Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung der Pathogenese der möglicherweise speziesspezifischen toxikologischen Effekte
von PDE4-Inhibitoren bei Ratten
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Sabine Tippelt
Hagenow
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Andreas Pahl
Institut für Pharmakologie und Präklinische Arzneimittelsicherheit, Takeda GmbH
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
2. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2013
Diese Arbeit wurde durch die Takeda GmbH (ehemals Nycomed GmbH) gefördert.
Für meine Familie
In Liebe und Dankbarkeit
1 EINLEITUNG ... 13
1.1 Einleitung und Zielsetzung ... 13
2 LITERATURÜBERSICHT ... 15
2.1 Phosphodiesterase 4 ... 15
2.1.1 Zyklische Nukleotide ... 15
2.1.2 Phosphodiesterasen ... 16
2.1.3 Phosphodiesterase-4 ... 17
2.2 Inhibition der Phosphodiesterase-4 ... 18
2.2.1 Phosphodiesterase-4 als Ziel der Pharmakotherapie ... 18
2.2.2 Übersicht über die Phosphodiesterase-4-Inhibitoren ... 19
2.2.3 Toxizität der Phosphodiesterase-4-Inhibitoren im Tiermodell ... 20
2.2.4 Besondere Zielparameter bei der Ratte ... 21
2.3 Mesenterium und männliche Geschlechtsorgane ... 23
2.3.1 Physiologie und Anatomie Mesenterium und Gefäße ... 23
2.3.2 Mesenterium und PDE4-Inhibitoren ... 25
2.3.3 Männliche Geschlechtsorgane ... 25
2.3.4 Männliche Geschlechtsorgane und PDE4-Inhibitoren ... 29
2.4 Interleukin-6 (IL-6) ... 30
2.4.1 Allgemeines ... 30
2.4.2 IL-6 und Phosphodiesterase-4-Inhibitoren ... 33
3 MATERIAL UND METHODEN ... 34
3.1 Material in vitro ... 34
3.1.1 Zelllinien mit Kulturgefäß ... 34
3.1.2 Testsubstanzen ... 34
3.1.2.1 PDE4-Inhibitor BYK199404 ... 34
3.1.2.2 Lipopolysaccharide ... 34
3.1.3 Material zur Kultivierung und zum Passagieren der Zelllinien ... 35
3.1.4 Material zur Bestimmung von Zellviabilität und IL-6 ... 36
3.1.4.1 Kommerziell erhältliche Kits ... 36
3.1.4.2 Gerät ... 37
3.1.4.3 Sonstiges Zubehör... 37
3.2 Material in vivo ... 38
3.2.1 Tiere ... 38
3.2.2 Testsubstanz/Antikörper mit Lösungsmittel ... 38
3.2.3 Material für die Messung der Blutparameter ... 39
3.2.3.1 Geräte ... 39
3.2.3.2 Zubehör für die Blutentnahme und kommerziell erhältliche Kits ... 39
3.2.4 Material für die RNA-Isolation und die Genexpressionsanalysen ... 40
3.2.4.1 Geräte ... 40
3.2.4.2 Kommerziell erhältliche Kits ... 40
3.2.4.3 Sonstiges Zubehör... 41
3.2.5 Histologie ... 41
3.2.5.1 Geräte ... 41
3.2.5.2 Chemikalien zur Fixation, Einbettung und Färbung der Gewebe ... 42
3.3 Versuchsübersicht und Methoden ... 43
3.4 Methoden in vitro ... 44
3.4.1 Übersicht über die Stimulations-Studie ... 44
3.4.2 Kultivierungsbedingungen der HUVEC ... 45
3.4.3 Kultivierungsbedingungen RBE4-Zellen ... 45
3.4.4 Passage von HUVEC und RBE4-Zellen ... 46
3.4.5 Aussaat der HUVEC ... 46
3.4.6 Aussaat der RBE4-Zellen ... 46
3.4.7 Herstellen der Lösungen und Stimulation der Zellen ... 47
3.4.7.1 PDE4-Inhbitor BYK199404 ... 47
3.4.7.2 Ansatz der Lipopolysaccharide (LPS) 0111:B4 und 0127:B8 ... 47
3.4.8 Bestimmung der Zellviabilität ... 47
3.4.9 Messung von Interleukin-6 (IL-6) im Zellkulturüberstand ... 48
3.5 Methoden in vivo ... 49
3.5.1 Übersicht über die Dosis-Findungsstudie ... 49
3.5.2 Übersicht über die Studie zur Bestimmung des IL-6-Profils ... 50
3.5.3 Übersicht über die Zeitverlaufsstudie ... 50
3.5.4 Übersicht über die Interventionsstudien ... 50
3.5.5 Tierhaltung ... 51
3.5.6 Ansatz und Applikation von Wirkstoff und Antikörper ... 52
3.5.6.1 PDE4-Inhibitor BYK199404 ... 52
3.5.6.2 Rat IL-6-Antibody und Anti-rat IgG-Antibody ... 52
3.5.7 Erscheinungsbild, Körpergewicht und Futterverbrauch ... 52
3.5.8 Blutentnahme und Blutparameter ... 53
3.5.8.1 Blutentnahme ... 53
3.5.8.2 Leukozyten, neutrophile Granulozyten und Lymphozyten ... 53
3.5.8.3 Haptoglobin ... 53
3.5.8.4 Fibrinogen ... 53
3.5.8.5 Interleukin-6 (IL-6) ... 53
3.5.9 Sektion ... 54
3.5.9.1 Organgewichte ... 54
3.5.9.2 Organentnahme ... 54
3.5.10 RNA-Isolation und Genexpressionsanalysen ... 54
3.5.11 Histologie ... 55
3.5.11.1Materialaufarbeitung ... 55
3.5.11.2Befundbeurteilung ... 56
3.6 Statistische Auswertung ... 57
4 ERGEBNISSE ... 58
4.1 Ergebnisse der In-vitro-Studie ... 58
4.1.1 Beeinflussung der Zellviabilität durch BYK199404 ... 58
4.1.2 Beeinflussung der IL-6-Produktion durch BYK199404 ... 60
4.2 Ergebnisse der In-vivo-Studien ... 62
4.2.1 Auswirkung des Rattenstammwechsels ... 62
4.2.2 Profil der IL-6-Plasmakonzentration nach Applikation von BYK199404 ... 66
4.2.3 Toxikologische Befunde in Abhängigkeit von Dosis und Zeit ... 67
4.2.3.1 Erscheinungsbild, Körpergewicht und Futterverbrauch ... 68
4.2.3.2 Blutparameter ... 70
4.2.3.3 Sektionsbefunde und Organgewichte ... 72
4.2.3.4 Histopathologie ... 75
4.2.3.4.1 Mesenterium... 75
4.2.3.4.2 Hoden, Nebenhoden, Ductuli efferentes ... 77
4.2.3.5 Genexpression ... 81
4.2.4 Einfluss des Anti-IL-6-AKs auf die toxikologischen Befunde ... 84
4.2.4.1 Erscheinungsbild, Körpergewicht und Futterverbrauch ... 84
4.2.4.2 Blutparameter ... 87
4.2.4.3 Sektionsbefunde und Organgewichte ... 90
4.2.4.4 Histopathologie ... 93
4.2.4.4.1 Mesenterium... 93
4.2.4.4.2 Hoden, Nebenhoden, Ductuli efferentes ... 95
4.2.4.5 Genexpression ... 97
4.2.4.6 Zusammenfassung ... 99
5 DISKUSSION ... 100
5.1 Einfluss von BYK199404 auf Zellviabilität und IL-6-Produktion in vitro .. 101
5.2 Auswirkung des Rattenstammwechsels auf die Dosis ... 103
5.3 Einfluss von BYK199404 auf die IL-6-Ausschüttung in vivo ... 104
5.4 Toxikologische Befunde in Abhängigkeit von Dosis und Zeit ... 106
5.4.1 Zunahme der toxikologischen Befunde ... 106
5.4.2 Histopathologie ... 109
5.5 Veränderung toxikologischer Befunde durch den Anti-IL-6-AK... 114
5.5.1 Verminderung toxikologischer Befunde ... 114
5.5.2 Unklare Rolle von IgG ... 116
5.6 Schlussfolgerung/Ausblick ... 118
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 120
7 SUMMARY ... 123
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 126
9 ANHANG ... 153
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
± Plus/Minus
® Marke, Warenzeichen
°C Grad Celcius
µg Mikrogramm
µmol Mikromol
5`-AMP 5`Adenosin-Monophosphat
5`-GMP 5`Guanosin-Monophosphat
A. Arteria, Arterie
Anti-IL-6-AK Anti-IL-6-Antikörper
ATP Adenosin-Tri-Phosphat
bzw. beziehungsweise
cAMP zyklisches Adenosin-3`,5`-Monophosphat cGMP zyklisches Guanosin-3`,5`-Monophosphat
cm2 Quadratzentimeter
COPD chronic obstructive pulmonary disease
Cox-2 Cyclooxygenase-2
CRE cAMP responsive element
CREB cAMP responsive element-binding protein
Ct threshold cycle
d Tag
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
ECGS/H endothelial cell growth supplement/Heparin
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGF epidermal growth factor
et al. et alii, und andere
Fc fragment crystallisable
FcR fragment crystallisable receptor
FcγR fragment crystallisable gamma receptor FGF fibroblast growth factor
Fgg Fibrinogen gamma-Kette
g Erdbeschleunigung
g Gramm
gp130 Glykoprotein 130
GRO/CINC-1 growth related oncogene/cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1
GTP Guanosin-Tri-Phosphat
h Stunde
HUVEC human umbilical vein endothelial cells
i.p. intra peritoneal
IBD inflammatory bowel disease
ID50 mittlere inhibitorische Dosis
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
IL-6Rα α-Kette des Interleukin-6-Rezeptors
IL-6Rαs lösliche α-Kette des Interleukin-6-Rezeptors
K Kalium
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
l Liter
LPS Lipopolysaccharid
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mRNA messenger Ribonukleinsäure
MTS Triphenyltetrazoliumchlorid
n Anzahl der Passagen/Tiere
Na Natrium
NaCl Natriumchlorid
NaPO4 Natriumphosphat
ng Nanogramm
NOAEL no observed adverse effect level
p Passage
p.a. post applicationem, nach der Applikation
p.o. per os
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase Kettenreaktion
PDE Phosphodiesterase
PDE4 Phosphodiesterase-4
pg Pikogramm
RBE4 rat brain endothelial cells
RLT Lysispuffer für Zellen aus dem „Rneasy-Kit” von Qiagen
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RT Reverse Transkriptase
s Sekunde
S.D. standard deviation, Standardabweichung Timp-1 tissue inhibitor of metalloproteinases-1
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor-α
UNG untere Nachweisgrenze
1 Einleitung
1.1 Einleitung und Zielsetzung
Seit den 1960er Jahren ist bekannt, dass Phosphodiesterasen (PDEs) Enzyme sind, welche die Konzentration zyklischer Nukleotide im Zellinneren durch Degradation kontrollieren (BUTCHER u. SUTHERLAND 1962). Die Familie der PDEs wird in 11 verschiedene Subfamilien eingeteilt (PDE1 bis PDE11). Jede dieser 11 PDE- Subfamilien hat wiederum verschiedene Isoformen und diese Isoformen verschiedene Splicing-Varianten (BENDER u. BEAVO 2006).
