. Die vom Immunsystem mit einer solchen überschießenden Reaktion beantworteten Antigene werden als „Allergene“ bezeichnet. Diese Allergene sind zumeist exogene Antigene, deren Herkunft pflanzlicher, tierischer oder, im Einzelfall anorganischer Natur sein kann. Wenn sich die Antwort des Immunsystems gegen körpereigene Antigene richtet, grenzt man die Allergie (exogene Antigene) gegen die Autoagression ab (endogene Antigene).
GELL und COOMBS (1968) teilten die Allergien in vier Typen ein und unterschieden dabei grob Antikörper vermittelte Immunreaktionen (Typen I bis III) von Antikörper unabhängigen, Zell vermittelten (Typ IV). Diese Formen von Immunmechanismen haben primär wichtige physiologische Bedeutungen. Aus weitgehend noch unbekannten Gründen können diese lebens- und funktionserhaltenden Mechanismen „überschießend“ ausgeführt und so zu Pathomechanismen werden. Eine Typ V Allergie, deren Antikörper abhängiger Pathomechanismus sich deutlich von den anderen Typen unterscheidet, hat bisher noch keinen allgemein gültigen Eingang ins Schrifttum gefunden.
Typ I-Allergien sind die Allergien vom Soforttyp, bei denen die klinischen Symptome in der Regel sehr schnell, meist innerhalb von Minuten (selten Stunden) nach dem Allergenkontakt auftreten. Diesem Mechanismus können protektive, regulatorische aber auch überschießende immunologische Reaktionen zugeordnet werden (COSTA et al. 1997).
Im Rahmen der immunologischen Antwort eines Individuums gegen ein Antigen synthetisieren B-Zellen, unter Einfluss von TH2-Zellen und deren Signalmolekülen
(FcεRI) auf der Oberfläche von v.a. Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden.
Diese zwei Zelltypen exprimieren diesen Rezeptor obligatorisch, während er auf einigen anderen Zellen induziert werden kann (FROESE 1984).
Freies Serum-IgE hat eine Halbwertszeit von wenigen Tagen. Ungebunden liegt IgE im Vergleich zu anderen Immunglobulin-Isotypen in sehr geringen Konzentrationen im Serum vor. Allerdings ergeben sich hier tierartliche Unterschiede in stärkerem Maße, als bisher vermutet. (IgE Spiegel aus WAGNER et al. 2002) Ein wesentlicher Grund für den niedrigen IgE Spiegel ist die Bindung an FcεRI, denn frei verfügbares IgE induziert diesen Rezeptor (FURUICHI et al. 1985; KUBO et al. 2001). Durch die Expression neuer Rezeptoren für IgE wird der Serumspiegel an IgE gesenkt.
In letzter Zeit konnten verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass bereits die Bindung von freiem IgE an seinen Rezeptor eine Signaltransduktion hervorruft (CHARLES et al. 2004).
Bereits diese Bindung trägt zur Aktivierung, der Rezeptorexpression sowie zum Überleben der allergischen Effektorzellen bei (KITAURA et al. 2003).
Dieser autokrine Verstärkungsmechanismus der FcεRI Expression ist initial nur vom Isotyp, also dem IgE abhängig. Eine fortgesetzte Präsenz des Antigens (Allergens) kann aber eine positive Rückkopplung des Typ I Immunmechanismus bewirken, indem allergenspezifische B-Zellen iterativ aktiviert werden. Die notwendigen Zytokine werden von Basophilen und/oder Mastzellen selbst zur Verfügung gestellt (GAUCHAT et al. 1993; YANAGIHARA et al. 1998). Als Folge dominieren jene IgE-Idiotypen den Serumpool, deren B-Zellen wiederholt oder dauerhaft aktiviert werden.
Kommt es im weiteren zu einem erneuten Kontakt des Individuums mit dem Allergen, so führt dessen Bindung an die spezifischen zellständigen IgE-Moleküle der sensibilisierten Mastzellen oder Basophilen zu einer Kreuzvernetzung dieser Immunglobuline, sofern sie auf der Zelloberfläche in ausreichender Dichte vorhanden sind. Die so herbeigeführte Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren aktiviert die Zelle, die zum einen innerhalb von Sekunden mit Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren (u.a. Histamin, Proteoglykane, Proteasen) aus zytoplasmatischen Granula reagiert (Sofortreaktion). Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten;
v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), aber auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet. Diese erhalten die Entzündungsreaktion über Stunden aufrecht (Spätreaktion).