In Zellen von Säugetieren sind PDE4-Isoformen die Hauptenzyme zur Degradation des sekundären Botenstoffs zyklisches Adenosin-3’,5’-Mono-Phosphat (cAMP). Darüber hinaus sind einige Isoformen der PDE4 die dominanten PDEs in Entzündungszellen (MULLER et al. 1996; WANG et al. 1999). Diese Funktion wird beim Einsatz von PDE4- Enzymhemmern (Inhibitoren), durch welche ein anti-inflammatorischer Effekt erreicht wird, ausgenutzt. Einige selektive Hemmer der PDE4 sind als Therapeutika für entzündliche Erkrankungen wie zum Beispiel chronic obstructive pulmonary disease (COPD), Asthma bronchiale, inflammatory bowel disease (IBD), Psoriasis oder allergische Rhinitis in der klinischen Entwicklung (BANNER u. TREVETHICK 2004;
DRAHEIM et al. 2004; SPINA 2004; HOUSLAY et al. 2005; CASTRO et al. 2005;
JEFFERY 2005; BÄUMER et al. 2007).
Präklinische Toxizitätsstudien mit PDE4-Inhibitoren in Tiermodellen zeigten beim Einsatz suprapharmakologischer Dosierungen das Auftreten von entzündlichen Gewebe- und Gefäßveränderungen. (LARSON et al. 1996; LOSCO et al. 2004;
MECKLENBURG et al. 2006; MCCLUSKIE et al. 2006; DIETSCH et al. 2006; DAGUES et al. 2007a; DAGUES et al. 2007b; HANTON et al. 2008; ZHANG et al. 2008; WEAVER et al. 2008; WEAVER et al. 2010).Von diesen entzündlichen Veränderungen waren je nach Spezies verschiedene Gewebe betroffen. Es zeigte sich am Beispiel der Ratte, dass vor allem das Mesenterium ein Zielorgan der PDE4-Inhibitor-induzierten
Organtoxizität ist (MECKLENBURG et al. 2006; ZHANG et al. 2008; WEAVER et al.
2008). Die entzündlichen Läsionen werden begleitet von einem Anstieg verschiedener Entzündungsparameter, unter denen auch Interleukin-6 (IL-6) als pro-inflammatorisches Zytokin bei der Ratte eine besondere Rolle zu spielen scheint (DIETSCH et al. 2006;
DAGUES et al. 2007b; WEAVER et al. 2008; WEAVER et al. 2010). Diese besondere Rolle des IL-6 zeigte sich zum einen in einer Korrelation zwischen IL-6-Anstieg und dem Auftreten histopathologischer Veränderungen im Mesenterium als Reaktion auf PDE4- Inhibitoren bei Ratten (DIETSCH et al. 2006; WEAVER et al. 2008). Zum anderen wurde eine speziesspezifische Reaktion nach Stimulation von Vollblut mit einem PDE4- Inhibitor beobachtet, bei welcher nur das Vollblut der Ratte eine IL-6-Ausschüttung zeigte, nicht aber das von Mensch oder Affe (DIETSCH et al. 2006).
Die Pathogenese dieser im Tiermodell auftretenden entzündlichen Veränderungen durch hohe Dosierungen von PDE4-Inhibitoren sowie die Relevanz für den Menschen sind bisher ungeklärt.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte an bereits veröffentlichte Studien angeknüpft und dabei die Rolle von IL-6 an den durch PDE4-Inhibitoren herbei geführten toxikologischen Läsionen weiter aufgedeckt werden, mit dem Endziel einen Beitrag zur Bewertung der Humanrelevanz der toxikologischen Befunde zu leisten.
Diese Doktorarbeit besteht aus zwei Teilen, einer In-vitro-Studie und mehreren In-vivo- Studien. In allen Studien wurde BYK199404, ein selektiver potenter PDE4-Inhibitor, benutzt. BYK199404 wurde bei der Takeda GmbH (Konstanz) bereits als Modellsubstanz für mechanistische Studien verwendet.
In der In-vitro-Studie wurden Endothelzelllinien von Mensch und Ratte hinsichtlich einer IL-6-Ausschüttung als Reaktion auf eine Stimulation mit dem PDE4-Inhibitor BYK199404 miteinander verglichen.
In den In-vivo-Studien wurde die IL-6-Ausschüttung als Reaktion auf den PDE4-Inhibitor BYK199404 bei Ratten überprüft. Anschließend wurde das Auftreten der toxikologischen Befunde des hier verwendeten Rattenstamms dosis- und zeitabhängig charakterisiert.
Dazu wurden das Allgemeinbefinden sowie bestimmte Blutwert- und Genexpressionsveränderungen untersucht. Ein weiterer wichtiger Untersuchungspunkt stellte die histologische Untersuchung dar. Neben dem Mesenterium als klassischem Organ der PDE4-Inhibitor-induzierten Organtoxizität bei Ratten wurden zusätzlich auch die männlichen Geschlechtsorgane, als weiteres Zielorgan, histologisch mit untersucht.
Nach dieser Analyse der toxikologischen Befunde wurde parallel zu dem PDE4-Inhbitor BYK199404 ein Anti-IL-6-Antikörper eingesetzt, um eine mögliche Verminderung der PDE4-Inhibitor-induzierten toxikologischen Befunde zu erreichen.
2 Literaturübersicht
2.1 Phosphodiesterase 4 2.1.1 Zyklische Nukleotide
RALL u. SUTHERLAND (1958) entdeckten das zyklische Nukleotid Adenosin-3‘,5‘- Mono-Phosphat (cAMP) und begannen die Funktion dieses Proteins als sekundären Botenstoff im Zellinneren zu verstehen. Heute, mehr als 50 Jahre nach dieser Entdeckung, ist bekannt, dass die Konzentration der zyklischen Nukleotide cAMP und Guanosin-3‘,5‘-Mono-Phosphat (cGMP) im Zellinneren für die Regulation einer Vielzahl biologischer Prozesse ausschlaggebend ist (BEAVO u. BRUNTON 2002).
Zur Synthese dieser zyklischen Nukleotide kommt es durch Adenylatzyklasen und Guanylatzyklasen. Die Zyklasen sind nach ihrer Aktivierung in der Lage, aus Adenosin- Tri-Phosphat (ATP) und Guanosin-Tri-Phosphat (GTP) jeweils cAMP oder cGMP zu bilden. Die Aktivierung der Zyklasen erfolgt durch primäre Botenstoffe, welche sich außerhalb der Zelle befinden (Hormone, Neurotransmitter oder beispielsweise Stickstoff). Im Fall der Adenylatzyklase erfolgt sie durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, an welche sich die Botenstoffe binden. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren können eine hemmende oder aktivierende Wirkung auf die Adenylatzyklasen haben. Guanylatzyklasen sind entweder löslich oder membrangebunden und werden direkt durch Botenstoffe aktiviert (BEAVO u. BRUNTON 2002; PIERCE et al. 2002; ZHANG et al. 2005; DERBYSHIRE u. MARLETTA 2009). Die
nun durch die aktivierten Zyklasen herbeigeführten erhöhten intrazellulären Konzentrationen an cGMP oder cAMP führen zu einer weiteren Stimulation anderer Effektoren, wie Proteinkinasen, so dass diese erhöhten Level an cAMP oder cGMP eine Aktivierung oder Inhibition einer Vielzahl biologischer Prozesse zur Folge hat. Diese Prozesse können Metabolismus, Zellproliferation, Relaxation von Gefäßen und glatten Muskelzellen oder die Freisetzung von Entzündungsmediatoren betreffen (BEAVO u.
BRUNTON 2002; DERBYSHIRE u. MARLETTA 2009). Kontrolliert wird diese erhöhte Konzentration der zyklischen Nukleotide durch die PDEs (BUTCHER u. SUTHERLAND 1962)
2.1.2 Phosphodiesterasen
PDEs sind zytosolische Enzyme. Sie sind in der Lage, aktivierte zyklische Nukleotide in eine inaktive Form zu überführen, in der sie nicht mehr als sekundäre Botenstoffe agieren können (siehe Abbildung 1). Erstmals entdeckt wurde dies für das cAMP um 1960 (BUTCHER u. SUTHERLAND 1962). Die Degradation von cAMP und cGMP erfolgt durch die Hydrolyse der 3‘-Phosphatbindung. Dadurch werden aus cAMP und cGMP die inaktiven Formen 5‘-AMP und 5‘-GMP. Die große Familie der PDEs besteht aus 21 verschiedenen Genprodukten, die sich 11 verschiedenen Subfamilien (PDE1 - 11) und deren jeweiligen Isoformen zuordnen lassen (BENDER u. BEAVO 2006). Die einzelnen Subfamilien haben eine unterschiedliche Spezifität für cAMP und/oder cGMP.
Dies macht die Komplexität der PDEs deutlich (BENDER u. BEAVO 2006).
Abbildung 1: Bildung der sekundären Boten PDEs (ZHANG et al. 2005) 2.1.3 Phosphodiesterase-4
Eine der wichtigsten PDEs in Säug
PDE4. Die PDE4 besteht aus 4 verschiedenen Isoformen (PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D), die jeweils zum Teil noch verschiedene
(OBERNOLTE et al. 1997; RICHTER et al. 2005; BENDER
et al. 2006). Dabei sind die verschiedenen Isoformen unterschiedlich in den Geweben verteilt. Während PDE4A, PDE4B und PDE4D ubiquitär vorkommen, ist PDE4C primär in Hoden, Skelettmuskel, Lunge und Gehirn von humanem Gewebe exprimiert (OBERNOLTE et al. 1997).
Am besten untersucht ist die Verteilung der PDE4
Zellen. Es stellte sich bei humanen Zellen heraus, dass die PDE4 die dominante Isoform auf einer Vielzahl von immunregulatorischen Zellen ist. Dazu gehören unter anderem
der sekundären Botenstoffe cGMP und cAMP sowie ihr (ZHANG et al. 2005).
Eine der wichtigsten PDEs in Säugetierzellen mit Substratspezifität für cAMP ist die PDE4. Die PDE4 besteht aus 4 verschiedenen Isoformen (PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D), die jeweils zum Teil noch verschiedene Splicing-Varianten haben (OBERNOLTE et al. 1997; RICHTER et al. 2005; BENDER u. BEAVO 2006; BINGHAM Dabei sind die verschiedenen Isoformen unterschiedlich in den Geweben verteilt. Während PDE4A, PDE4B und PDE4D ubiquitär vorkommen, ist PDE4C primär in Hoden, Skelettmuskel, Lunge und Gehirn von humanem Gewebe exprimiert
untersucht ist die Verteilung der PDE4-Isoformen auf hämatopoetischen e sich bei humanen Zellen heraus, dass die PDE4 die dominante Isoform auf einer Vielzahl von immunregulatorischen Zellen ist. Dazu gehören unter anderem
stoffe cGMP und cAMP sowie ihr Abbau durch
etierzellen mit Substratspezifität für cAMP ist die PDE4. Die PDE4 besteht aus 4 verschiedenen Isoformen (PDE4A, PDE4B, PDE4C und Varianten haben u. BEAVO 2006; BINGHAM Dabei sind die verschiedenen Isoformen unterschiedlich in den Geweben verteilt. Während PDE4A, PDE4B und PDE4D ubiquitär vorkommen, ist PDE4C primär in Hoden, Skelettmuskel, Lunge und Gehirn von humanem Gewebe exprimiert
Isoformen auf hämatopoetischen e sich bei humanen Zellen heraus, dass die PDE4 die dominante Isoform auf einer Vielzahl von immunregulatorischen Zellen ist. Dazu gehören unter anderem
Monozyten (WANG et al. 1999), B- und T-Lymphozyten (TENOR et al. 1995; GANTNER et al. 1998; BAROJA et al. 1999), neutrophile Granulozyten (WANG et al. 1999;
PRYZWANSKY u. MADDEN 2003), eosinophile Granulozyten (PRYZWANSKY u.
MADDEN 2003), basophile Granulozyten (PEACHELL et al. 1992) und Makrophagen (JIN u. CONTI 2002). Die Isoformen PDE4A und PDE4B sind für immunregulatorische Prozesse offenbar von größerer Wichtigkeit (WANG et al. 1999; MANNING et al. 1999;
JIN u. CONTI 2002).
Das Expressionsmuster der PDE4 variiert speziesspezifisch. Die Ratte beispielsweise zeigt, mit Blick auf die Leukozyten auf mRNA-Ebene und auch funktionell, eine höhere Aktivität der PDE4 als der Mensch (BIAN et al. 2004).
2.2 Inhibition der Phosphodiesterase-4
2.2.1 Phosphodiesterase-4 als Ziel der Pharmakotherapie
PDEs regulieren die intrazelluläre Konzentration an cAMP durch Degradation, wie in Kapitel 1.2.1 beschrieben. Die Inaktivierung des cAMP hat zur Folge, dass es nicht mehr als sekundärer Botenstoff wirken kann und somit bestimmte biologische Prozesse gehemmt werden. Im Fall von Entzündungszellen verhält es sich allerdings umgekehrt.
Dort ist cAMP überwiegend ein negativer Regulator der primär aktivierenden Signalwege.
Das heißt, ein niedriger Level an cAMP führt zu einem pro-inflammatorischen Effekt, hingegen erzeugt ein Anstieg von cAMP einen anti-inflammatorischen Effekt (KAMMER 1988; CASTRO et al. 2005). Erstmals herausgefunden wurde dies bereits im Jahr 1968, als ein erhöhter Level von cAMP in Leukozyten die Antigen-induzierte Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten inhibierte (LICHTENSTEIN u. MARGOLIS 1968).
Demzufolge ist es möglich, einen anti-inflammatorischen Effekt zu erzielen, indem man die PDE hemmt und somit den intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht hält.
Unter der Vielzahl der PDEs ist die PDE4 diejenige, die dominant auf immunregulatorischen Zellen zu finden ist (siehe Kapitel 2.1.3) und somit im Laufe der Zeit in den Fokus der Pharmakotherapie gerückt ist. Probleme, die in der präklinischen
Entwicklung von PDE4-Inhbitoren aufgetreten sind, sowie die potentiellen Einsatzgebiete werden in den nächsten Kapiteln dargestellt.
2.2.2 Übersicht über die Phosphodiesterase-4-Inhibitoren
Theophyllin war der erste natürlich vorkommende, unselektive PDE-Inhibitor der entdeckt wurde (RALL u. SUTHERLAND 1958). Bereits im frühen 20. Jahrhundert wurde Theophyllin zur Therapie von COPD eingesetzt und hat neben seiner broncho- dilatatorischen Wirkung auch einen Einfluss auf die bei Asthma bronchiale vorherrschende Entzündung. Auf Grund von Nebenwirkungen wie Tachykardien, Arrhythmien, Kopfschmerzen, Übelkeit und Erbrechen ist die klinische Anwendung von Theophyllin eingeschränkt (SCHUDT et al. 2011). Die Entdeckung, dass hauptsächlich die PDE4-Subfamilie für den anti-inflammatorischen Effekt verantwortlich ist, führte zur Entwicklung von spezifischen PDE4-selektiven-Inhibitoren. Die entwickelten selektiven PDE4-Inhbitoren der 1. Generation, wie zum Beispiel Rolipram, zeigten ebenfalls Nebenwirkungen. Auch bei den folgenden PDE4-Inhibitoren der 2. Generation, wie Roflumilast und Cilomilast, von denen Roflumilast als Daxas® für die Behandlung von COPD zugelassen ist, blieben die Nebenwirkungen nicht aus (GIEMBYCZ 2002;
GIEMBYCZ 2006; DIAMANT u. SPINA 2011).
Im Laufe der Zeit haben sich immer mehr mögliche Einsatzgebiete eröffnet, bei denen das anti-inflammatorische Potential der PDE4-Inhibitoren ausgenutzt wird, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis (KOBAYASHI et al. 2007), allergische Hauterkrankungen und Psoriasis (BÄUMER et al. 2007), IBD (BANNER u. TREVETHICK 2004) oder allergische Rhinitis (DRAHEIM et al. 2004).
Im Gegensatz zu dieser anti-inflammatorischen pharmakodynamischen Wirkung der PDE4-Inhibitoren zeigen präklinische Toxizitätsstudien mit PDE4-Inhibitoren beim Einsatz von suprapharmakologischen Dosierungen im Tiermodell toxikologische Befunde, die sich als entzündliche Gewebe- und Gefäßveränderungen äußern (LARSON et al. 1996; LOSCO et al. 2004; MECKLENBURG et al. 2006; MCCLUSKIE et al. 2006; DIETSCH et al. 2006; DAGUES et al. 2007a; DAGUES et al. 2007b; HANTON
et al. 2008; ZHANG et al. 2008; WEAVER et al. 2008; WEAVER et al. 2010). Die Art der Gewebe, die von diesen entzündlichen PDE4-induzierten Läsionen betroffenen sind, variiert speziesspezifisch. Die Humanrelevanz dieser in toxikologischen Dosierungen von PDE4-Inhibitoren auftretenden entzündlichen Läsionen im Tiermodell ist dabei bisher unbekannt.