Im gesunden Individuum besiedeln die Mastzellen die Lamina propria der Schleimhäute sowie die Subcutis der Epidermis. Wie auch der Basophile entstehen die Mastzellen im Knochenmark. Während ihres Aufenthaltes im peripheren Blut beladen sich die Zellen mit
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monomerem IgE und verlassen derart sensibilisiert die Blutbahn. Dementsprechend werden die Fcε Rezeptoren mit einem zum Zeitpunkt der Beladung repräsentativem Querschnitt aller IgE - Idiotypen im Serum ausgestattet .Im Gewebe können diese Zellen dann bei erneutem Kontakt zu einem Antigen, gegen das sie spezifische Immunglobuline gebunden haben, degranulieren. Mastzellen stellen somit einen wesentlichen Anteil der „first line of defense“
dar. Die freigesetzten Mediatoren bewirken im Gewebe eine lokale Begrenzung der Antigenverteilung, indem sich der Blutfluss im irritierten Bereich verlangsamt und die Exsudation von Plasma sich erhöht. Es kommt zur Ödembildung. Im Folgenden werden weitere Leukozyten chemotaktisch angelockt. Es etabliert sich eine Entzündung.
Seine physiologische Bedeutung hat dieser Mechanismus v.a. im Zuge der Immunantwort auf parasitäre Infektionen (Helminthen). Er ist aber auch bei der Abwehr anderer Pathogene, inklusive bakterieller, beteiligt.
Kommt es zur Ausprägung pathologischer Hypersensibilitätsreaktionen unter diesem Mechanismus können diese lokal beschränkt, aber auch systemisch ablaufen. Beispiele für Typ I Allergien des Menschen sind die allergische Rhinitis (Heuschnupfen), das Asthma, aber auch die systemische Anaphylaxie bis hin zum allergischen Schock.
Eine Aktivierung der Zellen zur Mediatorfreisetzung ist allerdings nicht alleine auf eine IgE- Vermittlung beschränkt. Auch andere Substanzen sind über spezifische Rezeptoren, z.B. IgG über FcγRI, IIa und III, in der Lage, eine Degranulation sowie die Neusynthese der Mediatoren auszulösen.
Untersuchungen bei allergischen Reaktionen haben bei Maus und Mensch gezeigt, dass hier verschiedene IgG-Isotypen beteiligt sind. Entsprechende Fcγ-Rezeptoren, die die Bindung von IgG-Isotypen auf Mastzellen ermöglichen, konnten auf humanen Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al. 2000 & 2003). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der Maus das IgG1 (DOMBROWICZ et al. 1997) und beim Mensch das IgG4 (KIEKENS et al. 2000) eine modulatorische Rolle bei der Aktivierung der Effektorzellen der Typ I Allergie (Mastzellen, basophile Granulozyten) und damit bei der Freisetzung der allergischen Symptome auslösenden Mediatoren wie z.B. dem Histamin spielt. Nachgewiesen werden konnte dies im Mausmodell: Mäusen, denen das IGHE Gen fehlt und die somit nicht in der Lage sind, IgE zu produzieren, zeigten dennoch anaphylaktische Reaktionen und nachgewiesene Mediatorfreisetzung aus Mastzellen (OETTGEN et al. 1994). Im Mausmodell ebenfalls nachgewiesen, ist die inhibitorische Wirkung auf die IgE vermittelten allergischen Reaktionen durch bestimmte FcγRIIb- Rezeptoren nach der Bindung von IgG (UJIKE et al. 1999; KATZ et al. 2002).
Bei Typ II Mechanismen dagegen handelt es sich um durch Antikörper vom IgG- und IgM- Isotyp vermittelte Immunmechanismen. Auf der Oberfläche partikulärer Antigene gebundenes IgG (Antigen-Antikörper-Komplex) kann Phagozyten über deren Fcγ-Rezeptoren dazu aktivieren, diese opsonisierten Antigene per Phagozytose zu eliminieren. Auf Zelloberflächen gebundenes IgG kann von NK-Zellen, die den FcγRIII exprimieren, erkannt werden, woraufhin diese die antikörpermarkierten Zielzellen zytotoxisch zerstören (antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC)). Ein dritter IgG-vermittelter Mechanismus ist die Aktivierung des klassischen Weges der Komplementkaskade über die Bindung von antigengebundenem IgG, und effektiver noch IgM, an C1q, einem von drei Proteinen im C1-Komplex. Die Aktivierung von C1q durch IgG erfordert jedoch eine ausreichend hohe Epitop- und Immunglobulindichte auf dem Pathogen, da dieser Komplementfaktor hierzu an mindestens zwei aktivierten Fc-Teilen komplementbindender Immunglobulinmoleküle binden muss.