2.2.3 Toxizität der Phosphodiesterase-4-Inhibitoren im Tiermodell Die Organe/Gewebe mit PDE4-Inhibitor-induzierten Läsionen sind:
• das Herz, dort traten neben Gefäßentzündungen auch Myokarddegenerationen auf (LARSON et al. 1996; DIETSCH et al. 2006);
• der Thymus, es zeigten sich neben einer Abnahme des Thymusgewichts (LARSON et al. 1996; LOSCO et al. 2004; ZHANG et al. 2008) auf histologischer Ebene eine lymphoide Atrophie (DIETSCH et al. 2006; PETER et al. 2011);
• der Gastrointestinaltrakt, dort fanden sich histologisch Nekrosen im Bereich des Magens, makroskopisch Dilatationen, flüssigkeitsgefüllte Darmschlingen sowie histologisch Enteritiden vor allem im Bereich des Dünndarms, zusätzlich stellten sich die Peyerschen Platten verdickt dar (LARSON et al. 1996; MECKLENBURG et al. 2006; ZHANG et al. 2008);
• das Mesenterium zeigte eine Mesenteritis und Vaskulitiden (DIETSCH et al. 2006;
MECKLENBURG et al. 2006)
• das Pankreas zeigte Entzündungen kleinerer Gefäße (ZHANG et al. 2008);
• die Leber zeigte ein vermindertes Gewicht (ROBERTSON et al. 2001) sowie Entzündungen kleinerer Gefäße (LARSON et al. 1996; ZHANG et al. 2008);
• die Milz wies histologisch eine lymphoide Atrophie auf (PETER et al. 2011; SHETH et al. 2011);
• die Niere zeigte eine Entzündung kleinerer Gefäße (ZHANG et al. 2008);
• die Nebennieren wiesen ein erhöhtes Gewicht (LARSON et al. 1996) sowie eine Hyperplasie auf (DIETSCH et al. 2006);
• das Weichgewebe um das Tibialgelenk zeigte eine Entzündungszellinfiltration (DIETSCH et al. 2006);
• die männlichen Geschlechtsorgane zeigten eine Zunahme des Hodengewichts sowie histologische Veränderungen in Hoden, Nebenhoden und Ductuli efferentes (HANTON et al. 2008; HEUSER et al. 2012).
Weiterhin kam es zu Veränderungen der Leukozyten in Form einer Zunahme der neutrophilen Granulozyten sowie einer Abnahme der Lymphozyten (WEAVER et al.
2010; PETER et al. 2011). Außerdem zeigte sich bei den Blutparametern unter anderem eine Zunahme von Haptoglobin, Fibrinogen, GRO/CINC-1, Timp-1 und IL-6 (DIETSCH et al. 2006; DAGUES et al. 2007b; WEAVER et al. 2008).
Während bei Affen relativ unspezifisch mehrere Organe, wie zum Beispiel Magen, Herz, Nieren oder das Mesenterium betroffen waren (LOSCO et al. 2004), zeigten sich insgesamt tierartspezifisch jeweils bestimmte Organe und Gewebe hauptsächlich von entzündlichen Läsionen betroffen. Beim Hund stellten sich die Nasenmuscheln und die Haut am Skrotum als sensitivste Gewebe dar (HANTON et al. 2008). Bei der Maus waren es das Herz und die Reproduktionsorgane (LOSCO et al. 2010). Das sensitivste Organ bei der Ratte war das Mesenterium (DIETSCH et al. 2006; MECKLENBURG et al. 2006;
DAGUES et al. 2007b).
2.2.4 Besondere Zielparameter bei der Ratte
Ratten sind die meistberichtete und gleichzeitig sensibelste Tierspezies für toxikologische Effekte in Form von entzündlichen Läsionen durch PDE4-Inhibitoren in toxikologischen Dosierungen. Aus diesen Gründen wurde die Ratte als Tierspezies in der Dissertation verwendet. Die PDE4-Inhibitor-induzierten toxikologischen Befunde zeigen bei der Ratte einige Besonderheiten auf, die für die Doktorarbeit eine Rolle spielten und sollen an dieser Stelle genauer betrachtet werden.
Das Mesenterium ist bei der Ratte das am häufigsten veröffentlichte Zielorgan der PDE4-Inhibitor-induzierten Organtoxizität (LARSON et al. 1996; ROBERTSON et al.
2001; DIETSCH et al. 2006; MECKLENBURG et al. 2006; DAGUES et al. 2007a;
DAGUES et al. 2007b; ZHANG et al. 2008; WEAVER et al. 2008; WEAVER et al. 2010;
PETER et al. 2011).
Daher stellte das Mesenterium auch ein Hauptzielorgan für die histologische Beurteilung der Organtoxizität des in der Dissertation verwendeten PDE4-Inhibitors BYK199404 dar.
Neben dem Mesenterium gab es weitere Hauptzielorgane. Dabei handelte es sich um Hoden, Nebenhoden sowie die Ductuli efferentes (Verbindung zwischen Rete testis und Nebenhodenkopf).
Die Auswahl dieser Organe basierte neben den oben erwähnten Veröffentlichungen auf früher bei der Takeda GmbH (Konstanz) durchgeführten Studien, in denen PDE4- Inhibitoren wiederholt bei Ratten verabreicht wurden. Diese früher durchgeführten Studien zeigten, dass die ausgewählten Organe (Mesenterium, Hoden, Nebenhoden und Ductuli efferentes) zu den klassischen Zielorganen der durch PDE4-Inhibitoren- induzierten Organtoxizität gehören. Diese Organe waren die sensibelsten im Auftreten toxikologischer Befunde durch PDE4-Inhibitoren und bestimmten damit den no observed adverse effect level (NOAEL). Außerdem wurde die beobachtete Organtoxizität als kritisch beurteilt, da sich die pathologischen Veränderungen des Mesenteriums und zum Teil auch der Hoden, Nebenhoden oder Ductuli efferentes nur schwer oder erst sehr spät an einem noch lebenden Organismus erkennen lassen und zudem schlecht zu überwachen sind.
Einhergehend mit diesen entzündlichen Läsionen ist ein Anstieg von Entzündungsparametern, unter denen IL-6, als pro-inflammatorisches Zytokin, bei der Ratte eine Rolle spielt (DIETSCH et al. 2006; DAGUES et al. 2007b; WEAVER et al.
2008; WEAVER et al. 2010). Einige dieser Studien gaben einen Hinweis darauf, dass IL-6 an der Pathogenese der toxikologischen PDE4-Inhibitor-induzierten Befunde beteiligt ist. In einem In-vitro-Versuch konnte gezeigt werden, dass ein IL-6-Anstieg nach PDE4-Inhibitor-Gabe rattenspezifisch ist (DIETSCH et al. 2006). Daher wurde IL-6
als Ansatzpunkt für eine pharmakologische Intervention zur Reduzierung der PDE4- Inhibitor-vermittelten Organtoxizität ausgewählt.
Diese Zielparameter (Mesenterium, Hoden, Nebenhoden, Ductuli efferentes und IL-6) spielen für die Dissertation eine besondere Rolle. In den folgenden Kapiteln werden physiologische Eigenschaften dieser Parameter und auch PDE4-Inhibitor-induzierte Veränderungen genauer beschrieben.
2.3 Mesenterium und männliche Geschlechtsorgane 2.3.1 Physiologie und Anatomie Mesenterium und Gefäße
Die Bauchfellhöhle (Peritonealhöhle) ist mit dem Bauchfell (Peritoneum) ausgekleidet.
Auch die Organe der Bauchfellhöhle sind mit Bauchfell überzogen. Das Mesenterium stellt eine Doppellamelle dieses Bauchfells dar, welche von der dorsalen Körperwand bis hin zu den Organen reicht. Im Mesenterium verlaufen Gefäße, Nerven und lymphatische Einrichtungen zur Versorgung jener Organe, außerdem ist Fett- und Bindegewebe eingelagert. Je nach Organ, an welchem es befestigt ist und es versorgt, hat das Mesenterium spezifische Bezeichnungen. Beispielsweise versorgt das Mesogastrium den Magen, das Mesoduodenum das Duodenum, das Mesocolon das Colon oder das Mesorchium den Hoden. Das eigentliche oder wahre Mesenterium dient dabei im engeren Sinne der Versorgung von Jejunum und Ileum (SHELDON BIVIN et al. 1979; KÖNIG et al.
2005).
Im histologischen Querschnitt des Mesenteriums befinden sich dorsal die Mesenteriallymphknoten. Darunter befindet sich die A. mesenterica cranialis. Die A.
mesenterica cranialis entspringt der Aorta und versorgt mit ihren Aufzweigungen das Jejunum und das Ileum. Dafür teilt sich die A. mesenterica cranialis bei der Ratte in ungefähr 20 terminale Abzweigungen, welche eine durchgängige „Randarterie“ formen.
Diese verläuft am distalen Rand des Mesenteriums nahe der Darmwand und versorgt die Darmabschnitte mit kurzen und langen Versorgungsgefäßen (ANTHONY et al. 1997). Der venöse Abfluss verläuft parallel dazu. Die A. mesenterica cranialis und ihre
Abzweigungen sind im histologischen Schnitt umgeben von Fettzellen, den Adipozyten, welche den Hauptbestandteil des Mesenteriums ausmachen.
Die Wände von Blutgefäßen können in 3 Schichten eingeteilt werden. Diese Schichten sind von innen nach außen die Intima, die Media und die Adventitia. Die Intima besteht aus Endothelzellen mit einer dünnen Schicht subendothelialem Bindegewebe. Die der Intima folgenden Media, besteht aus glatten Muskelzellen und wird zur Intima durch die Lamina elastica interna und zur Adventitia durch die Lamina elastica externa abgegrenzt.
Die abschließende Adventitia enthält Nerven, Blutgefäße und Kollagen (SCHOEN u.
COTRAN 1999).
Arterien können, abhängig von Größe und strukturellen Funktionen, in 3 Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe sind die großen oder elastischen Arterien, wie die Aorta und ihre großen Abzweigungen. Dazu gehört auch die A. mesenterica cranialis.
In großen Arterien, die dem großen Blutdruck mit einer dicken Schicht glatter Muskelzellen in der Media standhalten müssen, kann die Lamina elastica interna fenestriert sein um die Sauerstoffversorgung dieser Muskelzellen zu gewährleisten.
Außerdem können Gefäße in der Adventitia die äußeren Schichten dieser Muskelzellen mitversorgen. Diese Gefäße in der Adventitia nennt man Vasa vasorum. Weiterhin sind die Muskelzellen der Media in elastischen Arterien separiert durch Lagen von elastischen Fasern. Als zweite Gruppe von Arterien finden sich die mittleren oder muskuläre Arterien, welche ebenfalls Abzweigungen der Aorta sein können. In muskulären Arterien besteht die Media hauptsächlich aus glatten Muskelzellen. Die elastischen Fasern sind beschränkt auf die Lamina elastica interna und externa (SCHOEN u. COTRAN 1999).
Als dritte und letzte Gruppe kommen kleine Arterien vor, die hauptsächlich in Geweben und Organen verlaufen. Kleine Gefäße wie Kapillaren variieren in der Kontinuität von Endothelzellen und Basalmembran.
Venen sind dünnwandig mit großem Lumen. In diesen ist die Lamina elastica interna nicht so gut definiert wie in den Arterien und die Media ebenfalls aus weniger glatten Muskelzellen bestehend (SCHOEN u. COTRAN 1999).
2.3.2 Mesenterium und PDE4-Inhibitoren
In verschiedenen Veröffentlichungen wurde von PDE4-Inhibitor-induzierten histopathologischen Läsionen am Mesenterium in Form von interstitiellen Entzündungen, perivaskulären Zellinfiltrationen, fibrinoiden Gefäßwandnekrosen und zum Teil Panarteritiden berichtet. Die interstitiellen Entzündungen zeigten sich durch Zellinfiltrationen, die hauptsächlich aus Makrophagen und neutrophilen Granulozyten bestanden. Diese Zellinfiltrationen des Interstitiums gingen einher mit Ödemen und Fibroblastenproliferationen. Hinzu kam ein Verlust beziehungsweise eine Degeneration von Adipozyten. Perivaskuläre Entzündungen sowie Gefäßwandnekrosen betrafen hauptsächlich große oder mittelgroße Arterien. Die Gefäßwandveränderungen waren charakterisiert durch fibrinoide Nekrosen, segmentale Degenerationen der Media und Ablagerungen von eosinophilem Material. Zudem wurden Einblutungen in die Media und das umliegende Gewebe beschrieben (LARSON et al. 1996; ROBERTSON et al. 2001;
DIETSCH et al. 2006; MECKLENBURG et al. 2006; DAGUES et al. 2007a; DAGUES et al. 2007b; ZHANG et al. 2008; WEAVER et al. 2008; WEAVER et al. 2010; PETER et al.
2011). MECKLENBURG et al. (2006) beschrieben im zeitlichen Verlauf nach Gabe eines PDE4-Inhibitors innerhalb der ersten 3 Wochen eine Mesenteritis, ein sekundäres Auftreten von segmentalen Panarteritiden zeigte sich nur bei einem Teil der Tiere nach einer Behandlungszeit von mehr als diesen 3 Wochen. Eine andere Veröffentlichung zeigt ebenso das primäre Auftreten einer Mesenteritis vor einer Arteritis (DIETSCH et al.
2006).
2.3.3 Männliche Geschlechtsorgane
Die männlichen Geschlechtsorgane bestehen aus dem Hoden, den Ductuli efferentes, dem Nebenhoden, den akzessorischen Geschlechtsdrüsen sowie dem Penis. Dabei haben die einzelnen Bestandteile der männlichen Geschlechtsorgane unterschiedliche Funktionen. Der Hoden stellt den Ort der Spermatogenese und Testosteronproduktion dar, anschließend sind die Ductuli efferentes und der Nebenhoden für den Transport, die Reifung und die Lagerung der Spermien verantwortlich. Die Zusatzstoffe für das
finale Ejakulat werden von den akzessorischen Geschlechtsdrüsen
Penis dient der Überlieferung der Spermien in den weiblichen Reproduktionstrakt Abbildung 2 zur Lagebeziehung von Hoden, Nebenhoden und
(CREASY 1998).
Abbildung 2: Lagebeziehung Hoden (Testis), (Epididymis), modifiziert nach
Hoden
Der Hoden ist der Ort der Samenproduktion. Sie findet in den
Tubuli seminiferi liegen im Hoden als lange aufgewickelte Schläuche und münden mit beiden Enden ins Rete testis
Tubuli seminiferi. Zwischen den
Bindegewebe mit Leydigzellen zur Testosteronproduktion sowie testikulären Makrophagen. Die einzelnen Tubuli seminiferi
Ausgekleidet werden die Tubuli seminiferi
Ammenzellen dienen in dem germinativen Epithel die Sertoli
den akzessorischen Geschlechtsdrüsen sezerniert und der Überlieferung der Spermien in den weiblichen Reproduktionstrakt zur Lagebeziehung von Hoden, Nebenhoden und Ductuli efferentes)
Lagebeziehung Hoden (Testis), Ductuli efferentes und Nebenhoden (Epididymis), modifiziert nach HOMMA-TAKEDA et al. (2003).
Der Hoden ist der Ort der Samenproduktion. Sie findet in den Tubuli seminiferi
liegen im Hoden als lange aufgewickelte Schläuche und münden mit (Hodennetz). Bei der Ratte gibt es ungefähr 30 separat . Zwischen den Tubuli seminiferi befindet sich interstitielles Bindegewebe mit Leydigzellen zur Testosteronproduktion sowie testikulären
Tubuli seminiferi sind umschlossen von der
Tubuli seminiferi durch das Germinalepithel. Als Stütz Ammenzellen dienen in dem germinativen Epithel die Sertoli-Zellen. Außerdem bilden
sezerniert und der Überlieferung der Spermien in den weiblichen Reproduktionstrakt (siehe
Ductuli efferentes)
und Nebenhoden
Tubuli seminiferi statt. Die liegen im Hoden als lange aufgewickelte Schläuche und münden mit (Hodennetz). Bei der Ratte gibt es ungefähr 30 separate befindet sich interstitielles Bindegewebe mit Leydigzellen zur Testosteronproduktion sowie testikulären sind umschlossen von der Tunica propria.
durch das Germinalepithel. Als Stütz- und Zellen. Außerdem bilden
die Sertoli-Zellen das morphologische Korrelat der Blut-Hoden-Schranke. Sie sind durch Zytoplasmaausläufer miteinander verbunden. Zwischen diesen Zytoplasmaausläufern liegen die germinativen Zellen. Bei der Wanderung der germinativen Zellen durch das Epithel von außen nach innen reifen sie zu differenzierten Samenzellen heran (Spermatogenese). Die differenzierten Samenzellen werden entlang der Tubuli seminiferi zum Rete testis (Hodennetz) weitergeleitet (CREASY 1998).
Ductuli efferentes
Die Ductuli efferentes kommen aus den Tubuli seminiferi des Rete testis nahe der Tunica albuginea am Hoden hervor. Dieser Abschnitt der Ductuli efferentes direkt nach dem Rete testis nennt man den initialen oder proximalen Abschnitt. Dort sind die Ductuli efferentes eher gerade oder nur leicht geschwungen. Bei der Ratte gehen 2-8 Ductuli efferentes aus dem Rete testis hervor (siehe Abbildung 3) (HESS 2002). Weiter in Richtung Nebenhodenkopf ziehend werden die Ductuli efferentes der Ratte mehr und mehr geschwungener, diese Region nennt man Conus vasculosus (HESS 2002). Im Bereich des Conus vasculosus anastomieren die Ductuli efferentes miteinander und bilden einen einzigen Kanal, auch common ductulus genannt, welcher dann in das initiale Segment des Nebenhodenkopfes einmündet (ILIO u. HESS 1994). Es gibt verschiedene Varianten wie der common ductulus in den Nebenhoden einmünden kann, bei der Ratte geht er abrupt in das initiale Segment des Nebenhodenkopfes über (CLELAND 1957). Histologisch besteht das Epithel der Ductuli efferentes aus zilientragenden und nicht-zilientragenden Zellen (auch principal cells genannt), basal cells sowie intraepithelialen Lymphozyten und Makrophagen (TRASLER et al. 1988;
ILIO u. HESS 1994). Bei der Ratte beinhaltet das Epithel typische Einfaltungen, in unregelmäßiger Anzahl und Größe (ILIO u. HESS 1994).