Im Rahmen dieser Allergie sind die Antikörper gegen zellassoziierte Antigene gerichtet und lösen entweder über Phagozyten und NK-Zellen oder über das Komplementsystem die charakteristischen Effektormechanismen aus. Ein Beispiel aus der Humanmedizin hierfür sind die Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Penicillin, Methyldopa oder Chinidin. Diese Medikamente binden auf der Zelloberfläche von Erythrozyten oder Thrombozyten. Existieren spezifische Antikörper, die diese Medikamente erkennen, binden diese und lösen eine Komplementaktivierung aus, die zur Entfernung der betroffenen Blutzellen und somit zur immunhämolytischen Anämie bzw. Thrombozytopenie führt.
Antikörper können ebenso gegen körpereigene Zell- oder Matrixantigene gebildet werden und sind unter dem Typ II-Mechanismus so die Ursache für Autoimmunerkrankungen, wie die autoimmune hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura, Goodpasture-Syndrom, oder Pemphigus vulgaris.
Auch bei Immunmechanismen vom Typ III sind Antikörper beteiligt. Im Gegensatz zu Typ II-Mechanismen sind die Antikörper jedoch gegen lösliche Antigene gerichtet, mit denen sie primär lösliche Immunkomplexe bilden.
Die im Verlauf der physiologischen Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexe aktivieren – wenn komplementbindende Isotypen beteiligt sind - das Komplementsystem (klassischer Weg), werden mit dessen Hilfe über den Komplementfaktor C3b an Erythrozyten angelagert (Komplementrezeptor 1) und zur Milz und Leber transportiert, wo sie von Makrophagen phagozytiert werden.
Bei der Typ III-Allergie entstehen durch Antigenüberschuss relativ kleine Aggregate von Antigen-Antikörper-Komplexen. Durch diese wird das Komplementsystem schlechter aktiviert (mangels komplementbindender Antikörperisotypen) und deshalb werden diese
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Immunkomplexe schlechter oder gar nicht an Erythrozyten gebunden, da diese zwar den Komplementrezeptor CR1, jedoch keine Fc-Rezeptoren haben. Dies führt zu einem verminderten Abbau kleiner Immunkomplexe. Diese freien Komplexe neigen dazu, sich an den Basalmembranen kleiner Gefäße abzulagern. Mastzellen können solche Komplexe binden (über FcγRIII) und dadurch aktiviert werden. Die TNFα-Freisetzung durch so aktivierte Mastzellen gilt als Hauptursache für die folgenden Entzündungsreaktionen (WATANABE et al. 1999; BAUMANN et al. 2001), da hierdurch Leukozyten in das Entzündungsgebiet gelockt werden. Über eine Verknüpfung von Fc-Rezeptoren und Komplementrezeptoren auf Leukozyten werden diese aktiviert und lösen im Folgenden eine Schädigung des umliegenden Gewebes aus.
Ein klassisches Beispiel für die Typ III-Allergie ist die so genannte „Serumkrankheit“, die heute noch bei der Anti-Venin-Behandlung eine Rolle spielt. Serum von Pferden, die zuvor mit Schlangengift immunisiert wurden, dient dabei als Quelle für neutralisierende Antikörper bei der Behandlung von Schlangenbissen beim Menschen. Injizierte Bestandteile, insbesondere die Antikörper aus dem Pferdeserum, lösen eine adaptive Immunantwort des Empfängers mit Bildung anti equiner Antikörper aus, die bei wiederholter Applikation eines solchen Serums zur Immunkomplexbildung mit den zirkulierenden Antigenen führt. Diese massive Bildung von Immunkomplexen führt zu deren Ablagerung in Gefäßen, Nieren und Gelenken und somit zu autoagressiven Vasculitiden, Glomerulonephritis und Arthritiden.
Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes mit Bildung von ANA´s (Anti Nukleäre Antikörper: Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile wie DNS, Histonen oder anderen Nukleoproteinen).