Die wichtigste Funktion der Ductuli efferentes ist die Reabsorption der Luminalflüssigkeit, was zu einer Aufkonzentration der Spermien führt, bevor sie in den Nebenhoden gelangen (CLULOW et al. 1998; HESS 2000; HESS u. NAKAI 2000).
Desweiteren bilden sie einen Leitungskanal für die Spermien. Die Weiterleitung erfolgt
durch Flüssigkeitssekretion des Epithels der Tubuli seminiferi im Hoden (MASON u.
SHAVER 1952), die Kontraktion der myoepithelialen Zellen um die Tubuli seminiferi im Hoden (HARGROVE et al. 1977), dem Vakuum, welches bei der Ejakulation entsteht (MASON u. SHAVER 1952), und dem ansteigenden Druck durch die Verzweigungen und die Vereinigung der Ductuli efferentes (MACMILLAN 1953; TALO 1981).
Auch Sekretion und Phagozytose gehören zu den Aufgaben des Epithels der Ductuli efferentes (CRABO et al. 1971; HESS et al. 1976; GRAY et al. 1983; HESS 2002).
Abbildung 3: Speziesvariationen in der Formation der Ductuli efferentes (ED). Die Ductuli efferentes bestehen aus parallel gewundenen Kanälchen, welche aus dem Rete testis (RT) des Hodens kommen. Dabei können sie sich artspezifisch im Conus vasculosus vereinen und als common ductulus in das initiale Segment des Nebenhodens eintreten (zum Beispiel Ratte) oder separat in den Nebenhoden führen. Modifiziert nach HESS (2002).
Nebenhoden
Der Nebenhoden der Ratte besteht aus dem initialen Segment, der intermediaten Zone, dem Kopf (Caput), dem Körper (Corpus) und dem Schwanz (Cauda). Diese Einteilung basiert auf strukturellen und funktionellen Parametern (CLELAND 1957; HERMO 1995;
HERMO u. ROBAIRE 2002). Das initiale Segment ist die Einmündungsstelle des common ductulus der Ductuli efferentes.
Es gibt verschiedene Zelltypen im Epithel des Ductus epididymidis (Nebenhodengang), einige sind in allen Abschnitten des Ductus zu finden und andere speziell nur in
spezifischen Regionen (HERMO u. ROBAIRE 2002). Den dominanten Zelltyp im Nebenhoden stellen die principal cells dar. Diese Zellen treten entlang der gesamten Nebenhodens auf. Desweiteren gibt es narrow cells, apical cells, clear cells, basal cells und halo cells (MOORE u. BEDFORD 1979; SUN u. FLICKINGER 1979; SUN u.
FLICKINGER 1980; ABOU-HAILA u. FAIN-MAUREL 1984; ADAMALI u. HERMO 1996;
HERMO u. ROBAIRE 2002). Eine der Hauptfunktionen des Nebenhodens besteht in der Vollendung der Spermienreifung. Weiterhin stellen auch der Spermientransport sowie Schutz, Aufkonzentrierung und Aufbewahrung der Spermien Aufgaben des Nebenhodens dar (ORGEBIN-CRIST 1969; SETCHELL et al. 1993; HESS 2002).
2.3.4 Männliche Geschlechtsorgane und PDE4-Inhibitoren
Lange Zeit gab es nur einen indirekten Beweis dafür, dass der Rattenhoden Ziel von PDE-4-Inhibitor-induzierten Läsionen ist. Der unselektive PDE-Inhibitor Theophyllin verursachte eine Anstauung von Spermien in dilatierten Tubuli des Rete testis in Ratten.
(FOLEY 2001). Jedoch zeigten früher bei der Takeda GmbH (Konstanz) durchgeführte Studien und eine daraus resultierende Veröffentlichung von HEUSER et al. (2012), dass es durch suprapharmakologische Dosierungen von PDE4-Inhibitoren zu toxikologischen Befunden in den männlichen Geschlechtsorganen kommen kann. Dabei handelte es sich um Dilatationen der Tubuli seminiferi und des Rete testis des Hodens, der initialen Tubuli des Nebenhodenkopfes sowie der Ductuli efferentes. Außerdem fanden sich Degenerationen (abgeschilferte Samenzellen und Apoptose) und Atrophien der Tubuli seminiferi des Hodens. Interstitielle subakute Entzündungen und Gefäßveränderungen (Endothelzellaktivierung, eosinophile Nekrose der Media, perivaskuläre Fibroblastenproliferation) zeigten sich in den Ductuli efferentes aber auch im gesamten Nebenhoden. Weiterhin kam es zu segmentalen Verminderungen der Spermiendichte im Nebenhoden. Zusätzlich traten Spermiengranulome entweder in den Ductuli efferentes oder in Kopf beziehungsweise Schwanz des Nebenhodens auf (HEUSER et al. 2012).
2.4 Interleukin-6 (IL-6) 2.4.1 Allgemeines
IL-6 ist ein Glykoprotein mit einer Größe von 26 kDa mit 212 Aminosäuren in vier α- Ketten. Eine Reihe von Zellen ist in der Lage IL-6 zu produzieren. Dazu gehören T- und B-Zellen, Makrophagen, aktivierte Monozyten, Mastzellen, neutrophile und eosinophile Granulozyten, Gliazellen, Fibroblasten, Chondrozyten, Adipozyten, Osteoblasten sowie Endothelzellen. Die Effektorzellen sind Hepatozyten, Chondrozyten, Megakaryozyten, T- und B-Lymphozyten, Osteoklasten sowie Plasmazellen (ASSIER et al. 2010). Diese Vielzahl an Produktions- und Effektorzellen spiegelt wider, dass IL-6 an vielen biologischen Prozessen beteiligt ist.
Die Signalübertragung erfolgt über den IL-6-Rezeptor. Dieser Rezeptor ist ein Heterodimer und besteht aus zwei Einheiten: einer 80 kDa Kette (IL-6Rα) und einer 130 kDA Kette (gp130) (ARUFFO u. SEED 1987; YAMASAKI et al. 1988; TAGA et al.
1989; HIBI et al. 1990). Von dem IL-6Rα gibt es zwei Formen, die transmembrane Form, welche nur von Hepatozyten, Phagozyten sowie einigen Lymphozyten exprimiert wird, und eine lösliche Form (IL-6Rαs), welche durch Proteolyse der transmembranen Form oder durch Splicing der mRNA der α-Kette entsteht. Das gp130 ist nur transmembran lokalisiert und ubiquitär exprimiert (HIBI et al. 1990). Mit diesen Rezeptorbestandteilen gibt es zwei Arten einer Signalübertragung durch IL-6. Beiden Arten gleich ist, dass die drei Moleküle (IL-6; IL-6Rα oder IL-6Rαs; gp130) nur zusammen ein Signal übertragen können.
Bei der ersten Form der Rezeptoraktivierung binden zwei IL-6-Moleküle an zwei membrangebundene IL-6Rα-Einheiten. Dies wiederum führt zu Dimerisation des Rezeptors mit zwei membrangebundenen gp130-Einheiten und es kann zu einer Signalübertragung kommen (siehe Abbildung 4) (KISHIMOTO 2006; ASSIER et al.
2010).
Bei der zweiten Form der Rezeptoraktivierung bindet IL-6 an den löslichen Rezeptor.
Diese Einheit aus IL-6 und IL-6Rαs kann nun an eines der membrangebundenen gp130 binden. Mit einer zweiten solchen Einheit bestehend aus IL-6, IL-6Rαs und gp130 bildet
sich ein Dimer und das Signal kann übertragen werden (siehe Abbildung 4) (KISHIMOTO 2006; ASSIER et al. 2010). Bei beiden Mechanismen der Signalübertragung wird nach der Dimerisation eine Jak-Stat-Kinase aktiviert. Dieses wiederum kann zu einer Expression von Genen führen, welche im Entzündungsgeschehen eine Rolle spielen (MCLOUGHLIN et al. 2005).
Neben seinen Effekten auf hämatopoetische Zellen und der Leber ist es an vielen endokrinen sowie metabolischen Prozessen beteiligt und ein potenter Stimulator der Hypothalamus-Hypophysen-Achse (PAPANICOLAOU et al. 1998). Eine weitere wichtige Eigenschaft von IL-6 ist die Schlüsselrolle dieses Zytokins bei der Entzündung. Zum einen spielt IL-6 eine proinflammatorische Rolle, es ist der Hauptstimulator für die Bildung von Akute-Phase-Proteinen der Leber, es ist bei der Proliferation von zytotoxischen T-Zellen beteiligt und spielt auch eine Rolle bei der Leukozytenrekrutierung (BERTAGNOLLI et al. 1991; HURST et al. 2001; ASSIER et al.
2010). Weiterhin gibt es viele Veröffentlichungen, die eine Beteiligung von IL-6 bei immunbedingten Erkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, zeigen (HIRANO et al. 1988;
PAPANICOLAOU et al. 1998). Auf der anderen Seite jedoch zeigt sich IL-6 auch als Kontrolleur pro-inflammatorischer Zytokine und wirkt somit auch anti-inflammatorisch (ULICH et al. 1991; XING et al. 1998). Dies gilt bei akuten Entzündungsgeschehen, wie beispielsweise einer Sepsis (ULICH et al. 1991).