Letztlich besteht noch die Möglichkeit, dass Antikörper, ohne Beteiligung von Fc- vermittelten Sekundärreaktionen allein durch ihre spezifische Bindung zur Erkrankung führen (Typ V-Reaktionen). Unter physiologischen Umständen erfüllen Antikörper neben ihrer vermittelnden Rolle im Rahmen der Opsonisierung und Komplementaktivierung auch ohne Beteiligung weiterer Faktoren, bestimmte Funktionen. So sind sie wichtig zur Neutralisation z.B. von Toxinen, oder beeinflussen über ihre Bindung an zellständige Rezeptoren z.B. die Produktion von weiteren Antikörpern.
Bei einer Typ V Allergie können die im Rahmen von Infektionen gebildeten Antikörper mit körpereigenen Strukturen, z.B. Rezeptoren kreuzreagieren und diese z.B. stimulieren (TSH-
Auch in der Zell vermittelten Immunantwort (Typ IV Immunmechanismus) kann es, ohne Beteiligung von Immunglobulinen, zu Störungen im Sinne von Allergie oder Autoaggression kommen. Wird ein Antigen von den antigenpräsentierenden Zellen hierbei über MHC- Klasse II an der Zelloberfläche gezeigt, werden dadurch CD-4-T-Zellen (T-Helferzellen) angesprochen. Pathogen- und milieuabhängig können sich die CD-4-Zellen daraufhin in mindestens zwei Richtungen, TH1 oder TH2, differenzieren und im Weiteren anhand der Sekretion charakteristischer Zytokine und Chemokine z.B. Makrophagen aktivieren und B- Zellen zur IgG-Produktion anregen (TH1) oder z.B. durch Einfluss auf die Differenzierung antigenaktivierter B-Zellen eine v.a. antikörpervermittelte Immunantwort auslösen (TH2).
Im Verlauf von Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV erfolgt die Differenzierung der T-Helferzellen zu TH1-Zellen, bei Typ I-Allergien zu TH2. Altbekanntes Beispiel einer T- Zell vermittelten Allergie ist die Tuberkulinreaktion, aber auch Kontaktallergien, z.B. auf Pentadecacatechol, einer Substanz aus den Blättern des Gift-Sumach oder Metallionen, wie Nickel und Chrom fallen unter diese Kategorie. Eine Autoimmunerkrankung, die diesem Mechanismus folgt ist z.B. die gegen das basische Myelinprotein (MBP) gerichtete autoaggressive Reaktion, die zur multiplen Sklerose führt.
Wird ein Antigen über MHC-Klasse I präsentiert, reagieren darauf CD-8-Zellen und differen- zieren unter dem regulierenden Einfluss von T-Helferzellen zu zytotoxischen T-Zellen aus.
Diese töten zum einen diese antigenpräsentierenden Zellen ab, können aber auch Zytokine sezernieren, die u.a. Makrophagen anlocken und aktivieren (IFNγ, TNFα, TNFβ).
Lipidlösliche Allergene, wie Pentadecacatechol können über diesen Weg eine Gewebs- schädigung verursachen, da sie die Zellmembran durchqueren können und Proteine im Zellinneren verändern. Als Peptide gelangen diese dann über das endoplasmatische Reticulum und MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche, wo sie von CD-8-Zellen erkannt werden.
(JANEWAY und TRAVERS 2002)
Diese hier beschriebene Klassifikation der Immunmechanismen (Typ I-V) wurde in die Veterinärmedizin übernommen, obwohl sie sich größtenteils auf Untersuchungen im humanen und murinen System stützt. In wie weit sich die zu Grunde liegenden Immunmechanismen auf andere Spezies, insbesondere auf das Pferd, in allen Einzelaspekten transponieren lassen, ist heute in weiten Teilen noch ungeklärt.
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2.2.2 Die saisonal rekurrierende atopische Dermatitis des Pferdes – das Sommerekzem
Das Interesse an der Typ I Allergie wuchs, als die Häufigkeit dieser Erkrankung beim Menschen zunahm. Lange bevor die immunologichen Grundlagen einer Typ I Allergie erkannt wurden, berichteten französische Pferdehalter um 1840 von einer saisonal auftretenden Dermatitis (Lecoq 1842/43, Ref. in: UNKEL 1985). Zu dieser Zeit war das Sommerekzem in Indien ebenfalls bereits bekannt (DATTA, 1939, Ref. in: UNKEL 1985).
Mittlerweile liegen vergleichbare symptomatische Beschreibungen aus allen Teilen der Welt vor, wenn auch mit den verschiedensten Bezeichnungen versehen (sweet itch, queensland itch, ardeurs, dermite estivale recidivante, Kasen). Dabei wird von erkrankten Pferden der verschiedensten Rassen berichtet. Araber scheinen ebenso betroffen zu sein, wie z.B. Quarter Horse, englische Vollblüter, deutsches Kaltblut, Haflinger oder Islandpferde. Sogar bei Eseln und Maultieren wird das Sommerekzem beschrieben. Eine eindeutige Rassendisposition besteht dabei nicht. Islandpferde stellen jedoch in Deutschland eine der stärker betroffenen Rassen dar. Die Erkrankungshäufigkeit dieser Rasse wird in verschiedenen Untersuchungen zwischen 15% und 20%, für aus Island exportiere Tiere auf fast 25% geschätzt (UNKEL 1985). Andere berichten von bis zu 60-70% Erkrankungsrate exportierter Tiere (RÜSBÜLDT 2001 sowie persönliche Mitteilungen isländischer Pferdezüchter). Dies erklärt die enorme wirtschaftliche Bedeutung des Sommerekzems speziell für die isländische Landwirtschaft, deren Exportquoten seit Mitte der achtziger Jahre, nach bekannt werden dieser Zusammenhänge, dramatisch sanken. (UNKEL 1985, HECK 1991)
Durch eine Studie an Islandpferden im Rheinland konnte gezeigt werden, dass das Sommerekzem multifaktoriell vererbt wird. Dabei wird allerdings eine Heritabilität von nur etwa 10% angenommen, wobei der Einfluss der Stute hier unerklärlicherweise größer zu sein scheint, als der des Hengstes. Eine Disposition bezüglich Fellfarbe oder Geschlecht, wie von anderen Autoren vormals postuliert, konnte hier nicht nachgewiesen werden (UNKEL 1985).
Dass es sich beim Sommerekzem um eine allergische Reaktion auf Stiche bestimmter Blut saugender Insekten handelt, wurde schon 1954 von RIECK aufgrund von Untersuchungen in Australien geschlossen. Heute gilt es als gesichert, dass insbesondere Culicoides spp.
(Gnitzen) weltweit als die bevorzugten Auslöser anzusehen sind. Aber auch anderen Insektenarten wird eine gewisse Bedeutung zugewiesen, z.B. Stomoxis calcitrans und
calcitrans mit einem subepidermalen Ödem und begrenzter Eosinophilie reagieren, ähnlich dem histopathologischen Bild des Sommerekzems. Der Versuch, die für das Sommerekzem verantwortlichen Allergene von Culicoides genauer zu identifizieren, indem aufgetrennte Fraktionen für intradermale Hauttests eingesetzt wurden, gelang nicht (MORROW et al.
1986). QUINN et al. (1983) konnten die Reaktionsbereitschaft der Haut auf Culicoides Extrakte über das Serum erkrankter Tiere auf gesunde Pferde übertragen. Dies bestärkte den Verdacht, dass es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt. Dies folgerten auch STROTHMANN-LÜERSSEN et al. (1992), die, in Übereinstimmung zur Flohbissallergie des Hundes und der saisonalen allergischen Dermatitis des Schafes, bei histologischen und biochemischen Untersuchungen von an Sommerekzem erkrankten Pferden sowohl eine Infiltration von eosinophilen Granulozyten, als auch einen Anstieg von entzündungs- und allergiespezifischen Leukotrienen in den veränderten Hautbereichen fanden. Die Ansammlung eosinophiler und neutrophiler Granulozyten und die Ödembildung nach intradermaler Applikation von Culicoides Extrakt kann zudem durch die Histamin-1- Rezeptor Antagonisten Chlorphenamin und Mepyramin gehemmt werden (FOSTER et al.
1997). Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass auch bei Equiden eine phänotypische Differenzierung von TH1 und TH2 Zellen möglich ist, also entsprechend dem humanen System eine Immundeviation mittels Zytokinen auch in vivo als möglich gelten darf (AGGARWAL & HOLMES 2000; AGGARWAL und HOLMES 1999).
Anhand des von ihr entwickelten funktionellen in-vitro Testes gelang es KAUL (1998), eine spezifische Histaminausschüttung basophiler Granulozyten auf eine Stimulation mit Culicoides nubeculosus in Blutproben vorberichtlich Sommerekzem positiver Pferde nachweisen, während Blutproben von Pferden ohne Sommerekzem nicht reagierten. Diese Ergebnisse konnten von KOBELT (2001) bestätigt werden. KOBELT wies zudem nach, dass die spezifische Sensibilisierung basophiler Granulozyten gegen Culicoides auch im Winter, außerhalb der klinischen Periode, erhalten bleibt.