Abbildung 4: Verschiedene Formen der IL-6-Signalübertragung (ASSIER et al. 2010)
a) IL-6 bindet an die α-Kette des IL-6Rα um einen Komplex mit hoher Affinität für gp130 zu bilden. Nach Bildung eines Heterodimers kommt es zur Signalübertragung durch gp130.
b) IL-6 bindet an die α-Kette des löslichen IL-6Rαs um einen Komplex mit hoher Affinität für gp130 zu bilden, das auf fast allen Zellen exprimiert ist. Nach Bildung eines Heterodimers mit einem anderen Komplex dieser Art kommt es zur Signalübertragung durch gp130.
2.4.2 IL-6 und Phosphodiesterase-4-Inhibitoren
IL-6 scheint bei der Ratte in Zusammenhang mit den durch suprapharmakologische Dosierungen des PDE4-Inhbitors-induzierten toxikologischen Befunden zu stehen.
Mehrere Veröffentlichungen zeigen einen Anstieg von IL-6 bei Ratten nach Gabe eines PDE4-Inhibitors im Blut (DIETSCH et al. 2006; DAGUES et al. 2007a; DAGUES et al.
2007b; WEAVER et al. 2008; WEAVER et al. 2010) oder auf Genexpressions-Ebene (DAGUES et al. 2007a; DAGUES et al. 2007b). Dabei zeigte sich der IL-6-Anstieg unter Verwendung verschiedener chemischer Klassen von PDE4-Inhibitoren, Dosierungen, Rattenstämme und Messzeitpunkten des IL-6. Darüber hinaus stellten zwei der Veröffentlichungen eine klare Korrelation zwischen den histologischen Befunden im Mesenterium und dem IL-6-Anstieg im Blut dar (DIETSCH et al. 2006; WEAVER et al.
2008). Die Tiere mit den schwerwiegendsten histopathologischen Befunden im Mesenterium zeigten jeweils den höchsten IL-6-Anstieg im Blut. Weiterhin gab ein In-vitro- Assay einen weiteren Hinweis, dass IL-6 bei der Pathogenese PDE4-Inhibitor-induzierter toxikologischer Befunde bei der Ratte eine besondere Bedeutung hat. In diesem In-vitro- Assay wurde die IL-6-Ausschüttung nach Stimulation von Vollblut mit einem PDE4- Inhibitor gemessen. Verglichen wurde Vollblut von Mensch, Affe und Ratte. Dabei zeigte nur das Vollblut der Ratte eine IL-6-Ausschüttung (DIETSCH et al. 2006).
Diese Indizien spiegeln eine scheinbar wichtige Rolle von IL-6 im Zusammenhang mit PDE4-Inhibitoren bei der Ratte wider. Daher richtet sich der Fokus der Doktorarbeit auf IL-6 als zu untersuchenden speziesspezifischen Parameter. IL-6 stellt das Zielzytokin in den In-vitro-Versuchen dar und soll in vivo durch einen Antikörper antagonisiert werden.
3 Material und Methoden
3.1 Material in vitro
3.1.1 Zelllinien mit Kulturgefäß Tabelle 1: Zelllinien und Kulturgefäße
Zelllinie/Kulturgefäß Lieferanteninformation bzw. Herstellerinformation Human umbilical vein
endothelial cells (HUVEC), cryo
Provitro GmbH, Berlin, Deutschland
Cellstar® cellculture flasks (25 cm2)
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland
Rat brain endothelial cells (RBE4)
zur Verfügung gestellt vom Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland Tissue Culture Dish
(100x20 mm)
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
3.1.2 Testsubstanzen
3.1.2.1 PDE4-Inhibitor BYK199404 siehe Kapitel 3.2.2
3.1.2.2 Lipopolysaccharide
Tabelle 2: Lipopolysaccharide zur Stimulation der Zelllinien
Name Herstellerinformation
0111:B4 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland 0127:B8 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland
3.1.3 Material zur Kultivierung und zum Passagieren der Zelllinien Tabelle 3: Material zur Kultivierung der Zelllinien
Name Herstellerinformation
Endothelial cell growth medium, basal mit Endothelial cell growth Supplement-Mix, FCS und Antibiotics
Provitro GmbH, Berlin, Deutschland
F10 + GlutaMAX™-I Nutrient Mixture (Ham) 1x und MEM Alpha + GlutaMAX™-I MEM Alpha Medium 1x
Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland
Bovine Fetal Serum (BFS), Mycoplasma, screened, sterile filter
LINARIS Biologische Produkte GmbH, Dossenheim, Deutschland
L-Glutamine 200mM (100x)
Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland
Penicillin/Streptomycin 10000 U/ml/
10000 µg/ml
Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Recombinant Human Fibroblast Factor – basic (FGFb)
Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland
Amphotericin B (250 µg/ml)
PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich
Collagen I, Rat Tail (3 mg/ml)
Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland
Tabelle 4: Material zum Passagieren der Zelllinien
Name Herstellerinformation
PBS (phosphate
buffered saline) selbst hergestellt aus:
8 g NaCl; 0,2 g KCl, 1,44 g NaPO4; 0,2 g KH2PO4 Ad 1 l Aqua bidest, pH 7,4
EDTA (Versen) 1% (w/v)
Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Trypsin/EDTA Solution (10x) 0,5%/0,2% (w/v)
Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Trypanblau C.I. 23850
Serva Feinbiochemica GmbH & Co., Heidelberg, Deutschland
3.1.4 Material zur Bestimmung von Zellviabilität und IL-6 3.1.4.1 Kommerziell erhältliche Kits
Tabelle 5: Kits für die In-vitro-Versuche
Name Herstellerinformation
DuoSet® ELISA human IL-6
R&D Systems, Abingdon, England
CellTiter 96® AQeous One Solution Cell Proliferation Assay
Promega GmbH, Mannheim, Deutschland
DuoSet® ELISA rat IL-6
R&D Systems, Abingdon, England
3.1.4.2 Gerät
Tabelle 6: Gerät zur Messung der optischen Dichte
Name Herstellerinformation
Dynatech Laboratories MRX Microplate
Reader
Dynatech Laboratories, London, England
3.1.4.3 Sonstiges Zubehör
Tabelle 7: sonstige Materialien zur Parametermessung der In-vitro-Versuche
Name Herstellerinformation
Albumin, from bovine Serum, lyophilisiert
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland
Tween®20 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland 3,3`5,5`Tetra-
Methylen-benzidine (TMB) Liquid Substrate System
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland
2N H2SO4 selbst hergestellt aus:
10, 208 ml H2SO4 (95-97%) ad 100 ml Aqua bidest Normalserum (Ziege)
unkonjugiert
Dianova, Hamburg, Deutschland
3.2 Material in vivo 3.2.1 Tiere
Tabelle 8: Tierspezies
Spezies, Stamm Lieferanteninformation
Ratte, Wistar-Han Sociètè Janvier, ST BERTHEVIN CEDEX, Frankreich
3.2.2 Testsubstanz/Antikörper mit Lösungsmittel Tabelle 9: Testsubstanz/Antikörper
Name (Art) chemischer Name/Quelle oder Funktion
Herstellerinformation
BYK199404 (PDE4-Inhibitor)
2-{4-[(4aS,8aR)-4-(3,4- Dimethoxy-phenyl)-1-oxo- 4a,5,8,8a-tetra-hydro-1H- phthalazin-2-yl]-piperidin-1-yl}- acetamide.HCl
Takeda GmbH (ehemals Nycomed GmbH),
Konstanz, Deutschland
0,9% NaCl Lösungsmittel für BYK199404 B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Rat Anti-IL-6-
Antibody (Anti- IL-6-Antikörper)
PPPolyclonal Goat IgG Immunogen:
E. coli derived recombinant rat IL-6
R&D Systems, Abingdon, England
Anti-rat IgG- Antibody (Anti- Immunglobulin G- Antikörper)
Polyclonal Goat IgG Immunogen:
Rat IgG
R&D Systems, Abingdon, England
PBS (phosphate buffered saline) ohne Ca2+, Mg2+
Lösungsmittel für beide Antikörper
B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
3.2.3 Material für die Messung der Blutparameter 3.2.3.1 Geräte
Tabelle 10: Geräte für die Messung der Blutparameter
Name Herstellerinformation
Advia120 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, München, Deutschland
Thrombolyzer XR Behnk Elektronik, Norderstedt, Deutschland Cobas Mira Plus Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland Tecan Sunrise Tecan Sunrise, Crailsheim, Deutschland
(Software: Magellan) Sector® Imager
2400
Meso Scale Discovery, Gaithersburg, USA
3.2.3.2 Zubehör für die Blutentnahme und kommerziell erhältliche Kits Tabelle 11: Zubehör Blutentnahme und Kits zur Messung der Blutparameter
Name Herstellerinformation
Kalium-EDTA Microvette® 500;
1,3 ml
Mikroprobengefäße mit Kalium-EDTA und 1,3 ml Mikro- probengefäße mit Serumgerinnungs- aktivator
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
Quantikine® Rat IL-6 R&D Systems, Abingdon, England Rat Demonstration 7-
Plex Assay Ultra- Sensitive Kit
Meso Scale Discovery, Gaithersburg, USA
3.2.4 Material für die RNA-Isolation und die Genexpressionsanalysen 3.2.4.1 Geräte
Tabelle 12: Geräte für die RNA-Isolation und die Genexpressionsanalysen
Name Herstellerinformation
Precellys 24
Homogeniser Bertin Technologies, Seint Quentin en Yvelines, Frankreich
NanoDrop ND-1000
Spectrophotometer PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland ABI Prism 7900HT
Real-Time PCR Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland 3.2.4.2 Kommerziell erhältliche Kits
Tabelle 13: Kits für die RNA-Isolation und die Genexpressionsanalysen
Name Herstellerinformation
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland RNase-free DNase Set Qiagen, Hilden, Deutschland QuantiFast Probe
RT-PCR Kit Qiagen, Hilden, Deutschland TaqMan® Endogenous
Control: Rat ACTB
Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
TaqMan® Gene Expression Assays (FAM ™ Dye)
Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Primer Assay ID
IL-6 Cox-2 Timp-1 Fgg
Rn01410330_m1 Rn01483828_m1 Rn01430875_g1 Rn00561196_m1
3.2.4.3 Sonstiges Zubehör
Tabelle 14: sonstige Materialien für RNA-Isolation und Genexpressionsanalysen
Name Herstellerinformation
RNA later ICE solution Ambion®/Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Precellys tubes PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland Qiazol Qiagen, Hilden, Deutschland
Chloroform Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland Optical 96Well
Reaction Plate
Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
Optical Adhesive Film Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland 3.2.5 Histologie
3.2.5.1 Geräte
Tabelle 15: Geräte zur histologischen Gewebeaufarbeitung
Name Herstellerinformation
Pathcentre Shandon GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Tissue Block System
TES99
Medite GmbH, Burgdorf, Deutschland
Rotationsmikrotom
System HM360 Microm, Walldorf, Deutschland
Tissue Stainer TST44 Medite GmbH, Burgdorf, Deutschland OT-Coverslipper
RCM2000
Medite GmbH, Burgdorf, Deutschland
3.2.5.2 Chemikalien zur Fixation, Einbettung und Färbung der Gewebe Tabelle 16: Chemikalien zur histologischen Gewebeaufarbeitung
Name Herstellerinformation
30%iges Formalin CVH Chemie-Vertrieb GmbH & Co. Hannover KG Niederlassung Hamburg, Hamburg, Deutschland Ethanol vergällt Bundesmonopolverwaltung für Branntwein, Offenbach
am Main, Deutschland
Essigsäure 99-100 % Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Paraplast® VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Xylol Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Eosin-Y (alkoholisch) Shandon GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland Gill-3-Hämatoxylin Shandon GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland
3.3 Versuchsübersicht und Methoden
In den folgenden Versuchen wurde der Einfluss des PDE4-Inhibitors BYK199404 auf die IL-6-Produktion humaner und von Ratten stammender Endothelzelllinien in vitro untersucht sowie die Zeit- und Dosisabhängigkeit toxikologischer Befunde an der Ratte charakterisiert und der Einsatz eines Anti-IL-6-Antikörpers zur möglichen Verminderung der beobachteten Befunde in vivo an der Ratte geprüft.
Für den In-vitro-Versuch wurden HUVEC und RBE4-Zellen mit verschiedenen BYK199404-Konzentrationen stimuliert und die IL-6-Produktion zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen (Stimulations-Studie). Neben der Ausschüttung von IL-6 wurde eine Beurteilung der Zellviabilität durchgeführt.
Darauf folgten die In-vivo-Versuche mit Wistar-Han-Ratten. Zuerst erfolgte ein Vorversuch, um eine Dosis von BYK199404 zu finden, welche histopathologische Befunde in den Zielorganen (Mesenterium, Hoden, Nebenhoden und Ductuli efferentes) herbeiführt, aber dennoch für die Tiere verträglich ist (Dosis-Findungsstudie). Dieser Vorversuch war bedingt durch einen Rattenstammwechsel und die Tatsache, dass sich verschiedene Rattenstämme substanzspezifisch anders verhalten können.
Diesem Vorversuch folgten 3 Hauptstudien. In der ersten Hauptstudie wurde die IL-6- Ausschüttung im Blut als Reaktion der Ratten auf die Applikation von BYK199404 untersucht. Hierzu wurde IL-6 zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Applikation gemessen (IL-6-Profil). Im Rahmen der zweiten Hauptstudie wurden die BYK199404- induzierten Veränderungen in Allgemeinbefinden, Histopathologie, Genexpression und Blutparameter hinsichtlich ihres Dosis- und Zeitverlaufs genauer analysiert (Zeitverlaufsstudie). Der dritte Versuchsabschnitt beinhaltete die simultane Applikation von BYK199404 und eines Anti-IL-6-Antikörpers (Anti-IL-6-AK) um zu prüfen, ob mit Hilfe des Anti-IL-6-AKs eine Verminderung oder sogar Verhinderung der durch BYK199404-induzierten toxikologischen Befunde erreicht werden kann (Interventionsstudien). Hier basierten Applikationsdauer und Dosis von BYK199404 auf den Ergebnissen der vorher durchgeführten Zeitverlaufsstudie.
3.4 Methoden in vitro
3.4.1 Übersicht über die Stimulations-Studie
Die BYK199404-Konzentrationen zur Stimulation beider Zelllinien betrugen 0,01; 0,1; 1;
und 10 µmol/l. Von den RBE4-Zellen wurden 6 Passagen (p6, p10, p13, p14, p18, p19) und von den HUVEC 5 Passagen (p2, p3, p4, p5, p6) stimuliert, 3 Passagen der HUVEC (p4, p5, p6) wurden zusätzlich mit einer weiteren Konzentration von 0,001 µmol/l BYK199404 stimuliert. Als Positivkontrolle wurden alle Passagen beider Zelllinien mit LPS stimuliert. Dabei wurden die HUVEC mit dem LPS 0111:B4 und die RBE4-Zellen mit dem LPS 0127:B8 stimuliert. Die LPS-Konzentrationen für die Stimulation betrugen für beide Zelllinien 2 und 20 µg pro 1 ml Zellkulturmedium. Als Negativkontrolle diente eine Behandlung mit dem jeweiligen Komplettmedium. 24 h und 48 h nach der Stimulation beider Zelllinien wurde die Zellviabilität und der IL-6- Gehalt des Zellkulturüberstandes bestimmt (siehe Tabelle 17).
Tabelle 17: Versuchsübersicht der In-vitro-Studie
Zelllinie Stimulation mit: stimulierte
Passagen Zeitpunkte für die Viabilitäts-
und IL-6- Messung BYK
199404 (Konzentration)
LPS (Art;
Konzentration)
HUVEC
10 µmol/l, 1 µmol/l, 0,1 µmol/l, 0,01 µmol/l
0111:B4;
2 µg und 20 µg pro 1 ml Komplett- medium
p2, p3 p4, p5,
p6
24 h 48 h und
0,001 µmol/l p4, p5, p6
RBE4
10 µmol/l, 1 µmol/l, 0,1 µmol/l, 0,01 µmol/l
0127:B8;
2 µg und 20 µg pro 1 ml Komplett- medium
p6, p10, p13,p14, p18, p19
3.4.2 Kultivierungsbedingungen der HUVEC
Die HUVEC wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen mit 5 ml Komplettmedium in einem Brutschrank unter konstanten Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) kultiviert. Die Basis des Mediums für diese Zellen war ein Endothelzell-Wachstums-Medium. 500 ml dieses Mediums wurden versetzt mit:
1. 23,5 ml Endothelzell-Wachstums-Supplement-Mix, FKS (bestehend aus: 0,02 ml FKS; 4 µl Endothelzell-Wachstums-Supplement/Heparin (ECGS/H; 3 mg/ml); 0,1 ng rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor, human (EGF); 1 ng rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor, human (bFGF); 1 µg Hydrokortison pro 1 ml Basalmedium);
2. 3,5 ml Gentamicin (50 µg pro 1 ml Basalmedium);
3. 2,5 µg Amphotericin pro 1 ml Basalmedium.
Der Mediumwechsel erfolgte alle 2 - 3 Tage.
3.4.3 Kultivierungsbedingungen RBE4-Zellen
Die RBE4-Zellen wurden auf 100 x 20 mm Zellkultur-Petrischalen mit 10 ml Komplettmedium in einem Brutschrank unter konstanten Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) kultiviert. Die Kultivierungsgefäße mussten vorher mit Kollagen beschichtet werden.
Dazu wurde aus der Kollagen-Stammlösung (Collagen I, Rat Tail; 3 mg/ml) eine 1:50 Verdünnung mit Aqua bidest hergestellt. Pro 100 x 20 mm Zellkultur-Petrischale wurden 4 ml dieser Verdünnung aufgetragen und im Inkubator für 1 h bei 37 °C inkubiert.
Danach wurde die Kollagenverdünnung wieder abgesaugt. Das Komplettmedium für die RBE4-Zellen bestand aus:
1. 44 % F-10+GlutaMAX™-I Nutrient Mixture (Ham) 1x cell growth medium;
2. 44 % MEM Alpha+ GlutaMAX™-I MEM Alpha Medium 1x;
3. 10 % hitzeinaktiviertes (56 °C, 30 min) FKS, 4. 1 % L-Glutamin 200 mM;
5. 1 % Penicillin/Streptomycin 10 000 U/ml;
6. 1 ng/ml rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor;