Untersuchungen von WILSON et al. (2001) zeigten, dass Pferde, die Culicoides-Bissen ausgesetzt waren, im Gegensatz zu naiven Pferden (in Island; aufgrund der klimatischen Bedingungen kommen Culicoides spp. dort nicht vor) Antikörper gegen Speicheldrüsenbestandteile gebildet hatten. Dabei konnten bei allen exponierten Pferden Immunglobuline vom Isotyp IgG nachgewiesen werden, IgE jedoch nur bei Pferden mit klinischen Symptomen des Sommerekzems.
Zur klinischen Ausprägung des Ekzems kommt es nach UNKEL (1985) bei über 80% der untersuchten Islandpferde innerhalb der ersten drei Lebensjahre, 94% der späteren Sommerekzemer entwickeln bis zur Vollendung ihres vierten Lebensjahres erstmals
Literaturübersicht
schon bei Fohlen und Jährlingen eine Sensibilisierung basophiler Granulozyten nachgewiesen werden konnte (KOBELT, 2001). Bei isländischen Importpferden kommt es nach Untersuchungen aus Norwegen frühestens im zweiten Sommer nach Import, im Durchschnitt nach etwa vier Jahren, zu ersten klinischen Ausprägungen (HALLDORSDOTTIR &
LARSEN 1991).
Im Laufe der Erkrankung werden fünf Stadien unterschieden: Das Prodromalstadium wird gefolgt vom papulösen Stadium, gekennzeichnet durch stecknadelkopf- bis maximal drei Zentimeter im Durchmesser große Papeln, die einen lokalen Juckreiz auslösen, auf den die Pferde mit Unruhe und mehr oder weniger starkem Scheuern reagieren. Das Langhaar von Mähne und Schweif wird dabei bis zur Alopezie abgescheuert. Folgend kommt es im Exkoriationsstadium zuerst zu oberflächlichen Hautabschürfungen und in folge weiterer Automutilation später zu tieferen, die Cutis durchtrennenden Verletzungen. Es kann sich das sekundär infizierte oder ulcerierende Stadium anschließen. Letztendlich, mit Nachlassen der Allergenexposition, erfolgt im Regenerationsstadium eine Abheilung der Hautveränderungen.
Aufgrund des chronischen Verlaufs wird durch die permanente Reizung die Epidermis und Dermis jedoch stark zerstört. Es kommt, v.a. am Mähnenkamm und der Schweifrübe zur Pachydermie und andauernder Alopezie. Die vorgeschädigte Haut neigt auch außerhalb der Sommerekzemperiode, insbesondere in den luftabgeschlossenen Falten der pachydermen Bereiche, zu bakteriellen und mykotischen Infektionen. (RÜSBÜLDT 2001).
Der jahreszeitliche Verlauf der Symptomausprägung ist dabei indirekt an die herrschenden Klima-, bzw. Wetterbedingungen gekoppelt, da diese das Insektenaufkommen maßgeblich steuern. Mit dem Auftreten der ersten Erkrankungsstadien muss im Allgemeinen ab April / Mai gerechnet werden. In der Zeit um Oktober und November klingen die Symptome ab und die Regeneration erfolgt. (HECK 1991)
Der Grad der klinischen Ausprägung des Sommerekzems ist starken inter- und intraindividuellen Schwankungen unterworfen. Neben der Standort- und witterungsabhängigen Insektenbelastung sollen Faktoren, wie verzögerter Haarwechsel, Vorschädigung der Haut (Borken, Schuppen aus der vorhergehenden Saison, Pyodermien, Dermatomykosen, parasitäre Infektionen), hormonelle Imbalancen und sogar die psychische Ausgeglichenheit bzw. Stressbelastung des Einzeltiers eine nicht unerhebliche Rolle spielen.
(RÜSBÜLDT 2001).
Eine kausale Therapie des Sommerekzems und damit der Typ I Allergie existiert bisher nicht.
Versuche zur Hyposensibilisierung Culicoides-allergischer Pferde scheinen Erfolg versprechend (ANDERSON et al. 1996). Da das Allergen bisher nicht in aufgereinigter Form
